CN110713990A

CN110713990A - 一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110713990A
Application number: CN201911002963.4A
Authority: CN
Inventors: 谭天伟; 李小芳; 陈必强; 张世鼎
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN110713990B

Abstract

本发明涉及一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用。该烯酸还原酶的突变体蛋白是基于由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因，运用易错PCR与半理性设计方法，通过随机突变与定点突变，经定向进化而获得；当该序列包含位于野生型ER‑BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的沿5′端到3′端方向的氨基酸突变子p.Ser109Asn、p.Gly111Asp、p.Leu181Pro、p.Ile187Asn、p.Phe207Tyr、p.Phe229Ile、p.Gly531Ser中的一个或几个时，该烯酸还原酶突变体的酶活力较出发菌株呈现显著提高。

Description

一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用

技术领域

本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用技术领域，涉及一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用。

背景技术

己二酸常用作合成尼龙6.6的中间体，是最重要的二元羧酸之一。据估计到2022年时，全球的己二酸市场将达到80亿磅，因此己二酸具有的商业价值不容小觑。目前生产己二酸普遍还是通过石油化工路线，如硝酸催化KA油(环己醇/环己酮混合物)的氧化进行化学合成，在合成过程中会产生大量的N₂O，其造成的温室气候影响比CO₂高298倍。己二酸生产造成的N₂O排放占工业总N₂O排放的80％左右，其工业减排潜力约占96.2％，使用绿色可再生原料生产己二酸可以有效地降低生产过程所带来的环境污染。生物基己二酸由于没有可靠的天然的合成途径，需要以基因工程和代谢工程的手段整合外源基因从而构建人工合成己二酸途径，但是到目前为止利用生物法合成己二酸在经济上看仍然是不可行的。对于构建热力学可行且经济可行的绿色生物己二酸途径还需要更多的努力。

生物法己二酸途径主要有两种：(1)生物合成己二酸前体并化学转化，研究较多的有顺，顺-粘康酸和葡萄糖酸的累积；(2)全生物合成，其中反向己二酸降解途径、β-氧化或逆β-氧化与ω-氧化途径结合、2-氧代庚二酸途径都是已经证明可行的方法(Karlsson，Emma，et al.Biotechnology advances 2018；Deng，Yu，Lizhou Ma，and YinMao.Biochemical engineering journal 2016：16-26；Polen，Tino，Markus Spelberg，etal.Journal of biotechnology 2013：75-84.)。

全生物合成中还存在一些尚未证实的理论途径，2-氧代己二酸途径就是其中一个，已经发现2-羟基己二酸、2-羟基己二酰CoA和2-己二酰CoA作为中间体将2-氧代己二酸转化为2-烯己二酸的酶催化途径(Parthasarathy，Anutthaman，et al.Biochemistry50.17(2011)：3540-3550.)。近期又证实了6种来自梭菌的烯酸还原酶(ERs)在大肠杆菌中表达后，其中5种具有催化2-烯己二酸到己二酸的活性，其中来自凝结芽孢杆菌的烯酸还原酶(enoate reductase from Bacillus coagulans，简称为ER-BC)具有最高的酶活，为2.3±0.04U.mg^-1，(Ress T，HummelW，Hanlon S.P，etal.ChemCatChem 2015，7，1302-1311)。烯酸还原酶较低的催化活性将会限制2-氧代己二酸途径合成己二酸的产量，若想获得高酶活或高催化效率的烯酸还原酶ER-BC，需要进一步对其进行定向进化改造。但是ER-BC的晶体结构、活性位点、催化机制等信息还尚未有报道，将会对烯酸还原酶定向进化的工作带来很大的阻碍。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种高酶活或高催化效率的烯酸还原酶ER-BC。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的烯酸还原酶ER-BC对2-烯己二酸催化效率低的问题，提供一种烯酸还原酶的突变体蛋白，其通过半理性设计进化改造，具有较高的酶活力；将该烯酸还原酶的突变体蛋白应用于催化还原烯酸类物质具有较高的催化效率。

为此，本发明第一方面提供了一种影响烯酸还原酶酶活力的氨基酸突变子，其包括位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变、第531位Gly与Ser的突变中的一个或几个。

本发明第二方面提供了一种烯酸还原酶的突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变、第531位Gly与Ser的突变中的一个或几个。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为1号ER-BC突变体蛋白，其序列中包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述1号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ IDNO 2所示。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为2号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第531位Gly与Ser的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述2号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ IDNO 3所示。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为3号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述3号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ IDNO4所示。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为4号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述4号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ IDNO5所示。

根据本发明，所述突变体蛋白还包括由本发明上述突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述突变体蛋白还包括由1号ER-BC突变体蛋白、2号ER-BC突变体蛋白、3号ER-BC突变体蛋白或4号ER-BC突变体蛋白的N端或C端连接His标签得到的融合蛋白。

本发明第三方面提供了一种影响烯酸还原酶酶活力的核苷酸突变子，其包括位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变、第1591位G与A的突变中的一个或几个。

本发明第四方面提供了一种编码本发明第二方面所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ IDNO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变、第1591位G与A的突变中的一个或几个。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ IDNO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ IDNO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第1591位G与A的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ IDNO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第542位T与C的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ IDNO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO10所示。

根据本发明，所述核酸分子为如下DNA分子：

(a1)编码区包括如SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列的DNA分子；

(a2)核苷酸序列如SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10所示的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码第二方面的所述的蛋白质的DNA分子。

本发明第五方面提供了一种含有如本发明第四方面所述核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

本发明第六方面提供了一种本发明第二方面所述的突变体蛋白的同源建模所得蛋白分子三维结构模型。

本发明第七方面提供了如第二方面所述的突变体蛋白或由本发明第四方面所述的核苷酸分子或如本发明第五方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化还原烯酸类物质中的应用。

在本发明的一些实施例中，所述应用包括催化还原烯酸类物质、提高催化还原烯酸类物质产量、提高烯酸还原酶ER-BC催化效率，和催化还原2-烯己二酸生成己二酸。

本发明的实验证明，本发明构建了凝结芽孢杆菌来源的ER-BC重组工程菌株。通过序列比对，对凝结芽孢杆菌来源的烯酸还原酶ER-BC进行同源建模，通过易错PCR随机突变与半理性设计定点突变，成功获得了酶活力提高24倍的烯酸还原酶ER-BC突变体。本发明提供的烯酸还原酶ER-BC突变体可以高效催化制备己二酸。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1为烯酸还原酶催化2-烯己二酸的反应示意图。

