CN108079302B - Nrf2激动剂在制备治疗银屑病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Nrf2激动剂在制备治疗银屑病的药物中的应用，以及Nrf2激动剂个性化用药的方法。本发明通过建立感染银屑病的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠临床症状及病理组织病理切片进行分析，同时以健康小鼠、感染银屑病后未给药治疗的小鼠和感染银屑病后用已批准治疗银屑病的药物治疗的小鼠作为参比，实验结果显示，在临床症状及皮肤组织病变等方面，Nrf2激动剂阿司咪唑和珠氯噻醇对银屑病有一定的治疗效果，为临床用药提供了新的选择。本发明还提供了一种基于病人基因表达数据的个性化用药方法，可以有效预测Nrf2激动剂对于特定银屑病病人的药效，指导个性化用药。
Description
技术领域
本发明涉及药物新用途技术领域，具体涉及Nrf2激动剂在制备治疗银屑病的药物中的应用。
背景技术
银屑病是一种慢性、复发性的炎症性皮肤病。根据银屑病的临床和病理特征，一般可分为寻常型、关节炎型、脓疱型、掌跖脓疱病、红皮病型及连续性肢端皮炎六种类型。寻常型银屑病病理特征为表皮角化过度及角化不全，具有鳞屑的硬币大小红色皮肤损伤，通常在头皮、躯干、四肢伸侧最为常见。目前银屑病尚无有效根治方案，治疗仍基于控制症状，患者通常需要终身治疗缓解疾病。
最新统计报告显示，银屑病发病率占世界人口的0.1％～3％，目前全球已有银屑病患者1.25亿，且白种人明显高于黄种人，黑种人次之，男性多于女性，城市多于农村。我国总患病率为0.6％，初发年龄男性大多为20-39岁，女性大多为15-39岁。其病因和发病机制目前尚未完全明确，也无有效的根治方法，近十年来发病率有上升和提前的趋势，所以银屑病的治疗已成为皮肤疾病领域的重要研究课题之一。
人皮肤是机体直接暴露于外界环境的第一屏障，承受着来自外界环境的氧化压力。紫外线(UV)等多种污染物可产生氧化压力，其所致的氧化损伤在多种皮肤病的发病中起着重要的作用。氧化应激是指活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成过多超过机体抗氧化防御能力时产生的一种病理状态。目前大量研究表明，银屑病患者皮肤中存在氧化剂与抗氧化防御系统的失衡，氧化损伤可能参与了银屑病发病。
阿司咪唑(Astemizole)是一种长效，非镇静的第二代抗组胺药，用于治疗过敏症状。珠氯噻醇(Zuclopenthixol)是基于噻吨酮的精神安定药，其治疗作用类似于吩噻嗪抗精神病药。目前，尚无将阿司咪唑、珠氯噻醇等Nrf2激动剂用于制备治疗银屑病的药物先例。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供了Nrf2激动剂在制备治疗银屑病的药物中的新用途，为银屑病治疗的临床用药提供了新的选择。
本发明的另一个目的在于提供一种Nrf2激动剂个性化用药的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明提供了一种Nrf2激动剂在制备治疗银屑病的药物中的应用。
本发明使用NGF方法来实现银屑病致病基因中关键基因的鉴定。通过GO分析(http://www.pantherdb.org/)，发现在重要度排名前1000基因中显著富集到与氧化应激功能有关的基因，可以认为氧化应激在银屑病发病机制中起着重要作用。Nrf2(NF-E2-related factor 2)是调节参与氧化应激反应的许多细胞保护酶的重要转录因子，受Kea1的调控，通过与抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)相互作用，调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达。因此Nrf2激动剂，可通过直接清除自由基或通过间接增加内源性细胞抗氧化剂防御功能来抗氧化。Nrf2/ARE是迄今为止最为重要的抗氧化应激通路，由于其内源性特点，对于它的调节为实现适度、可控的抗氧化治疗开辟了新途径。因此，发明人基于这一机制，设计了针对Nrf2激动剂的银屑病治疗药物重定位，涉及的Nrf2激动剂包括阿司咪唑和珠氯噻醇。
