JP4840695B2 - 組織薄切片パラフィンマスキング方法、及び装置 - Google Patents

Description

本発明は生体の病理組織細胞等を顕微鏡等で観察する際に作製される、ガラス基板に貼りつけた細胞組織薄切片（以下、「組織片」という）をパラフィンで被覆する方法、及び装置に関する。

生体の病理細胞組織等を顕微鏡観察するための組織片標本を作製するためには、まず病理組織を所定の手順でパラフィン浸透かつパラフィン包埋した通常パラフィンブロックと呼ばれる標本サンプルを作製し、このパラフィンブロックからミクロトームなどの薄切り用機器を使用して３ミクロンメートル程度の厚みの組織片を作製する。組織をパラフィン包埋する理由は顕微鏡で組織観察可能な厚さ３ミクロンメートル程度の組織片標本を作るための薄切りがし易いことと細胞組織の経時劣化を防ぐためである。しかしながらこのサンプルから一度に多量の組織片標本を作製すると大気による酸化や湿度などの修飾を受け組織構造の経時劣化が生じるため長期保存ができず、組織観察の都度、必要な組織片をパラフィンブロックから薄切りする手間が必要であった。本発明はパラフィンブロックから一度に多数の組織片標本を作製しても組織劣化の無い長期保存が可能な組織片を作製する方法、及び装置を提供するものである。

パラフィンブロックから３μｍ〜５μｍほどの厚さに薄切りされた組織片は通常、水のなかに浮かべて伸展しながら幅２．５ｃｍ、長さ７．５ｃｍ程度のガラス基板に付着させ、そのあと水分が無くなるまで乾燥される（この組織片を付着させたガラス基板を以下、「ガラス標本」という）。通常、パラフィンブロックから薄切りされた組織片はこのガラス標本状態でまとめて専用ケースに入れられ大気中または低温庫などで保管される。実際に顕微鏡観察で使用する際はこのガラス標本からキシレンなどの脱パラフィン溶剤を用いてパラフィンを除去したあと、組織を判別し易くするための染色工程などを経て観察標本となる。前記乾燥されたガラス標本上の組織片はパラフィンが浸透しているものの薄切り切断された表面は大気に暴露されており酸化、湿度などにより修飾を受けて細胞組織の経時劣化が生じ、正しい組織診断を阻害する欠点があった。

このガラス標本をそのまま長期間、組織の経時劣化無く保存する実用的な方法や装置はこれまで存在しなかった。
ごく稀に、このガラス標本の経時劣化を防止する方法として簡便に用いられるのは、ガラス標本ごと融解パラフィン浴に浸漬してパラフィン包埋する方法である。しかしながらこの方法では不必要なガラスの裏面、側面までパラフィンが付着し、また、付着厚さも制御できず比較的厚く付着するため、この後の脱パラフィン工程で大量の溶剤が必要となり、溶剤費用がかかるばかりか、多量の廃溶剤が排出されるので環境負荷が大きく、脱パラフィン工程時間も多くかかるという欠点を有していたため実用性に乏しく普及するには至っていない。

解決しようとする課題はガラス標本を長期間、組織細胞の変質、劣化が少なく保存できる方法、及び装置を提案するもので、具体的には極薄のパラフィン膜で組織片を被覆（以下、「マスキング」という）する方法、及び装置を提供するものである。ガラス標本上の組織片をパラフィンでマスキングする場合、実用的にはパラフィン膜厚を３０μｍ以下、望ましくは２０μｍ以下であって且つガラス標本上の組織片の部分のみを選択的にマスキングすることが望ましい。
本発明によれば組織片の部分のみ均一なパラフィン薄膜でマスキングできるのでパラフィン使用量を少なくできるばかりか、脱パラフィンに必要な溶剤量も少なくでき、環境負荷を小さくできるとともに脱パラフィン工程所要時間をも短縮できるパラフィンマスキングを可能にするものである。

