CN110724179A

CN110724179A - 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途

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Publication number: CN110724179A
Application number: CN201910970783.9A
Authority: CN
Inventors: 陈勇; 赵宁; 朱东烈
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2020-01-24
Anticipated expiration: 2039-10-14
Also published as: CN110724179B

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途，筛选初始的多肽序列为：VLGLLAVVLVLVI。由于溶解性问题，进一步将初始13肽分成9肽(VL‑9序列为：VLGLLAVVL)与4肽(序列为：VLVI)两部分，分别进行细胞功能学实验验证，结果发现9肽具有明显肿瘤抑制作用。本发明人发现将VL‑9序列任意打乱之后得到的系列多肽，都保留较强的抑癌活性，且分别能够与人源性蛋白的片段相匹配，为了加强溶解性我们在9肽的两端各加上4个精氨酸而形成RR‑17人源性抗肿瘤系列多肽，其中RR‑171活性最为明显。本发明涉及的多肽是通过固相合成方法获得的。体内外药效学实验结果表明，本发明的多肽可显著抑制人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97H的生长，具有潜在的抗肿瘤药物开发价值。

Description

一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种多肽的筛选、合成及其应用，本发明的多肽具有抗肿瘤活性。

背景技术

癌症仍是威胁人类健康的重要因素，中国是癌症大国，发病人数和死亡人数均居世界第一。随着现代医学技术的进步，癌症的治疗已经有了飞跃式的发展，各类治疗方法和治疗药物层出不穷，但治疗效果仍不理想。癌症治疗的局面仍然非常复杂，其中癌症筛查、精准治疗以及老龄化是目前影响肿瘤治疗的主要三个方面。因此研发更为有效的肿瘤靶向治疗药物已成为当前研究的热点。

近年来，许多科学家将抗癌药物的研究重点放在了不良反应少、活性高、不容易产生耐药的多肽药物上。多肽是化学与生物学交叉的一个领域，与生物的生长、代谢、免疫、疾病等密切相关，发挥重要的调控作用。多肽易于穿透细胞膜，分子量小、活性高，不易产生耐药性且易于改造，越来越受到人们的关注，在临床上的尝试和应用越来越广泛。但抗肿瘤肽(ACPs)也有不足之处，主要有两点，一是容易被血液中的一些蛋白酶水解或者被内皮系统吸收，导致稳定性差。二是多肽的选择性弱，容易对人体正常的活细胞会有一些毒副作用。药物的设计思路对ACPs的抗肿瘤活性、稳定性、选择性有重要影响。通过氨基酸序列的设计，可以筛选出抗肿瘤活性极好的多肽。

抗肿瘤多肽来源十分广泛，主要有以下几种：1.天然产物肽：是指从昆虫、动物、植物、海洋生物和微生物等体内或其代谢产物中提取出来的生物活性多肽。如从萨氏海鞘得到抗肿瘤多肽CS5931，该多肽可以通过诱导结肠癌细胞Cyc C的释放，导致了caspases 3和caspases9的活化，使结肠癌癌细胞亡。2.化学合成肽：利用化学合成技术，以氨基酸为原料合成多肽。化学合成多肽方法简单，产量较多。还能通过化学修饰的方法，提高其稳定性和可溶性，在抗肿瘤领域有很大的应用价值。固相合成法、液相合成法是化学合成多肽经常使用的两种方法。3.噬菌体肽库：噬菌体展示技术1985年Smith建立，在筛选功能性多肽有广泛的应用，可以筛选相关抗原，筛选靶向肽，研究疫苗，免疫诊断等。有人用细胞膜上可表达的KDR(血管内皮生长因子的受体)筛选噬茵体七肽库，并用化学方法合成短肽AATWLPPR。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途,本发明的多肽可显著抑制人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97H的生长，具有潜在的抗肿瘤药物开发价值。

