CN110731965A - 柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用 - Google Patents
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Classifications
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
Abstract
本发明提供了涉及柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用，属于生物医药技术领域，所述药物以柴胡皂苷a为活性成分，以生理盐水为溶剂溶解柴胡皂苷a获得。采用本发明所述药物适当的剂量灌胃治疗咪喹莫特银屑病模型小鼠，能够抑制小鼠皮损的炎症反应，改善鳞屑和皮损厚度，能够抑制人表皮角质形成细胞HEKa细胞系的过度增殖；柴胡皂苷a通过诱导细胞线粒体跨膜电位Δψ降低和氧自由基ROS产生来减缓银屑病的进展以及促进皮损恢复正常。相比其它治疗银屑病药物，作用机制更加明确；安全性更好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用。
背景技术
银屑病是一种常见的免疫介导的慢性复发性炎症性皮肤病，其特征是表皮增生、免疫细胞浸润、皮肤血管生成增加和局部各种炎症介质上调。银屑病的典型皮损表现为鳞屑性红斑或斑块，其反复发作和长期病程对于患者的身体、心理、精神等均造成严重的影响。银屑病组织病理主要表现为角化过度和角化不全，角化不全区域常可见中性粒细胞集聚，称Munro微脓肿。表皮突延伸，真皮乳头上延成杵状，其上方棘层变薄。乳头内毛细血管迂曲扩张充血，管周炎细胞浸润。对于银屑病的治疗，轻度以外用药物为主，中重度可使用系统治疗，对传统系统性药物治疗效果欠佳的患者可适当选择靶向生物制剂治疗。但由于一些药物的副作用及价格等因素，银屑病的治疗仍然面临困难，是研究的重点所在。
柴胡，属于伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，具有多种药理作用，如免疫调节、抗炎保肝、抗肿瘤及抗细胞黏附等。柴胡的主要成分根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、b、c和d，以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d为主，具有多种生物学活性，是评价柴胡质量的重要指标。
柴胡皂苷a属于五烷三萜类齐果烷型衍生物，其化学结构式为C42H68O13，分子量为780.98，其化学结构式如图1。柴胡皂苷a具有抗炎、免疫调节、抗病毒等多种药理作用。
目前对于柴胡皂苷a防治银屑病的机理和效果尚不明确。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用，所述药物
以柴胡皂苷a为活性成分，以生理盐水为溶剂溶解柴胡皂苷a获得。
优选的，所述药物中柴胡皂苷a的浓度为10～20mg/ml。
优选的，所述药物中柴胡皂苷a的浓度为12～18mg/ml。
优选的，所述生理盐水为质量浓度0.9％的NaCl溶液。
本发明提供了柴胡皂苷a在制备抑制人表皮角质形成细胞过度增殖的药物中的应用。
本发明提供了柴胡皂苷a在制备降低银屑病小鼠模型中炎症因子mRNA表达的药物中的应用。
优选的，所述炎症因子包括TNF-a、IL-17A、IL-8和IL-1β。
本发明提供了柴胡皂苷a在制备诱导细胞中线粒体跨膜电位Δψ降低药物中的应用。
本发明提供了柴胡皂苷a在制备诱导细胞中氧自由基ROS产生的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用，所述药物以柴胡皂苷a为活性成分，以生理盐水为溶剂溶解柴胡皂苷a获得。采用本发明所述药物适当的剂量灌胃治疗咪喹莫特银屑病模型小鼠，能够抑制小鼠皮损的炎症反应，改善鳞屑和皮损厚度；所述药物能够抑制人表皮角质形成细胞HEKa细胞系的过度增殖，从而抑制银屑病。柴胡皂苷a通过诱导细胞线粒体跨膜电位Δψ降低和氧自由基ROS产生来减缓银屑病的进展以及促进皮损恢复正常。柴胡皂苷a通过诱导银屑病发病通路中ROS产生，下调炎症因子表达水平来抑制银屑病，相比其它治疗银屑病药物，作用机制更加明确；所述药物中柴胡皂苷a及其辅料生理盐水都对身体无毒副作用，具有良好的安全性。
附图说明
