CN110719789A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自至少5种流感病毒毒株的流感病毒抗原和一种或更多种式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐或酯：其中：R1表示氢或C1‑6烷基；R2表示C1‑6烷基；并且R3表示C1‑6烷基。本发明还涉及制备免疫原性组合物的方法、包括免疫原性组合物的药物组合物和疫苗组合物以及免疫原性药物组合物和疫苗组合物用于预防流感病毒感染的用途。

Description

疫苗组合物
技术领域
本发明涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自流感病毒的至少5种毒株的流感病毒抗原和具体的二烷基甘氨酸化合物和三烷基甘氨酸化合物。本发明也涉及制备免疫原性组合物的方法、包括免疫原性组合物的药物组合物和疫苗组合物，以及免疫原性药物组合物和疫苗组合物用于预防流感病毒感染的用途。
背景技术
流感病毒是正粘病毒科的成员。存在命名为A、B、C和D的4种类型的流感病毒。A、B和C感染人。
流感的季节性流行可在世界范围内快速扩散，并且在医院和其他卫生保健成本以及损失的生产力方面，造成了明显的经济负担。世界卫生组织估计，在每年的流感流行时，严重疾病的病例在三百万和五百万之间，并且世界范围内每年约250,000和500,000例死亡。
目前的季节性流感疫苗为三价的或四价的。2015年，疫苗的成本是31亿美元，并且预测到2025年为43亿美元。每年，基于预测的主要的传播流感毒株而开发新的季节性流感疫苗。
当在人群中出现具有高致病性和新抗原性的新流感毒株时，将发生流感流行病。在一年中，全球流行病可影响20％和40％之间的世界人口。例如，1918-1919年的流行病影响了世界上2亿人，使超过3千万人去世。尽管从那时起，卫生保健已经显著提高，开发了疫苗和抗病毒的疗法，但是估计如今的流行病将导致全球两百万至七百万的死亡。
因为免疫干扰，认为疫苗可包括的抗原的数量是有限的(J Exp Med.1969 Oct 1；130(4)：821-832)。当更多的抗原包括在组合物中时，降低了对各自抗原的应答，因此限制了可包括在疫苗中的抗原的数量。流感疫苗通常为三价的并且最近为四价的。
发明内容
令人吃惊地，本发明人已经发现可制备包括来自流感病毒的5种或更多种毒株的抗原的多价免疫原性组合物。通过在存在二烷基甘氨酸和三烷基甘氨酸(比如二甲基甘氨酸(DMG)和/或三甲基甘氨酸(TMG))的情况下，将流感病毒抗原冷冻、冻干或热处理而制备免疫原性组合物。
由于免疫干扰，开发包括来自至少5种流感病毒毒株的抗原的免疫原性组合物是出乎意料的。因为需要的抗原的量，之前将更多的流感病毒毒株放入单个疫苗中的尝试已经失败了。通过在存在DMG和TMG的情况下将流感病毒抗原进行热处理，发明人已经令人吃惊地开发了包括来自流感病毒的15种毒株的流感病毒抗原的免疫原性组合物。开发的组合物令人吃惊地预期提供了针对组合物中的流感病毒抗原所源自的所有流感毒株的保护。
目前的流感疫苗是三价的或四价的，即它们限于含有来自3种或4种流感毒株的抗原。每年，基于预测的该季节主要的传播流感毒株，必须重新设计季节性流感疫苗，这已经证实为不准确的科学，其中12年中的6年(2003/2004年至2014/2015年之间)毒株选择错配-最近的例子是2014/2015年中对于北半球的H3N2毒株选择了A/Texas/50/2012，但是最终A/Switzerland/9715293/2013占优，导致疫苗效力低至3.4％(Pebody RG等人(2015)LOWEFFECTIVENESS OF SEASONAL INFLUENZA VACCINE IN PREVENTING LABORATORY-CONFIRMED INFLUENZA IN PRIMARY CARE IN THE KINGDOM：2014/15MID–SEASONRESULTS.Eurosurveillance，Volume 20，Issue 5；http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx？ArticleId＝21025)。提供包括来自5种或更多种流感毒株的抗原的疫苗将不仅仅增加毒株覆盖范围从而当进行毒株选择时，包括不是最流行但是具有支配潜力的毒株，其还可以降低必须重新设计季节性流感疫苗的频率。此外，其具有提供针对A、B、C和D型的所有毒株，包括所有亚型以及抗原漂移变体的流感疫苗的潜力。这可消除对每年重新设计季节性流感疫苗的需求。
所以，本发明提供了免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自至少5种流感病毒毒株的流感病毒抗原和一种或更多种式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐或酯：
Figure BDA0002278728260000031
其中：
R1表示氢或C1-6烷基；
R2表示C1-6烷基；和
R3表示C1-6烷基。
本发明还提供了制备根据本发明的免疫原性组合物的方法，所述方法包括(a)冷冻、(b)热处理和/或(c)冻干(i)单种含水组合物或(ii)两种或更多种含水组合物，所述单种含水组合物包括流感病毒抗原和化合物，所述两种或更多种含水组合物均包括至少一种流感病毒抗原和至少一种化合物；和随后将所得的处理的组合物组合。
本发明还提供了通过本发明的方法获得的或可获得的免疫原性组合物。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包括本发明的免疫原性组合物，以及可选地，药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本发明的免疫原性组合物，以及可选地，药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明还提供了在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的免疫原性组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物。
本发明还提供了在受试者中预防流感病毒的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的免疫原性组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物。
本发明还提供了本发明的免疫原性组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的用途。
本发明还提供了本发明的免疫原性组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物在受试者中预防流感病毒感染的用途。
本发明还提供了本发明的免疫原性组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物在制造用于在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的药物中的用途。
本发明还提供了本发明的免疫原性组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物在制造用于在受试者中预防流感病毒感染的药物中的用途。
本发明还提供了单位剂型，所述单位剂型包括本发明的免疫原性组合物、本发明的药物组合物或本发明的疫苗组合物。
附图说明
图1显示了对于包括在第0天和第天28施用至BALB-c小鼠的源自15种流感毒株的抗原的多价组合物的凝血素抑制试验(HAI)的结果。在第-7天(即，第一次施用之前7天)和在第11天、第25天、第35天和第45天，在从小鼠中获得的血清中测量HAI滴度。从各自第11天、第25天、第35天和第45天中扣除第-7天的测量，以校正血清中固有存在的背景免疫前非特异性的HAI活性。对于每个时间点的从左向右的条对应于图中从上到下列举的流感毒株。
具体实施方式
应当理解，可为本领域具体的需要定制所公开的产品和方法的不同应用。还应理解，本文使用的术语是仅仅为了描述本发明的具体实施例的目的，并且不旨在是限制性的。除非另外定义，否则本文使用的技术和科技术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
