CN110731982A - 一种花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物提取物领域，公开了一种花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法。本发明花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法包括一提、二提、提取浓缩、分离柱预处理、吸附、水洗、醇洗及解吸、浓缩、干燥、等步骤，提取溶剂用量少，且采用套用提取方式，即第一批的二提滤液套用在第二批的一提，作为第二批一提的提取溶剂，有效减少了溶剂的投入量，缩短了提取浓缩时间，节约能耗及成本，且制备方法工艺过程简单，操作方便，容易实现工业化，其总花色苷含量可达到65％～75％，花色苷产出/投入的总收率≥65％，HPLC指纹图谱符合欧洲药典(EP)的规定。

Description

一种花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法
技术领域
本发明涉及植物提取物领域，具体是涉及一种花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法。
背景技术
欧洲越橘提取物是以成熟的欧洲越橘浆果或其加工余料为原料，经过提取、分离、干燥等系列工艺得到的深紫色粉末，其主要活性成分为花色苷，共有15种，分别为：
Figure BDA0002304786020000011
欧洲越橘提取物花色苷具有促进视红素再生、改善视力、改善微循环、抗氧化、抗癌、保护血管、抗溃疡、抗炎、抗痉挛、镇静等作用，临床上主要用于治疗眼科疾病、炎症、过敏、高血压、糖尿病等症状，还可用于治疗腹泻，减轻晕车和消化不良等。欧洲越橘提取物被作为植物原料药载入欧洲药典(EP)，并作为食品补充剂载入美国药典(USP)中。EP及USP均对欧洲越橘提取物的总花色苷含量做出规定：以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物计，EP规定欧洲越橘提取物的总花色苷含量在32.4％-39.6％之间，USP规定欧洲越橘提取物的总花色苷含量≥36.0％。
目前，市售用于药用的欧洲越橘提取物中总花色苷含量只有36％，由于总花色苷含量不高，提取物中还含有大量的未知组分，使得花色苷药效的发挥受到了限制，这无疑就增加了药物服用量。因此制备更高纯度花色苷的欧洲越橘提取物具有非常重要的意义。
申请号201110184914.4的中国专利申请公开了一种从越橘上提取含有花青甙的提取物的方法。该方法针对花色苷受热易分解的特性，将浸泡液及分离液采用纳滤膜进行浓缩，替代了传统的减压加热浓缩方式，可避免在浓缩过程中加热所造成的花色苷分解，有效的保护了花色苷。但该方法有以下缺陷：①纳滤膜对单价离子、小分子酸碱、醇的透过率只有30-80％，这就需要设计二级甚至多级的纳滤膜；②浸泡液中大量的杂质组分容易造成纳滤膜堵塞，需要频繁清洗更换纳滤膜，成本高；③该方法得到的欧洲越橘提取物花色苷也只有34％-39％，且提取物花色苷的指纹图谱不明确。
申请号201310461582.9的中国专利申请公开了一种从欧洲越橘中提取花色苷的方法。以欧洲越橘为原料，以9倍原料量的乙醇加热回流提取2-3次，减压浓缩，D101树脂吸附、解吸、浓缩、干燥得粗提物，粗提物再用丙酮萃取，得到总花色苷含量约70％的欧洲越橘提取物。该方法得到的欧洲越橘提取物虽然纯度较高，但是产品收率只有0.5％，且提取物中花色苷的指纹图谱不明确。另外，萃取所用的丙酮为有毒溶剂，产品有严格的限量要求，容易导致产品丙酮残留超标。
申请号201410253728.5的中国专利申请公开了一种欧洲越橘提取物及其制备方法。该方法以欧洲越橘为原料，加入果浆3倍量体积分数为60％的酸化乙醇，50℃加热回流提取2次，浓缩后用自制的以聚苯乙烯为主要骨架的大孔树脂进行吸附，再用酸性水洗，酸性乙醇、甲醇或丙酮解吸，喷雾干燥得到总花色苷含量在55％-95％的欧洲越橘提取物，且谱图符合欧洲药典规定。该方法得到的欧洲越橘提取物尽管花色苷纯度高，但采用加热回流方式进行提取容易导致作为主要活性成分的花色苷受热分解，影响花色苷总收率。其次，提取、水洗、解吸工艺过程中均用盐酸对溶剂进行酸化，容易把氯离子带入产品中，导致产品氯离子超标。
