CN105803010A - 一种基于异养微藻油脂积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于异养微藻油脂积累的方法，主要包括：首先利用葡萄糖作为有机碳源异养培养微藻至对数生长期后期，经新鲜BG‑11培养基稀释重新悬浮后作为诱导藻液；然后用纯水配制100mM的甜菜碱母液，将甜菜碱母液添加到已经稀释好的诱导藻液中稀释甜菜碱母液，并将藻液置于强光照下培养；最后隔天离心收集藻细胞，并利用有机溶剂浸提藻细胞内油脂。本发明方法操作简单，能够缩短藻细胞生长周期，提高油脂的产率，为微藻产业化过程中存在的藻种扩培时间长、油脂产率低等问题提供了一种有效的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种基于异养微藻油脂积累的方法。
背景技术
微藻生物质作为替代陆生植物生产生物燃料的原料，因其可以进行光合作用，能有效利用太阳能将水、CO2和无机盐转化为有机物。微藻具有光合利用率高、生长速度快、对生长环境要求低及储能物质(油脂、烃)含量高等优点已被广泛研究(MarkouG,NerantzisE.Microalgaeforhigh-valuecompoundsandbiofuelsproduction:Areviewwithfocusoncultivationunderstressconditions[J].Biotechnologyadvances,2013,31(8):1532-1542)。
微藻的生长模式主要有自养、异养和兼养。现在微藻主要采用光自养培养。Yang等自养培养单针藻MonoraphidiumdybowskiiLB50时，在对数生长期前期和后期分别添加一定浓度的NaCl来诱导藻细胞积累油脂，发现藻细胞在20g/LNaCl的诱导下油脂积累量最高(YangH,HeQ,HuC.LipidaccumulationbyNaClinductionatdifferentgrowthstagesandconcentrationsinphotoautotrophictwo-stepcultivationofMonoraphidiumdybowskiiLB50[J].Bioresourcetechnology,2015,187:221-227)。但光自养培养模式具有使藻细胞生长周期过长、产率低、易染菌且采收成本高等特点。而在异养条件下微藻利用葡萄糖等有机碳源可快速积累生物质，大大缩短了藻细胞生长周期，提高了细胞生物量产率，Li等在异养阶段培养小球藻Chlorellavulgaris至对数生长期时，其油脂含量仅20％左右；当加入不同浓度的NaCl，发现在0.5MNaCl诱导下，藻细胞油脂含量有显著性增加(LiY,MuJ,ChenD,etal.ProteomicsanalysisforenhancedlipidaccumulationinoleaginousChlorellavulgarisunderaheterotrophic-Na+inductiontwo-stepregime[J].Biotechnologyletters,2015,37(5):1021-1030)。但异养条件下培养的藻细胞品质较差，一般获得的藻细胞油脂含量较低，因此异养阶段一般不适于积累油脂。微藻在兼养条件下，因需要足够的光照和同时保证无菌环境，所需要的设备要求较高，一般不用于产业化生产。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于异养微藻油脂积累的方法，采用可异养的微藻，进行藻种异养的培养使藻细胞在短时间内快速生长，随后稀释至适量的浓度进行光自养培养，同时结合甜菜碱诱导藻细胞大量积累油脂，并利用有机溶剂提取藻细胞内油脂。本发明操作简单，能够缩短藻细胞的生长周期，提高油脂的产率。
本发明的基于异养微藻油脂积累的方法，包括以下步骤：
步骤1、诱导藻液的制备：在25℃时，以10g/L葡萄糖为碳源的BG11基础培养基异养摇瓶培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期，此时生物量达到5.58g/L，收集藻细胞，用新鲜的BG11培养基稀释重悬浮藻细胞至1g/L作为诱导藻液；
步骤2、诱导藻细胞积累油脂：用纯水配制100mM的甜菜碱母液，将甜菜碱母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使甜菜碱浓度为5-20mM，并置于光照条件下培养；
步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞内油脂。
其中，本发明的特点还在于：
所述的微藻为单针藻菌株Monoraphidiumsp.QLY-1(NCBI:KM199735)。
所述步骤2中诱导条件为：温度24℃-26℃、光强95-105umol·m-2·s-1、冷光灯持续光照诱导。
所述步骤3中利用有机溶剂提取藻细胞内油脂，其具体方法为：首先将培养液经4000r/min离心富集5min，并用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉，称重；其次加入所述干藻粉2倍质量的石英砂，且充分研磨；随后加入适量体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，最后离心收集有机相干燥称重，即可。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
本发明提供一种基于异养微藻油脂积累的方法，包括以下步骤：
步骤1、诱导藻液的制备：在25℃时，以10g/L葡萄糖为碳源的BG11基础培养基异养摇瓶培养单针藻Monoraphidiumsp.QLY-1，培养单针藻至对数生长期后期，此时生物量达到5.58g/L，利用新鲜的BG-11培养基稀释到1g/L作为诱导藻液；
步骤2、诱导藻细胞积累油脂：用纯水配制100mM的甜菜碱母液，将甜菜碱母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使甜菜碱浓度分别为0mM、5mM、10mM和20mM，并置于光照条件下培养，并置于24℃-26℃、光强95-105umol·m-2·s-1、冷光灯持续光照诱导；
步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞内油脂，其具体方法为：首先将培养液经4000r/min离心富集5min，并用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉，称重；其次加入所述干藻粉2倍质量的石英砂，且充分研磨；随后加入适量氯仿-甲醇(体积比为2:1)重复抽提至藻体发白，最后离心收集有机相干燥称重，即可。
对比例1
为充分说明本发明方法的优越性，本发明的对比例1为自养培养模式下微藻的油脂积累方法，其主要步骤为：