另外，如在本说明书和所附的权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述(该)”包括复数提及物，除非上下文明确另外指出。因此，例如，提及“化合物”包括这种化合物的两种或更多种例子或变体，或提及“毒株”包括两种或更多种这种毒株等。
一般而言，术语“包括”旨在是指包括但不限于，例如“包括流感抗原”的组合物指示组合物具有该流感抗原，但是可包括另外的流感抗原。在本发明的一些实施例中，措辞“包括”可被措辞“基本上由……组成”替换。
本文无论上文或下文引用的所有的出版物、专利和专利申请，通过引用以它们的整体并入本文。
免疫原性药物组合物和疫苗组合物
本发明的免疫原性组合物包括源自至少5种流感病毒毒株的流感病毒抗原。本发明的药物组合物包括本发明的免疫原性组合物。药物组合物可以可选地包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。本发明的疫苗组合物包括本发明的免疫原性组合物。疫苗组合物可以可选地包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
组合物描述为“免疫原性(的)”意思是组合物必须能够诱导免疫应答。例如，免疫原性药物组合物或疫苗组合物为当施用至患者，比如人类患者时，可产生免疫应答的组合物。优选地，免疫应答针对流感病毒。更优选地，免疫应答针对组合物中的一种抗原所源自的至少一种流感病毒毒株。甚至更优选地，免疫应答针对组合物中的流感病毒抗原所源自的所有的流感病毒毒株。在一个实施例中，免疫原性药物组合物或疫苗组合物包括有效量的流感病毒抗原。有效量的流感病毒抗原为当其作为免疫原性组合物的一部分施用至患者时，足够诱导免疫应答的量。有效量可取决于许多因素而改变，包括患者的体型、他们的年龄和他们是否免疫低下。为了诱导保护免疫性，可能需要多次(例如2次、3次或更多次)施用。
免疫应答可为T细胞应答。免疫应答可为B细胞应答。免疫应答可为T细胞和B细胞应答二者。例如，免疫应答包括B细胞(体液)应答，其中由分化的B淋巴细胞产生针对流感病毒抗原的抗体；和/或T细胞(细胞介导)应答，其中各种类型的T淋巴细胞对流感病毒抗原作出应答。当免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至受试者时，受试者可产生抗体。抗体优选地特定针对流感病毒抗原所源自的一种或更多种或所有的流感病毒毒株。免疫应答可在受试者中导致血清转化，即受试者中的下述水平：其在将来，例如，在自施用的2天至20年的时间点，比如1个月、3个月或6个月，或1年、2年、5年或10年，响应暴露于流感病毒抗原将产生抗体。本领域技术人员可使用本领域已知的技术确定受试者是否是血清转化的，例如，从受试者提取血液样品并且测试抗体的水平。
确定组合物是否可诱导免疫应答的方法是本领域技术人员熟知的。例如，使用HAI试验(例如，参见实施例)。测量体液免疫和细胞免疫的方法包括ELISA、细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)试验、CTL前体频率试验、T-细胞增殖试验、羧基乙酸荧光素琥珀酰亚胺基酯试验、使用ELISA或多通道和流式细胞术通过培养中的细胞进行细胞内和细胞外细胞因子或抗体产生、多官能团T-细胞试验、细胞因子记忆和ASC(抗原特异性抗体-分泌细胞)二者的ELISpot、MHC I/II类四聚物结合、HAI、NAI、病毒中和以及DTH。
优选地，免疫应答是保护性的，即，如果将免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至宿主，则该宿主出现针对流感病毒的保护性免疫应答。通常，保护性免疫应答针对组合物中的至少一种抗原所源自的至少一种流感病毒毒株，并且优选地针对免疫原性组合物中的抗原所源自的所有流感病毒毒株。可经挑战试验确定免疫原性药物组合物或疫苗组合物是否是保护性的。例如，免疫原性药物组合物或疫苗组合物可施用至测试动物，比如小鼠，并且然后可将小鼠暴露于流感病毒，优选组合物中的抗原所源自的一种毒株。如果小鼠被流感感染了至少2天、至少3天、至少5天、至少7天、至少14天或至少21天仍活着，则免疫原性药物组合物或疫苗组合物视为能够诱导保护性免疫应答。可选地，血凝抑制(HAI)试验是可用于指示组合物是否可诱导保护性免疫应答的标准技术。用于该试验的示例性方案阐释在本文的示例中。等于或大于40的背景校正后的HAI滴度视为指示保护免疫性应答水平(Skountzou，Ioanna等人“Influenza Virus-Specific Neutralizing IgM AntibodiesPersist for a Lifetime.”Ed.S.A.Plotkin.Clinical and Vaccine Immunology：CVI21.11(2014)：1481-1489.PMC.)。可通过扣除施用前HAI滴度，例如，扣除施用前7天记录的HAI滴度而校正背景。因此，在一些实施例中，流感抗原的有效量可为针对流感病毒抗原所源自的一种或更多种流感病毒毒株产生40或更多的背景校正后的HAI滴度的量。
如本文所讨论，免疫原性组合物可针对并非免疫原性组合物中的流感病毒抗原所源自的流感病毒毒株产生免疫应答。这种免疫应答优选地另外针对流感病毒抗原所源自的一种或更多种、优选地所有的流感毒株产生免疫应答。该交叉反应性是优势，因为其可防范并非免疫原性组合物中的流感病毒抗原所源自的流感病毒毒株。所以，可获得针对因为抗原漂移而具有突变的流感病毒毒株的保护。在施用免疫原性药物组合物或疫苗组合物之后产生的免疫应答可针对并非在组合物中存在的抗原所源自的一种或更多种毒株和/或一种或更多种亚型。在一些实施例中，流感病毒抗原的有效量可为针对并非免疫原性组合物中的流感病毒抗原所源自的一种或更多种流感病毒毒株产生40或更多的背景校正后的HAI滴度的量。在这种实施例中，优选地，有效量针对免疫原性组合物中的流感病毒抗原所源自的一种或更多种、优选地所有的流感病毒毒株也产生40或更多的背景校正后的HAI滴度。免疫原性药物组合物或疫苗组合物可针对任何流感病毒毒株，比如本文所述的那些流感病毒毒株，产生免疫应答。流感病毒毒株可为季节性毒株或流行病毒株。免疫原性药物组合物或疫苗组合物可针对A、B、C和D类的所有毒株，包括所有亚型以及抗原漂移变体，产生免疫应答。免疫原性药物组合物或疫苗组合物可针对流感A的所有亚型和/或流感B的所有亚型产生免疫应答。免疫原性药物组合物或疫苗组合物可针对流感A的所有毒株和/或流感B的所有毒株产生免疫应答。可消除每年重新设计季节性流感疫苗的需求。
当本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至受试者时，可发生本文讨论的免疫应答。例如，本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物当施用至受试者时，可针对至少5种流感病毒抗原的至少一种诱导免疫应答。优选地，免疫应答针对所有5种流感病毒抗原。免疫应答优选地针对免疫原性组合物中存在的所有流感病毒抗原，比如15种。免疫应答优选地为保护性的。如本文所讨论，等于或大于40的背景校正后的HAI滴度视为指示保护免疫性应答水平。因此，在一些实施例中，本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物当施用至受试者时，对于流感病毒抗原所源自的一种或更多种或每种流感病毒毒株，可产生40或更多的背景校正后的HAI滴度。在一些实施例中，本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物当施用至受试者时，对于不是免疫原性组合物中的流感病毒抗原所源自的一种或更多种流感病毒毒株，可产生40或更多的背景校正后的HAI滴度。
本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物当施用至受试者时，对于至少5种流感病毒抗原的至少一种，可诱导血清转化。优选地，血清转化针对于所有5种流感病毒抗原。血清转化优选地针对于免疫原性组合物中存在的所有流感病毒抗原，比如15种。通过已知的方法，本领域技术人员可确定受试者，比如人，是否是血清转化的。在一些实施例中，本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物可对于流感病毒抗原所源自的一种或更多种或每种流感病毒毒株诱导血清转化。在一些实施例中，本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物可对于不是免疫原性组合物中的流感病毒抗原所源自的一种或更多种流感病毒毒株诱导血清转化。