申请号201710522268.5的中国专利申请公开了一种欧洲越橘提取物的制备方法。该方法以欧洲越橘为原料，用果实重量3倍(二提4.5倍)体积量的95％乙醇常温搅拌提取，一提时需加硫酸进行提取，提取结束后再用饱和柠檬酸钠溶液调节提取液pH为3.0-3.5，离心过滤，浓缩，浓缩液再加水稀释得料液，料液用HPD100树脂吸附，pH为3.0-3.5的柠檬酸水溶液洗脱，80％-90％乙醇解吸，解吸的料液经浓缩、干燥得欧洲越橘提取物。该方法工艺过程简单，容易操作，便于工业化生产，但提取过程中乙醇用量大，乙醇浓度高，使得后续提取浓缩成本高，且得到的欧洲越橘提取物总花色苷含量较低，仅为37％。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供了一种花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法。本发明方法制备的欧洲越橘提取物总花色苷质量分数在65％-75％之间，且HPLC指纹图谱与欧洲药典(EP)中的指纹图谱一致。
为达到本发明的目的，本发明花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法包括以下步骤：
(1)一提：以欧洲越橘冻果为原料，粉碎，按料液质量体积比(W:V)1：2.0～3.0加入体积分数为60％～85％的酸化乙醇溶液，搅拌提取，提取结束后离心过滤，得一提滤液及一提滤渣，其中，所述酸化乙醇溶液是用苹果酸或柠檬酸调节pH至3～4；
(2)二提：一提滤渣转移至提取罐中，加入与步骤(1)中同等体积和浓度的酸化乙醇溶液，搅拌提取，提取结束后离心过滤，得二提滤液及二提滤渣；
(3)提取浓缩：取一提滤液，水浴减压浓缩，回收乙醇，离心过滤，得提取浓缩液，快速降至25℃或以下；
(4)分离柱预处理：以聚酰胺大孔树脂填装分离柱，填装后用85％～95％乙醇洗净树脂，再用纯化水洗脱至流出液酒精计检测酒精度≤3.0％；
(5)吸附：将提取浓缩液通过分离柱进行吸附，流速控制为1～3BV柱/h，花色苷的单位吸附量控制为6～21mg/ml(1ml吸附树脂中吸附花色苷的量为6～21mg)，其中，所述1～3BV柱/h是指1h通过提取浓缩液的体积为树脂体积的1～3倍；
(6)水洗：吸附结束后，用2～5BV柱的纯化水洗柱，去除杂质，其中，所述纯化水用苹果酸或柠檬酸调节pH至3～4；
(7)醇洗及解吸：水洗结束后，先用0.5～1.0BV柱体积分数为30％～70％的乙醇洗脱，流速控制为2～4BV柱/h，洗脱液回收，再用6～8BV柱体积分数为70％～95％的乙醇解吸，解吸流速控制为2～4BV柱/h，其中，所述乙醇用苹果酸或柠檬酸调节pH至3～4；
(8)浓缩、干燥：将解吸液水浴减压浓缩至物料无流动性，取出后放入真空干燥箱中真空干燥，即得花色苷含量高的欧洲越橘提取物。
进一步地，所述步骤(1)和(2)中搅拌提取时温度为25±5℃，搅拌线速度≥50m/min。
进一步地，所述步骤(1)和(2)中二提滤液作为下一批一提的提取溶剂。
本发明所述步骤(2)中二提滤渣弃去，滤渣中花色苷质量分数≤0.05％。
经检测，所述步骤(3)中提取浓缩液中花色苷浓度为3.0～8.0mg/ml，乙醇残留量≤3.0％(GC法)。
进一步地，所述步骤(4)中树脂填充高度h：柱内径d＝2～12：1；优选地，所述步骤(4)中水洗流速控制为2～4BV柱/h。
优选地，所述步骤(5)中花色苷的单位吸附量控制为9～15mg/ml。
优选地，所述步骤(7)中先用体积分数为40％～60％的乙醇洗脱，再用体积分数为80％～90％的乙醇解吸。
进一步地，所述步骤(3)和(8)中减压浓缩是于60±5℃，-0.090～-0.100MPa条件下水浴减压浓缩。
进一步地，所述步骤(8)中真空干燥是在真空干燥箱中于50±5℃，-0.090～-0.100MPa条件下真空干燥。
本发明中，欧洲越橘提取物总花色苷含量的检测方法为高效液相色谱法(HPLC法)，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物(C21H21O11Cl)计，所述花色苷含量高的欧洲越橘提取物中总花色苷含量不低于65％。