图2示出烯酸还原酶ER-BC超家族酶的序列比对结果。

图3为同源建模所得野生型烯酸还原酶ER-BC的三维结构图。

图4为野生型烯酸还原酶ER-BC与底物2-烯己二酸分子对接图。

图5为野生型ER-BC促反应动力学曲线图。

图6为3号突变体酶促反应动力学曲线图。

图7为4号突变体酶促反应动力学曲线图。

图8示出野生型烯酸还原酶ER-BC、烯酸还原酶ER-BC的3号突变体和4号突变体酶催化反应体系的LC-MS结果，其中a为野生型ER-BC；b为烯酸还原酶ER-BC的3号突变体；c为烯酸还原酶ER-BC的4号突变体；d为底物2-烯己二酸；产物己二酸的出峰时间为1.2min左右，底物2-烯己二酸出峰时间为2.2min左右。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

I.术语

本发明所述用语“dNTPs Mix”是指可用于聚合酶链式反应(PCR)、测序、填补、切口平移、cDNA合成及TdT加尾反应的试剂，其中，dNTP代表“2′-脱氧核苷酸-5′-三磷酸”，Mix包含四种核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。

本发明所述用语“NADH”(Nicotinamide adenine dinucleotide)与“NAD⁺”是细胞中的一对氧化还原对，其中，NADH是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶I，亦即辅酶INAD的还原形式，且其中N指烟酰胺，A指腺嘌呤，D是二核苷酸；而NAD⁺是辅酶INAD的氧化形式。

本发明中所述用语“核苷酸突变子”是指基因的核苷酸序列中可发生突变的最小单位。

类似地，本发明中所述用语“氨基酸突变子”是指蛋白质的氨基酸序列中可发生突变的最小单位。

本发明中所用标记“＞”在表示核苷酸突变时代表碱基替换。

本发明中所用标记“c.”表示蛋白质的编码基因的核苷酸序列。

本发明中所用标记“p.”在表示蛋白质突变子时代表蛋白质的氨基酸序列。

本发明所述用语“催化效率”是指催化还原烯酸类底物的比活力。

本发明中所述用语“酶活力”(enzyme activity)也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力；本发明中酶活力以比活力表示，是指每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位为U/mg。

本发明中所述用语“蛋白”与“蛋白质”可以互换使用。

II.实施方案

现有的烯酸还原酶ER-BC对2-烯己二酸催化效率低，为解决该问题，本发明人对于烯酸还原酶ER-BC进行了大量的研究，通过半理性设计进化改造，获得了具有较高活性的烯酸还原酶ER-BC的突变体蛋白。

进一步地，本发明人基于由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因(其GenBank登录号CP003056.1)，运用易错PCR与半理性设计方法，通过随机突变与定点突变，经定向进化而获得烯酸还原酶ER-BC的突变体蛋白。

具体地，本发明人通过以下步骤获得具有较高活性的烯酸还原酶ER-BC的突变体蛋白：

(1)基于由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因(其GenBank登录号CP003056.1)，通过易错PCR的方法构建随机突变文库，高通量筛选出酶活力提高的突变体，对有效突变体进行基因测序，从而提供有用的生物学信息；

(2)在步骤(1)所提供的生物学信息基础上，结合同源建模和半理性设计定点突变，构建一系列酶活提高的ER-BC突变体蛋白。

更加具体的操作参见本发明下文中的实施例1-4，实施例1-4对于较高活性的烯酸还原酶ERBC的突变体蛋白的制备过程进行了详细的说明。从中可以看出，本发明基于由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因(其GenBank登录号CP003056.1)，先通过构建易错PCR突变文库，高通量筛选2000个突变体，获得酶活力分别提高6.8、6.9倍的突变体，后经同源建模、理性设计与定点突变相结合，成功构建酶活力提高12倍的突变体，该烯酸还原酶ERBC可高效催化还原2-烯己二酸制备己二酸，其酶催化反应示意图如图1所示。

基于上述，在本发明第一方面，本发明人研究发现以下氨基酸突变子影响烯酸还原酶ER-BC的酶活力，其包括位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的沿5′端到3′端方向的第109位Ser与Asn的突变(p.Ser109Asn)、第111位Gly与Asp的突变(p.Gly111Asp)、第181位Leu与Pro的突变(p.Leu181Pro)、第187位Ile与Asn的突变(p.Ile187Asn)、第207位Phe与Tyr的突变(p.Phe207Tyr)、第229位Phe与Ile的突变(p.Phe229Ile)、第531位Gly与Ser的突变(p.Gly531Ser)中的一个或几个。

本发明中，所述野生型ER-BC由野生凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)产生，如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列为野生凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶的氨基酸序列。

本发明第二方面所提供的烯酸还原酶的突变体蛋白，其序列中包含如本发明第一方面所述的氨基酸突变子，这可以理解为，当其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变、第531位Gly与Ser的突变中的一个或几个时，ER-BC酶活力会呈现较显著的变化。

具体地，以下烯酸还原酶ER-BC的突变体蛋白具有相对于由野生凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)产生的野生型ER-BC具有显著提高的酶活力，尤其是对于2-烯己二酸的催化效率。

所述突变体蛋白为1号ER-BC突变体蛋白，其序列中包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变；所述1号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO 2所示。

所述突变体蛋白为2号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第531位Gly与Ser的突变；所述2号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO 3所示。

所述突变体蛋白为3号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变；所述3号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO4所示。

所述突变体蛋白为4号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变；所述4号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO5所示。

根据本发明的一些实施方式，ER-BC突变体蛋白质连接His标签可形成融合蛋白；在蛋白分离纯化时，His标签可与镍离子结合，从而分离杂蛋白与目的蛋白，而分离纯化所获得的由ER-BC突变体蛋白质连接His标签构成的融合蛋白可以直接用作催化剂用于催化还原2-烯己二酸制备己二酸，而不会对酶活力有不良影响。

基于上述，本发明中，所述突变体蛋白还包括其制备过程中分离纯化时由本发明上述ER-BC突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述突变体蛋白还包括由1号ER-BC突变体蛋白、2号ER-BC突变体蛋白、3号ER-BC突变体蛋白或4号ER-BC突变体蛋白的N端或C端连接His标签得到的融合蛋白。

在本发明第三方面，本发明人研究发现以下核苷酸突变子影响烯酸还原酶酶活力，其包括位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变(c.325T＞A)、第326位C与A的突变(c.326C＞A)、第332位G与A的突变(c.332G＞A)、第542位T与C的突变(c.542T＞C)、第560位T与A的突变(c.560T＞A)、第620位T与A的突变(c.620T＞A)、第685位T与A的突变(c.685T＞A)、第1591位G与A的突变(c.1591G＞A)中的一个或几个。

如前文所述，所述野生型ER-BC由野生凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)产生；如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列为野生凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶的氨基酸序列；编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQID NO 6所述的核苷酸序列为野生凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因(其GenBank登录号CP003056.1)的核苷酸序列。

本发明第四方面所提供的编码本发明第二方面所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含如本发明第三方面所述的核苷酸突变子，这可以理解为，当其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变、第1591位G与A的突变中的一个或几个时，烯酸还原酶的酶活力会呈现较显著的变化。