在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物可基本上由下述组成：源自至少5种毒株的流感抗原和一种或更多种式(I)的化合物或生理学上可接受的盐或酯。在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物可基本上由下述组成：源自至少5种毒株的流感抗原、一种或更多种式(I)的化合物或生理学上可接受的盐或酯以及辅助剂。在这种实施例中，免疫原性组合物可包括不实质上影响免疫原性组合物的基本特性的其他组分。
确定药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂是本领域标准的。许多药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂是本领域技术人员熟知的并且可容易采用而用在本发明中。例如，适当的药学上可接受的赋形剂包括碳水化合物、多元醇、氨基酸、氢氧化铝、氢氧化镁、羟基磷灰石、滑石、氧化钛、氢氧化铁、硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、明胶、植物蛋白胨(vegetal peptone)、黄原胶、阿拉伯胶或环糊精。药物组合物或疫苗组合物可包括或是乳霜、乳液、凝胶脂质体、纳米颗粒或软膏。可选地，药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂不包括任何源自动物的组分。
冷冻、冻干或热处理之后，可将所得组合物分别融化、重构或冷却，并且然后用作免疫原性药物组合物或疫苗组合物。在一个实施例中，本文所述的含水组合物(多种组合物)可包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在这种实施例中，典型地，处理为冷冻或热处理。当处理为冻干时，可使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂将所得组合物重构。必要的话，在使用之前，可利用例如磷酸盐缓冲盐水或注射用水，将免疫原性药物组合物或疫苗组合物稀释。
根据本发明的制备方法处理至少一种流感病毒抗原，即冷冻、热处理和/或冻干本发明的包括流感病毒抗原和化合物的含水组合物。优选地，根据本发明的制备方法处理免疫原性药物组合物或疫苗组合物中的所有流感病毒抗原。可使用与一种或更多种其他流感病毒抗原不同的处理来处理一种或更多种流感病毒抗原。例如，一种或更多种流感病毒抗原可被热处理并且一种或更多种其他流感病毒抗原可被冷冻。
本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物可被冻干。在这种冻干的实施例中，本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物可包括稳定剂，比如海藻糖、乳糖或麦芽糖。
免疫原性药物组合物或疫苗组合物还可以包括辅助剂。辅助剂是用作免疫刺激剂即增强宿主的对流感病毒的免疫应答的化合物。适当的辅助剂包括本文所述的那些，包括铝盐氢氧化物。
在一些实施例中，本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至患者，并且这可在患者中诱导免疫应答。免疫应答的类型可为本文所述的任何免疫应答。优选地，免疫应答针对组合物中的抗原所源自的至少一种流感病毒毒株。更优选地，免疫应答针对组合物中的抗原所源自的所有流感毒株。优选地，免疫应答是保护性的。确定组合物是否可诱导免疫应答的方法是本领域技术人员熟知的并且本文讨论了示例。
本发明提供了本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物在预防受试者中的流感病毒感染中的用途。本发明还提供了预防流感病毒感染的方法，所述方法包括将本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至受试者。预防流感病毒感染的方法可包括将有效量的本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至受试者。本发明还提供了本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物在制造用于受试者中的流感病毒感染的药物中的用途。预防的流感病毒感染通常为组合物中的至少一种抗原所源自的至少一种流感病毒毒株，并且优选地为组合物中的抗原所源自的所有流感病毒毒株。预防的流感病毒感染可为任何流感毒株，比如本文所述的那些。流感病毒毒株可为季节性毒株或流行病毒株。可以以两个剂量施用免疫原性药物组合物或疫苗组合物。在这种实施例中，有效量为在施用第二剂量之后，足够诱导免疫应答的量。类似地，可使用三剂量方案，或使用更多数量的剂量的方案。
本发明提供了免疫原性药物组合物或疫苗组合物在受试者针对流感病毒感染的疫苗接种中的用途。本发明还提供了针对流感病毒感染的疫苗接种的方法，所述方法包括将本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至受试者。疫苗接种的方法可包括将有效量的本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物施用至受试者。本发明还提供了本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物在制造用于在受试者针对流感病毒感染的疫苗接种的药物中的用途。疫苗接种的流感病毒通常针对组合物中的至少一种抗原所源自的至少一种流感病毒毒株，并且优选针对组合物中的抗原所源自的所有流感病毒毒株。疫苗接种的流感病毒感染可针对任何流感毒株，比如本文所述的那些。流感病毒毒株可为季节性毒株或流行病毒株。
使用已知的技术，本领域技术人员可容易确定将施用至受试者的药物组合物或疫苗组合物的适当的量。
本发明还提供了包括本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物的单位剂型。单位剂型包括限定量的形成免疫原性药物组合物或疫苗组合物的剂量的流感病毒抗原和化合物。使用本领域已知的技术，技术人员可容易确定限定量。限定量是产生期望的免疫应答的量，比如如本文所描述的有效量。免疫应答可为本文所述的那些免疫应答中的任何免疫应答。免疫应答优选地为保护性的。如本文所描述，可存在大于一个剂量。所以，与剂量方案中的剂量数相同数量的单位剂型可产生免疫应答，其优选地为保护性的。确定组合物是否可诱导免疫应答的方法是本领域技术人员熟知的并且本文讨论了示例。
可通过例如对人或动物患者进行注射来施用免疫原性药物组合物或疫苗组合物。患者可为需要疫苗接种的。典型地，患者为人。可通过肠胃外、肠或局部施用来施用免疫原性药物组合物或疫苗组合物。可作为喷雾(鼻、肺)、口服/栓剂剂量或经皮施用免疫原性药物组合物或疫苗组合物。可皮下施用免疫原性药物组合物或疫苗组合物。
患者可为“处于风险中的”人群的一部分的人。这种患者包括儿童，老年患者，和/或遭受肺疾病、糖尿病、癌症或肾或心脏问题的患者。该患者群体特别优选用本发明的免疫原性药物组合物或疫苗组合物处理，因为当与标准疫苗比较时，用本疫苗实现的免疫性可为快速的，并且这减小了患者在疫苗接种和出现免疫性之间的时间段内被感染的风险。
术语“患者”和“受试者”在本文互换使用。术语不表示具体的年龄，因此，旨在覆盖成年和新生个体。术语“患者”和“受试者”包括人和其他灵长类，包括非人灵长类，比如黑猩猩和其他无尾猴和猴子种。术语“患者”和“受试者”也包括鸟，包括家养的鸟、野生的鸟和猎鸟，比如小鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭子和鹅。术语“患者”和“受试者”还包括农场动物，比如牛、绵羊、猪、山羊和马。术语“患者”和“受试者”还包括家养的哺乳动物，比如狗和猫。术语“患者”和“受试者”还包括实验室动物，包括啮齿动物，比如小鼠、大鼠和豚鼠。优选地，患者或受试者为人。
流感病毒抗原
