CN110710454A - 氨基酸络合银脂质体及其制备方法和植物组织培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氨基酸络合银脂质体及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：制备银氨络合液，加入氨基酸溶液中得到氨基酸络合溶液，制备脂质体薄膜，加入氨基酸络合溶液，超声振荡溶解，得到氨基酸络合银脂质体溶液。本发明还提供了添加了氨基酸络合银脂质体的植物组织培养基。所述本发明制备的所述氨基酸络合银脂质体，通过恰当的氨基酸络合与脂质体包裹双重稳定，很好的控制了银离子的释放率，利用银离子的特性，从而使植物组织培养基能够达到长效抑菌。

Description

氨基酸络合银脂质体及其制备方法和植物组织培养基

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种氨基酸络合银脂质体及其制备方法和植物组织培养基。

背景技术

植物组织培养技术是20世纪30年代初期利用植物细胞全能性发展起来的一项生物技术，即在人工配制的培养基上，于一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料的方法。20世纪80年代以来，植物组培技术已经渗透到植物生理学、植物病理学、中药学、作物遗传育种以及生物化学等各个研究领域，为珍稀濒危植物的优良品种快速繁育、脱病毒、突变筛选、次生代谢产物的工厂化生产、种质资源库建设和基因库建立等方面开辟了新途径，已经成为现代生物技术中重要的基础技术和研究手段之一。由于它侧重于技术，与产业的联系也就日益紧密，被应用于高度集约化的工厂化生产种苗，结合自动化控制技术，为未来农业育苗的工厂化发展提供了技术保障。但是实际生产应用过程中，它的技术环节还存在不少问题：杂菌污染、外植体的褐变、增殖速率低、所培养材料的遗传不稳定等，其中微生物污染是影响植物组培产业发展的首要问题，因此控制污染成了植物组织培养技术中的关键技术之一。

导致植物组织培养污染的原因有两种。一种是接种的外植体带菌，这与外植体的生长环境和消毒不彻底有关，其表面或内部带有较多微生物；另一种原因是生产环境和无菌操作不严格引起的污染，由于接种或培养过程中微生物侵入而引起。青霉菌、镰刀菌、黑曲霉和短小芽孢杆菌是导致植物组织培养污染的主要菌种，也是常见的菌类。

污染会造成的植物组培生产成本的翻倍增加，在植物组织培养污染防治方面国外的研究较多。目前国内外大部分利用化学农药类和医用抗生素进行污染防治，容易污染环境。

针对这种情况，我们尝试把抗菌效果优异的银离子抗菌材料引入MS培养基中。银离子除了可以高效抗菌以外，还可以促进穗条生根和顶芽萌发，提前放叶，提早木质化，另外，还可以抑制植物体内合成乙烯，起到防止茎基老化的作用。但是在植物培养过程中，银离子会被植物吸收，导致培养基中银浓度的快速降低，其抑菌长效性能难以保证。

发明内容

基于此，本发明的目的之一是提供了一种氨基酸络合银脂质体及其制备方法，所制备得到的氨基酸络合银脂质体用于植物组织培养的培养基中，能够控制降低银离子释放速率，促进银离子的抗菌功效的发挥。

一种氨基酸络合银脂质体的制备方法，包括以下步骤：

1)氨基酸溶于水，制备氨基酸溶液，氨基酸浓度是0.02-0.2mol/L；

2)银离子源加入去离子水中，搅拌溶解，滴入氨水至无色透明，得银氨络合液，其中所述银离子源的浓度为0.03-0.3mol/L；

3)将银氨络合溶液缓慢滴入氨基酸溶液中，搅拌均匀，得到氨基酸银络合溶液；

4)制备脂质体薄膜；

5)加入氨基酸络合溶液，超声振荡溶解，得到氨基酸络合银脂质体溶液，氨基酸络合银与脂质体薄膜的质量比为1：9-20。

在其中一些实施例中，所述氨基酸浓度是0.03-0.1mol/L，进一步优选为0.03-0.08mol/L。

在其中一些实施例中，所述银离子源的浓度0.05-0.1mol/L，进一步优选为0.06-0.08mol/L。

在其中一些实施例中，在氨基酸银络合溶液中，所述银与氨基酸的摩尔比为1：1-1：10，更优选1：2-1：5；发明人发现，两者比例太低了银离子络合不完全，太高了会发生氧化还原反应。