具体地，以下核苷酸分子所编码的本发明第二方面所述的突变体蛋白的相对于由野生凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因(其GenBank登录号CP003056.1)的核苷酸序列编码的野生型ER-BC具有显著提高的酶活力，尤其是对于2-烯己二酸的催化效率。

所述核苷酸分子为编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变；所述编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。

所述核苷酸分子为编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第1591位G与A；所述编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。

所述核苷酸分子为编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第542位T与C的突变；所述编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示。

所述核苷酸分子为编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变；所述为编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO10所示。

根据本发明，所述核酸分子为如下DNA分子：

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的DNA分子。

在本发明第五方面，提供了用于制备本发明第二方面所述酸还原酶的突变体蛋白的表达盒、重组载体或重组微生物，其包括：

(1)含有本发明第四方面所述核苷酸分子的表达盒；

(2)含有本发明第四方面所述核苷酸分子的重组质粒；

(3)含有本发明第四方面所述核苷酸分子或上述重组质粒的重组细胞，即含有本发明第四方面所述核苷酸分子或上述重组质粒的基因工程菌。

本发明第四方面所述核苷酸分子所述cDNA可用于构建重组表达质粒，其可被转移到宿主细胞内进行突变体蛋白表达，并获得本发明第二方面所述的烯酸还原酶的突变体蛋白。

本发明所述重组表达质粒的载体为pET28a(+)，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

本发明提供的烯酸还原酶ER-BC系列突变体蛋白，其野生型蛋白ER-BC由一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)产生。所述突变体蛋白的编码基因(cDNA)被导入宿主细胞后，所形成的突变体蛋白为胞内蛋白，需通过超声破胞等方法获得。

在本发明第六方面，提供了一种本发明第二方面所述的突变体蛋白的同源建模所得蛋白分子三维结构模型。

本发明中所述蛋白分子三维结构模型为网站I-ATSSER(https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)同源建模所得，使用软件GROMACS对模型进行评估以及分子动力学计算，使用软件autodock4进行分子对接，使用软件Pymol进行图片展示和距离测量。

本发明中的检测方法及仪器：

(1)采用PTC-200型PCR仪(MJ RESEARCH.INC.美国)进行PCR扩增。

(2)采用MINI-SUB CELL GT POWER PAC 1000型琼脂糖凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)进行PCR产物的检测与分离。

(3)采用10mL规格镍琼脂糖凝胶FF亲和层析柱填料预装柱(中国bersee)进行蛋白纯化。

(4)采用NanoDrop2000型超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)进行纯化后蛋白质浓度测定。

(5)采用870型酶标仪(Thermo Fisher Scientific)进行吸光度测定。

(6)采用LC-MS 8080型液质联用仪(日本岛津)进行产物测定。

III.实施例

实施例中涉及到的培养基配方如下：

LB液体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％；

LB固体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％、琼脂1.5％；

HB-PET自诱导培养基(商业途径购买)。

培养基中的单位为％(W/V)。

实施例1：构建易错PCR突变文库

利用易错PCR试剂盒(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(AgilentTechnologies))，构建碱基突变率在1-2‰(2-4碱基/基因)，氨基酸突变率在1-2氨基酸/基因的Error prone PCR突变库。

易错PCR的反应体系如表1所示，总体积：50μL。

表1易错PCR反应体系

其中，F和R引物序列为：

上游引物F：5′-CGCGGATCCATGAAGTACAAGAAGCTGTTCG-3′

下游引物R：5′-CCCAAGCTTTTACAGGTTTGCAGCGACC-3′

易错PCR的扩增程序如表2所示：

表2易错PCR的扩增程序

易错PCR结束后将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离检验后，胶回收得到实验所需的基因DNA片段，纯化后所得基因DNA片段及载体pET 28a(+)空质粒均用限制性内切酶BamHI-HF和Hind III-HF进行双酶切，然后连接，转化至E.coli BL21(DE3)(菌种保藏编号为ATCC 68004)感受态细胞中，涂布于LB平板上(含50μg/μL的Kana抗生素)，37℃过夜培养12h，获得随机突变文库。

实施例2：易错PCR突变文库中高酶活突变体的筛选

由文献知ER-BC催化时需要利用NADH(Ress T，HummelW，Hanlon S.P，etal.ChemCatChem 2015，7，1302-1311)，故可利用UV/Vis-based法(UV/Vis吸收光谱法)测定NADH的减少量来高通量筛选高酶活突变体。

96孔板初筛：

(1)提前准备好灭菌的96深孔板、HB-PET自诱导培养基，在超净台里给96深孔板分装加有0.1％卡纳抗生素的HB-PET自诱导培养基，每个孔700μL；

(2)给平板上的单克隆做好标号，然后依次挑入96深孔板中，30℃/180rpm培养24h，每个深孔板有6个未突变的单克隆以作对照；

(3)培养结束后，将装有菌液的96深孔板放入低温离心机中，4℃/4000rpm离心10min，弃上清后将菌体放入-80℃的冰箱里反复冻融3次，每次30min；

(4)菌体反复冻融结束后，每孔加入200μL的Tris-HCl溶液(0.05M、pH＝7.5)，使菌体重悬起来；

(5)用Tris-HCl溶液(0.05M、pH＝7.5)配制终浓度为0.3mg/mL的溶菌酶溶液，然后给96深孔板每孔加入100μL的溶菌酶溶液，37℃反应1h，使菌体充分裂解；

(6)菌体裂解结束后，4℃低温4000rpm离心10min；

(7)重新取一块干净的96孔板，每孔中加入80μL的终浓度为1mM 2-烯己二酸+1mMNADH的反应液，然后再加入上述所得120μL的细胞裂解液，30℃/180rpm反应5min，用酶标仪测定反应结束时体系在340nm处的吸光度；

(8)用Tris-HCl溶液(0.05M、pH＝7.5)配制浓度为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM的NADH溶液，用酶标仪测定其在340nm处的吸光度，从而得到NADH浓度和吸光度的标准曲线；

(9)计算酶活，筛选酶活提高的有效突变体。

摇瓶发酵复筛：

(1)把初筛出的有效单克隆重新挑入加有0.1％卡纳抗生素的4mL LB液体培养基中，37℃、180rpm过夜培养；

(2)过夜培养得到的菌液接入加有0.1％卡纳抗生素的30mL LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD_600nm为0.6-0.8，然后加入0.1％的IPTG诱导剂，25℃、180rpm过夜培养；