本发明的免疫原性组合物包括源自至少5种流感毒株的流感病毒抗原。免疫原性组合物可包括源自多于5种流感病毒毒株的流感病毒抗原。免疫原性组合物可包括源自至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种流感病毒毒株的流感病毒抗原。免疫原性组合物优选地包括源自至少6种或至少7种流感病毒毒株的流感病毒抗原。免疫原性组合物可包括源自不多于20种流感病毒毒株的流感病毒抗原。因此，免疫原性组合物可包括源自5种至20种、5种至19种、5种至18种、5种至17种、5种至16种或5种至15种流感病毒毒株的流感病毒抗原。免疫原性组合物可包括源自6种至20种、6种至19种、6种至18种、6种至17种、6种至16种或6种至15种流感病毒毒株的流感病毒抗原。免疫原性组合物可包括源自7种至15种、8种至15种、8种至15种、10种至15种、11种至15种、12种至15种或13种至15种流感病毒毒株的流感病毒抗原。免疫原性组合物可包括源自7种至19种、9种至18种、11种至17种、13种至16种、14种至16种或15种至18种流感病毒毒株的流感病毒抗原。
免疫原性组合物优选地包括源自15种流感病毒毒株的流感病毒抗原。
抗原包括至少一种免疫原性抗原决定部位。抗原可包括一种或更多种B细胞抗原决定部位。抗原可包括一种或更多种T细胞抗原决定部位。抗原可包括一种或更多种B细胞抗原决定部位和一种或更多种T细胞抗原决定部位。使用本领域已知的方法，技术人员可确定免疫原性抗原决定部位的存在。可使用本文所述的用于测量免疫应答的方法。例如，可使用HAI试验(例如，参见实施例)确定免疫原性抗原决定部位的存在。抗原能够诱导免疫应答，优选地在动物比如人中。例如，抗原肽序列为可诱导这种免疫应答的序列。确定这种免疫应答是否可诱导的方法是本领域技术人员熟知的并且本文讨论了具体的实施例。
源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为该流感病毒毒株的所有或一部分。流感病毒毒株可为任何流感病毒毒株，比如本文所述的那些。流感毒株可为如本文所描述的任何类型或亚型。“完整流感病毒”为包括野生型流感病毒的基本上所有组分的流感病毒。
源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为该流感病毒毒株的失活的完整流感病毒、分离的流感病毒、流感病毒亚单位、流感病毒体或活的减毒流感病毒。流感病毒抗原都可通过相同的技术制备。例如，流感抗原都可为失活的完整流感病毒、分离流感病毒、流感病毒亚单位、流感病毒体或活的减毒流感病毒。流感病毒抗原可通过一种以上的技术制备。例如，一种或更多种流感病毒抗原可为失活的完整流感病毒，并且一种或更多种流感病毒抗原可为亚单位流感病毒。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可使用细胞培养制备(例如，对于流感病毒亚单位)，或可为源自蛋的(例如，对于失活的完整流感病毒)。一种或更多种流感病毒抗原可使用细胞培养制备，并且一种或更多种流感病毒抗原可为源自蛋的。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可使用烟草叶、昆虫细胞或病毒样颗粒(VLP)技术制备(Pillet等人；Vaccine；“Plant-derived H7 VLP vaccine elicits protective immune responseagainst H7N9 influenza virus in mice and ferrets”；2015Nov 17；33(46)：6282-9)。使用细胞培养是有利的，因为(i)其不需要使用鸡蛋，其使得流感病毒抗原对于施用至鸡蛋过敏的患者更安全，和(ii)能够更快地启动流感疫苗制造过程，因为该过程不受鸡蛋供应能力的限制。本发明的优势为与疫苗的源自蛋的和基于细胞的制造兼容。
“活的减毒病毒”为与野生型病毒相比，较不易对其宿主造成疾病的病毒。因此“活的减毒流感病毒”为与野生型流感病毒相比，对其宿主较不病原性。流感病毒可通过将流感病毒经外源宿主比如组织培养或鸡蛋传代而减毒。病毒可传代5次至50次，比如20次或30次。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为该流感病毒毒株的活的减毒流感病毒。
可使用噬菌斑测定法(plaque assay)测量病毒传染。适当的噬菌斑形成试验涉及以不同的稀释，感染汇合单层的宿主细胞，适当地源自H9的神经干细胞或其他初级未分化的神经培养物，或胶质母细胞瘤细胞，比如U251。当病毒感染固定的细胞单层中的细胞时，形成病毒噬菌斑。病毒感染的细胞将裂解并且将感染扩散至邻近细胞等。感染的细胞区域将产生视觉可见或使用显微镜可见的噬菌斑，并且这些可被计数。如果形成的噬菌斑的数量大于参考病毒，则测试病毒比参考病毒更有感染性。
完整活的减毒病毒可用作疫苗组合物的组分，因为它们包括天然病毒的所有组分。因为它们包括天然病毒的所有组分，所以当受试者用完整病毒免疫时，它们暴露于它们针对其可获得免疫性的许多抗原。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为该流感病毒毒株的完整活的减毒流感病毒。
“失活的病毒”指通过例如将病毒暴露于能够破坏病毒外壳的试剂而已经失活的病毒。这种失活的病毒用于疫苗，因为它们含有病毒抗原但是一般不能感染宿主。但是，在一些情况下，失活的病毒可能不是完全失活的，即一些病毒的颗粒在失活之后可为完整的，其能够感染宿主。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为该流感病毒毒株的失活的流感病毒。
“病毒亚单位”指包括一部分病毒的颗粒。例如“病毒亚单位”可包括与至少一种病毒外壳蛋白复合但是不必与所有的病毒外壳蛋白复合的多核苷酸。通常使用细胞培养制备病毒亚单位。细胞培养中的细胞可为昆虫细胞。病毒亚单位可为重组体和/或纯化的。病毒亚单位可为重组体和/或纯化的HA和NA。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为该流感病毒毒株的病毒亚单位，例如来自该流感病毒毒株的HA和NA。
“分离的病毒”通常为已经被去污剂或其他试剂破坏而使脂质包膜溶解的失活的病毒。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为该流感病毒毒株的分离的病毒。
源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为流感蛋白，例如，本文所述的任何流感病毒蛋白，比如表面蛋白。尤其，源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为血细胞凝集素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)、核蛋白/核衣壳蛋白(NP)、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2或PB2蛋白。例如，源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15、HA16、HA17或HA18。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为NA1、NA2、NA3、NA4、NA5、NA6、NA7、NA8或NA9。例如，源自流感毒株的流感病毒抗原可为与来自该流感病毒毒株的HA或NA相同的HA或NA。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为与在该流感病毒毒株中存在的抗原的序列相同的序列。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可包括相同数量的NA和HA蛋白。
如果源自流感病毒毒株的流感病毒抗原为蛋白，则如果流感病毒抗原的序列与来自该流感病毒毒株的抗原的序列至少90％相同，则流感病毒抗原“源自”流感病毒毒株。例如，源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为与流感A的亚型HA1的毒株(比如，流感A的H1N1亚型)(例如，07/102 A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)(IVR-145))中存在的HA1蛋白的序列至少90％相同的HA1蛋白序列。在进一步的实施例中，源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为与流感A的亚型NA2毒株(比如，流感A型的H3N2亚型)(例如，09/310 A/威斯康辛/15/2009(H3N2)(NYMCX-183))中存在的NA2蛋白的序列至少90％相同的NA2蛋白序列。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原的序列可与该流感病毒毒株中存在的抗原的序列至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