本发明通过建立感染银屑病的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠的存活率、临床症状及皮肤组织病理切片进行分析，同时以健康小鼠、感染银屑病后未给药治疗的小鼠作为参比，对照试验、临床症状及皮肤组织病变等方面结果表明，Nrf2激动剂对银屑病有一定的治疗效果。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述Nrf2激动剂包括如下(a)或(b)：
(a)苯并咪唑类衍生物或其药学上可以接受的盐；
(b)硫杂蒽类衍生物或其药学上可以接受的盐。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述苯并咪唑类衍生物包括氟苯达唑、奥美拉唑或阿司咪唑；所述硫杂蒽类衍生物包括氯普噻吨、二盐酸氟哌噻吨、二盐酸珠氯噻醇、盐酸氯普噻吨或珠氯噻醇。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述Nrf2激动剂为阿司咪唑或珠氯噻醇。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物的剂型为注射液或固体口服制剂。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述固体口服制剂为临床上可接受的颗粒剂、胶囊或片剂。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述Nrf2激动剂为阿司咪唑，其成人口服使用剂量为1-20mg/day。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述Nrf2激动剂为珠氯噻醇，其成人口服使用剂量为0.5-300mg/day；其成人注射使用剂量为10-1000mg/次，每2-4周注射一次。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述固体口服制剂为片剂，所述片剂中含有1-20mg/片阿司咪唑或含有5-80mg/片珠氯噻醇；或者，所述注射液含有25mg/mL-1000mg/mL珠氯噻醇。
本发明还提供了一种Nrf2激动剂个性化用药的方法，包括以下步骤：
(1)获取银屑病病人样本的银屑病皮损组织和对照样本的正常皮肤组织的基因表达数据；
(2)基于步骤(1)中获取的基因表达数据，构建基因互作矩阵，计算银屑病病人的关键基因列表；
(3)收集银屑病对应的批准药物和研发药物及它们的靶标信息；
(4)通过统计分析查看所述药物的靶基因是否显著地靶向所述关键基因列表；
(5)筛选适合特定银屑病病人的药物，预测Nrf2激动剂的药物有效率，从而实现所述特定银屑病病人的个性化用药。
本发明通过从NCBI GEO Dataset中下载的银屑病人皮损组织和健康组织的基因表达数据。计算每个基因的fold-change(差异倍数)值，将其作为该病人基因的初始重要性，并使用从STRING数据库(http://string-db.org/)下载的基因-基因互作信息，一同输入GeneRank计算银屑病病人发病过程中的基因的重要性排名。根据药物靶标信息，通过Kolmogorov-Smirnov检验统计分析，检测药物的靶基因是否显著地分布于病人的关键基因列表的最上部分(即该药物是否显著的靶向了病人的重要基因)，从而预测药物的对病人是否具有药效。在本发明中，针对特定病人进行Nrf2激动剂药物活性预测，则可以实现该病人的个性化用药。
作为本发明所述Nrf2激动剂个性化用药的方法的优选实施方式，所述靶基因为DGIdb、TTD和Drugbank三个数据库的靶基因数据的并集。
作为本发明所述Nrf2激动剂个性化用药的方法的优选实施方式，所述基因表达数据通过基因表达量分析方法获得，所述基因表达量分析方法包括基因芯片、RNA-Seq中的至少一种。
作为本发明所述Nrf2激动剂个性化用药的方法的优选实施方式，所述步骤(4)中的统计分析为富集分析，所述富集分析使用的富集分析模型为Kolmogorov-Smirnov检验。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过建立感染银屑病的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠的存活率、临床症状及皮肤组织病理切片进行分析，同时以健康小鼠、感染银屑病后未给药治疗的小鼠作为参比，通过对照试验、临床症状及皮肤组织病变等方面Nrf2激动剂对银屑病有一定的治疗效果。Nrf2激动剂可用于制备治疗银屑病的药物。本发明涉及的药物阿司咪唑(CAS:0068844-77-9)和珠氯噻醇(CAS:0053772-83-1)，能够有效治疗银屑病，为临床用药提供了新的选择。本发明还提供了一种基于病人基因表达数据的个性化用药方法，可以有效预测Nrf2激动剂对于特定银屑病病人的药效，指导个性化用药。