在25℃时，光强30umol·m-2·s-1以BG-11为基础培养基自养摇瓶培养单针藻Monoraphidiumsp.QLY-140天至对数生长期后期，离心收集藻细胞，利用有机溶剂浸提藻细胞内油脂，此时细胞生物量为0.878g/L，油脂含量、油脂产率分别为52.79％和11.59mg/L·d(参照表1)。
对比例2
为说明本发明方法中甜菜碱浓度对藻细胞中油脂积累的影响，本对比例为异养光诱导培养模式下微藻的油脂积累方法，其中甜菜碱浓度为0mM，其主要步骤为：
(1)在25℃时，以10g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养摇瓶培养单针藻Monoraphidiumsp.QLY-1，培养单针藻至对数生长期后期，此时生物量达到5.58g/L，微藻生物量较自养条件下增加了利用新鲜的BG-11培养基稀释到1g/L作为诱导藻液；
(2)将已经稀释好的诱导藻液置于25℃、光强100umol·m-2·s-1、冷光灯持续光照诱导，隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂浸提藻细胞内油脂，发现诱导第三天油脂含量达到最高，然而油脂含量低于单一自养时的油脂含量，但油脂产率较单一自养条件下提高了约8.2倍(参照表1)。
实施例1
本实施例为异养光诱导培养模式下微藻的油脂积累方法，其主要步骤为：
(1)在25℃时，以10g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养摇瓶培养单针藻Monoraphidiumsp.QLY-1，培养单针藻至对数生长期后期，此时生物量达到5.58g/L，利用新鲜的BG-11培养基稀释到1g/L作为诱导藻液；
(2)用纯水配制100mM的甜菜碱母液，将甜菜碱母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使甜菜碱浓度为5mM，并置于25℃、光强100umol·m-2·s-1、冷光灯持续光照诱导，隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂浸提藻细胞内油脂，发现诱导第三天油脂含量达到最高，生物量产率基本保持不变，5mM甜菜碱诱导下的藻细胞油脂含量和产率较对照组分别增加了29.14％和27.16％(参照表1)。
实施例2
本实施例为异养光诱导培养模式下微藻的油脂积累方法，其主要步骤为：
(1)在25℃时，以10g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养摇瓶培养单针藻Monoraphidiumsp.QLY-1，培养单针藻至对数生长期后期，此时生物量达到5.58g/L，利用新鲜的BG-11培养基稀释到1g/L作为诱导藻液；
(2)用纯水配制100mM的甜菜碱母液，将甜菜碱母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使甜菜碱浓度为10mM，并置于24℃、光强95umol·m-2·s-1、冷光灯持续光照诱导，隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂浸提藻细胞内油脂，发现诱导第三天油脂含量达到最高，生物量产率有些许下降，10mM甜菜碱诱导下的藻细胞油脂含量和产率较对照组分别增加了19.55％和17.51％(参照表1)。
实施例3
本实施例为异养光诱导培养模式下微藻的油脂积累方法，其主要步骤为：
(1)在25℃时，以10g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养摇瓶培养单针藻Monoraphidiumsp.QLY-1，培养单针藻至对数生长期后期，此时生物量达到5.58g/L，利用新鲜的BG-11培养基稀释到1g/L作为诱导藻液；
(2)用纯水配制100mM的甜菜碱母液，将甜菜碱母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使甜菜碱浓度为20mM，并置于26℃、光强105umol·m-2·s-1、冷光灯持续光照诱导，隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂浸提藻细胞内油脂，发现诱导第三天油脂含量达到最高，生物量产率有些许下降，20mM甜菜碱诱导下的藻细胞油脂含量和产率较对照组分别增加了8.7％和6.05％(参照表1)。
表1不同培养模式下生物量、生物量产率、油脂含量、油脂产率结果
上述结果表明，单一自养条件下微藻的油脂含量比较高，但其培养周期过长且生物量较低；异养培养微藻可快速增加微藻生物量，利用光自养添加诱导子诱导异养后的藻细胞积累油脂，发现较低浓度的甜菜碱可有效促进可异养微藻细胞中油脂的积累。通过此两阶段培养微藻的方法，既实现了微藻的快速高密度生长，又实现了微藻的高品质培养。
以上所述，仅是本发明的较佳案例，并不对本发明做出任何限制，凡是针对本发明技术内容对以上实施案例所做的任何简单修改、变更、模仿均属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (4)
1.一种基于异养微藻油脂积累的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、诱导藻液的制备：在25℃时，以10g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至1g/L作为诱导藻液；
步骤2、诱导藻细胞积累油脂：用纯水配制100mM的甜菜碱母液，将甜菜碱母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使甜菜碱浓度为5-20mM，并置于光照条件下诱导培养；
步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞内油脂。
2.根据权利要求1所述的基于异养微藻油脂积累的方法，其特征在于，所述的微藻为单针藻菌株Monoraphidiumsp.QLY-1(NCBI:KM199735)。
3.根据权利要求1所述的基于异养微藻油脂积累的方法，其特征在于，所述步骤2中诱导条件为：温度24-26℃、光强95-105umol·m-2·s-1、冷光灯持续光照诱导。
4.根据权利要求1所述的基于异养微藻油脂积累的方法，其特征在于，所述步骤3中利用有机溶剂提取藻细胞内油脂具体方法为：首先将培养液经4000r/min离心富集5min，并用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉，称重；其次加入所述干藻粉2倍质量的石英砂，且充分研磨；随后加入适量体积比为1:2的氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，最后离心收集有机相干燥称重，即可。
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