本发明的免疫原性组合物的流感病毒抗原所源自的流感病毒毒株中的抗原可为该流感病毒毒株中存在的较大组分比如蛋白的片段。例如，片段可为HA的一部分。片段能够在受试者中诱导免疫应答，优选地诱导保护性免疫应答。因此，片段包括至少一个免疫原性抗原决定部位。片段可包括一种或更多种B细胞抗原决定部位。片段可包括一种或更多种T细胞抗原决定部位。片段可包括一种或更多种B细胞抗原决定部位和一种或更多种T细胞抗原决定部位。使用本领域已知的方法，技术人员可确定免疫原性抗原决定部位的存在。可使用本文所述的用于测量免疫应答的方法。例如，可使用HAI试验确定免疫原性抗原决定部位的存在(例如，参见实施例)。如果片段为蛋白，比如流感表面蛋白，则片段的长度通常为至少50个氨基酸。例如，片段的长度可为至少75、100、150、200、300、400或500个氨基酸。片段可为本文所述的任何流感蛋白。例如，片段可为NA或HA的片段。如果源自流感病毒毒株的流感病毒抗原为蛋白片段，则如果流感病毒抗原的序列与该流感病毒毒株中存在的蛋白的片段的序列至少90％相同，则流感病毒抗原源自流感病毒毒株。例如，源自流感病毒毒株的流感病毒抗原可为与流感A的亚型NA1的毒株，比如流感A的H1N1亚型，例如08/100 A/布里斯班/59/2007(IVR-148)(H1N1)中存在的NA1蛋白的序列至少90％相同的NA1蛋白序列的片段。源自流感病毒毒株的流感病毒抗原的序列可与该流感病毒毒株中存在的蛋白的片段序列至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
测量序列同一性的方法是本领域熟知的。当确定流感病毒抗原序列(“参考”序列)是否与具体的流感病毒毒株中存在的序列(“测试”序列)90％相同时，将测试序列与参考序列的全长进行比较。例如，当确定本发明的流感病毒抗原是否“源自”具体的流感病毒毒株时，“参考”序列为免疫原性组合物中包括的本发明的流感病毒抗原，并且“测试”序列为感染的流感病毒抗原可源自的具体的流感病毒毒株中存在的序列。例如，测试序列，例如HA1，可与参考序列，例如免疫原性组合物中包括的HA1的片段进行比较。参考序列的全长与测试序列对齐。如果参考序列的全部长度与测试序列的部分或全长90％相同，则参考序列视为源自含有测试序列的毒株。序列可为氨基酸序列。如果测试序列为融合蛋白，则融合蛋白的一部分可源自流感病毒毒株，并且蛋白的该部分(参考序列)与测试序列进行比较。
可使用BLAST来比较序列。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)是公众可用的。
流感毒株
本发明的免疫原性组合物包括源自至少5种流感毒株的流感抗原。根据来源的宿主种类、分离的年份、地理起源和系列号，将流感毒株分类。而且，对于流感A型，流感毒株也通过HA和NA的亚型的血清学特性分类。
至少5种流感毒株可都为相同类型的流感，或可大于一种类型的流感。每种流感毒株可独立地为A型、B型、C型或D型。优选地，一种或更多种或所有流感毒株为当前传播和/或过去10年中已经传播的流感的毒株。优选地，至少一种流感毒株为A型流感。优选地，至少一种流感毒株为B型流感。更优选地，至少一种流感毒株为A型流感并且至少一种流感毒株为B型流感。一种或更多种流感毒株可为具有任何HA亚型比如HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15、HA16、HA17或HA18和/或任何NA亚型比如NA1、NA2、NA3、NA4、NA5、NA6、NA7、NA8或NA9的A型流感毒株。A型流感毒株可为H1N1、H5N1、H3N2、H7N7、H7N9、H1N2、H2N2、H7N3、H5N2、H1N7、H9N2、H7N2或H10N7。优选地，A型流感毒株为H1N1或H3N2。至少5种流感毒株中，可存在为相同亚型的多于一种的A型流感毒株。至少5种流感毒株中，可存在多于一种亚型的A型流感。优选地，至少一种毒株为H1N1并且至少一种毒株为H3N2。免疫原性组合物中可包括的流感毒株的例子为07/102 A/所罗门群岛(SolomonIslands)/3/2006(H1N1)(IVR-145)、02/336 A/新喀里多尼亚(New Caledonia)、08/100 A/布里斯班(Brisbane)/59/2007(IVR-148)(H1N1)、08/140 B/佛罗里达(Florida)/4/2006、08/184 B/马来西亚(Malaysia)/2506/2004、09/174 A/加利福尼亚(California)/7/09(H1N1)(NYMCX-179A)、09/310 A/威斯康辛(Wisconsin)/15/2009(H3N2)(NYMCX-183)、12/ 110 B/威斯康辛/1/2010(源自细胞的)、12/112 A/维多利亚(Victoria)/210/2009(H3N2)(NYMCX-187)、12/114 A/维多利亚/361/2011(H3N2)(IVR-165)、13/134 B/马萨诸塞(Massachusetts)/02/2012、13/162 A/德克萨斯(Texas)/50/2012(H3N2)(NYMCX-223A)、13/234 B/布里斯班(Brisbane)/60/08、14/252 B/普吉岛(Phuket)/3073/2013和14/254A/瑞士(Switzerland)/9715293/2013(NIB88)，其中所有都可包括在免疫原性组合物中。(加下划线的粗体＝NIBSC鉴定的流感资源中心(IRC))。免疫原性组合物中可包括的流感毒株亚型的例子为H1N1、H3N2、H5N1、H5N6、H7N7、H7N9和H9N2，其中所有都可包括在免疫原性组合物中。流感病毒毒株可均为季节性毒株或流行病毒株，或可为季节性毒株和流行病毒株的组合。
制备免疫原性组合物
本发明提供了制备免疫原性组合物的方法。当为也包括一种或更多种化合物的含水组合物时，通过冷冻、热处理和/或冻干流感抗原，而制备免疫原性组合物。流感抗原通常与化合物混合，而产生一种或更多种含水组合物，然后使含水组合物经受处理，比如冷冻、热处理和/或冻干，这增加了流感抗原的免疫原性。在存在化合物的情况下将流感抗原冷冻、热处理和/或冻干，与如果流感抗原仅仅与化合物混合而不冷冻、热处理和/或冻干所观察到的相比，增加了抗原的免疫原性。
可使用包括流感病毒抗原的单个含水组合物制备免疫原性组合物。免疫原性组合物可以可选地如下制备：使用两种或更多种含水组合物，其均包括至少一种流感病毒抗原以及一种或更多种化合物中的至少一种化合物；以及随后将所得的处理后的组合物组合。“所得的处理后的组合物”为从冷冻、热处理和/或冻干产生的组合物。所述含水组合物或每种含水组合物可进行一种或更多种类型的处理。一种或更多种含水组合物可进行与一种或更多种其他含水组合物不同的处理或处理组合。
流感病毒抗原和化合物在处理期间相互作用，从而与处理之前的流感病毒抗原的免疫原性相比，增加了流感病毒抗原的免疫原性。所以，在处理步骤期间，抗原的免疫原性通常增加。
典型地，处理为冷冻或热处理或冻干，优选热处理。可选地，可使用处理的组合，比如冷冻随后热处理，或冻干随后热处理。在后一种情况下，冻干的组合物将通常在热处理之前被重构。
在分别冷冻、冻干或热处理之后，所得的组合物可被融化、重构或冷却，并且作为免疫原性组合物、药物组合物或疫苗组合物施用。
如本文所描述，在冷冻、热处理和/或冻干之前，含水组合物可包括所有的流感病毒抗原，或可选地，一种或更多种流感病毒抗原可在分开的含水组合物中进行冷冻、热处理和/或冻干，然后进行组合以形成免疫原性组合物。因此，一种或更多种流感抗原可单独地进行处理并且然后组合。
可通过如下制备免疫原性组合物：通过本领域技术人员的方法(例如，本文的示例中举例的)，将每种流感抗原单独吸附至铝胶，产生可添加化学组分甘露醇、DMG和TMG的批量多价合并掺混物。
