CN110741301B - 用于显微镜载片的石蜡屏蔽涂覆层 - Google Patents

Abstract

提供显微镜载片上的屏蔽涂覆层。具体地，提供选择施加石蜡层以屏蔽生物材料和无机化学沉积物以免受微生物攻击以及氧化。更具体地，还提供显微镜载片上施加石蜡层，以作为沉积的生物材料反应性靶标的暴露屏蔽。石蜡屏蔽层阻止生物材料和化学靶标免于暴露，其可能导致由于氧化而导致的降解，并提供对真菌生长的抵抗力，同时使用现有的染色处理步骤，将石蜡从屏蔽和共存的组织切片中清除。

Description

用于显微镜载片的石蜡屏蔽涂覆层

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年6月15日提交的美国临时申请No.62/520169和2017年6月15日提交的美国临时No.62/520319的权益，其每一个的公开内容通过引用整体结合于此。

技术领域

本发明涉及显微镜载片上的屏蔽涂覆层。本发明具体涉及，施加石蜡层以屏蔽生物材料和无机化学沉积物以免受微生物攻击以及氧化。本发明更具体涉及，提供了在显微镜载片上施加石蜡层，以作为沉积的生物材料反应性靶标的暴露屏蔽。石蜡屏蔽层阻止生物材料和化学靶标免于暴露，其可能导致由于氧化而导致的降解，并提供对真菌生长的抵抗力，同时使用现有的染色处理步骤将石蜡从屏蔽和共存的组织切片中清除。

背景技术

石蜡通常是一种白色或无色的软固体，衍生自石油、煤炭或油页岩，其由含二十至四十个碳原子的烃分子混合物组成。在室温下为固体，高于约37℃(99℉)时开始熔化；其沸点为>370℃(698℉)。石蜡的通常应用包括润滑、电绝缘和蜡烛；染色的石蜡可以制成蜡笔。它不同于有时称为石蜡的煤油和其他石油产品。

在病理实验室中，先使用石蜡来浸渍组织，再切片薄组织样本。通过提高酒精浓度(达到75％纯度)从组织中除去水，并在例如二甲苯的有机溶剂或例如二甲苯酚的一种脂肪族替代物中清洁组织。然后将组织放在石蜡中放置数小时，然后将其放入带有蜡的模具中冷却并固化；然后在切片机上切出切片。

将组织切片嵌入石蜡是延长组织切片保存时间的常规做法。然而，尚未报道过将石蜡作为薄涂层施加在显微镜载片的选定区域上。选定区域可以包含蛋白质、结合蛋白质、抗体、被肽链或蛋白质包裹的珠、或其他细胞材料。石蜡固有地被认为含有抗真菌性和抗细菌性的试剂，其防止抗原位点的氧化以及暴露位点的空气传播的酸/碱降解。石蜡屏蔽涂覆层将生物材料和化学靶标的使用寿命从3-5天变为1-2年，从而为最终用户提供了有用的产品寿命。去除包埋的石蜡也是常规做法，为的是使组织切片暴露于随后的免疫组织化学(IHC)或苏木精和曙红(H&E)染色。利用相同或相似的石蜡制剂以屏蔽在同一显微镜载片的其他沉积的材料，以确保没有额外的载片处理必须在开始IHC或H&E染色之前进行。

可以参考CN204790174(U)，其公开了石蜡密封代替盖玻片，该盖玻片用于密封载片内的埋入室的两个入口。密封的腔室能够对样品进行近距离的显微镜检查，而没有被显微镜光学器件或其他处理方式损坏的风险。这样的实施方式不支持直接地封装生物材料或IHC处理，特别是组织切片的脱石蜡处理。

发明概述

一般而言，本发明的一方面是将石蜡涂覆层施加在生物材料和无机靶标上。

在本发明的另一方面，将生物材料和无机靶标沉积在显微镜载片上，其中石蜡涂覆层被选择性地施加以涂覆刚刚超过沉积物的位置作为屏蔽。

在本发明的还一方面，所得的显微镜载片被后加热，以将石蜡颗粒熔化和/或共混成整体表面涂覆层，从而密封沉积物以及围绕沉积物的载片表面两者。

在本发明的又一方面，可以通过喷涂、丝网印刷、喷墨方法、移印和辊转移印刷等来施加石蜡涂覆层。

在本发明的又一方面，施加的石蜡通过防止抗原位点的氧化和暴露位点的空气传播的酸和/或碱降解，而增加组织切片的保存期限。

在以下描述中公开了本发明的其他方面。

具体说明

通过参考以下详细描述，可以更容易地理解本发明，该详细描述形成本公开的一部分。应当理解，本发明不限于在此描述和/或示出的特定设备、方法、条件或参数，并且在此使用的术语仅是示例性的，并不意图限制所要求保护的发明。另外，如在包括所附权利要求书的说明书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数，并且除非明确指出，否则对特定数值的引用至少包括该特定值。当在另一个实施例中表示范围时，该范围在此可以表示为“大约”或“近似”另一个特定值。此外，应当理解，除非另外指出，否则本文所述的尺寸和材料特性是作为示例而非限制，并且是为了更好地理解合适用途的样本实施例，以及取决于特定的应用，所述值以外的变化也可以在本发明的范围内。