(3)培养结束后，4℃、8000rpm离心5min，弃上清，加入6mL Tris-HCl溶液(0.05M、pH＝7.5)重悬菌体，超声破胞10min；

(4)破胞后4℃、8000rpm离心5min，所得上清即为实验所需粗酶液；

(5)粗酶液过镍琼脂糖凝胶FF亲和层析柱填料预装柱纯化，纯化过程均在4℃条件下进行，平衡Ni柱所用溶液为Ni-lysis buffer(400mM NaCl，50mM Tris，5％甘油，5mM咪唑，pH＝8.0)，洗脱杂蛋白所用溶液为Ni-Wash buffer(400mM NaCl，50mM Tris，5％甘油，30mM咪唑，pH＝8.0)，洗脱目的蛋白所用溶液为Ni-Elution buffer(400mM NaCl，50mMTris，5％甘油，250mM咪唑，pH＝8.0)。纯化时先用Ni-LB平衡柱子3-4次，然后上样，依次用Ni-LB、Ni-WB洗脱杂蛋白至考马斯亮蓝不变色，最后用Ni-EB洗脱目的蛋白；

(6)用NanoDrop2000型超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测定纯化后的蛋白浓度；

(7)进行酶催化反应，总反应体系为500μL，其中2-烯己二酸为1mM、NADH为1mM，纯化后的酶液所加体积为100μL，30℃反应5min，用酶标仪测定反应结束时体系在340nm处的吸光度，根据NADH浓度和吸光度的标准曲线计算比活；

(8)用LC-MS准确测定产物己二酸的浓度，其中流动相A相为加了20mM醋酸铵+0.1％甲酸的超纯水，B相为加了0.1％甲酸的乙腈。

以易错PCR构建的突变文库为基础，经96孔板初筛及摇瓶发酵复筛，获得2株[分别命名为ER-BC-1(SEQ ID NO 2)、ER-BC-2(SEQ ID NO 3)]酶活明显提高的菌株。将酶活力明显提高的突变体菌株重新培养，提取质粒后测定核苷酸序列，氨基酸突变情况及酶活结果如表3所示。

表3突变体的测序结果

实施例3：烯酸还原酶ER-BC同源建模

根据数据库中搜索到ER-BC目前已知的信息仅有基因序列而没有解析的蛋白晶体结构，因此需要建模法得到其结构。目前的蛋白质建模法主要分为三种：同源建模、穿线法和从头算法。由于BLAST比对后找到的ER-BC同源结构序列一致性最高只能达到29％，因此同源建模法并不适用(两个序列的一致性超过30％同源性时，建模才能趋于成功)，最终使用穿线法——I-ATSSER预测服务器建模得到ER-BC结构。

实施例3使用网站I-ATSSER(https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)同源建模，使用软件GROMACS对模型进行评估以及分子动力学计算，使用软件autodock4进行分子对接，使用软件Pymol进行图片展示和距离测量。

利用穿线法建模得到ER-BC结构(见图3)，最低的预测结构的C-score为1.04，TM-score为0.91(C-score值范围为[-5，2]，当TM-score值大于0.5时结构是可靠的)，说明预测的酶结构具有可信性；利用穿线法构建的ER-BC模型与底物2-烯-1，6-己二酸通过autodock4进行分子对接，对接结果如图4所示，图4中的对接结果显示底物与Val61、His71和Tyr180形成了氢键作用，配体FMN处在底物与活性位点的附近，但其与底物具有一定距离，Tyr180与底物的羧基O^-能够形成氢键。

实施例4：半理性设计的定点突变

通过文献阅读，发现ER-BC与YqjM(Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌)是来自同一家族的酶(Ene家族)(Dr.Kathrin Heckenbichler，MSc Anna Schweiger，Lea AlexandraBrandner，et al.Angewandte Chemie，2018，6，7240-7244.)。YqjM的催化过程分为两步：1)H164和H167的侧链与底物的C＝O键形成氢键，使底物向酶的活性中心靠近，并增加了C＝O的极性，然后NADH的H通过FMN传递到底物C＝C双键的β-C，形成烯醇中间体；2)Y169侧链质子H+的传递。整个反应的限速步骤是NADH上的H传递。H164和H167侧链与底物的C＝O键之间形成的氢键起着重要作用：固定底物；增加C＝O键的极性，从而促进NADH上的H转移；稳定烯醇中间体，防止Y169对烯烯醇中间体的质子化，使质子H+转移到与羰基相邻的α-C碳原子上。

根据其超家族酶的序列比对(见图2)，发现YqjM的H164、H167、Y169分别对应ER-BC的H174、H177、Y180，从而推测ER-BC的H174、H177、Y180是酶的结合位点及催化位点，H174、H177应该会与底物形成氢键，并起着重要作用，二者的催化步骤应该大致一致。

综合上述文献所得信息及随机突变、同源建模结果，共设计21种突变体蛋白(表4)：

表4半理性设计的突变文库

定点突变所用引物对如表5所示：

表5引物序列

以突变体L181P为例详细说明实验过程及方法。

引物对1：

上游引物-BamHI：cgcggatccatgaagtacaagaagctgttcg

下游引物-L181P-R：actgatccagcgggtagccttcgtgcac

引物对2：

上游引物-L181P-F：aggctacccgctggatcagttcgcaatc

下游引物-HindIII：cccaagcttttacaggtttgcagcgacc

以pUC 57-ER-BC(全长1992bp)为模板，利用设计好的引物对1和引物对2分别扩增目的基因的上游基因(1-543bp)和下游基因(544-1992bp)，PCR扩增反应体系1如表6所示。

表6 PCR扩增反应体系1

PCR扩增反应程序1如表7所示。

表7 PCR扩增反应程序1

扩增得到的上游基因和下游基因PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离检验后，胶回收得到实验所需的基因DNA片段，将胶回收得到的上游基因和下游基因产物继续进行PCR，上游基因和下游基因互补序列重新结合，使二者重新形成完整的目的基因片段，PCR扩增体系2如表8所示，扩增程序第4步时间设置应以目的基因全长设定。

表8 PCR扩增反应体系2

PCR扩增反应程序2如表9所示。

表9 PCR扩增反应程序2

将上述PCR产物加入引物继续扩增，PCR扩增体系3如表10所示。

表10 PCR扩增反应体系3

PCR扩增反应程序3如表11所示。

表11 PCR扩增反应程序

PCR结束后将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离检验后，胶回收得到实验所需的基因DNA片段，纯化后所得基因DNA片段及载体pET 28a(+)空质粒均用限制性内切酶BamHI-HF和Hind III-HF进行双酶切，然后连接，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于LB平板上(含50μg/μL的Kana抗生素)，37℃过夜培养12h，平板上的单克隆进行菌落PCR及核苷酸序列测定，获得正确的突变菌株。

测序正确的单克隆经发酵表达、超声破胞、Ni柱纯化获得所需酶液，然后进行酶活测定：

反应体系(1mM 2-烯己二酸，2mM NADH，酶液200μL，DMSO 8％)，反应体系总体积为1000μL，缓冲液为pH＝7.5的Tris-HCl。30℃、180rpm反应3min后，利用吸光度测定NADH减少量计算酶活。

1个酶活力单位定义为在特定条件下，在1分钟内能转化1μmol底物(2-烯己二酸)生成产物(己二酸)的酶量，故比活力的计算公式为：

U/mg＝ΔC_NADH(mM)×10³×1mL/3min/(蛋白浓度(mg/mL)×200μL)