本发明的技术方案是：

一种抗肿瘤多肽VL-9，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID：No.1 所示。

一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID：No.2 所示。

一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于该多肽为具有显著抑制肿瘤细胞活性的生物学效应多肽。

一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于，包含与药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂和其他介质混合的任一项的多肽或者其盐。

本发明人通过对脐带血清高效色谱筛选和MALDI-TOF MS质谱检测，得到了13肽，其序列为VLGLLAVVLVLVI。根据13肽的序列特征，将13肽分成9肽(VL-9的序列为：SEQ ID：No.1 VLGLLAVVL)与4肽(序列为：VLVI)两部分，分别进行细胞功能学实验验证，结果发现VL-9具有明显肿瘤抑制作用。本发明人发现将VL-9序列任意打乱之后得到的系列多肽，都保留较强的抑癌活性，且分别能够与人源性蛋白的片段相匹配，为了加强溶解性我们在 9肽的两端各加上4个精氨酸而形成RR-17人源性抗肿瘤系列多肽，其中我们发现RR-171肿瘤抑制活性最显著，(RR-171的序列为：SEQ ID：No.2 RRRRLVAGVLVLLRRRR)。本发明采用固相化学合成法获得具有较高抗肿瘤活性的目标多肽。药效学实验表明，RR-171人源性抗肿瘤多肽体内外显著抑制人肝癌细胞的生长，表明RR-171人源性抗肿瘤多肽可能作为一种抗肿瘤治疗的药物。

本发明所述的“RR-171人源性抗肿瘤多肽”也包括本领域技术人员所知的将SEQIDNo.2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代或添加且具有相同活性的由其衍生的多肽或蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、前导序列、分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列等；一个或多个保守性氨基酸残基被取代；或成熟多肽与另一化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合所形成的多肽；也可以是一个或几个氨基酸残基中具有取代基团的多肽。

附图说明

图1是MTT检测多肽的生物学活性。

图2是流式检测肿瘤细胞死亡。

图3是裸鼠荷瘤实验体内验证多肽的抗肿瘤特性。

图4是多肽RR-171与阴性对照多肽RR-170和PBS空白对照组相比，导致MHCC97H细胞凋亡的细胞比例图。

图5是多肽RR-171与阴性对照多肽RR-170和PBS空白对照组相比，注射多肽RR-171组的裸鼠肿瘤的体积变化图。

具体实施方式

一、多肽筛选和改构

血清样品的制备：收集胎儿脐带血清约5ml，室温下静置30分钟后，4℃低温保存4小时后离心(2000r/min、10min)，吸取上层血清置于-80℃保存待用。

二维色谱：体积排阻色谱(SEC):将血清样品用PBS(pH7.4)稀释10倍，每次进样100μl。流动相为20mmol·L-1KH2PO4+ 100mmol·L-1NaCl，pH＝7.0，流速0.5ml·min-1。用紫外检测仪在 280nm进行检测。按照色谱洗脱曲线进行分段收集，由于SEC分离主要取决于被分离分子的大小，因此血清中第一段组分主要为血清中大分子量蛋白质。本研究主要收集160min-180min和200min-220min 后两段组分，将收集的色谱组分浓缩冻干，如图1所示。反相液相色谱(RPLC)：用150μl超纯水融解浓缩冻干的色谱组分。取100μl用 C18大孔反相液相色谱柱分离，以CH₃OH-H₂O-1‰三氟乙酸(TFA) 体系为流动相，A液为H₂O+1‰TFA，B液为CH₃OH+1‰TFA， 30min线形梯度洗脱从100％A到100％B，后延长15min。按照色谱洗脱曲线进行分段收集反向液相色谱相关产物，进行质谱鉴定，于质核比2021处检测到特异性峰。经测序和生物信息学分析，确定该序列为VLGLLAVVLVLVI。如图2所示。