含水组合物
可存在多于一种含水组合物。存在一种含水组合物，单个含水组合物包括化合物和流感病毒抗原。在冷冻、热处理和/或冻干之前，单个含水组合物可包括所有的流感抗原。如果存在两种或更多种含水组合物，则两种或更多种含水组合物均包括至少一种流感病毒抗原和至少一种化合物。因此，一种或更多种流感抗原可在分开的含水组合物中进行冷冻、热处理和/或冻干并且然后组合以形成免疫原性组合物。可存在与流感病毒抗原相同数量的含水组合物。如在任何单个含水组合物中可存在多于一种流感病毒抗原，可存在比流感病毒抗原更少的含水组合物。本文的含水组合物的描述可独立地应用于每种含水组合物。
含水组合物通常为悬浮液或溶液。可通过在水性溶剂中将化合物与流感病毒抗原掺混而制备含水组合物。可使用任何适当的水性溶剂体系。水性溶剂可为缓冲水。水性溶剂通常为HEPES缓冲水、Tris缓冲水、磷酸盐缓冲水或纯水。
可选地，在与化合物和流感病毒抗原混合之前将一种或更多种糖与水性溶剂混合。可选地，可以在化合物和流感病毒抗原之后将一种或更多种糖可与水性溶剂混合。
可选地，在与化合物和流感病毒抗原混合之前将辅助剂与水性溶剂混合。可选地，可在化合物和流感病毒抗原之后将辅助剂与水性溶剂混合。
典型地，如果存在辅助剂，则也将存在一种或更多种糖，因为一种或更多种糖将通常使辅助剂稳定，特别是在处理步骤期间。
其他组分也可存在于含水组合物中。例如，也可存在式(II)的化合物：
Figure BDA0002278728260000181
其中，X表示-S(O)2-，Ra和Rb独立地表示C1-6烷基。式(II)的优选的化合物为甲基磺酰甲烷(MSM)，其中Ra和Rb都表示甲基。一种或更多种化合物和式(II)的化合物的组合可在一起相互作用，从而在处理步骤期间进一步增加流感抗原的免疫原性。
含水组合物中的一种或更多种化合物的浓度通常的范围为0.001M或更大，优选地范围为0.01M或更大，并且更优选地0.1M或更大，例如0.1M至5.0M，或约0.5M。优选地，免疫原性组合物包括0.3M至0.5M的本发明的一种化合物和0.3M至0.5M的本发明的另一化合物。更优选地，免疫原性组合物包括约0.4M的本发明的一种化合物和约0.4M的本发明的另一化合物。
如果使用一种或更多种糖，则含水组合物中糖的浓度或糖的总浓度通常为1M或更小，优选地0.7M或更小，例如0.5M或更小或0.3M或更小。糖浓度或总浓度可下降至0.1mM或至0.5mM。糖浓度或总浓度可为0.5M至0.7M，优选为约0.6M。
采用的每种组分的具体的浓度将取决于若干因素，包括流感病毒抗原的性质；使用的化合物；是否使用一种或更多种糖，并且如果是，则糖的身份如何；是否存在辅助剂；和采用的具体的冷冻、冻干或热处理程序。
化合物
本发明的免疫原性组合物包括式(I)的一种或更多种化合物或其生理学上可接受的盐或酯。本文化合物的描述可独立地应用于各化合物。可存在2种、3种、4种或更多种化合物。可存在1至3种化合物。优选地，存在2种化合物。
生理学上可接受的盐通常为具有生理学上可接受的酸的盐，并且因此包括与无机酸(比如盐酸或硫酸)或有机酸(比如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、富马酸或甲磺酸)形成的那些。盐酸盐是优选的。
酯通常为C1-6烷基酯，优选地C1-4烷基酯。所以，酯可为甲基酯、乙基酯、丙基酯、异丙基酯、丁基酯、异丁基酯或叔丁基酯。乙酯是优选的。
如本文所使用，C1-6烷基优选地为C1-4烷基。优选的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。甲基和乙基是特别优选的。
为了避免疑义，式(I)的化合物的定义也包括其中羧酸盐阴离子被质子化以产生-COOH并且铵阳离子与药学上可接受的阴离子缔合的化合物。此外，为了避免疑义，上面定义的化合物可以以任何对映体形式使用。
典型地，R1表示氢或C1-4烷基，优选地为氢或C1-3烷基，更优选地为氢、乙基或甲基，最优选地为氢或甲基。
典型地，R2表示C1-4烷基，优选地为C1-3烷基，更优选地为乙基或甲基，最优选地为甲基。
典型地，R3表示C1-4烷基，优选地为C1-3烷基，更优选地为乙基或甲基，最优选地为甲基。
R2和R3可以是相同的或不同的，但是优选是相同的。当R1表示C1-6烷基时，则R1、R2和R3可以是相同的或不同的，但是优选是相同的。
在优选的实施例中，R1表示氢，R2和R3为如上定义的。因此，特别优选的是，R1表示氢，R2和R3表示甲基，使得式(I)的化合物为二甲基甘氨酸。
在可选的优选的实施例中，R1表示C1-6烷基，R2和R3为如上定义的。因此，特别优选的是，R1至R3都表示甲基，使得式(I)的化合物为三甲基甘氨酸。
在优选的实施例中，免疫原性组合物包括二甲基甘氨酸(DMG)和三甲基甘氨酸(TMG)二者。更优选地，免疫原性组合物包括约0.4M的DMG和约0.4M的TMG。
糖
一种或更多种糖可选地存在于所述含水组合物或每种含水组合物中。如果存在大于一种含水组合物，则每种含水组合物中存在的糖可不同或相同。可存在两种或更多种糖，例如两种、三种或四种糖。优选地，存在一种或两种糖，最优选地存在两种糖。化合物和糖的组合可一起相互作用，从而在处理步骤期间，进一步增加流感抗原的免疫原性。在处理步骤期间，糖还有助于使辅助剂(当存在时)特别是铝盐辅助剂稳定。
糖通常为单糖、二糖、三糖、四糖、糖醇或另一寡糖。
典型地，单糖为葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘油醛、半乳糖或甘露糖。典型地，二糖为蔗糖、海藻糖、乳糖、纤维二糖、松二糖、麦芽酮糖、蜜二糖、异麦芽糖或麦芽糖。典型地，三糖为棉子糖、松三糖或伞形糖。典型地，四糖为水苏糖。典型地，糖醇为甘露醇。寡糖的其他例子包括戊多糖毛蕊花糖。
典型地，糖为非还原糖，例如蔗糖或棉子糖。
当水溶液中存在一种糖时，糖优选地为甘露醇或蔗糖，优选甘露醇。
当水悬浮液中存在两种糖时，糖优选地为蔗糖和棉子糖。
辅助剂
辅助剂可选地存在于所述含水组合物或每种含水组合物中和/或存在于免疫原性药物组合物或疫苗组合物中。可使用任何适当的辅助剂，但是铝盐辅助剂是优选的。当使用铝盐辅助剂时，优选的是，一种或更多种糖也存在于所述含水组合物或每种含水组合物中，以在处理步骤期间使辅助剂稳定。
典型地，铝盐辅助剂为氢氧化铝(Al(OH)3)、磷酸铝(AlPO4)、铝盐酸盐(aluminiumhydrochloride)、硫酸铝、铵铝矾、钾铝矾或硅酸铝。优选地，使用的铝盐辅助剂为氢氧化铝或磷酸铝。最优选地，铝盐辅助剂为氢氧化铝(Al(OH)3)。
典型地，铝盐辅助剂为从铝盐制备的水合凝胶的形式，水合凝胶为水性介质中的微粒悬浮液。铝盐辅助剂的制备是本领域技术人员熟知的。例如，氢氧化铝和磷酸铝辅助剂通常通过将铝离子(通常如硫酸盐或氯化物)的水溶液在良好限定和控制的化学环境中暴露于碱条件而制备，如本领域技术人员已知的。这种方法可用于例如制备氢氧化铝或磷酸铝水合凝胶。
冷冻
所述含水组合物或每种含水组合物的冷冻可通过任何适当的方法进行。因此，冷冻可通过浸渍在液氮或液氮蒸汽中、放置在冰箱中或使用干冰和醇冷冻浴进行。
典型地，将所述含水化合物或每种含水组合物冷冻至-4℃或更低，优选-10℃或更低，更优选-20℃或更低，更优选-30℃。所述含水化合物或每种含水组合物通常不冷冻低于-100℃。所述含水化合物或每种含水组合物可例如被冷冻至约-80℃。
所述含水化合物或每种含水组合物通常保持在期望的温度下冷冻30分钟或更长，优选1小时或更长，例如2小时至24小时。
在用作免疫原性组合物、药物组合物或疫苗之前，通常允许所述或每种冷冻的含水组合物保持在室温下而融化。
冷冻和融化条件可适当地经常规实验而优化。
冻干
可根据标准程序进行冻干。有三个主要阶段：冷冻、初级干燥和次级干燥。通常使用冻干机器进行冷冻。在该步骤中，重要的是将生物材料冷却低于其共晶点，即，固相和液相材料可共存的最低温度。这确保在下述步骤中发生升华而不是熔化。可选地，非晶材料没有共晶点，但是具有临界点，在临界点以下必须保持产物，以防止在初级和次级干燥期间的回熔或坍塌。
在初级干燥期间，通过应用适当水平的真空来控制压力，但是提供足够的热，以能够使水升华。材料中至少50％，通常60％至70％的水在该阶段升华。初级干燥可为缓慢的，因为过多的热可降解或改变生物材料的结构。冷的冷凝器腔和/或冷凝器板提供在其上通过再凝固而捕获水蒸汽的表面。