附图说明
图1是MCF-7细胞在8μM阿司咪唑药物及DMSO对照处理不同时间后，细胞内相关基因的表达情况。
图2是MCF-7细胞在0.011mM咳平及0.0092mM珠氯噻醇药物处理不同时间后，细胞内相关基因的表达情况。
图3是咪喹莫特组+干扰素诱导的银屑病小鼠模型病理组织切片HE染色结果。
图4是健康对照小鼠正常皮肤组织切片HE染色结果。
图5是阿司咪唑给药第八天小鼠症状。
图6是珠氯噻醇给药第八天小鼠症状。
图7是阴性对照第八天小鼠症状。
图8是阿司咪唑给药小鼠切片结果。
图9是珠氯噻醇给药小鼠切片结果。
图10是阴性对照(银屑病)小鼠切片结果。
图11是阳性对照(地塞米松治疗)小鼠切片结果。
图12是批准药物和研发药物有效率百分比累积折线图。
图13是批准药物和研发药物有效率区间统计直方图。
图14是批准药物和研发药物KS检验-P值箱形图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了更好地理解本发明，下面提供相关的解释和说明：
HE染色：Hematoxylin-eosin staining，苏木精-伊红染色法；
NGF：Network-Guided Forest，用差异基因表达谱以及基因网络作为输入，训练得到一个能将表达谱正确划分到对应的条件下的分类模型。根据对NGF分类能力的贡献，NGF为基因网络中的每一个基因和基因互作分配一个重要性分值(important score，IS)；
GO分析：Gene Ontolog，可分为分子功能(Molecular Function)，生物过程(biological process)和细胞组成(cellular component)三个部分；
PASI：Psoriasis area and severity index，银屑病面积和严重程度指数；
PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点；
Astemizole:阿司咪唑；
Zuclopenthixol:珠氯噻醇；
RNA-Seq：转录组测序技术；
DGIdb：药物靶标数据库；
TTD：药物靶标数据库；
DrugBank：药物靶标数据库；
MCF7细胞：人乳腺癌细胞。
基于本实验室的药物发现新技术，以NCBI-GEO Dataset下载的银屑病病人表达谱数据出发，基于NGF算法，得到致病基因的重要性排序。对重要性排序最高的前1000基因进行GO分析，发现其显著的富集到氧化应激功能的基因，针对这一机制，设计药物重定位。
Network-Guided Forest(NGF)方法是一种基于网络的监督学习算法，它是通过构造一个集成的决策树来投票判断基因的表型以及基因的重要程度。该方法的特点是从生物基本原理出发，利用了基因表达谱中蕴含的基因相互作用关系和某个特定状态下基因表达谱蕴含的特异性信息，不依赖遗传学模型，不依赖特定数据，实现理性的关键基因挖掘，具有很好的推广性。本发明使用NGF方法来实现银屑病致病基因中氧化应激调控基因的鉴定。通过GO分析(http://www.pantherdb.org/)，发现在重要度排名前1000基因中显著富集到与氧化应激功能有关的基因共33个如下表1，富集分析P值为0.00017。可以认为氧化应激在银屑病发病机制中起着重要作用。
表1
Nrf2(NF-E2-related factor 2)是调节参与氧化应激反应的许多细胞保护酶的重要转录因子，受Kea1的调控，通过与抗氧化反应元件ARE(antioxidant responseelement)相互作用，调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达。因此Nrf2激动剂，可通过直接清除自由基或通过间接增加内源性细胞抗氧化剂防御功能来抗氧化。Nrf2/ARE是迄今为止最为重要的抗氧化应激通路，由于其内源性特点,对于它的调节为实现适度、可控的抗氧化治疗开辟了新途径。发明人基于这一机制，设计了针对Nrf2激动剂的银屑病治疗药物重定位，涉及的Nrf2激动剂包括阿司咪唑和珠氯噻醇。
本发明初步获得对银屑病有治疗活性的新药物—阿司咪唑(CAS:0068844-77-9)和珠氯噻醇(CAS:0053772-83-1)，其有效药物剂量应该根据病程的严重程度、施药途径和其他相关因素决定。