本发明在其应用中不限于所阐述的结构细节和组件的布置。在以下描述中或者在以下描述中示出或者在附图中示出。本发明能够有其他实施例并且能够以各种方式被实施或执行。同样地，本文中出于描述的目的而使用的措词和术语不应视为限制性的。“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变体以及其他项目的使用。

现在将详细参考本发明的优选实施例。

将组织块和从组织块切下的切片注入石蜡，从而完全替代组织的细胞结构的水分。石蜡固有地不支持细菌和真菌的生长，从而确保包埋生物材料的长期稳定性。

沉积在显微镜载片、玻璃或塑料上的靶标蛋白为细菌或真菌拮抗剂提供了丰富的食物来源。另外，蛋白质的抗原位点容易被氧化，从而有效地使检测抗体与蛋白质结合的能力无效。许多随后的反应结合位点都是羟基，其可通过与空气中的酸和碱反应而被破坏。典型的，含有蛋白质沉积物的载片被储存在低于支持微生物生长的温度下。但是，这样的约束限制了沉积物的有效利用。另外，沉积有蛋白质的载片被包装在真空密封的容器中，以防止氧化破坏。未保护的沉积有蛋白质的载片的露天保持期限为2至5天之间，具体取决于环境温度和空气中的污染物水平。

与无机染料的化学结构独特地发生反应的靶标也易于氧化并与空气传播的材料发生反应。此类染料反应物靶标包括苏木素、曙红和大多数特异染料的组。这些染料的靶标被设计为仅与一种染料发生单一反应。大多数情况下，生物学靶标并不能提供这种单一性，但是化学结构可以提供。因此，本发明通过提供一种方法来提供一种解决方案，该方法用于选择性地施加生物材料以及靶标，以屏蔽它们免受任何类型的显微镜载片上的任何类型的降解。

在本发明的一个实施方式中，将石蜡与溶剂共混以在室温下，将材料状态从固体改变为液体。共混物使用帕拉普拉斯特X-tra(Paraplast X-tra)或与二甲苯或绿色二甲苯相当的替代品：脂肪族溶剂，例如二甲苯酚，以降低粘度并减慢沉积后的固化速度。在另一个实施例中，可以选择不限于甲苯、油漆稀释剂、松节油或丙酮和煤油的50:50混合物的溶剂。

在另一个实施方式中，将固体石蜡在高于石蜡熔融温度的、不超过75℃的温度下熔融直至液体，然后缓慢加入脂肪族溶剂直至观察到饱和点(形成固体)。使混合物冷却至45℃，然后缓慢添加更多的脂肪族直至完全澄清。

在另一个实施方式中，上述石蜡涂覆层施加在生物材料上，并且特殊的染色反应性沉积物先前施加到涂覆在显微镜载片的粘合剂上，其中生物材料可以包括但不限于蛋白质、肽、结合蛋白质、蛋白质包裹的珠、肽包裹的珠、或结合包裹的珠，并且特异的染色反应性端基，其独特地捕获了一种特异染色材料，该染色材料与所施加的抗体和次级染色试剂反应。

在另一个实施方式中，可以将石蜡层沉积在施加有粘合剂的显微镜载片上，其包括但不限于：喷涂、喷墨沉积、转移印刷(例如移印)、丝网印刷和气相沉积。在所有沉积方法中，石蜡层的厚度都必须小于5um，以确保在染色过程的石蜡去除步骤中，所有石蜡(屏蔽层和组织切片的包埋)都可以被溶解并带走。与沉积过程/方法无关，石蜡的标准是：

·薄层，优选不厚于5微米，

·熔融温度低于60℃，优选低于56℃，在暴露于二甲苯或二甲苯类(脂肪族替代物)溶剂时溶解，以及，

·具有与包埋石蜡相似的环境温度硬度。

在另一个实施方式中，组织块包埋石蜡材料可以包括但不限于赛默飞世尔(Thermo Fisher)的TissuePrep和TissuePrep2，熔点为56℃，徕卡(Leica)的Paraplast和Paraplast plus，熔点为56℃，徕卡(Leica)的Paraplast X-tra，熔点为50-54℃。Paraplast X-tra特别加入了丁基化羟基甲苯，一种酚类抗氧化剂，以减少蛋白质、肽和无机靶标的氧化降解。