图1为柴胡皂苷a的分子结构式；
图2为不同剂量的柴胡皂苷a灌胃治疗咪喹莫特小鼠的临床照片，其中阳性对照组为0.5mg/kg/d甲氨蝶呤，阴性对照组质量浓度0.9％的生理盐水，治疗组为37.5mg/kg/d、75mg/kg/d和150mg/kg/d的柴胡皂苷a；
图3为对照组及治疗组咪喹莫特小鼠的PASI评分，其中a为红斑的PASI评分，b为鳞屑的PASI评分，c为皮肤厚度的PASI评分，d为总的PASI评分；
图4为对照组和治疗组咪喹莫特小鼠皮损的组织学照片；
图5为对照组和治疗组咪喹莫特小鼠皮损的HPSS评分，其中a为表皮(Epidermis)的评分，b为血管(Vascularity)变化的评分，c为浸润(Infiltration)情况的评分；
图6为提取对照组和治疗组咪喹莫特小鼠皮损总的RNA，real-timePCR检测银屑病相关炎症因子的相对表达变化；其中a为白介素-17，b为肿瘤坏死因子(TNF-a)，c为白介素-1β。
图7为在HEKa细胞应用不同浓度的柴胡皂苷a刺激24h、48h及72h后，应用MTT法检测对HEKa细胞增殖的影响；
图8为不同浓度柴胡皂苷a刺激HEKa细胞24h后，各组线粒体膜电位Δψ的变化；
图9为不同浓度柴胡皂苷a刺激HEKa细胞24h后，各组活性氧ROS含量变化。
具体实施方式
本发明提供了柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用，所述药物以柴胡皂苷a为活性成分，以生理盐水为溶剂溶解柴胡皂苷a获得。
在本发明中，所述药物中柴胡皂苷a的浓度优选为10～20mg/ml，更优选为12～18mg/ml，最优选为15mg/ml。在本发明中，所述生理盐水优选为质量浓度0.9％的NaCl溶液。本发明对所述柴胡皂苷a和生理盐水的来源和规格没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可；所述生理盐水优选的自行制备获得。
在本发明中，所述药物的制备方法优选的如下：将柴胡皂苷a粉末离心后溶于生理盐水中获得悬浊液。在本发明中所述离心的转速优选为1500～2500rpm，更优选为2000rpm；所述离心的时间优选为50～70s，更优选为60s；本发明中所述离心的目的是使附壁药物离心至管底，充分溶解。
本发明提供了柴胡皂苷a在制备抑制人表皮角质形成细胞过度增殖的药物中的应用。在本发明中，所述人表皮角质形成细胞优选的选择HEKa细胞进行试验，本发明优选的应用不同浓度的柴胡皂苷a刺激HEKa细胞24h、48h及72h后，应用MTT法检测对HEKa细胞增殖的影响。本发明实验结果表明柴胡皂苷a能够抑制人表皮角质形成细胞的过度增殖。
本发明提供了柴胡皂苷a在制备降低银屑病小鼠模型中炎症因子mRNA表达的药物中的应用。在本发明中，所述炎症因子优选的包括TNF-a、IL-17A、IL-8和IL-1β；所述炎症因子的mRNA表达优选的通过real-time PCR进行检测。
本发明提供了柴胡皂苷a在制备诱导细胞中线粒体跨膜电位Δψ降低药物中的应用。本发明采用不同浓度的柴胡皂苷a刺激aHEKa细胞24h、48h及72h后，检测线粒体跨膜电位Δψ，所述线粒体跨膜电位Δψ显著降低。
本发明还提供了柴胡皂苷a在制备诱导细胞中氧自由基ROS产生的药物中的应用。本发明采用不同浓度的柴胡皂苷a刺激aHEKa细胞24h、48h及72h后，检测细胞中氧自由基ROS，所述细胞中氧自由基ROS的水平显著升高。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)对照组和实验组动物模型的建立及PASI评分
从西安交通大学医学院动物实验中心购买6～8周BALB/c小鼠共42只，分为对照组、模型组、治疗组和3个给药组，每组7只，每只体重为22±2g。2％水合氯醛麻醉后，剃去背部毛约2×3cm大小，外用咪喹莫特乳膏62.5mg，每天一次。对照组及模型组灌胃0.9％生理盐水200μl，治疗组灌胃等体积甲氨蝶呤(MTX)0.5mg/kg/d，给药组灌胃不同剂量(37.5mg/kg/d、75mg/kg/d和150mg/kg/d)的柴胡皂苷a 200μl，每天一次，每天拍照并PASI评分，共7天，第八天脱颈椎处死小鼠后，取皮损，一部分做HE染色，一部分提总RNA做real-timePCR。