在其中一些实施例中，所述氨基酸络合银与脂质体薄膜的质量比为1：9-11，更优选为1：10。

在其中一些实施例中，所述银离子源可以是硝酸银、硫酸银、碳酸银、氧化银、柠檬酸银、磷酸银中的一种或者几种。更优选为硝酸银。

在其中一些实施例中，氨基酸为赖氨酸、色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、结氨酸、组氨酸、精氨酸中的一种或者几种的组合物。更优选为赖氨酸和组氨酸组合，更优选为赖氨酸和组氨酸以3-5:1的组合，最优选为赖氨酸和组氨酸以4:1的组合。

在其中一些实施例中，脂质体通过薄膜分散法、注入法、超声波分散法、冷冻干燥法中的任一种方法制备。进一步地，在其中一些实施例中，脂质体的制备方法为：卵磷脂6±0.5g、胆固醇1±0.1g加入100±1ml氯仿和乙醚体积比为4.5-5.5：1的混合液的有机溶剂中，搅拌溶解，60±2℃加热冷凝，蒸发掉有机溶剂，得到脂质体薄膜。

在其中一些实施例中，所述磷脂包括卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂、合成磷脂中的一种或者几种。

本发明的另一个目的是提供上述制备方法得到的氨基酸络合银脂质体。

本发明的另一目的是提供了一种长效抑菌的植物组织培养基。

实现上述目的技术方案如下：一种植物组织培养基，包括MS基础培养基、上述氨基酸络合银脂质体，其中银含量为1-100ppm。进一步优选为银含量为10-50ppm。

在组织培养过程中，还需要添加氨基酸，为植物提供含氮营养成分。我们创造性地利用培养基中本来就要用到的氨基酸来络合银离子，降低其释放速率；另外，通过脂质体对氨基酸络合银进一步包裹，可以达到对银离子释放的进一步控制。这样可以充分发挥银离子的抗菌促生长功效。降低组培成本，提高组培质量，降低环境污染。本发明所述制备方法，通过合理控制工艺，制备方法简单实用。

本发明制备的所述氨基酸络合银脂质体，通过恰当的氨基酸络合与脂质体包裹双重稳定，很好的控制了银离子的释放率，利用银离子的特性，从而使植物组织培养基能够达到长效抑菌。

本发明所述氨基酸络合银脂质体通过氨基酸络合与脂质体包裹双重稳定，很好的控制了银离子的释放率，利用银离子的特性，可达到长效抑菌的效果，所以本发明所述的氨基酸络合银脂质体添加到植物培养基中，可以有效抑制组培培养过程中菌类的生长，显著节约生产成本，提升种苗成活率，并且减少环境污染。

附图说明

图1为刚配置好的培养基照片。

图2为12天后无抑菌剂培养基长菌的照片。

图3为12天含银5ppm培养基无菌的照片。

图4为12天含银10ppm培养基无菌的照片。

图5为12天含银20ppm培养基无菌的照片。

图6为12天含银40ppm培养基无菌的照片。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例一、制备氨基酸络合银脂质体

本实施例所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，包括以下步骤：

1、氨基酸溶液配制：48g赖氨酸(0.32mol)、12g(0.08mol)组氨酸加入8L去离子水中，搅拌溶解，得氨基酸混合溶液；

2、银氨溶液配制：25.5g硝酸银加入1500ml去离子水中，搅拌溶解，滴入氨水至无色透明，得银氨络合液；

3、将步骤2所得全部银氨络合溶液缓慢滴入步骤1所得氨基酸溶液中，搅拌30min，定容到10L，得到氨基酸银络合溶液；

4、制备脂质体薄膜：卵磷脂6g、胆固醇1g加入100ml氯仿/乙醚(体积比为5：1)有机溶剂中，搅拌溶解；60℃加热冷凝，蒸发掉有机溶剂，得到脂质体薄膜；

5、往脂质体薄膜中加入100ml氨基酸银络合溶液，超声振荡溶解，得到氨基酸络合银脂质体溶液。其中，其中脂质体含量约为7.5g，银浓度为1000mg/L，氨基酸络合银约0.75g。