在另一个实施方式中，每种都是纯化的石蜡、合成聚合物和其他材料的混合物，以确立熔融温度、硬度和粘度。石蜡固有的特性不支持微生物的生长在另一个实施例中，特异染色可包括但不限于：阿尔新蓝(Alcian Blue)、苯胺蓝-耐光橙G溶液(Analine Blue-Orange G Solution)、偶氮卡红染色(Azan Stain)、比耳朔夫斯基银染(Bielschowskysilver stain)、布朗本-革兰氏染色(Brow&Benn-Gramm Stain)、焦油紫(Cresyl Violet)、二氨基联苯胺(DAB)、黑色素染色(Fontana Masson)、戈登-斯威特浸银(Gordon andSweet's silver staining)、；戈塞特六氨银染色法(Grocett's Methanamine silvermethod)、霍尔胆红素染色法(Hall's Bilirubin stain)、琼斯六胺银法(JonesMethanamine silver method)、劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue)、劳克坚牢蓝-焦油紫(Luxol Fast Blue-Cresyl Violet)、黏卡红(梅耶法)(Mucicarmine(Mayer's Method))、穆勒-莫里胶体铁(Muller-Mowry colloidal Iron)、耐光橙G(Orange G)、核固红(NuclearFast Red)、带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏(PAS with Diastase Digestion)、过碘酸雪夫氏(PAS)(Periodic Acid Schiff(PAS))、磷钨酸(Phosphotungstic Acid)、苏木素(Haematoxylin)、天狼星红(Picro Sirius Red)、酸化甲苯胺蓝(Toluidine BlueAcidified)、一步三色戈莫理氏染色(Trichrome-Gomoris One-Step)、马森三色染色(Trichrome-Masson's)、维多利亚蓝(Victoria Blue)、钙盐染色(Von Kossa)、魏格特雷琐辛品红(Weigert's Resorcin Fuchsin)、魏格特铁苏木素(Weigert's IronHaematoxylin)、萋-尼氏染色法(Zell-Neelsen Method)。

在另一个实施方式中，靶标可以选择，但不限于颜料着色的沉积物，例如黑色和白色，但是可以包括任何颜料颜色。

在另一个实施方式中，可以在其上施加上述石蜡涂覆层的显微镜载片可以选自但不限于玻璃、塑料或任何聚合物材料。在另一个实施例中，石蜡可以是纯化的且无水。

在另一个实施方式中，所得的显微镜载片可以被后加热，以将石蜡颗粒熔化和/或共混成整体表面涂覆层，从而密封沉积物和围绕沉积物的载片表面。

在又一个实施方式中，在沉积石蜡之后加热所得的显微镜载片，以迫使溶剂从石蜡中出来，从而确保其返回硬化状态。这必须从载片的石蜡一侧开始，优选使用红外光。从上到下熔化石蜡可确保溶剂能够上升并从石蜡中蒸发而不会有阻碍。结果如图1所示，该图示出了熔化的石蜡如何确保其沉积物边缘的良好密封。

附图说明

图1这是在生物材料和化学沉积物上选择性施加的石蜡屏蔽层的剖视图。石蜡在沉积后已经融化，以驱出使石蜡变为液体所需的溶剂，并将边缘密封于载片和/或载片粘合剂涂覆层。

实施例

下面提到的实施例是为了阐明本发明的工作方式而举例说明的，不应解释为限制本发明的范围。

实施例1

喷涂施加方法：

用低气流喷涂在表面上。优选低液体与空气的混合。混合物通过掩膜被喷涂到载片上，以涂覆PRS靶标。典型地需要经过1-2次形成厚度小于5微米的层。将石蜡混合物储存器和喷头都加热到略高于56℃，以确保石蜡为液体，并在从喷头飞向载片的过程中维持为液体。来自喷头的喷洒覆盖范围大约0.375英寸，但对于较小的屏蔽区域也可使用掩模。后红外再加热确保100％密封。

实施例2

丝网印刷方法：

通过使电流经过两个平行侧边之间的丝网来加热不锈钢丝网。丝网的温度需要略低于石蜡熔化温度，以使石蜡不会渗透至丝网的底侧。基本上，石蜡更表现为糊剂而不是液体。PRS需要再加热以确保100％密封。