不同剂量的柴胡皂苷a灌胃治疗咪喹莫特小鼠的临床照片结果如图2所示，其中对照组和模型组给予0.9％生理盐水，治疗组为甲氨蝶呤(MTX)0.5mg/kg/d，治疗组分别为37.5mg/kg/d、75mg/kg/d和150mg/kg/d的柴胡皂苷a溶液。
局部外用咪喹莫特乳膏可以诱导小鼠皮肤产生银屑病样炎症，其严重程度的评分标准采用临床研究中使用的银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)评分。由于炎症出现的面积相对固定，因此根据红斑、鳞屑和皮损厚度三项分别单独评分，每项的分值为0-4分：0分示无皮损；1分示轻度；2分示中度；3分示明显；4分示非常明显。三者相加累计的分数作为最终评分(0-12分)。6组咪喹莫特小鼠的PASI评分结果如图3所示，其中A为红斑的PASI评分，B为鳞屑的PASI评分，C为皮肤厚度的PASI评分，D为总的PASI评分。咪喹莫特小鼠皮损对照实验结果表明经过常规的治疗银屑病药物和不同剂量的柴胡皂苷a后，小鼠皮损症状均明显改善。
2)小鼠皮损HE染色和HPSS评分
(1)标本的处理
处死小鼠后取下背部皮损处的皮肤，仔细剥离弃去皮下脂肪组织，剪取约3cm2大小皮肤组织，随后将组织块置于4％多聚甲醛中，固定24h。剩余的皮肤组织置于无菌无酶2ml冻存管中，分别标记后放入液氮中，转移至负80℃保存，以待后续分析。
(2)载玻片的处理
a)将载玻片洗洁精超声清洗后，放入重铬酸钾-浓硫酸混合液中浸泡24h；
b)酸缸中取出后用自蒸馏水冲洗至完全干净，置于烤箱中60℃烘干过夜；
c)为防止组织掉片，载玻片需经3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilane，APES)处理。将APES原液与丙酮1∶50稀释成工作液，将洗净的玻片放入新配置的APES工作液中停留30s后取出；
d)取出玻片，停顿10s钟，再放入丙酮溶液30s，涮去未结合的APES；
e)再置于烤箱中烘干2h，装盒后备用。
(3)石蜡包埋和组织切片
a)包埋组织：先在模具中加入一些液态石蜡，稍微冷却后，将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，冷却使其变成固态；
b)切片：将包埋好的组织从模具上取下来，置于石蜡切片机上，调节切片的厚度4μm，连续切片；
c)切片置于60℃烤箱中烤90分钟，然后转入37℃烤箱中过夜。
(4)HE染色步骤
a)将切好的石蜡组织切片于60℃烘烤30分钟；
b)取出切片，置于二甲苯中I、II各脱蜡15分钟；
c)用无水酒精I、II各水化5分钟；
d)再置于95％、90％、80％的梯度酒精中各5分钟后，用纯水洗涤3分钟；
e)用苏木素染色3分钟，自来水冲洗；
f)1％盐酸酒精分化数秒(7秒左右)，自来水冲洗5分钟；
g)PBS返蓝3分钟，自来水冲洗；
h)用伊红染色3分钟后自来水冲洗；
i)置于80％、90％、95％的梯度酒精中各1分钟脱水；
j)无水酒精I、II中各3分钟；
k)二甲苯I、II中各透明5分钟；
l)中性树胶封片，待树胶干燥后放入玻片盒中常温保存，待观察分析；
(5)结果分析方法
对HE染色的切片在显微镜下扫描拍照，并进行银屑病严重程度组织病理学评分(HPSS)评估，该评分标准是根据表皮、血管及炎症细胞三个类别进行的，每个类别又分为4个子类。该评分是在盲法下由两位病理学家完成的，具体评分如表1所示。
表1 银屑病严重程度组织病理学评分(HPSS)评分
分析结果分别如图5中的a、b、c所示，结果表明治疗组和给药组小鼠银屑病样皮损明显改善。以上结果表明柴胡皂苷a对银屑病有治疗作用。
3)提取银屑病小鼠模型皮损总RNA检测相关炎症因子表达水平
(1)TRIzol法提取组织中的RNA
a)提前将所需实验物品无菌无酶处理；
b)将称取好的组织放入1.5ml的EP管中，加入1ml的TRIzol，用电动匀浆器匀浆处理90s。
c)加入200μl氯仿，上下颠倒10次，使其充分混匀呈乳白状，冰上放置5min，然后4℃12000rpm离心15min；
d)小心地将上层无色透明的上清液(约300μl)转移至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，轻柔颠倒10次，然后冰上放置20min；
e)4℃12000rpm离心15min，可见管底有白色沉淀，小心弃去上清；
f)加入预冷的75％乙醇1ml洗涤沉淀，然后4℃7500rpm离心5min；