实施例二：含银培养基抑菌效果验证

1)称取培养基大量元素、微量元素、有机物、植物激素、卡拉胶和蔗糖，加水加热溶胀搅拌，定容到100ml，调pH值，用于制备MS培养基；

MS培养基的元素以及有机成分组成如下，MS培养基也可以通过购买得到。

2)分装到5个培养容器中，每份20ml；除第1份不加氨基酸银脂质体，让其自然冷却凝固，作为对照样之外；2、3、4、5样中分别加入定量的氨基酸银脂质体，使得其中银含量分别为5ppm、10ppm、20ppm、40ppm的标号为2、3、4、5号的植物组织培养基；

3)2、3、4、5号植物组织培养基冷却凝固；

4)1、2、3、4、5号植物组织培养基均在常温放置，观察培养基中自然生成细菌生长情况(见图1)；

12天后，对照基础培养基1中有菌落出现(见图2)；12天后，抑菌培养基保持原状，无菌落出现(见图3-6)。培养基实验结果显示：添加银离子的培养基与空白培养基相比，具有明显的抑制培养基细菌生长的功效。

实施例三、氨基酸络合银与氨基酸络合银脂质体使用效果对比

1)按照实施例2所述方法，制备MS培养基1.5L；添加有实施例1所述制备方法得到的氨基酸络合银溶液的MS培养基1.5L(银含量为20ppm)；含有实施例1所述制备方法得到的氨基酸络合银脂质体的MS培养基1.5L(银含量为20ppm)；共设三组；

2)分装到45个培养容器中，每份100ml，三组样品各15瓶；

3)冷却凝固；

4)加压高温120℃灭菌15min

5)每组培养基中加入石斛组培苗在无菌室常温密闭培养；

6)分别在第7天、14天、21天、28天通过ICP-MS法测试含氨基酸络合银和氨基酸络合银脂质体培养基中银含量，两个培养基中银含量如表一所示。

7)持续培养45天，观察组培试样的染菌情况，计算染菌率(见表二)

表一 添加氨基酸络合银和氨基酸络合银脂质体培养基中银含量随时间变化表

从表格中可以看出，添加氨基酸络合银脂质体的培养基中，银离子释放相对更慢，更有利于培养基保持长效抑菌功能。

表二 三种培养基组培试样的染菌率

从表二可以看出，添加银添加剂后，明显降低了染菌率，且添加氨基酸络合银脂质体的培养基组培试样染菌率更低，提高了组培苗的成活率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)氨基酸溶于水，制备氨基酸溶液，氨基酸浓度是0.02-0.2mol/L；

2)银离子源加入去离子水中，搅拌溶解，滴入氨水至无色透明，得银氨络合液，其中所述银离子源的浓度为0.03-0.3mol/L；

3)将银氨络合溶液缓慢滴入氨基酸溶液中，搅拌均匀，得到氨基酸银络合溶液；

4)制备脂质体薄膜：通过薄膜分散法、注入法、超声波分散法、冷冻干燥法中的任一种方法制备；

5)往脂质体薄膜中加入氨基酸银络合溶液，超声振荡溶解，得到氨基酸络合银脂质体溶液，氨基酸络合银与脂质体薄膜的质量比为1：9-20。

2.根据权利要求1所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于，在氨基酸银络合溶液中，所述银与氨基酸的摩尔比为1：1-1：10，更优选1：2-1：5。

3.根据权利要求1所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于，所述氨基酸络合银与脂质体薄膜的质量比为1：9-11。

4.根据权利要求1所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于，所述银离子源是硝酸银、硫酸银、碳酸银、氧化银、柠檬酸银、磷酸银中的一种或者几种，更优选为硝酸银。

5.根据权利要求1所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸、色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、结氨酸、组氨酸、精氨酸中的一种或者几种的组合物。

6.根据权利要求5所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸和组氨酸组合。

7.根据权利要求1-6任一项所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于：所述脂质体的制备方法为：磷脂6±0.5g、胆固醇1±0.1g加入100±1ml氯仿和乙醚体积比为4.5-5.5：1的混合液的有机溶剂中，搅拌溶解，60±2℃加热冷凝，蒸发掉有机溶剂，得到脂质体薄膜。

8.根据权利要求7所述的氨基酸络合银脂质体的制备方法，其特征在于，所述磷脂包括卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂、合成磷脂中的一种或者几种。

9.权利要求1-8所述制备方法得到的氨基酸络合银脂质体。

10.一种植物组织培养基，其特征在于，包括MS基础培养基、权利要求9所述的氨基酸络合银脂质体，MS基础培养基中的银含量为1-100ppm。

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