本発明はガラス標本の組織片を付着させた面に、融解パラフィンを保持する回転ロール（以下、「転写ロール」という）を密着回転させることにより、該パラフィンをガラス標本の組織片上に転写させることで組織片を３０μｍ以下の極薄の均一な厚みでパラフィンマスキングする方法、及び装置を提供する。

すなわち、本発明はパラフィンブロックから薄切りされた組織片を付着させたガラス基板、すなわちガラス標本をまず転写ロール上部に設けられた上下昇降手段を有する基板ホルダーに挿入、セットする。基板ホルダーにはガラス標本の両端を把持、ガイドするような「Ｌ」字型又は「コ」の字型断面形状の一対の案内手段（以下、ガイドレールという）が設けられており、ガラス標本は組織片を付着させた面を下にして、そのガイドレールに、水平にかつ組織片の位置が転写ロール最上部より奥になる位置まで挿入される。ガイドレールは、好ましくはガラス標本の全長を受け入れる挿入方向長さを有し、挿入されたガラス標本はガイドレールに沿って摺動可能である。なお、ガイドレールの代わりに円柱部材や回転可能なロール部材を列状に並べてもよい。転写ロールにはこれを回転させる駆動手段が設けられている。

転写ロールはその下部が常時、融解パラフィン浴に浸漬されており、転写ロールの回転により転写ロール表面には常時融解パラフィンが薄膜状に付着して上部に持ち上げられている。融解パラフィン浴にはパラフィンを融解するための加熱手段及び温度調節手段が設けられている。

該基板ホルダーには、転写ロールの最上点位置付近の上部にあって且つ挿入されたガラス標本の上面に近接して送り出しロールが設けられており、上下昇降手段により基板ホルダーを押し下げた際に送り出しロールがガラス標本上面すなわち組織片が付着していない面側に接触しガラス標本を転写ロールに押し付けると同時に、転写ロールと同期して送り出しロールが回転するよう転写ロールと送り出しロールの軸にはクラッチ手段としてそれぞれ一対の噛み合い歯車が設けられている。噛み合い歯車のピッチ円径はそれぞれのロールの外径にほぼ等しくなるよう設定される。なお、クラッチ手段は転写ロールの回転を送り出しロールに伝え得る構成であれば、噛み合い歯車以外の手段であってもよい。また、転写ロールの回転速度（周速度）と送り出しロールの回転速度（周速度、これは後述するガラス標本の送り出し速度に等しい）は概ね同一であることが好ましいが、例えば、転写ロールの外径と送り出しロールの外径を変えたり、噛み合い歯車のギア比を１以外に変えるなどして転写ロールの回転速度（周速度）とは異なる線速度でガラス標本が送り出されるようにしてもよい。
基板ホルダーには上下昇降機構としてのバネ機構を含み、通常はそのバネ機構の付勢力によりガラス標本が転写ロールに触れないような位置に基板ホルダーが保持される。

この状態でガラス標本を基板ホルダーに挿入セットした後、把手によりバネ機構の付勢力に抗して基板ホルダーを押し下げるとガラス標本が転写ロール上面に適当な接触圧力で密着せしめられ転写ロール表面の融解パラフィンがガラス標本上に転写されて組織片をパラフィン薄膜でマスキングすることができると同時に噛み合い歯車により送り出しロールが回転し、ガラス標本がガイドレールに沿って水平に転写ロールの回転方向すなわちガラス標本挿入側に送り出される。
転写ロールの回転方向をガラス標本が手前に送り出されるようにすれば、最初にセットしたガラス標本位置から奥側の部分がパラフィンでマスキングされ、組織片を含む必要最小限の部分パラフィンマスキングが可能となる。ガラス標本に接触する送り出しロールの表面材質はゴム系材質や軟質プラスチックなどが望ましい。