Generank算法(基因排序算法)(Morrison J L,Breitling R,Higham D J,etal.GeneRank:using search engine technology for the analysis of microarrayexperiments[J].BMC bioinformatics,2005,6(1):1.)，该算法的输入是基因依赖关系构成的矩阵和每个基因的初始重要性(fold change值)，如果一个基因被很多重要的基因指向(依赖)，那么该基因就更重要。在GeneRank的计算过程中，涉及一个参数d(0<＝d<1),d代表的是基因依赖关系在计算过程中的比重。如果d越大，说明基因的重要性越依赖于基因依赖关系，d越小说明基因的重要性越依赖于基因的初始重要性。在本发明中，d优先选择为0.5。
Kolmogorov-Smirnov检验，该统计能够统计一个集合中的元素是否显著地分布于一个序列中的上部或者下部。在本发明中，最上部分的基因列表是最重要的基因，因此我们使用该统计查看待测药物的靶基因是否显著地分布于病人的关键基因列表的最上部分。如果该检验的P值越小，就认为该药物对于此病人是越合适的药物。
实施例1
阿司咪唑和珠氯噻醇的Nrf2激活活性验证试验
本实施例涉及的主要试验仪器：荧光定量PCR(型号：LightCycler 96，生产厂家：Roche)。
本实施例涉及的主要试验试剂与耗材见表2：
表2
本实施例的具体实验方案如下：
(1)细胞药物处理：
使用各种不同药物处理状态良好的MCF7细胞(人乳腺癌细胞，购买于上海生科院细胞库)后，分别在三个不同的时间点收集处理后的细胞，液氮速冻，以备RNA抽提。设置加氯仿及DMSO的处理作为对照组，各种药物处理作为实验组(对照组和处理组)，总计处理12孔；药物处理后，取3个不同时间点进行检测，3次生物学重复；具体处理浓度，处理时间及药物使用浓度见下表3：
表3
(2)细胞样品RNA抽提：将收集后的细胞利用RNeasy Mini kit(74104)抽提总RNA。
(3)反转录：反转录使用TOYOBO反转录试剂盒(FSQ-101)，反转录体系及程序如下表4所示：
表4
(4)定量PCR检测
使用内参：β-actin；
待检测基因序列如下：
SEQ ID NO:1：HO-1F：ATGGCCTCCCTGTACCACATC
SEQ ID NO:2：HO-1R：TGTTGCGCTCAATCTCCTCCT
SEQ ID NO:3：NQO1F：CGCAGACCTTGTGATATTCCAG
SEQ ID NO:4：NQO1R：CGTTTCTTCCATCCTTCCAGG
SEQ ID NO:5：GCLM-1F：TTGGAGTTGCACAGCTGGATTC
SEQ ID NO:6：GCLM-1R：TGGTTTTACCTGTGCCCACTG
SEQ ID NO:7：β-actin F：TCATGAAGTGTGACGTGGACATC
SEQ ID NO:8：β-actin R：CAGGAGGAGCAATGATCTTGATCT
Real-time RT-PCR反应体系如下：
SYBR-Green Mix：10μL，
Primer F(10μmol/L)：0.8μL，
Primer R(10μmol/L)：0.8μL，
Template：2μL，
ddH2O：up to 20μL。
Real-time RT-PCR反应条件为：
95℃变性2min，95℃变性10s；
57℃退火10s，72℃延伸15s；
40个循环；95℃变性1min；
55℃退火1min；
从65℃～95℃做产物溶解曲线。
MCF-7细胞在0.0094mM阿司咪唑药物处理及DMSO对照处理不同时间后，细胞内相关基因的表达情况分别如图1所示；MCF-7细胞在珠氯噻醇药物处理及咳平对照处理不同时间后，细胞内相关基因的表达情况分别如图2所示。
本实施例的实验结果显示阿司咪唑和珠氯噻醇对Nrf2调控的基因都具有激活作用，这两种药物确实有Nrf2激活活性。
实施例2
阿司咪唑对银屑病小鼠的治疗效果
本实施例通过建立感染银屑病的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠临床症状进行分析，显示阿司咪唑对银屑病有一定的治疗效果。具体实验方案如下：
(1)建立感染银屑病的小鼠模型
一、实验动物及药物
1、实验动物：6周龄Balb/c雌鼠，10只。
2、药物：5％咪喹莫特(湖北科益)、重组人干扰素α-2b注射剂(凯因益生)、凡士林
二、银屑病造模方案
1、小鼠脱毛处理
实验前2天，用温和型脱毛膏将小鼠背部中心区域的被毛剃去，去毛面积约为2cm×3cm。若实验过程中被毛再次长出，则重复脱毛1-2次。