比活力最终测定结果如表12所示，其中突变体p.S109N+G111D+L181P(命名为4号突变体)与p.G111D+L181P(命名为3号突变体)的蛋白比活提高最多，野生型ER-BC的比活为1.77U/mg，p.S109N+G111D+L181P与p.G111D+L181P的比活为43.3U/mg、21.4U/mg，分别为野生型的11和12倍。

表12突变体蛋白质比活力

由表12可知3号突变体(氨基酸突变位点为p.Leu181Pro+Gly111Asp；核苷酸突变位点为c.332G＞A/542T＞C)与4号突变体(氨基酸突变位点为p.Ser109Asn+Leu181Pro+Gly111Asp；核苷酸突变位点为c.325T＞A/326C＞A/332G＞A/542T＞C)比活明显提高，分别为野生型酶的12和11倍。

随后用LC-MS准确测定产物己二酸的浓度，反应体系包括1mM 2-烯己二酸、20mMNADH、纯化酶液100μL，反应体系总体积为1000μL，缓冲液为pH＝7.5的Tris-HCl。充入氮气37℃、180rpm反应3min后，取20μL反应样品加入980μL含有千分之一甲酸的甲醇，15000rpm/4℃离心15min，随后用LC-MS测定己二酸含量，A相为加了0.1％甲酸和20mM醋酸铵的超纯水，B相为加了0.1％甲酸的乙腈，从而计算催化酶活。

U/mg＝C_己二酸(ng/ml)×10^-3×1mL/146g.mol^-1/3min/(蛋白浓度(mg/mL)×100μL)

LC-MS结果如附图8所示，其中a为野生型ER-BC；b为烯酸还原酶ER-BC的3号突变体；c为烯酸还原酶ER-BC的4号突变体；d为底物2-烯己二酸；产物己二酸的出峰时间为1.2min左右，底物2-烯己二酸出峰时间为2.2min左右。最终测定结果显示野生型ER-BC、烯酸还原酶ER-BC的3号突变体、烯酸还原酶ER-BC的4号突变体催化体系己二酸产量分别为16750ng/mL、17400ng/mL、29100ng/mL。

实施例5：突变体动力学参数测定

分别测定底物浓度为5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM的反应体系的反应速率，以底物浓度为横坐标、V为纵坐标绘制酶促反应动力学曲线，采用双倒数法求的Km值，从而计算Kcat＝Vmax/蛋白浓度和Km/Kcat。

仅测定比活力提高最多的3号与4号突变体和野生型酶的动力学参数，酶促反应动力学曲线分别如附图5、6、7所示，由图5、6、7可知3号与4号突变体的Km值均有减小，证明其与底物亲和力增强。Km、Kcat与Km/Kcat的计算结果如表13所示：

表13动力学参数

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用

<130> RB1903841-FF

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 663

<212> PRT

<213> （野生型ER-BC）

<400> 1

Met Lys Tyr Lys Lys Leu Phe Glu Thr Val Lys Ile Arg Asn Val Glu

1 5 10 15

Leu Lys Asn Arg Tyr Ala Met Ala Pro Met Gly Pro Leu Gly Leu Ala

20 25 30

Asp Ala Glu Gly Gly Phe Asn Gln Arg Gly Ile Glu Tyr Tyr Thr Ala

35 40 45

Arg Ala Arg Gly Gly Thr Ala Leu Ile Ile Thr Gly Val Thr Phe Val

50 55 60

Asp Asn Glu Val Glu Glu His Gly Met Pro Asn Val Pro Cys Pro Thr

65 70 75 80

His Asn Pro Val His Phe Val Arg Thr Ser Lys Glu Met Thr Glu Arg

85 90 95

Ile His Ala Tyr Asp Ser Lys Ile Phe Leu Gln Met Ser Ala Gly Phe

100 105 110

Gly Arg Val Thr Ile Pro Thr Asn Leu Gly Glu Tyr Pro Pro Val Ala

115 120 125

Pro Ser Pro Ile Pro His Arg Trp Leu Asp Lys Thr Cys Arg Glu Leu

130 135 140

Thr Val Glu Glu Ile His Ser Ile Val Arg Lys Phe Gly Asp Gly Ala

145 150 155 160

Phe Asn Ala Lys Arg Ala Gly Phe Asp Gly Val Gln Ile His Ala Val

165 170 175

His Glu Gly Tyr Leu Leu Asp Gln Phe Ala Ile Ala Phe Phe Asn Lys

180 185 190

Arg Thr Asp Ala Tyr Gly Gly Pro Leu Glu Asn Arg Leu Arg Phe Ala

195 200 205

Arg Glu Ile Val Glu Glu Ile Lys Gln Arg Cys Gly Glu Asp Phe Pro

210 215 220

Val Thr Leu Arg Phe Ser Pro Lys Ser Phe Ile Lys Asp Trp Arg Glu

225 230 235 240

Gly Ala Leu Pro Gly Glu Glu Phe Glu Glu Lys Gly Arg Asp Leu Asp

245 250 255

Glu Gly Ile Glu Ala Ala Lys Leu Leu Val Ser Tyr Gly Tyr Asp Ala

260 265 270

Leu Asp Val Asp Val Gly Ser Tyr Asp Ser Trp Trp Trp Ser His Pro

275 280 285

Pro Met Tyr Gln Lys Lys Gly Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala Arg Leu Val