もちろん上記基板ホルダーを用いず、人の手でガラス標本を直接回転する転写ロール表面に接触させながらパラフィンを転写させつつ手前に移動させる方法でも同様の効果は得られるが、個人差を生じやすく、パラフィン転写膜の均一性、繰り返し再現性、操作性の点で上記したような基板ホルダーを使用する方法がより望ましい。

通常、ガラス標本の幅は接触する転写ロールの幅より若干小さめであるため、基板ホルダーが下降してガイドレールに支持されたガラス標本を転写ロールに接触させる前に、ガラス標本を把持するガイドレールが先に転写ロールと干渉してしまうのでガイドレールの一部を切り欠くことが必要である。

組織片をマスキングするパラフィン膜の厚さは薄いほうがパラフィン原料や脱パラフィン溶剤のコストの点で望ましいが、薄すぎると組織が部分的に露出したり、保存効果が得られにくい。発明者等の実験では通常１０μｍ〜３０μｍ程度が望ましい。

組織片をマスキングするパラフィン膜の厚さを調節する方法はいくつかある。

まず融解パラフィンの温度である。使用するパラフィン自体の融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ）よりも高くするほど転写ロールに付着する膜厚は薄くなる。発明者等の実験ではパラフィン浴を融解温度より１０〜４０℃程度高くすることが望ましい。これ以上高すぎると組織片がダメージを受けることと融解パラフィンの粘度が小さくなりすぎて転写膜厚にばらつきが生じやすいので好ましくない。

次は転写ロール表面に付着して持ち上がってくるパラフィン膜厚を制御する通常ドクターナイフと呼ばれる転写ロール表面との隙間調整冶具を用いる方法である。転写ロール表面とドクターナイフの隙間間隔を調整することで転写ロールに付着したパラフィン膜厚を調整でき、結果としてガラス標本に転写されるパラフィン膜厚が調整される。

転写ロールの外径、回転速度もガラス標本に転写されるパラフィンの膜厚に影響する。外径が大きく、回転速度が遅い場合はロール表面に付着した融解パラフィンがガラス標本に接触するまでの時間が長く、途中で重力落下しやすく結果的に転写膜厚が薄くなる。一方、接触までの時間が長すぎると転写ロール表面の融解パラフィンが大気中で冷却凝固しやすく、厚い膜のままガラス標本に転写される傾向が生じる。この兼ね合いから転写ロールの表面周速度の適切な値が決められるが、発明者等の実験では操作性、生産性も含めて転写ロール表面周速度は毎分５０〜３００ｃｍ程度が望ましい。

このほか転写ロール表面周速度とガラス標本の送り出し線速度の比を１以外に変えることでも転写膜厚を変えることができる。この比は噛み合い歯車の比を変えることで容易に変えることができる。ガラス標本の送り出し線速度を転写ロール表面周速度よりも大きくすれば転写膜厚は容易に薄くできる。ただ、両者の比を大きくし過ぎると転写膜厚にムラが生じるので要注意である。例えば５倍以下、好ましくは１〜３倍の範囲にすることができる。但し、転写ロール表面周速度によってはこの範囲外でもよい。

接触圧力やガラス標本自体の温度も膜厚に影響する。接触圧力は強いほど一般に膜厚は薄くなるが、組織片への悪影響が出やすいので注意が必要である。ガラス標本の温度も高い程転写される膜厚は薄くなるが、膜厚があまり薄いと組織片をすべてマスキングすることが困難となる。また、ガラス標本温度は通常、常温でよいが、膜厚を極端に薄くしたい場合はガラス標本を予熱すると効果がある。

図１はＭｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ ５５〜５７℃のパラフィンを使用した場合のパラフィン浴の温度を横軸、ガラス標本への転写膜厚を縦軸にして両者の関係を転写ロールの周速度を７８．５ｃｍ／ｍｉｎで測定したグラフである。この場合、転写ロールの外径５０ｍｍ、パラフィン浴への浸漬長さを全周の３分の１とし、ロールとドクターナイフの隙間を３０μｍとした。パラフィン転写膜厚はパラフィン温度が高いほど薄くなることが判る。パラフィン浴温度８０℃、ロール周速度を７８．５ｃｍ／ｍｉｎにすればパラフィン転写膜厚は２０μｍ程度となり、実用的なパラフィンマスキングが得られる。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
図２は本発明の実施の形態を示す装置の正面図である。図３は同側面図である。