2、银屑病造模
将5％咪喹莫特乳膏按照50mg/cm2的剂量均匀涂抹于脱毛部位，每天一次，连续两周；在涂抹之后10min，按照1万U/500g的剂量腹腔注射重组人干扰素α-2b注射液，每天给药一次，连续两周。对照组小鼠脱毛后涂抹凡士林。注：对照小鼠应设5％咪喹莫特组、干扰素组以及凡士林组，以确定5％咪喹莫特+干扰素为最佳建模方法，但在此次实验中，我们仅评价5％咪喹莫特+干扰素是否能够长时间的诱导小鼠产生银屑病症状，因此，只设凡士林组。
本次实验中，按0.2g/只的剂量涂抹5％咪喹莫特，连续涂抹9天，小鼠背部皮肤所呈现的银屑病症状较轻。因此，改变给药策略，一次给药0.1g/只，间隔6h后再次给药0.1g/只(该0.1g的咪喹莫特分两次涂抹，每次涂抹0.05g，待吸收后再补充0.05g)。小鼠抹药后10min腹腔注射1万U/500g剂量的重组人干扰素α-2b注射液。
三、动物模型评价指标
1、银屑病小鼠的皮损评分
评分依据：Psoriasis Area Severity Index(PASI)。
评分指标：按照皮损的鳞片程度、表皮厚度以及红斑的严重度进行打分，0：无，1：轻微，2：适度，3：严重，4：非常严重。
小鼠皮损评分每天统计一次。
2、HE染色
建模结束后，用脱颈法将小鼠处死，取小鼠背部局部皮肤，进行标本固定，制作石蜡切片并进行HE染色，观察发病程度是否符合药物活性评价的需求。
3、实验结果
图3是咪喹莫特组+干扰素诱导的银屑病小鼠模型病理组织切片HE染色结果。按上述涂药方法，连续给药3天后，可明显观察到小鼠背部皮肤出现块状角质增生的现象，且有较多皮屑生成，符合银屑病病症。图3的HE染色结果显示，细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。经武汉同济医院皮肤科专家鉴定造模成功。
(2)阿司咪唑对感染银屑病的小鼠的治疗效果评价
1、实验药品
阿司咪唑，性状：白色粉末，片剂，使用方法：灌胃给药
2、动物实验分组与给药
6周龄Balb/c雌鼠分为三组：银屑病小鼠+水(银屑病感染组，3只)，银屑病小鼠+阿司咪唑(药物参照组，2只)，健康小鼠(空白对照组，1只)
参考人用阿司咪唑的剂量(10mg/day)，按照人与小鼠之间的体重比换算药物剂量，每只小鼠按照1.5mg/day的剂量口服阿司咪唑，连续给药三天后，观察小鼠背部皮肤的恢复程度。按上述给药方法，在治疗三天后小鼠症状无明显减轻，故适当增加给药剂量，后期的给药剂量为1.5mg/次，一日两次。并用常用的评价指标对小鼠的临床症状进行评价，量化症状的轻重程度。
3、临床症状观察
图4是健康对照小鼠正常皮肤组织切片HE染色结果。图5是阿司咪唑给药第八天小鼠症状。给药治疗3天后，小鼠症状未有明显减轻。增加用药剂量后，第4天，给药组小鼠皮毛大量生长，皮肤表面的皮屑变为小块，皮屑量较多；未给药组小鼠略有毛发生长，皮肤仍呈暗红色，但角质增生现象较之前略有缓解。第5天，给药组小鼠皮屑消失或略有皮屑，皮肤颜色与健康小鼠无较大区别；未给药组小鼠皮肤颜色较健康组仍略深，但角质增生现象已有明显好转(推测原因：在降低咪喹莫特的给药剂量及给药次数后，小鼠自行恢复，在此过程中，虽每日涂药维持，但药物剂量不足以使其银屑病样症状得以长时间的维持)。由此可见，本发明涉及的阿司咪唑对于银屑病确实有一定的治疗效果。
实施例3
珠氯噻醇对银屑病小鼠的治疗效果
本实施例通过建立感染银屑病的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠临床症状进行分析，显示珠氯噻醇对银屑病有一定的治疗效果。具体实验方案如下：
(1)建立感染银屑病的小鼠模型
具体步骤请见实施例2的步骤(1)建立感染银屑病的小鼠模型
(2)珠氯噻醇对感染银屑病的小鼠的治疗效果评价
1、实验药品
珠氯噻醇，给药方式：肌肉注射；阿维A，给药方式(腹腔注射)。
2、药物注射液配制：
珠氯噻醇溶于5％二甲基亚砜(DMSO)，阿维A溶于10％DMSO+2％失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(Tween 80)；
所得珠氯噻醇注射液浓度为1mg/mL，阿维A注射液浓度为0.6mg/mL。
3、动物实验分组及给药
6周龄Balb/c雌鼠分为四组：银屑病小鼠+珠氯噻醇(药物参照组，5只，3mg/kg)，银屑病小鼠+阿维A(阳性对照组，4只，5mg/kg)，生理盐水(阴性对照组，5只，0.1mL)，健康组(3只，脱毛后涂抹凡士林)。
4、临床症状观察
