CN110714086A - 赤眼鳟mda5双链rna结合位点区扩增的引物、方法及应用 - Google Patents

赤眼鳟mda5双链rna结合位点区扩增的引物、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的引物、方法及应用。赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的引物，该引物的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，后向引物序列如SEQ ID No.2所示。赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明获得具有增强鱼类细胞免疫功能的双链RNA结合特征序列，在鱼类分子免疫功能研究、疫苗制作和抗病分子育种方面具有良好应用前景。

Description

赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的引物、方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的引物、方法及应用。
背景技术
草鱼常因感染具双链RNA基因组的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)而致死。赤眼鳟对GCRV具有强抗性，可作为抗性资源供体与草鱼杂交获得强抗性子代，是研究抗性分子机制的优良材料。赤眼鳟和草鱼的胞质模式识别受体黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)均参与抗GCRV免疫。两种鱼MDA5序列差异主要是GCRV抗性赤眼鳟中存在具有病毒核酸结合功能的双链RNA结合位点，而GCRV易感草鱼缺乏该双链RNA结合功能位点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何扩增赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区并将其应用到鱼类抗GCRV中。
本发明的技术方案为：赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的引物，该引物的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，后向引物序列如SEQ ID No.2所示。
赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的方法，以赤眼鳟的DNA为扩增模板，以SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的引物进行PCR扩增，得到SEQ ID No.3所示的赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区。
进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃60s，共30个循环；72℃延伸7min。
一种表达质粒，含有SEQ ID No.3所示的核苷酸片段。
上述表达质粒的构建方法，以权利要求3所述的方法进行扩增，挑选目的产物进行纯化和回收，测序验证后经KpnⅠ和BamHⅠ酶切，然后与同样经KpnⅠ和BamHⅠ酶切的pEGFP-N1-Flag载体进行连接；连接体系为：0.5微升胶纯化回收片段、2.5微升线性化pEGFP-N1-Flag、1微升ExnaseⅡ、2微升5×CEⅡBuffer和4微升ddH2O；37℃连接30min；在转化涂板(Kan+)后挑菌测序，获取含有SEQ ID No.3所示的核苷酸片段的表达质粒。
本发明的所述的赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区或表达质粒在提高鱼类抗GCRV上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明获得具有增强鱼类细胞免疫功能的双链RNA结合特征序列，在鱼类分子免疫功能研究、疫苗制作和抗病分子育种方面具有良好应用前景。
附图说明
图1：目的质粒转染效果检测；
图2：IRF3和IFN的表达量检测。
具体实施方式
1、赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增
首先在NCBI里面预测获得MDA5的双链RNA结合位点区域，设计如下引物：
F:CGGGGTACCCAATGGGGCTCGATGATGC(SEQ ID No.1)
R:CGCGGATCCATCACAGTCCATGTCTTCTTCTGAGT(SEQ ID No.2)
以赤眼鳟DNA为模板，进行双链RNA结合位点区的PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃60s，共30个循环；72℃延伸7min。
2、构建含双链RNA结合位点区的表达质粒
对MDA5的双链RNA结合位点区域进行扩增后，挑选目的产物进行纯化和回收，测序验证后经KpnⅠ和BamHⅠ酶切，然后与同样经KpnⅠ和BamHⅠ酶切的pEGFP-N1-Flag载体进行连接。连接体系为：0.5微升胶纯化回收片段、2.5微升线性化pEGFP-N1-Flag、1微升ExnaseⅡ、2微升5×CEⅡBuffer和4微升ddH2O；37℃连接30min。在转化涂板(Kan+)后挑菌测序，获取含目的序列的表达质粒。其中双链RNA结合位点区域序列为：CAATGGGGCTCGATGATGCTGTATAAAAGCATCGAGTGTCCCTGCCTCCATATCAAGAACTTTGTGGTCACATACGGCTCTAAGAAGAAGACGTTCAGCAAATGGAGTGAGCTGCCCATAAGTTTCACTGCATTTGACTACACCCAACACGCCGATCTCCTTGTAGAGGACTCAGAAGAAGACATGGACTGTGAT(SEQ ID No.3)
3、细胞转染及GCRV攻毒实验
设立六瓶密度为80％的草鱼卵巢细胞；其中三瓶转染双链RNA结合区目的质粒，为实验组；三瓶转染pEGFP-N1-Flag空载体，为对照组。转染24h后观察细胞荧光情况，拍照保存并更换含10％胎牛血清的细胞培养液。发现细胞转染实验成功(图1)，其中绿色荧光部分所示为转染目的质粒成功的细胞。转染24h时，在实验组和对照组细胞中按10微升每毫升培养基的量加入GCRV病毒液，轻晃细胞瓶，使病毒均匀分布。
4、荧光定量检测
攻毒24h时，用15毫升离心管分别收集细胞，5000g/min离心10分钟后收集细胞沉淀，提取总RNA后用核酸蛋白仪检测其质量和浓度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；利用所提取的mRNA逆转录合成cDNA，通过荧光定量PCR检测发现转入双链RNA结合区的目标质粒实验组中IRF3和干扰素IFN的表达量显著高于对照组中对应基因的表达量(P<0.05，图2)。干扰素对抵抗病毒入侵具有重要作用，进行双链RNA结合区目的质粒转染的细胞干扰素表达量显著升高，表明着双链RNA结合区能提升细胞抗病毒能力。
引物序列如下表1所示：
Figure BDA0002245918850000031
本发明获得具有增强鱼类细胞免疫功能的双链RNA结合特征序列，在鱼类分子免疫功能研究、疫苗制作和抗病分子育种方面具有良好应用前景。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的引物、方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggggtaccc aatggggctc gatgatgc 28
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcggatcca tcacagtcca tgtcttcttc tgagt 35
<210> 3
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caatggggct cgatgatgct gtataaaagc atcgagtgtc cctgcctcca tatcaagaac 60
tttgtggtca catacggctc taagaagaag acgttcagca aatggagtga gctgcccata 120
agtttcactg catttgacta cacccaacac gccgatctcc ttgtagagga ctcagaagaa 180
gacatggact gtgat 195

Claims (7)

1.赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的引物，其特征在于，该引物的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，后向引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区扩增的方法，其特征在于，以赤眼鳟的DNA为扩增模板，以权利要求1所述的引物进行PCR扩增，得到SEQ ID No.3所示的赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区。
4.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃60s，共30个循环；72℃延伸7min。
5.一种表达质粒，含有SEQ ID No.3所示的核苷酸片段。
6.权利要求5所述的表达质粒的构建方法，其特征在于，以权利要求3所述的方法进行扩增，挑选目的产物进行纯化和回收，测序验证后经Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，然后与同样经KpnⅠ和BamH Ⅰ酶切的pEGFP-N1-Flag载体进行连接；连接体系为：0.5微升胶纯化回收片段、2.5微升线性化pEGFP-N1-Flag、1微升Exnase Ⅱ、2微升5×CE Ⅱ Buffer和4微升ddH2O；37℃连接30min；在转化涂板后挑菌测序，获取含有SEQ ID No.3所示的核苷酸片段的表达质粒。
7.权利要求2所述的赤眼鳟MDA5双链RNA结合位点区或权利要求5所述的表达质粒在提高鱼类抗GCRV上的应用。
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CN107760716A (zh) * 2017-10-27 2018-03-06 河南师范大学 草鱼呼肠孤病毒s11基因真核表达重组质粒的制备方法及其作为核酸疫苗的应用

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