ガラス標本１には下面に組織片５が貼り付けられ、それ自身が上下昇降機構１５を有する基板ホルダー２に設けられたガイドレール３のガイド溝４に組織片５のすべてが転写ロール８との接触位置より奥になるよう挿入、セットされる。該基板ホルダー２には送り出しロール６が設けられており、送り出しロール６と転写ロール８の軸にはクラッチ手段として噛み合い歯車７及び９が設けられて基板ホルダー２が下降した際、噛み合い歯車７と９が噛み合って送り出しロール６が転写ロール８と逆回転するようになっている。同時に送り出しロール６と転写ロール８がガラス標本１を狭持し、ガラス標本１を挿入側に送り出す役割をする。

このとき、送り出しロール６の軸心を転写ロール８の軸心より１〜３ｍｍ程度挿入方向に変位させておくとガラス標本１が送り出された際、最後部が転写ロール８から離れやすくなり、最後部のパラフィン転写膜厚が厚くなる、いわゆるバルキング現象を防ぐことができる。

転写ロール８の下部は融解パラフィン浴１０に浸漬されており、回転により転写ロール表面に融解パラフィンが付着して薄膜状に持ち上げられ、最上部でガラス標本１に転写される。
１１は加熱ヒーター、１２はヒーター温度調節装置、１３はパラフィン浴槽、１４は転写ロール８の駆動装置、１５は基板ホルダー２の上下昇降機構である。上下昇降機構１５にはガラス標本１を転写ロール８に接触させる際の接触圧力を調整するバネ機構１８が組み込まれており、通常はガラス標本１が転写ロール８に接触しないような位置にバネ機構１８の付勢力で保持される。１９は基板ホルダー２全体を人手で上下昇降させるための把手である。

把手１９を押し下げ、上下昇降機構１５により基板ホルダー２を下降させてガラス標本１を転写ロール８に接触させるとパラフィン膜がガラス標本１に転写されると同時にガラス標本１を送り出しロール６と転写ロール８で狭持し、両者の回転によりガラス標本１を水平に挿入側に送り出す。１６は転写ロール表面のパラフィン膜厚を調整するドクターナイフ、１７は転写ロール表面に常時接触して転写ロールに固着したパラフィンをそぎ落とすスクレーパーを示す。

図２、３において幅２５ｍｍ、長さ７５ｍｍ、厚さ１ｍｍのスライドガラスに厚さ３μｍの組織片を付着させたガラス標本を用いて外径５０ｍｍ、表面長さ３０ｍｍのアルミ製転写ロールを回転数毎分５回転（周速度７８．５ｃｍ／ｍｉｎ）に設定して融解点５５〜５７℃のパラフィンを８０℃に制御した融解パラフィン浴にロール全周の３分の１を浸漬してガラス標本にパラフィンを転写したところ、転写パラフィンの厚みは２０μｍ±３μｍの範囲内に収まり、組織片を均一にパラフィンでマスキングすることができた。
そのときの転写ロールとドクターナイフとの隙間は１５μｍに調整された。また、送り出しロールの外径は２５ｍｍ、表面長さ２５ｍｍ、表面材質は軟質ゴムを用いた。

パラフィン融解温度とパラフィン転写膜厚を示すグラフである。 本発明を示す装置の正面図である。 本発明を示す装置の側面図である。

符号の説明

１ ガラス標本
２ 基板ホルダー
３ ガイドレール
４ ガイド溝
５ 組織片
６ 送り出しロール
７ 噛み合い歯車
８ 転写ロール
９ 噛み合い歯車
１０ 融解パラフィン浴
１１ 加熱ヒーター
１２ ヒーター温度調節装置
１３ パラフィン浴槽
１４ 駆動装置
１５ 上下昇降機構
１６ ドクターナイフ
１７ スクレーパー
１８ バネ機構
１９ 把手