图6是珠氯噻醇给药第八天小鼠症状；图7是阴性对照第八天小鼠症状。给药4天后银屑病小鼠状态良好，皮肤上有皮屑大部脱落，均有明显损伤，使用珠氯噻醇和阿维A的小鼠损伤较其他组轻，继续给药后阳性对照组和药物参照组症状继续减轻，给药第6天使用珠氯噻醇和阿维A的小鼠多数除皮肤增厚外无明显损伤。第8天后全部小鼠拍照并处死。由此可见，本发明涉及的珠氯噻醇对于银屑病确实有一定的治疗效果。
实施例4
阿司咪唑和珠氯噻醇给药小鼠的组织切片HE染色实验
本实施例涉及的实验器材如表5所示：
表5
本实施例涉及的主要实验试剂如表6所示：
表6
| 试剂 | 厂家 | 货号 |
| 苏木素 | Sigma | H9627 |
| 伊红Y(水溶性) | 国药集团 | 71014544 |
| 无水乙醇 | 国药集团 | 10009218 |
| 二甲苯 | 国药集团 | 10023418 |
| 盐酸 | 国药集团 | 10011018 |
| 包埋石蜡 | 国药集团 | 69019361 |
| 中性树胶 | 国药集团 | 10004160 |
本实施例的具体方案如下：
(1)组织脱水
(2)组织透明
组织块经酒精脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
无水乙醇：二甲苯(1：1) 10min
二甲苯Ⅰ 10min
二甲苯Ⅱ 7min
(3)浸蜡
透明后的组织块依次经3缸石蜡(60℃)进行浸蜡。
石蜡Ⅰ(60℃) 1h
石蜡Ⅱ(60℃) 1h
石蜡Ⅲ(60℃) 1h
以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成。
(4)包埋
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。
(5)切片和烤片
切片前先将蜡块切面在冻台上冷冻几分钟，然后将所要切的包埋块固定在标本夹上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度(一般为4微米)，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于42℃左右水浴展片锅中，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。
切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。捞片法首先将连串的切片放入到42℃左右(视蜡的熔点而定，此温度适合熔点为59℃左右的石蜡)的温水浴展片锅中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，用镊子将切片分开，然后用APES或多聚赖氨酸处理过的防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃烤箱烤片3个小时即可。
(6)切片脱蜡
将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ(10min)-二甲苯Ⅱ(10min)-无水乙醇Ⅰ(5min)-无水乙醇Ⅱ(5min)-95％酒精(3min)-90％酒精(3min)-80％酒精(2min)-70％酒精(2min)，然后蒸馏水浸洗2min。
(7)切片入Harris氏苏木素染液染色5-7min，自来水洗浸洗返蓝。
(8)切片入1％的盐酸酒精分化2-5s，自来水洗浸洗返蓝。
(9)切片入1％水溶性伊红染液染色2min，自来水洗浸洗30s。
(10)切片入无水乙醇脱水，二甲苯透明，风干后中性树胶封片，最后镜检。
图8是阿司咪唑给药小鼠切片结果；图9是珠氯噻醇给药小鼠切片结果；图10是阴性对照(银屑病)小鼠切片结果；图11是阳性对照(地塞米松治疗)小鼠切片结果。细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。实验结果显示，阿司咪唑处理第七天的样本角质层厚度明显低于阴性对照(银屑病)组，接近健康小鼠的水平；珠氯噻醇组小鼠有部分切片厚度低于阴性对照组，与健康组差距较大。
实施例5
基于银屑病个性化用药方法的Nrf2激动剂的药效预测实验
作为本发明所述Nrf2激动剂个性化用药的方法的一种实施例，本实施例所述Nrf2激动剂个性化用药的方法包括以下步骤：
(1)获取银屑病病人样本的银屑病皮损组织和对照样本的正常皮肤组织的的基因表达数据
从NCBI GEO Dataset中下载了银屑病病人及对照组芯片数据(series：GSE13355),得到共64个健康组织和116个银屑病病人皮肤组织的基因表达数据。