实施例3

喷墨方法：

喷墨头需要在打印头内具有集成加热器，以将石蜡保持在液态。载片上的后加热循环将确保100％密封。

实施例4

辊转印方法：

加热的辊将石蜡膜从加热的储存器中拉到辊上。然后，辊用拉毛辊涂刷墙壁的方式大致一样的方式将石蜡膜转印到载片上。载片上的后加热循环将确保100％密封。

Claims (16)

1.一种具有石蜡屏蔽涂覆层的显微镜载片，所述石蜡屏蔽涂覆层用于在所述显微镜载片上涂覆生物材料和/或无机沉积物，其中所述石蜡屏蔽涂覆层通过如下步骤涂覆在所述显微镜载片上：

(a)在60至75℃的范围内的温度熔化固体石蜡直至所述固体石蜡熔化成液体石蜡；

(b)将溶剂加至步骤(a)中获得的所述液体石蜡直至获得饱和混合物；

(c)使步骤(b)中获得的所述饱和混合物在30至33℃之间冷却，然后缓慢加入溶剂，直至获得澄清的石蜡液体；

(d)将步骤(c)中生成的所述澄清的石蜡液体层施加在所述显微镜载片上的所述生物材料和/或无机沉积物上，以在所述显微镜载片的全部或选择区域上形成所述石蜡屏蔽涂覆层；以及

(e)施加红外热以从所述石蜡屏蔽涂覆层蒸发所述溶剂，从而使其返回到硬化和固体的状态。

2.根据权利要求1所述的显微镜载片，其中所述固体石蜡是纯化并且无水的。

3.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中所述固体石蜡的熔融温度为50-60℃。

4.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中所述石蜡选自具有56℃的熔融温度的赛默飞世尔TissuePrep或TissuePrep2，具有56℃的熔融温度的徕卡Paraplast或Paraplastplus，或具有50-54℃的熔融温度的徕卡Paraplast X-tra。

5.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中所述溶剂选自二甲苯，脂肪族二甲苯替代物，甲苯，涂料稀释剂，松节油，丙酮和煤油的50:50混合物，或所列溶剂的混合物。

6.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中所述步骤(d)的石蜡屏蔽涂覆层厚度在1至5微米之间。

7.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中所述步骤(d)的石蜡屏蔽涂覆层厚度在2至3微米之间。

8.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中所述生物材料选自组织切片，蛋白质相关样品，或其组合；所述无机沉积物选自无机靶标、成像参考靶标，或其组合。

9.根据权利要求8所述的显微镜载片，其中所述蛋白质相关样品选自蛋白质，肽，结合蛋白质，蛋白质包裹的珠，肽包裹的珠，或结合包裹的珠，其与所施加的抗体和次级染色试剂反应。

10.根据权利要求8所述的显微镜载片，其中所述成像参考靶标是颜料着色的沉积物。

11.根据权利要求8所述的显微镜载片，其中所述成像参考靶标包括黑或白颜料。

12.根据权利要求8所述的显微镜载片，其中所述无机靶标为与选自阿尔新蓝，苯胺蓝-耐光橙G溶液，偶氮卡红染料，比耳朔夫斯基银染料，布朗本-革兰氏染料，焦油紫，二氨基联苯胺，黑色素染料，戈登-斯威特浸银染料，戈塞特六氨银染料，霍尔胆红素染料，琼斯六胺银染料，劳克坚牢蓝，劳克坚牢蓝-焦油紫，黏卡红，穆勒-莫里胶体铁，耐光橙G，核固红，带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏，过碘酸雪夫氏(PAS)，磷钨酸，苏木素，天狼星红，酸化甲苯胺蓝，一步三色戈莫理氏染料，马森三色染料，维多利亚蓝，钙盐染料，魏格特雷琐辛品红，魏格特铁苏木素，萋-尼氏染料的染料反应的化合物。

13.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中在步骤(d)中，在可以通过喷涂施加法，喷墨沉积法，转移印刷法，丝网印刷法和气相沉积法来施加步骤(c)中得到的所述澄清的石蜡液。

14.根据权利要求1或2所述的显微镜载片，其中所述显微镜载片是玻璃或塑料载片。

15.根据权利要求1所述的显微镜载片，其中所述石蜡屏蔽涂覆层用于保护所述显微镜载片上的所述生物材料和/或无机沉积物免受氧化和/或微生物攻击，以及无机物免受导致氧化和/或空气传播的酸和/或腐蚀性物质的反应。

16.根据权利要求1所述的显微镜载片，其中所述石蜡屏蔽涂覆层用于增加所述显微镜载片上的所述生物材料和/或无机沉积物的保存期限。

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