Claims (6)

1. 組織薄切片を付着させたガラス基板を組織片付着側が下面になるよう保持し、基板上面に自由回転ロールを、基板下面に融解パラフィンを保持しながら回転する転写ロールを同時に密着せしめて基板を転写ロールの回転方向に沿って水平に移動させて基板下面の組繊薄切片をパラフィンで被覆することを特徴とするガラス基板のパラフィンマスキング方法。
2. 組織薄切片を下面に付着させたガラス基板を水平に移動させる送り出しロールを含み上下動可能な基板ホルダー、融解パラフィンを保持する転写ロールとこれを回転させる駆動手段、及び基板ホルダー内の基板と転写ロールとが接触したときに前記駆動手段の駆動力を前記送り出しロールに伝えるクラッチ手段を含み、基板ホルダーに基板を挿入しこれを下降せしめたときに、基板下面が転写ロールに接触して融解パラフィンが基板に転写されると同時に、基板を送り出しロールと転写ロールとで挟持し、送り出しロールまたは送り出しロールと転写ロールの回転により水平に移動させて基板ホルダーから送り出すことを特徴とするパラフィンマスキング装置。
3. 基板ホルダーが基板を受け入れてこれを保持する案内手段を有し、クラッチ手段が、送り出しロールの回転軸に設けられた第１の噛み合い歯車と転写ロールの回転軸に設けられた第２の噛み合い歯車とを有し、基板ホルダーを下降せしめたときに、転写ロールの上面が案内手段内の基板の下面に密着するとともに、前記第１の噛み合い歯車と前記第２の噛み合い歯車とが互いに噛み合うことにより駆動手段の駆動力を送り出しロールに伝えてこれを回転させ、案内手段内の基板を転写ロールの回転に合わせて水平方向に移動させる請求項２に記載のパラフィンマスキング装置。
4. さらに、前記上下昇降機構が、基板ホルダーが転写ロールから離れるように上方に向けて付勢するバネ機構を含み、基板ホルダーがバネ機構の付勢力に抗して基板ホルダーを押し下げるための把手を含む請求項３に記載のパラフィンマスキング装置。
5. 組織薄切片を付着させた基板を水平方向に可動に保持するための基板案内手段と基板案内手段の上方に軸支され、回転させたときに案内手段内の基板を水平方向に移動させる送り出しロールとを含む垂直方向に可動な基板ホルダー、
   パラフィンを融解させるための加熱手段を備えた融解パラフィン浴、
   少なくともその表面の一部が融解パラフィン浴内に位置し送り出しロールと実質的に平行に基板案内手段の下方に軸支された転写ロール、
   転写ロールを回転させるための駆動手段、
   基板ホルダーを、前記基板が転写ロールに接触しない第１の位置と転写ロールに接触する第２の位置との間で上下に移動させる上下昇降機構、及び
   送り出しロールの回転軸に設けられた第１の噛み合い歯車と転写ロールの回転軸に設けられた第２の噛み合い歯車とを有し、
   前記バネ手段により第１の位置に保持された基板ホルダーを前記把手により前記第１の位置から前記第２の位置に押し下げたときに、転写ロールの上面が案内手段内の基板の下面に密着するとともに、前記第１の噛み合い歯車と前記第２の噛み合い歯車とが互いに噛み合うことにより駆動手段の駆動力を送り出しロールに伝えてこれを回転させ、案内手段内の基板を転写ロールの回転に合わせて水平方向に移動させるように構成された請求項４に記載のパラフィンマスキング装置。
6. 送り出しロールの軸心を転写ロールの軸心よりも基板挿入方向に変位させて設けた請求項５に記載のパラフィンマスキング装置。

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