290 295 300

Lys Glu Ala Val Asp Val Pro Val Leu Cys Ala Gly Arg Met Asp Asn

305 310 315 320

Pro Asp Leu Ala Leu Ala Ala Leu Glu Asp Gly Ala Cys Asp Ile Ile

325 330 335

Ser Leu Gly Arg Pro Leu Leu Ala Asp Pro Asp Tyr Val Asn Lys Leu

340 345 350

Arg Ile Gly Gln Val Ala Asp Ile Arg Pro Cys Leu Ser Cys His Glu

355 360 365

Gly Cys Met Gly Arg Ile Gln Glu Tyr Ser Ser Leu Gly Cys Ala Val

370 375 380

Asn Pro Ala Ala Cys Arg Glu Lys Glu Ala Ala Leu Thr Pro Ala Leu

385 390 395 400

Lys Lys Lys Arg Val Leu Ile Ala Gly Gly Gly Val Ala Gly Cys Glu

405 410 415

Ala Ala Arg Val Leu Ala Leu Arg Gly His Glu Pro Val Ile Phe Glu

420 425 430

Lys Ser Asn Arg Leu Gly Gly Asn Leu Ile Pro Gly Gly Ala Pro Asp

435 440 445

Phe Lys Glu Asp Asp Leu Ala Leu Val Ala Trp Tyr Glu His Thr Leu

450 455 460

Glu Arg Leu Gly Val Glu Ile His Leu Asn Thr Ala Leu Thr Lys Glu

465 470 475 480

Glu Ile Leu Ala Ala Asn Val Asp Ala Val Leu Ile Ala Thr Gly Ser

485 490 495

Asn Pro Lys Ile Leu Pro Leu Asp Gly Lys Asn Lys Val Phe Thr Ala

500 505 510

Glu Asp Val Leu Leu Asp Lys Val Asp Ala Gly Gln His Val Val Ile

515 520 525

Val Gly Gly Gly Leu Val Gly Cys Glu Leu Ala Leu Asn Leu Ala Glu

530 535 540

Lys Gly Lys Asp Val Ser Leu Val Glu Met Gln Asp Lys Leu Leu Ala

545 550 555 560

Val Asn Gly Pro Leu Cys His Ala Asn Ser Asp Met Leu Glu Arg Leu

565 570 575

Val Pro Phe Lys Gly Val Gln Val Tyr Thr Ser Ser Lys Ile Val Asp

580 585 590

Thr Thr Glu Lys Thr Ala Val Val Asp Val Asp Gly Glu Leu Arg Glu

595 600 605

Ile Glu Ala Asp Ser Ile Val Leu Ala Val Gly Tyr Ser Ala Glu Lys

610 615 620

Ser Leu Tyr Glu Asp Leu Lys Phe Glu Val Ala Asp Leu His Val Val

625 630 635 640

Gly Asp Ala Arg Lys Val Ala Asn Ile Met Tyr Ala Ile Trp Asp Ala

645 650 655

Tyr Glu Val Ala Ala Asn Leu

660

<210> 2

<211> 663

<212> PRT

<213> （1号ER-BC突变体蛋白）

<400> 2

Met Lys Tyr Lys Lys Leu Phe Glu Thr Val Lys Ile Arg Asn Val Glu

1 5 10 15

Leu Lys Asn Arg Tyr Ala Met Ala Pro Met Gly Pro Leu Gly Leu Ala

20 25 30

Asp Ala Glu Gly Gly Phe Asn Gln Arg Gly Ile Glu Tyr Tyr Thr Ala

35 40 45

Arg Ala Arg Gly Gly Thr Ala Leu Ile Ile Thr Gly Val Thr Phe Val

50 55 60

Asp Asn Glu Val Glu Glu His Gly Met Pro Asn Val Pro Cys Pro Thr

65 70 75 80

His Asn Pro Val His Phe Val Arg Thr Ser Lys Glu Met Thr Glu Arg

85 90 95

Ile His Ala Tyr Asp Ser Lys Ile Phe Leu Gln Met Ser Ala Gly Phe

100 105 110

Gly Arg Val Thr Ile Pro Thr Asn Leu Gly Glu Tyr Pro Pro Val Ala

115 120 125

Pro Ser Pro Ile Pro His Arg Trp Leu Asp Lys Thr Cys Arg Glu Leu

130 135 140

Thr Val Glu Glu Ile His Ser Ile Val Arg Lys Phe Gly Asp Gly Ala

145 150 155 160

Phe Asn Ala Lys Arg Ala Gly Phe Asp Gly Val Gln Ile His Ala Val

165 170 175

His Glu Gly Tyr Pro Leu Asp Gln Phe Ala Asn Ala Phe Phe Asn Lys

180 185 190

Arg Thr Asp Ala Tyr Gly Gly Pro Leu Glu Asn Arg Leu Arg Tyr Ala

195 200 205

Arg Glu Ile Val Glu Glu Ile Lys Gln Arg Cys Gly Glu Asp Phe Pro

210 215 220

Val Thr Leu Arg Ile Ser Pro Lys Ser Phe Ile Lys Asp Trp Arg Glu

225 230 235 240

Gly Ala Leu Pro Gly Glu Glu Phe Glu Glu Lys Gly Arg Asp Leu Asp

245 250 255

Glu Gly Ile Glu Ala Ala Lys Leu Leu Val Ser Tyr Gly Tyr Asp Ala

260 265 270

Leu Asp Val Asp Val Gly Ser Tyr Asp Ser Trp Trp Trp Ser His Pro

275 280 285

Pro Met Tyr Gln Lys Lys Gly Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala Arg Leu Val