(2)计算银屑病病人的关键基因列表
基于(1)下载的180个芯片数据中的基因名称和从STRING数据库下载的基因互作信息，构建基因互作矩阵，并且计算每个病人每个基因的fold change值作为初始重要性输入GeneRank算法计算银屑病病人和正常人群的重要基因排序列表。最后，将该病人中的所有基因按照其重要性降序排列。
(3)收集银屑病批准药物和研发药物及其靶标信息
查找药物靶标数据库(包含DGIdb:http://dgidb.genome.wustl.edu/、DrugBank:http://www.drugbank.ca/和TTD:http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp)，得到数据库中所包含的银屑病批准药物和研发药物以及其对应的靶标数据
(4)通过统计分析查看该药物的靶基因是否显著地靶向所述关键基因列表
通过Kolmogorov-Smirnov检验来查看该药物的靶基因是否显著地分布在步骤二得到的重要基因列表的靠前部分，也就是查看该药物的靶基因是否靶向了该病人发病过程中的那些最重要的基因。如果该统计的P值越小，就说明该药物对于此病人是越合适的药物。
(5)预测性能评估：对收集的银屑病对应的批准药物和研发药物的药物有效率进行统计分析
对所收集的银屑病批准药物(共31个)和银屑病研发药物(共34个)的药物有效率和Kolmogorov-Smirnov检验所得的P值进行统计分析。有效率的计算方式为：如果KS检验P值小于0.05/0.01，则认为该药物对该病人有效，统计在病人群体中有效病人的比例。
在两组药物中，我们通过Wilcoxon秩和检验，得到两组药物有效率差异的P值为0.0059，KS检验所得结果差异的P值为0，认为银屑病批准药物和研发药物的有效率有十分显著的差异，批准药物有效率明显高于研发药物。这可以证实我们的药物药效预测方法的有效性。批准药物和研发药物有效率百分比累积折线图见附图12，批准药物和研发药物有效率区间统计直方图见附图13，批准药物和研发药物KS检验-P值箱形图见附图14。
(6)Nrf2激动剂药物有效率的预测
通过查找上述药物靶标数据库，得到阿司咪唑，珠氯噻醇这两种Nrf2激动剂，以及富马酸二甲酯(Dimethyl Fumarate，CAS：624-49-7，富马酸二甲酯是一种抗炎药，适用于复发型多发性硬化症患者，并且正在研究用于治疗银屑病，我们将其作为对照以判别阿司咪唑和珠氯噻醇的有效率水平)的靶标信息。将这三种药物输入，通过计算得到它们的有效率如下表7所示：
表7
| 药物名称 | 有效率(P<＝0.01) | 有效率(P<＝0.05) | 平均P值 |
| 富马酸二甲酯 | 0.42 | 1 | 0.0113 |
| 阿司咪唑 | 0.69 | 0.93 | 0.0112 |
| 珠氯噻醇 | 0.25 | 0.82 | 0.0296 |
本发明涉及的药物可以制备为任何形式，例如颗粒、粉末、片剂、胶囊、注射液。
本发明的药物可进一步将阿司咪唑替换成其它的苯并咪唑类衍生物，如氟苯达唑、奥美拉唑或它们的药学上可接受的盐，将珠氯噻醇替换成其它的硫杂蒽类衍生物，如氯普噻吨、二盐酸氟哌噻吨、二盐酸珠氯噻醇、盐酸氯普噻吨或它们的药学上可接受的盐。
本发明的药物可进一步包括一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂，这些载体将适当配制以便于给药，药学上可接受的载体或稀释剂可以为水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸钠、滑石粉、高岭土、吐温、琼脂、碳酸钙、表面活性剂、淀粉类及其衍生物、纤维素及其衍生物中的至少一种。
综上，本发明通过建立感染银屑病的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠临床症状及病理组织病理切片进行分析，同时以健康小鼠、感染银屑病后未给药治疗的小鼠和感染银屑病后用已批准治疗银屑病的药物治疗的小鼠作为参比，实验结果显示，在临床症状及皮肤组织病变等方面，Nrf2激动剂中的阿司咪唑和珠氯噻醇对银屑病有一定的治疗效果，为临床用药提供了新的选择。
发明人通过银屑病个性化用药的方法预测了银屑病批准药物和研发药物的有效率，证实了我们预测方法的准确性，因此我们也用该方法对阿司咪唑和珠氯噻醇这两种Nrf2激动剂的药效进行预测，再次说明Nrf2激动剂阿司咪唑和珠氯噻醇确实对银屑病具有一定的治疗效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉百药联科科技有限公司