进一步地，所述检测方法的分析条件为：
色谱柱：Zorbax Extend-C18，5μm，4.6*250mm
进样量：20uL
流动相：A相：色谱甲酸：水＝1:9
B相：色谱甲酸：水：色谱乙腈：色谱甲醇＝4：16：9：9
泵流速：1.0ml/min
检测波长：535nm
柱温箱：30℃
洗脱梯度：
Figure BDA0002304786020000061
与现有技术相比，本发明的优点如下：
(1)本发明欧洲越橘提取物的制备方法工艺过程简单，操作方便，容易实现工业化，且其总花色苷含量可达到65％～75％，花色苷产出/投入的总收率≥65％(即欧洲越橘提取物中花色苷的净量/冻果投入的花色苷净量≥65％)，HPLC指纹图谱符合欧洲药典(EP)的规定。
(2)本发明酸化乙醇溶液所用的苹果酸和柠檬酸均为越橘果实中的主要有机酸，作为越橘果实本身就含有的成分，加入柠檬酸或者苹果酸既保证了花色苷的稳定性，又避免了引入其它外物影响产品质量，工艺安全无污染。
(3)本发明提取溶剂用量少，且采用套用提取方式，即第一批的二提滤液套用在第二批的一提，作为第二批一提的提取溶剂，有效减少了溶剂的投入量，缩短了提取浓缩时间，节约能耗及成本，具有更强的市场竞争力。
(4)本发明通过控制大孔树脂中花色苷单位吸附量、水洗用水量以及解吸前后醇洗乙醇浓度，最大化的提高了总花色苷的含量及收率。
附图说明
图1是欧洲药典中欧洲越橘提取物的HPLC谱图；
图2是本发明中欧洲越橘提取物的HPLC谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例
以欧洲越橘冻果为原料，加入经苹果酸酸化后pH为3～4，体积分数为80％的乙醇，乙醇投入体积为冻果重量的2倍。25±5℃搅拌提取2次，搅拌线速度为75m/min。离心过滤，得一提滤液、二提滤液及二提滤渣。二提滤液转入下批，作为下批的一提溶剂用，二提滤渣(滤渣中花色苷质量分数≤0.05％)弃去。一提滤液于60℃、-0.095MPa条件下水浴减压浓缩，离心过滤，得提取浓缩液，快速降至25℃或以下。将提取浓缩液通过填充有聚酰胺大孔吸附树脂的分离柱进行吸附，流速2BV柱/h，花色苷的单位吸附量分别为6mg/ml。吸附结束后用3BV柱经苹果酸酸化后pH为3～4的纯化水洗，流速3BV柱/h。水洗结束后，用1BV柱经苹果酸酸化后体积分数为50％的乙醇洗，流速3BV柱/h。再用6BV柱经酸化后体积分数为85％的乙醇解吸，流速3BV柱/h，得解吸液。解吸液经于60℃、-0.095MPa条件下水浴减压浓缩，在真空干燥箱中于50℃、-0.090～-0.100MPa条件下真空干燥即得欧洲越橘提取物成品。
上述酸化溶剂所使用的酸为食品级DL-苹果酸，纯度98％。其在各工序中的添加量为：①提取：添加量为提取用乙醇体积的0.015％；②水洗：添加量为水洗用水体积的0.023％；③50％乙醇洗脱：添加量为所用乙醇体积的0.015％；④85％乙醇解吸：添加量为所用乙醇体积的0.01％。
对欧洲越橘提取物总花色苷含量进行检测，检测方法为高效液相色谱法(HPLC法)，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物计(C21H21O11Cl)计，所述检测方法的分析条件为：
色谱柱：Zorbax Extend-C18，5μm，4.6*250mm
进样量：20uL
流动相：A相：色谱甲酸：水＝1:9
B相：色谱甲酸：水：色谱乙腈：色谱甲醇＝4：16：9：9
泵流速：1.0ml/min
检测波长：535nm
柱温箱：30℃
洗脱梯度：
改变上述实施例中花色苷的单位吸附量、解吸前醇洗乙醇浓度、解吸乙醇浓度，得到的欧洲越橘提取物，其总花色苷含量及收率并不相同，结果如下：
Figure BDA0002304786020000091
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法包括以下步骤：
(1)一提：以欧洲越橘冻果为原料，粉碎，按料液质量体积比1：2.0～3.0加入体积分数为60％～85％的酸化乙醇溶液，搅拌提取，提取结束后离心过滤，得一提滤液及一提滤渣，其中，所述酸化乙醇溶液是用苹果酸或柠檬酸调节pH至3～4；