在次级干燥过程中，通过进一步施加热而去除水合的水。典型地，也降低压力，以促进进一步的干燥。在完成冻干过程之后，可以在密封之前用惰性气体比如氮打破真空，或可以在真空下将材料进行密封。
在用作疫苗之前，使用例如水或水性缓冲液，将冻干的组合物重构为含水组合物。
可经常规实验适当地优化冻干条件。
热处理
可通过任何适当的方法进行所述含水化合物或每种含水组合物的热处理。
典型地，将所述含水化合物或每种含水组合物加热至大于30℃，优选大于40℃。更优选地，将所述含水化合物或每种含水组合物加热至30℃至80℃，例如35℃至60℃或40℃至50℃的温度。优选的温度为约45℃。
一旦所述含水化合物或每种含水组合物已经被加热至期望的温度，则所述含水化合物或每种含水组合物优选地保持在该温度下30分钟或更长，优选1小时或更长，例如2小时至2周或4小时至24小时。
典型的热处理涉及加热至约45℃并且保持在该温度下约7天。
在用作疫苗之前，通常使得所述或每种热处理的含水组合物返回至室温。
可经常规实验适当地优化热处理条件。
免疫原性的增加
流感病毒抗原的免疫原性是该抗原在动物体，比如人体中激发免疫应答的能力。可通过使用预测免疫应答的水平的标准试验，比较未处理的(对照)流感抗原的免疫原性与已根据本发明处理的流感病毒抗原的免疫原性，而测量免疫原性的改变。可使用本领域技术人员已知的任何适当的技术，比如本文所述的那些，测量流感病毒抗原的免疫原性。优选的标准技术是血凝抑制试验。用于该试验的示例性方案在下面的示例中阐述。
热处理、冷冻或冻干本发明的包括化合物和流感病毒抗原的含水组合物的使用增加了流感病毒抗原的免疫原性。本发明的流感病毒抗原的增加的免疫原性是指可用更小量的流感病毒抗原获得相同免疫应答。因此，如果患者施用剂量D的未处理的流感病毒抗原并且剂量D实现了免疫原性的水平，则通常0.5D或更少、优选0.1D或更少、更优选0.01D或更少剂量的处理的流感病毒抗原将实现相同水平的免疫原性。通常在施用至患者之后至少10天(例如10天、15天或20天之后)测量免疫原性。
本发明的处理的流感病毒抗原增加的免疫原性是指相比未处理的流感病毒抗原，免疫性的出现发生地更快。因此，如果患者在施用给定剂量的未处理的抗原需要时间T获取免疫性，则对于施用相同剂量的处理的抗原患者，其通常需要0.75T或更少的时间，优选0.5T或更少的时间，最优选0.2T或更少的时间获取免疫性。
下面的示例阐释了本发明。
示例
制备多价流感组合物，其由下述15种流感抗原毒株组成：07/102 A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)(IVR-145)、02/336 A/新喀里多尼亚、08/100 A/布里斯班/59/2007(IVR-148)(H1N1)、08/140 B/佛罗里达/4/2006、08/184 B/马来西亚/2506/2004、09/174 A/加利福尼亚/7/09(H1N1)v(NYMCX-179A)、09/310 A/威斯康辛/15/2009(H3N2)(NYMCX-183)、12/ 110 B/威斯康辛/1/2010(源自细胞的)、12/112 A/维多利亚/210/2009(H3N2)(NYMCX-187)、12/114 A/维多利亚/361/2011(H3N2)(IVR-165)、13/134 B/马萨诸塞/02/2012、13/ 162 A/德克萨斯/50/2012(H3N2)(NYMCX-223A)、13/234 B/布里斯班/60/08、14/252 B/普吉岛/3073/2013、14/254 A/瑞士/9715293/2013(NIB88)。(加下划线的粗体＝NIBSC鉴定的流感资源中心(IRC))。
材料和方法
如下制备HEPES缓冲液：在圆筒中测量20ml的无菌水。在校准检查后的天平上称重0.0437g的NaC1并且使用磁力搅拌器和棒溶于无菌水中。添加1.2ml的1M HEPES并且搅拌。当充分溶解时，使用pH计和氢氧化钠将pH改变至7.9。用无菌水使最终体积达到30ml。然后，在生物学安全工作橱中通过0.2μm过滤器单元，将最终的HEPES缓冲液混合物过滤。
称重组分(在示例中称为“赋形剂组分”)DMG(1.237g)、TMG(1.406g)和甘露醇(3.276g)，然后放置在50ml无菌烧瓶中。然后，将约6ml的HEPES缓冲液添加至烧瓶中，并且通过起漩涡使内容物混合。然后，将烧瓶和内容物在+60℃水浴中加热，直到溶解。当溶解时，测量混合物的体积并且用更多的HEPES缓冲液使最终体积达到10ml。在生物学安全工作橱中，通过0.2μm过滤器单元，将赋形剂制剂过滤。
使冻干的流感病毒抗原毒株07/102 A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)(IVR-145)、02/336 A/新喀里多尼亚、08/100 A/布里斯班/59/2007(IVR-148)(H1N1)、08/140 B/佛罗里达/4/2006、08/184 B/马来西亚/2506/2004、09/174 A/加利福尼亚/7/09(H1N1)(NYMCX-179A)、09/310 A/威斯康辛/15/2009(H3N2)(NYMCX-183)、12/110 B/威斯康辛/1/2010(源自细胞的)、12/112 A/维多利亚/210/2009(H3N2)(NYMCX-187)、12/114 A/维多利亚/361/2011(H3N2)(IVR-165)、13/134 B/马萨诸塞/02/2012、13/162 A/德克萨斯/50/2012(H3N2)(NYMCX-223A)、13/234 B/布里斯班/60/08、14/252 B/普吉岛/3073/2013、14/254 A/瑞士/9715293/2013(NIB88)的小瓶从-20℃达到室温并且在无菌水中制备抗原的工作储料。将每种相应的流感病毒抗原组分按体积计1份的流感病毒抗原添加至1.292份的铝胶(2％初始浓度)中，用于吸收，其在室温下，在摇板(50rpm)上进行1小时(50rpm)，并且在4℃下静置过夜。吸收之后，将相应的流感病毒抗原组分合并，以将多价组合物装入添加了赋形剂组分和另外的HEPES缓冲液的拧旋螺帽的小瓶中，体积份为1份流感病毒抗原合并物、1.162份赋形剂组分和1.382份HEPES缓冲液，产生总计3ml体积。然后，将总体积存储在45℃下5天，作为名义上的热处理过程。制备的最终疫苗组合物含有0.32％的铝胶、0.6M的甘露醇、0.4M的DMG、0.4M的TMG，其中相应的流感病毒抗原组分浓度为1.252μg/ml并且总抗原浓度为18.78μg/ml。
在热处理之后，然后使疫苗组合物制品返回冷藏存储，然后在第0天和第28天，皮下施用(0.1ml剂量体积)至BALB-c小鼠。通过测量在第-7天(疫苗施用前)、第11天、第25天、第35天和第45天，从BALB-c小鼠获得的血清中的HAI滴度来确定组合物在各个时间点针对流感毒株的保护作用。
根据WO2015/155527 A1，第19页，经下面对第11行的修改(步骤1)，进行HAI试验。在WO2015/155527第19页的步骤1中，将血清在56℃下失活30分钟。但是，在当前的情况下，在步骤1中，使血清通过受体破坏酶处理，随后在56℃下加热30分钟而失活。
结果
HAI结果例证了(在小鼠中)15价流感皮下疫苗，其针对测试的所有的A/B毒株产生大于40的HAI滴度(见图1)。已经测量了15种毒株中的14种的免疫反应。预期第15种毒株(A/维多利亚/361/2011)显示相同的结果。等于或大于40的背景校正后的HAI滴度视为指示保护免疫性应答水平(Skountzou，Ioanna等人“Influenza Virus-Specific NeutralizingIgM Antibodies Persist for a Lifetime.”Ed.S.A.Plotkin.Clinical and VaccineImmunology：CVI 21.11(2014)：1481-1489.PMC.)。疫苗包括源自细胞培养的流感抗原和源自鸡蛋的资源。预期的是，疫苗可提供针对相同亚型的其他流感毒株的交叉保护。疫苗能够提供针对所有A、B、C和D型毒株，包括所有亚型以及抗原漂移变体的流感疫苗。这可消除对于每年重新设计季节性流感疫苗的需求。

Claims (32)

1.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自至少5种流感病毒毒株的流感病毒抗原和一种或更多种式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中：