<120> Nrf2激动剂在制备治疗银屑病的药物中的应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
atggcctccc tgtaccacat c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Human
<400> 2
tgttgcgctc aatctcctcc t 21
<210> 3
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<212> DNA
<213> Human
<400> 3
cgcagacctt gtgatattcc ag 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Human
<400> 4
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<212> DNA
<213> Human
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ttggagttgc acagctggat tc 22
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<212> DNA
<213> Human
<400> 6
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<211> 23
<212> DNA
<213> Human
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tcatgaagtg tgacgtggac atc 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> Human
<400> 8
caggaggagc aatgatcttg atct 24
Claims (5)
1.Nrf2激动剂在制备治疗银屑病的药物中的应用,其特征在于，所述Nrf2激动剂为珠氯噻醇。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射液或固体口服制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述固体口服制剂为临床上可接受的颗粒剂、胶囊或片剂。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Nrf2激动剂为珠氯噻醇，其成人口服使用剂量为0.5-300mg/day，其成人注射使用剂量为10-1000mg/次，每2-4周注射一次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| Antipsychotic inductors of brain hypothermia and torpor-like states: perspectives of application;Yury S. Tarahovsky等;《Psychopharmacology》;20161208;第1-12页 * |
| Identification of Non-Electrophilic Nrf2 Activators from Approved Drugs;Qing-Ye Zhang等;《molecules》;20170526;第22卷;第1-12页 * |
| Pro-oxidant status and Nrf2 levels in psoriasis vulgaris skin tissues and dimethyl fumarate-treated HaCaT cells;Yoon Jin Lee等;《Arch. Pharm. Res.》;20170916;第1-12页 * |
| Yoon Jin Lee等.Pro-oxidant status and Nrf2 levels in psoriasis vulgaris skin tissues and dimethyl fumarate-treated HaCaT cells.《Arch. Pharm. Res.》.2017,第1-12页. * |
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