290 295 300

Lys Glu Ala Val Asp Val Pro Val Leu Cys Ala Gly Arg Met Asp Asn

305 310 315 320

Pro Asp Leu Ala Leu Ala Ala Leu Glu Asp Gly Ala Cys Asp Ile Ile

325 330 335

Ser Leu Gly Arg Pro Leu Leu Ala Asp Pro Asp Tyr Val Asn Lys Leu

340 345 350

Arg Ile Gly Gln Val Ala Asp Ile Arg Pro Cys Leu Ser Cys His Glu

355 360 365

Gly Cys Met Gly Arg Ile Gln Glu Tyr Ser Ser Leu Gly Cys Ala Val

370 375 380

Asn Pro Ala Ala Cys Arg Glu Lys Glu Ala Ala Leu Thr Pro Ala Leu

385 390 395 400

Lys Lys Lys Arg Val Leu Ile Ala Gly Gly Gly Val Ala Gly Cys Glu

405 410 415

Ala Ala Arg Val Leu Ala Leu Arg Gly His Glu Pro Val Ile Phe Glu

420 425 430

Lys Ser Asn Arg Leu Gly Gly Asn Leu Ile Pro Gly Gly Ala Pro Asp

435 440 445

Phe Lys Glu Asp Asp Leu Ala Leu Val Ala Trp Tyr Glu His Thr Leu

450 455 460

Glu Arg Leu Gly Val Glu Ile His Leu Asn Thr Ala Leu Thr Lys Glu

465 470 475 480

Glu Ile Leu Ala Ala Asn Val Asp Ala Val Leu Ile Ala Thr Gly Ser

485 490 495

Asn Pro Lys Ile Leu Pro Leu Asp Gly Lys Asn Lys Val Phe Thr Ala

500 505 510

Glu Asp Val Leu Leu Asp Lys Val Asp Ala Gly Gln His Val Val Ile

515 520 525

Val Gly Gly Gly Leu Val Gly Cys Glu Leu Ala Leu Asn Leu Ala Glu

530 535 540

Lys Gly Lys Asp Val Ser Leu Val Glu Met Gln Asp Lys Leu Leu Ala

545 550 555 560

Val Asn Gly Pro Leu Cys His Ala Asn Ser Asp Met Leu Glu Arg Leu

565 570 575

Val Pro Phe Lys Gly Val Gln Val Tyr Thr Ser Ser Lys Ile Val Asp

580 585 590

Thr Thr Glu Lys Thr Ala Val Val Asp Val Asp Gly Glu Leu Arg Glu

595 600 605

Ile Glu Ala Asp Ser Ile Val Leu Ala Val Gly Tyr Ser Ala Glu Lys

610 615 620

Ser Leu Tyr Glu Asp Leu Lys Phe Glu Val Ala Asp Leu His Val Val

625 630 635 640

Gly Asp Ala Arg Lys Val Ala Asn Ile Met Tyr Ala Ile Trp Asp Ala

645 650 655

Tyr Glu Val Ala Ala Asn Leu

660

<210> 3

<211> 663

<212> PRT

<213> （2号ER-BC突变体蛋白）

<400> 3

Met Lys Tyr Lys Lys Leu Phe Glu Thr Val Lys Ile Arg Asn Val Glu

1 5 10 15

Leu Lys Asn Arg Tyr Ala Met Ala Pro Met Gly Pro Leu Gly Leu Ala

20 25 30

Asp Ala Glu Gly Gly Phe Asn Gln Arg Gly Ile Glu Tyr Tyr Thr Ala

35 40 45

Arg Ala Arg Gly Gly Thr Ala Leu Ile Ile Thr Gly Val Thr Phe Val

50 55 60

Asp Asn Glu Val Glu Glu His Gly Met Pro Asn Val Pro Cys Pro Thr

65 70 75 80

His Asn Pro Val His Phe Val Arg Thr Ser Lys Glu Met Thr Glu Arg

85 90 95

Ile His Ala Tyr Asp Ser Lys Ile Phe Leu Gln Met Ser Ala Asp Phe

100 105 110

Gly Arg Val Thr Ile Pro Thr Asn Leu Gly Glu Tyr Pro Pro Val Ala

115 120 125

Pro Ser Pro Ile Pro His Arg Trp Leu Asp Lys Thr Cys Arg Glu Leu

130 135 140

Thr Val Glu Glu Ile His Ser Ile Val Arg Lys Phe Gly Asp Gly Ala

145 150 155 160

Phe Asn Ala Lys Arg Ala Gly Phe Asp Gly Val Gln Ile His Ala Val

165 170 175

His Glu Gly Tyr Leu Leu Asp Gln Phe Ala Ile Ala Phe Phe Asn Lys

180 185 190

Arg Thr Asp Ala Tyr Gly Gly Pro Leu Glu Asn Arg Leu Arg Phe Ala

195 200 205

Arg Glu Ile Val Glu Glu Ile Lys Gln Arg Cys Gly Glu Asp Phe Pro

210 215 220

Val Thr Leu Arg Phe Ser Pro Lys Ser Phe Ile Lys Asp Trp Arg Glu

225 230 235 240

Gly Ala Leu Pro Gly Glu Glu Phe Glu Glu Lys Gly Arg Asp Leu Asp

245 250 255

Glu Gly Ile Glu Ala Ala Lys Leu Leu Val Ser Tyr Gly Tyr Asp Ala

260 265 270

Leu Asp Val Asp Val Gly Ser Tyr Asp Ser Trp Trp Trp Ser His Pro

275 280 285

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290 295 300

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<213> （编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子）

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ctgatcccag gcggtgctcc agatttcaag gaggacgatc tggcactcgt cgcttggtac 1380