g)弃去上清，室温干燥5-10min，可见底部白色沉淀物变为透明，加入适量的(30-50μl)DEPC水，弹匀并放置在55-60℃10min，使RNA充分溶解；
h)RNA纯度和浓度的测定：吸取1μl提取的RNA加入99μl DEPC水中(稀释100倍)，于分光光度仪上测OD260nm和OD280nm值，OD260/OD280在1.9-2.0之间说明所提取的RNA纯度较高。总RNA浓度(μg/ml)＝A260nm×40×稀释倍数，以备其后反转录为cDNA实验所需，余RNA产物放于-80℃冰箱保存备用。
(2)反转录反应
a)在冰上向PCR管中按照如下表2反转录体系加入试剂，混匀之后短暂离心；
表2 逆转录试剂加样表
b)放入PCR仪中，反转录条件：25℃，10min；42℃，30min；85℃，5min；
c)反转录产物放入-20℃保存备用。
(3)PCR扩增反应
a)向反转录好的20μl cDNA中加入80μl DEPC水(即稀释至5倍)；
b)在冰上向PCR管中按照表3体系加入试剂，混匀之后短暂离心。引物序列见表4：
表3 普通PCR试剂加样表
表4 PCR引物序列
c)放入PCR仪中，反应条件如表5所示：
表5 PCR反应条件
(4)琼脂糖凝胶电泳
a)配2.5％的琼脂糖凝胶，室温冷却20-30min待其凝固成凝胶；
b)取各个RNA样品10μl，Marker 6μl混匀，加入加样孔中；
c)电泳：110V电压下电泳20-30min，用凝胶紫外分析仪观察并拍照。
(5)荧光实时定量PCR(qRT-PCR)
a)在冰上向PCR管中按照如表6体系加入试剂，混匀之后短暂离心；
表6 实时定量PCR反应体系
b)放入实时定量PCR仪中，反应条件如表7所示：
表7 实时定量PCR反应条件
c)结果判定：用2-ΔΔCt的方法对CT值进行分析，计算各基因的相对表达量。
real-timePCR检测炎症因子TNF-a、IL-17A、IL-8和IL-1β的相对表达变化结果如图5所示，结果表明柴胡皂苷a剂量依赖地下调小鼠皮损处相关炎症因子mRNA的表达水平。
4)不同浓度柴胡皂苷a刺激HEKa细胞24h、48h和72h后，MTT法检测HEKa细胞增殖。
(1)细胞复苏
a)将细胞冻存管从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴箱中，使其在1min内迅速融化；
b)加入事先准备好的含有5ml 10％FBS的DMEM培养基的中，800rpm离心5min，弃去上清；
c)加入5ml含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，接种到10cm2培养皿中，置37℃、5％CO2培养箱中培养，次日更换培养基。
(2)细胞培养
细胞常规培养于37℃恒温、5％CO2培养箱中，每2d更换一次培养基。
(3)细胞传代
a)当细胞覆盖率达到80％以上时，可以进行传代。先弃去旧的培养基，用PBS洗2次；
b)加入2ml 0.25％胰酶消化，37℃放置约3min，在倒置显微镜下观察，可见细胞变圆，细胞间隙变大，此时立刻加入4ml含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞悬液，转入离心管中；
c)将细胞悬液移至离心管，800rpm离心5min，弃去上清，加入新鲜的培养基重悬，重新接种于新的培养瓶中继续培养。一般传代比例为1∶2-4。
(4)细胞冻存
a)当细胞覆盖率达到80％以上且状态较好时时，可进行细胞冻存。先弃去旧的培养基，用PBS洗2次；
b)用0.25％胰酶消化，含10％FBS的DMEM培养基终止消化，转移到离心管中，800rpm离心5min；
c)弃去上清，加入1ml细胞冻存液，吹打均匀，转移至冻存管中；
d)将冻存管放入冻存盒中后，放入-80℃冰箱过夜，最后转移到液氮罐中进行长期保存。
(5)MTT法检测不同浓度柴胡皂苷a对HEKa细胞增殖的影响
a)取对数生长期的细胞，用胰酶消化收集细胞后，用含10％FBS的DMEM培养基制成单个细胞悬液，调整细胞密度为2.5×104个/ml；
b)96孔板中每孔加入200μl细胞悬液(5×103个细胞/孔)，每组设5个复孔，同时设置空白对照组只加培养基，37℃、5％CO2细胞培养箱中常规培养；
c)24h后按设计好的浓度梯度加入柴胡皂苷a刺激
d)于刺激24h后进行检测。测时每孔加入0.5mg/ml的MTT溶液20μl，置于培养箱中继续孵育4h，弃去液体，每孔加入150μl DMSO，室温震荡10min溶解结晶，在波长490nm测定吸光度(OD)值；