R1表示氢或C1-6烷基；
R2表示C1-6烷基；并且
R3表示C1-6烷基。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自20种或更少流感病毒毒株的流感病毒抗原。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自至少6种流感病毒毒株的流感病毒抗原。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自8种至18种流感病毒毒株的流感病毒抗原。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自14种至18种流感病毒毒株的流感病毒抗原。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自15种流感病毒毒株的流感病毒抗原。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自至少2种流感病毒类型的流感病毒抗原。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括至少一种源自A型流感病毒毒株的流感病毒抗原和至少一种源自B型流感病毒毒株的流感病毒抗原。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自A型流感病毒的至少2种亚型的流感病毒抗原。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括至少一种源自A型流感病毒毒株的H1N1亚型的流感病毒抗原和至少一种源自A型流感病毒毒株的H3N2亚型的流感病毒抗原。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括源自一种或更多种下述流感病毒毒株的流感病毒抗原：
-07/102A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)(IVR-145)，
-02/336A/新喀里多尼亚，
-08/100A/布里斯班/59/2007(IVR-148)(H1N1)，
-08/140B/佛罗里达/4/2006，
-08/184B/马来西亚/2506/2004，
-09/174A/加利福尼亚/7/09(H1N1)(NYMCX-179A)，
-09/310A/威斯康辛/15/2009(H3N2)(NYMCX-183)，
-12/110B/威斯康辛/1/2010(源自细胞的)，
-12/112A/维多利亚/210/2009(H3N2)(NYMCX-187)，
-12/114A/维多利亚/361/2011(H3N2)(IVR-165)，
-13/134B/马萨诸塞/02/2012，
-13/162A/德克萨斯/50/2012(H3N2)(NYMCX-223A)，
-13/234B/布里斯班/60/08，
-14/252B/普吉岛/3073/2013，和
-14/254A/瑞士/9715293/2013(NIB88)。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括一种或两种式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐或酯。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括二甲基甘氨酸或其药学上可接受的盐或酯。
14.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括二甲基甘氨酸和三甲基甘氨酸，或其中的一者或二者的药学上可接受的盐或酯。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，其中当在另外包括所述化合物或每种化合物的含水组合物中时，所述流感病毒抗原先前已经进行了(a)冷冻、(b)热处理和/或(c)冻干。
16.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括一种或更多种糖。
17.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括一种糖，所述糖为甘露醇。
18.根据前述权利要求中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括辅助剂。
19.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其中所述辅助剂为铝盐辅助剂。
20.一种制备根据权利要求1至19中的任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：对(i)单种含水组合物或(ii)两种或更多种含水组合物进行(a)冷冻、(b)热处理和/或(c)冻干(i)，所述单种含水组合物包括所述流感病毒抗原和所述化合物，所述两种或更多种含水组合物均包括至少一种流感病毒抗原和至少一种化合物；以及随后将所得的处理后的组合物组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括热处理所述含水组合物。
22.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物是通过根据权利要求20或21中限定的所述方法获得的或可获得的。
23.根据权利要求1至19中的任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物是通过权利要求20或21中限定的所述方法制备的。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至19、22或23中的任一项所述的免疫原性组合物，以及可选地，药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
25.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括根据权利要求1至19、22或23中的任一项所述的免疫原性组合物，以及可选地，药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
26.一种在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至19、22或23中的任一项中限定的所述免疫原性组合物、如权利要求24中限定的所述药物组合物、或如权利要求25中限定的所述疫苗组合物。
27.一种在受试者中预防流感病毒的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至19、22或23中的任一项中限定的所述免疫原性组合物、如权利要求24中限定的所述药物组合物、或根据权利要求25所述的疫苗组合物。
28.如权利要求1至19、22或23中的任一项中限定的所述免疫原性组合物、如权利要求24中限定的所述药物组合物、或如权利要求25中限定的所述疫苗组合物在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的用途。
29.如权利要求1至19、22或23中的任一项中限定的所述免疫原性组合物、如权利要求24中限定的所述药物组合物、或如权利要求25中限定的所述疫苗组合物在受试者中预防流感病毒感染的用途。
30.如权利要求1至18、22或23中的任一项中限定的所述免疫原性组合物、如权利要求24中限定的所述药物组合物、或如权利要求25中限定的所述疫苗组合物在制造在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的药物中的用途。
31.如权利要求1至19、22或23中的任一项中限定的所述免疫原性组合物、如权利要求24中限定的所述药物组合物、或如权利要求25中限定的所述疫苗组合物在制造在受试者中预防流感病毒感染的药物中的用途。
32.一种单位剂型，所述单位剂型包括如权利要求1至18、21或22中的任一项限定的所述免疫原性组合物、如权利要求23中限定的所述药物组合物、或如权利要求24中限定的所述疫苗组合物。
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