二、多肽合成

本发明多肽均为固相化学合成法获得，具体步骤如下：

多肽固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)进行。以Fmoc-Ile-wangregin树脂为载体，用DCM膨胀后树脂体积扩大，使其在后面的反应中能和反应溶剂充分接触；在六氢吡啶DMF 溶液的作用下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸Fmoc-Ala-OH 接到固相载体上。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ- 二环己基碳二亚胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基活化后的的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，在固相载体上就生成一个带有保护基的二肽。依次重复上面的反应步骤，使肽链从C端向N端延长，直至达到所需要的肽链长度，最后N端合成Fmoc-Ala-OH。反应完成后在六氢吡啶DMF 溶液的作用下，脱掉氨基的保护基，最后再次使用DCM膨胀两次，用乙醚或者甲醇收缩干燥后下肽。

三、生物学效应

1、RR-171多肽在体外对肝癌细胞系生长的影响。

细胞活力检测：用含10％胎牛血清的DMEM培养Hep3B细胞，常规铺96孔板，每孔细胞约5000个/200ul。每孔加入多肽RR-171 及其对照序列RR-170，工作浓度分别为0μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、 25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、200ug/ml。多肽作用24h后，利用MTT法检测细胞存活情况。每孔加入MTT试剂20ul，37℃继续培养4-6h，弃去培养液，加入150μl DMSO，室温避光震荡10min，多功能酶标仪检测OD值，波长为490nm。

结果显示：多肽RR-171能显著抑制肿瘤细胞(A为肝癌细胞系、 B为胰腺癌细胞系、C为结肠癌细胞系、D为卵巢癌细胞系、E为乳腺癌细胞系、F为肺癌细胞系、G为胃癌细胞系)的活力，其生物学作用体现一定的浓度梯度效应。而对照多肽RR-170则不体现生物学活性，如图3所示。

流式细胞仪检测：正常培养MHCC97H细胞至70％融合，加入分别多肽RR-171工作浓度100μg/ml，继续培养24h；收集细胞， 1000r/min离心5min，弃去培养液，孵育缓冲液(10mmol/L HEPES/NaOH，PH7.4，140mmol/L NaCL，5mmol/L CaCL2)洗涤1 次，1000r/min离心5min；100ul标记液(FITC-Annexin V和PI加入孵育缓冲液，终浓度1ug/ml)室温避光孵育15min，孵育缓冲液洗涤一次，加入荧光溶液(SA-FLOUS)4℃避光孵育20min，流式细胞仪检测。结果显示：多肽RR-171能导致MHCC97H细胞凋亡细胞比例明显增加。对照多肽RR-170和空白对照无此效应，如图4所示。

2、RR-17对人肝癌MHCC97H裸鼠异种移植肿瘤小鼠的体内抑制活性研究。

构建裸鼠荷瘤模型，研究多肽RR-17对肿瘤的体内抑制活性。 6-7周大小雌性裸鼠(购自北京)，于每只裸鼠背部皮下注射3×10⁶个 MHCC97H细胞，注射体积200ul。一周后将上述裸鼠随机分为三组，分别尾静脉注射200ul PBS(空白对照)、RR-170(阴性对照)(2mg/ml)、 RR-171(2mg/ml)4天注射一次，连续注射20天后，处死小鼠，测量肿瘤体积，肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝ 1/2×a×b²，其中a、b分别表示长和宽。

结果显示：RR-171对人肝癌细胞MHCC97H的体内成瘤抑制作用明显；与阴性对照多肽RR-170组和PBS空白对照组相比，注射多肽RR-171组的裸鼠肿瘤的体积明显缩小，如图5所示。

需要说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。

凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 陈勇

<120> 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

Val Leu Gly Leu Leu Ala Val Val Leu

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

Arg Arg Arg Arg Leu Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg

Claims

1.一种抗肿瘤多肽VL-9，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID：No.1所示。

2.一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。

3.根据权利要求书2所述的一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于该多肽为具有显著抑制肿瘤细胞活性的生物学效应多肽。

4.根据权利要求书2所述的一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求书2所述的一种抗肿瘤多肽RR-171，其特征在于，包含与药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂和其他介质混合的任一项的多肽或者其盐。