gaacacaccc tggagcgcct gggcgtggag atccacctga acaccgcact gaccaaggag 1440

gaaatcctgg cagcaaacgt cgacgcagtg ctgatcgcaa ccggctccaa cccaaagatc 1500

ctgccactgg atggcaagaa caaggtgttc accgctgagg acgtgctgct ggacaaggtg 1560

gacgctggcc agcacgtcgt gatcgtcggc ggcggtctgg tgggctgcga actggcactg 1620

aacctggctg agaagggcaa ggacgtcagc ttagttgaga tgcaggacaa gctgctggca 1680

gtcaacggcc cactgtgcca cgcaaactcc gacatgctgg agcgcctcgt gccattcaag 1740

ggcgtgcagg tgtacacctc ctccaagatc gtcgacacca ccgaaaagac cgcagtcgtg 1800

gacgtggacg gcgagctgcg cgaaatcgaa gcagactcca tcgtcctggc tgtcggctac 1860

tccgcagaga agtccctgta cgaagacctg aagttcgaag tcgcagatct gcacgtggtg 1920

ggcgacgctc gcaaggtggc aaacatcatg tacgcaatct gggacgctta cgaggtcgct 1980

gcaaacctgt aa 1992

<210> 10

<211> 1992

<212> DNA

<213> （编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子）

<400> 10

atgaagtaca agaagctgtt cgaaaccgtc aagatccgca acgtcgaact gaagaaccgc 60

tacgctatgg ctccaatggg cccactgggc ctggctgacg ctgaaggcgg cttcaaccag 120

cgcggcatcg agtactacac cgctcgcgct cgcggcggca ccgcactgat tatcaccggc 180

gtcaccttcg tggacaacga ggtggaggag cacggcatgc caaacgtgcc atgcccaacc 240

cacaacccag tgcacttcgt ccgcacctcc aaggaaatga ccgagcgcat ccacgcttac 300

gactccaaga tcttcctgca gatgaacgct gacttcggcc gcgtgaccat cccaaccaac 360

ctgggcgagt acccaccagt cgctccatcc ccaatcccac accgctggct ggacaagacc 420

tgccgcgaac tgaccgtgga ggagatccac tccatcgtcc gcaagttcgg cgacggcgct 480

ttcaacgcaa agcgcgctgg cttcgacggc gtccagatcc acgcagtgca cgaaggctac 540

ccgctggatc agttcgcaat cgcattcttc aacaagcgca ccgatgctta cggcggccca 600

ctggagaacc gcctgcgctt cgcacgcgag atcgtcgaag agatcaagca gcgctgcggc 660

gaagatttcc cagtcaccct gcgcttctcc ccaaagtcct tcatcaagga ctggcgcgag 720

ggcgcactgc caggcgaaga gttcgaggag aagggccgcg atctggacga gggcatcgag 780

gcagctaagc tgctggtctc ctacggctac gacgcactgg acgtcgacgt cggctcctac 840

gactcctggt ggtggtccca cccaccaatg taccagaaga agggcctgta catcccatac 900

gctcgcctgg tgaaggaagc agtcgacgtc ccagtgctgt gcgcaggccg catggacaac 960

ccagatctgg cactggcagc tctggaggac ggcgcttgcg acatcatctc cctgggccgc 1020

ccactgctgg ctgacccaga ctacgtgaac aagctgcgca tcggccaggt ggcagatatc 1080

cgcccatgcc tgtcctgcca cgaaggctgc atgggccgca tccaggaata ctcctccctg 1140

ggctgcgctg tcaacccagc tgcatgccgc gaaaaggagg ctgcactgac cccagcactg 1200

aagaagaagc gcgtcctgat cgcaggcggc ggcgtcgcag gttgcgaagc agcacgcgtc 1260

ctggctctgc gcggccatga gccagtcatc ttcgagaagt ccaaccgcct gggcggcaac 1320

ctgatcccag gcggtgctcc agatttcaag gaggacgatc tggcactcgt cgcttggtac 1380

gaacacaccc tggagcgcct gggcgtggag atccacctga acaccgcact gaccaaggag 1440

gaaatcctgg cagcaaacgt cgacgcagtg ctgatcgcaa ccggctccaa cccaaagatc 1500

ctgccactgg atggcaagaa caaggtgttc accgctgagg acgtgctgct ggacaaggtg 1560

gacgctggcc agcacgtcgt gatcgtcggc ggcggtctgg tgggctgcga actggcactg 1620

aacctggctg agaagggcaa ggacgtcagc ttagttgaga tgcaggacaa gctgctggca 1680

gtcaacggcc cactgtgcca cgcaaactcc gacatgctgg agcgcctcgt gccattcaag 1740

ggcgtgcagg tgtacacctc ctccaagatc gtcgacacca ccgaaaagac cgcagtcgtg 1800

gacgtggacg gcgagctgcg cgaaatcgaa gcagactcca tcgtcctggc tgtcggctac 1860

tccgcagaga agtccctgta cgaagacctg aagttcgaag tcgcagatct gcacgtggtg 1920

ggcgacgctc gcaaggtggc aaacatcatg tacgcaatct gggacgctta cgaggtcgct 1980

gcaaacctgt aa 1992

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> （表1中易错PCR反应体系上游引物）

<400> 11

cgcggatcca tgaagtacaa gaagctgttc g 31

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> （表1中易错PCR反应体系下游引物）

<400> 12

cccaagcttt tacaggtttg cagcgacc 28

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> （引物BamHI）

<400> 13

cgcggatcca tgaagtacaa gaagctgttc g 31

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物HindIII）

<400> 14

cccaagcttt tacaggtttg cagcgacc 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61S-F）

<400> 15

caccggctcc accttcgtgg acaacgag 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61S-R）

<400> 16

ccacgaaggt ggagccggtg ataatcag 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61H-F）

<400> 17

caccggccac accttcgtgg acaacgag 28

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61H-R）

<400> 18

ccacgaaggt gtggccggtg ataatcag 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61A-F）

<400> 19

caccggcgcc accttcgtgg acaacgag 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61A-R）

<400> 20

ccacgaaggt ggcgccggtg ataatcag 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61R-F）

<400> 21

caccggccgc accttcgtgg acaacgag 28

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物V61R-R）

<400> 22

ccacgaaggt gcggccggtg ataatcag 28

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物H71Y-F）

<400> 23

ggaggagtac ggcatgccaa acgtgcca 28

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物H71Y-R）

<400> 24

ttggcatgcc gtactcctcc acctcgttg 29

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> （引物M73Q-F）

<400> 25

gcacggccag ccaaacgtgc catgcccaac 30

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物M73Q-R）

<400> 26

gcacgtttgg ctggccgtgc tcctccac 28

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物S109N-F）

<400> 27

gcagatgaac gctggcttcg gccgcgtg 28

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物S109N-R）

<400> 28

cgaagccagc gttcatctgc aggaagatc 29

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物S109K-F）

<400> 29

gcagatgaaa gctggcttcg gccgcgtg 28

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物S109K-R）

<400> 30

cgaagccagc tttcatctgc aggaagatc 29

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物S109Q-F）

<400> 31

gcagatgcaa gctggcttcg gccgcgtg 28

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物S109Q-R）

<400> 32

cgaagccagc ttgcatctgc aggaagatc 29

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物G111D-F）

<400> 33

gtccgctgac ttcggccgcg tgaccatc 28

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物G111D-R）

<400> 34

cgcggccgaa gtcagcggac atctgcag 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物G111S-F）

<400> 35

gtccgctagc ttcggccgcg tgaccatc 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物G111S-R）

<400> 36

cgcggccgaa gctagcggac atctgcag 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L181P-F）

<400> 37

aggctacccg ctggatcagt tcgcaatc 28

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L181P-R）

<400> 38

actgatccag cgggtagcct tcgtgcac 28

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物Y280G-F）

<400> 39

cggctccggc gactcctggt ggtggtcc 28

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物Y280G-R）

<400> 40

accaggagtc gccggagccg acgtcgac 28

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物G111D+S109N-F）

<400> 41

gaacgctgac ttcggccgcg tgaccatc 28

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物G111D+S109N-R）

<400> 42

cgcggccgaa gtcagcgttc atctgcag 28

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物H174A+H177A-F）

<400> 43

ccagatcgcc gcagtggccg aaggctac 28

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物H174A+H177A-R）

<400> 44

cggccactgc ggcgatctgg acgccgtc 28

Claims

1.一种影响烯酸还原酶酶活力的氨基酸突变子，其包括位于野生型ER-BC的如SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变、第531位Gly与Ser的突变中的一个或几个。

2.一种烯酸还原酶的突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变、第531位Gly与Ser的突变中的一个或几个。

3.根据权利要求2所述的烯酸还原酶的突变体蛋白，其特征在于，

所述突变体蛋白为1号ER-BC突变体蛋白，其序列中包含位于野生型ER-BC的如SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变；优选地，所述1号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO 2所示；

和/或，所述突变体蛋白为2号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第531位Gly与Ser的突变；优选地，所述2号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO3所示；

和/或，所述突变体蛋白为3号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变；优选地，所述3号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO4所示；

和/或，所述突变体蛋白为4号ER-BC突变体蛋白，其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变；优选地，所述4号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO5所示；

优选地，所述突变体蛋白还包括上述ER-BC突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述突变体蛋白还包括由1号ER-BC突变体蛋白、2号ER-BC突变体蛋白、3号ER-BC突变体蛋白或4号ER-BC突变体蛋白的N端或C端连接His标签得到的融合蛋白。

4.一种影响烯酸还原酶酶活力的核苷酸突变子，其包括位于编码野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变、第1591位G与A的突变中的一个或几个。

5.一种编码权利要求2或3所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变、第1591位G与A的突变中的一个或几个。

6.根据权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子为编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变；优选地，所述编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示；

和/或，所述核苷酸分子为编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第1591位G与A；优选地，所述编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示；

和/或，所述核苷酸分子为编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第542位T与C的突变；优选地，所述编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示；

和/或，所述核苷酸分子为编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变；优选地，所述编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO10所示。

7.根据权利要求6所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下DNA分子：

(a3)与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求3中的所述的蛋白质的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码权利要求3中的所述的蛋白质的DNA分子。

8.一种含有权利要求5-7中任意一项所述的核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

9.一种如权利要求2或3所述的突变体蛋白的同源建模所得蛋白分子三维结构模型。

10.如权利要求2或3所述的突变体蛋白或由权利要求5-7中任意一项所述的核苷酸分子或如权利要求8所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化还原烯酸类物质中的应用；优选地，所述应用包括催化还原烯酸类物质、提高催化还原烯酸类物质产量、提高烯酸还原酶ER-BC催化效率，和催化还原2-烯己二酸生成己二酸。