(2)二提：一提滤渣转移至提取罐中，加入与步骤(1)中同等体积和浓度的酸化乙醇溶液，搅拌提取，提取结束后离心过滤，得二提滤液及二提滤渣；
(3)提取浓缩：取一提滤液，水浴减压浓缩，回收乙醇，离心过滤，得提取浓缩液，快速降至25℃或以下；
(4)分离柱预处理：以聚酰胺大孔树脂填装分离柱，填装后用85％～95％乙醇洗净树脂，再用纯化水洗脱至流出液酒精计检测酒精度≤3.0％；
(5)吸附：将提取浓缩液通过分离柱进行吸附，流速控制为1～3BV柱/h，花色苷的单位吸附量控制为6～21mg/ml，其中，所述1～3BV柱/h是指1h通过提取浓缩液的体积为树脂体积的1～3倍；
(6)水洗：吸附结束后，用2～5BV柱的纯化水洗柱，去除杂质，其中，所述纯化水用苹果酸或柠檬酸调节pH至3～4；
(7)醇洗及解吸：水洗结束后，先用0.5～1.0BV柱体积分数为30％～70％的乙醇洗脱，流速控制为2～4BV柱/h，洗脱液回收，再用6～8BV柱体积分数为70％～95％的乙醇解吸，解吸流速控制为2～4BV柱/h，其中，所述乙醇用苹果酸或柠檬酸调节pH至3～4；
(8)浓缩、干燥：将解吸液水浴减压浓缩至物料无流动性，取出后放入真空干燥箱中真空干燥，即得花色苷含量高的欧洲越橘提取物。
2.根据权利要求1所述的花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中搅拌提取时温度为25±5℃，搅拌线速度≥50m/min。
3.根据权利要求1所述的花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中二提滤液作为下一批一提的提取溶剂。
4.根据权利要求1花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中树脂填充高度h：柱内径d＝2～12：1；优选地，所述步骤(4)中水洗流速控制为2～4BV柱/h。
5.根据权利要求1所述的花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中花色苷的单位吸附量控制为9～15mg/ml。
6.根据权利要求1所述的花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中先用体积分数为40％～60％的乙醇洗脱，再用体积分数为80％～90％的乙醇解吸。
7.根据权利要求1花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和(8)中减压浓缩是于60±5℃，-0.090～-0.100MPa条件下水浴减压浓缩。
8.根据权利要求1所述的花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述步骤(8)中真空干燥是在真空干燥箱中于50±5℃，-0.090～-0.100MPa条件下真空干燥。
9.根据权利要求1所述的花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述欧洲越橘提取物总花色苷含量使用高效液相色谱法检测，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物计，所述花色苷含量高的欧洲越橘提取物中总花色苷含量不低于65％。
10.根据权利要求1花色苷含量高的欧洲越橘提取物制备方法，其特征在于，所述检测方法的分析条件为：
色谱柱：Zorbax Extend-C18，5μm，4.6*250mm
进样量：20uL
流动相：A相：色谱甲酸：水＝1:9
B相：色谱甲酸：水：色谱乙腈：色谱甲醇＝4：16：9：9
泵流速：1.0ml/min
检测波长：535nm
柱温箱：30℃
洗脱梯度：
时间 0.01min 35min 45min 46min 60min 流动相A 93％ 75％ 35％ 0％ 0％ 流动相B 7％ 25％ 65％ 100％ 100％
。
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