e)转染后48h、72h分别重复步骤(d)；
f)以无细胞完全培养液为本底对照，绘制细胞生长曲线(以平均OD值为纵坐标，以时间为横坐标)。
在HEK细胞应用不同浓度柴胡皂苷a刺激24h、48h及72h的细胞增殖如图6所示，结果表明柴胡皂苷a可抑制角质形成细胞增殖，从而抑制银屑病发展进程。
5)柴胡皂苷a刺激HEKa细胞24h后检测细胞线粒体膜电位Δψ变化
a)将培养好的HEKa细胞用胰蛋白酶消化，计数，完成后，铺于96孔板中，每孔加入200μl的培养基，细胞数目8000个/每孔；
b)待第二天细胞贴壁后，加入不同浓度梯度的药物处理24h，37℃，5％CO2培养24h；
c)培养结束后，吸走培养基，用150μl的PBS洗细胞一次，然后加入无血清培养基配制的JC-1试剂，100μl/每孔，结束后用锡箔纸包裹放于细胞培养箱继续孵育1h；
e)孵育结束后，吸走培养基加入150μl/每孔的PBS洗剂一至两次，加入每孔100μL的PBS，用酶标仪去检测525nm与590nm的荧光值(激发光均为488nm，吸收光分别为525nm与590nm)；
f)检测结束后，将数据保存于EXCEL中，用于后续处理分析
g)以无药物刺激组对照，绘制Δψ-药物浓度柱状图。
在HEK细胞应用不同浓度柴胡皂苷a刺激24h后，各组Δψ如图8所示，结果表明柴胡皂苷a可诱导线粒体膜电位降低，并且呈剂量依赖性。
6)柴胡皂苷a刺激HEKa细胞24h后检测活性氧ROS含量变化
(1)试剂配制
a)按表8配制细胞裂解液，调pH至7.5，4℃保存。
表8 细胞裂解液的组分及含量
b)二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)用DMSO溶解，配制成10mmol/L的储备液，避光保存于-20℃。
(2)检测方法
a)将H2DCF-DA储备液用无血清培养基按1∶1000稀释成终浓度为10μmol/L的工作液，充分震荡混匀。
b)弃去6孔板的培养基，每孔加1mL H2DCF-DA工作液，37℃避光孵育30分钟；
c)弃去H2DCF-DA工作液，在避光条件下用预冷的PBS洗三次，每孔加入300μl细胞裂解液，轻摇使其充分浸润孔底细胞，冰浴10分钟；
d)刮取细胞至预冷的1.5ml离心管中，13000g，4℃离心10分钟，将上清液收集到新的离心管中；
e)再将上清转移至96孔板中，每孔200μl，以细胞裂解液作为空白对照，检测激发光485nm，发射光538条件下的荧光强度；
f)剩余上清用BCA法检测其蛋白浓度，用荧光值与蛋白浓度的比值表示ROS含量。
实验结果显示5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L刺激HEKa细胞24h后，ROS含量相比对照组增加，并呈剂量依赖型。
综上实验检测结果表明，柴胡皂苷a对银屑病有治疗作用，适当浓度的柴胡皂苷a治疗咪喹莫特小鼠银屑病模型，能够改善鳞屑和皮损厚度，并且通过诱导Δψ降低和ROS产生抑制银屑病发展以及促进皮损恢复正常。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.柴胡皂苷a在制备防治银屑病的药物中的应用，其特征在于，所述药物以柴胡皂苷a为活性成分，以生理盐水为溶剂溶解柴胡皂苷a获得。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中柴胡皂苷a的浓度为10～20mg/ml。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物中柴胡皂苷a的浓度为12～18mg/ml。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生理盐水为质量浓度0.9％的NaCl溶液。
5.柴胡皂苷a在制备抑制人表皮角质形成细胞过度增殖的药物中的应用。
6.柴胡皂苷a在制备降低银屑病小鼠模型中炎症因子mRNA表达的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括TNF-a、IL-17A、IL-8和IL-1β。
8.柴胡皂苷a在制备诱导细胞中线粒体跨膜电位Δψ降低的药物中的应用。
9.柴胡皂苷a在制备诱导细胞中氧自由基ROS产生的药物中的应用。
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