CN109937884B - 一种板栗与真菌离体共生培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菌根培养技术领域，尤其是涉及一种板栗与真菌离体共生培养的方法。所述板栗与真菌离体共生培养的方法，包括如下步骤：将板栗根系与真菌的纯菌丝共培养，共培养时将板栗根系和纯菌丝使用第一半透膜与共培养的培养基隔离，所述第一半透膜的孔径大小为0.5μm‑0.7μm。本发明的板栗根系和硬皮马勃菌离体共生培养的方法，采用特定的半透膜将培养基与共培养体系中的板栗根系和纯菌丝物理分离，但是能够保证培养基能够提供养分给板栗根系和纯菌丝，不影响板栗根系和纯菌丝的正常生长。

Description

一种板栗与真菌离体共生培养的方法

技术领域

本发明涉及菌根培养技术领域，尤其是涉及一种板栗与真菌离体共生培养的方法。

背景技术

外生菌根，是由真菌与植物根系建立互惠共生关系所形成的共生体，能够形成这样共生关系的真菌称为外生菌根真菌。

外生菌根对宿主营养生长的作用一是扩大宿主的吸收面积及吸收范围。二是提高营养元素的吸收作用。研究表明，外生菌根能提高宿主植物对营养元素的吸收和利用，尤其是促进P和N的吸收利用。三是外生菌根菌分泌植物激素的促生长作用，绝大多数外生菌根真菌能合成或分泌植物激素和生长调节剂来调节共生关系，对植物生长发育过程起着多重作用。

板栗能够与特定的外生菌根真菌形成典型的外生菌根结构，大量研究表明，形成外生菌根对板栗是有益的。

当前的板栗根系与真菌研究方法具有一定的缺陷：

(1)周期长，过程复杂：传统的板栗根系与真菌互作研究采用容器法进行土培，需要通过拌土、蘸根等方式接种真菌，这种方法不但需要对培养的土壤进行灭菌，还需要占用大量空间，且试验周期长；

(2)不利于互作过程中的观察：传统土培板栗根系研究无法直观地观察根系分布和菌-根互作过程；组培苗的根系通常深入培养基质中难以直接接触真菌；

(3)不利于互作体系的分离：采用容器法或分室法难以分离根系与培养基质，分离过程会对根系造成损伤；采用传统组培的方法根部携带的培养基质不容易去除，直接影响真菌生长、菌-根间的互作，甚至影响后续实验的准确性；

(4)不利于实验分析：由于传统板栗根系与真菌互作体系并非全部都是无菌环境，无法排除其他微生物的干扰，外界环境对板栗根系与菌根真菌影响大，使得互作机制研究困难。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种板栗与真菌离体共生培养的方法，以解决现有技术中存在的菌根形成效率低、培养步骤繁琐、周期长、损伤根系等的技术问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种板栗与真菌离体共生培养的方法，包括如下步骤：

将板栗根系与真菌的纯菌丝共培养，共培养时将板栗根系和纯菌丝使用第一半透膜与共培养的培养基隔离，所述第一半透膜的孔径大小为0.5μm-0.7μm；

所述真菌包括硬皮马勃菌、美味牛肝菌、大红菇、须腹菌中的任一种。

本发明的板栗根系和真菌离体共生培养的方法，采用特定的半透膜将培养基与共培养体系中的板栗根系和纯菌丝物理分离，但是能够保证培养基能够提供养分给板栗根系和纯菌丝，不影响板栗根系和纯菌丝的正常生长。

本发明通过采用半透膜，能够在共培养期间通过半透膜对根系分布、真菌形态以及互作共生情况进行观察，了解共培养过程中的根系与真菌互作程度等。

半透膜的孔径大小在上述范围内，能够使培养基与半透膜紧密接触，培养基中的营养物质能够均匀扩散至半透膜的另一侧，与另一侧的板栗根系和纯菌丝接触，为二者共培养提供养分。同时，板栗根系与纯菌丝共培养体系被隔离在半透膜的另一侧。

本发明的板栗与真菌的离体共生培养方法中，真菌优选为硬皮马勃菌。

在本发明一些具体实施方式中，第一半透膜的孔径优选为0.55μm-0.65μm，进一步优选为0.6μm。

如在不同实施方式中，第一半透膜的孔径可以为0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm等等。采用上述孔径的半透膜，能够配合培养基的成分，对板栗根系及真菌提供充足的营养，同时实现物理隔离。

在本发明一些具体实施方式中，所述共培养的培养基优选采用真菌培养基。

优选的，所述共培养的方法包括：在板栗无菌苗开始萌发二级侧根时与真菌的纯菌丝共培养。更优选的，纯菌丝的菌落大小为2-2.5cm。

在实际操作中，共培养时，板栗无菌苗的板栗根系可以直接与真菌纯菌丝接触，也可以与真菌纯菌丝有一小段距离，如0.5cm-1.5cm。

优选的，所述共培养的条件包括：采用避光材料包覆板栗根系和纯菌丝，每天光照15-17h，共培养1-4周。

每天光照15-17h，其余实现黑暗条件。如在不同实施方式中，每天光照时间可以为15h、15.5h、16h、16.5h、17h等等。

优选的，共培养过程中，光照时的温度为25-27℃。在非光照条件下，温度为20-22℃。

采用上述条件进行共培养，在板栗根系与硬皮马勃菌菌丝接触10-15d即可观察到菌丝包裹根的现象；在20天左右可以观察到明显的菌套结构，初步形成外生菌根结构。对共培养20d后的侵染率进行测试，共生20d后硬皮马勃菌的侵染率大于80％。同时，得到的互作共生体系在培养条件下可保持4个月以上。

优选的，采用真菌培养基对真菌进行培养得到纯菌丝，培养时采用第二半透膜隔离真菌培养基和真菌；所述第二半透膜的孔径大小为0.5μm-0.7μm，优选为0.55μm-0.65μm。

通过半透膜隔离培养基和菌进行培养，能够获得不含培养基的纯菌丝，避免在后续与板栗根系进行共培养时，需要提前将菌丝与培养基分离造成对菌丝的损坏等。

优选的，所述真菌的培养条件包括：在25±1℃条件下，暗培养10-15d。通过上述培养条件，能够获得生长在半透膜上的不含有培养基的纯菌丝。

在实际操作中，可将带有培养基的真菌预先在铺有半透膜的真菌培养基中暗培养10-15d，得到菌丝，再将菌丝接种至共培养培养基中暗培养5-10d后使用。

优选的，所述板栗根系的获取方法包括：采用板栗培养基对板栗种子进行培养，培养时采用第三半透膜或滤纸隔离板栗培养基和板栗种子；所述第三半透膜的孔径大小为0.5μm-0.7μm，优选为0.55μm-0.65μm。

通过半透膜或滤纸隔离培养基和板栗种子再进行培养，能够获得不含培养基的生根的板栗无菌苗，避免在后续与纯菌丝进行共培养时，需要提前将生根的板栗无菌苗与培养基分离造成对板栗根系的损坏等。

优选的，所述板栗种子的培养条件包括：将板栗种子接种至板栗培养基中，使用避光材料包裹根系所在的培养皿，每天光照15-17h培养。更优选的，培养2d后，切除下胚轴的根尖部分。以刺激侧根生长。

在实际培养过程中，如必要，可将上述培养的植物每7天转移至新的板栗培养基中重复进行培养。使得板栗种子形成无菌苗。

优选的，待板栗一级侧根生长2-3cm时或切除下胚轴的根尖部分时，转移至真菌培养基中进行培养，直至其萌发二级侧根。

在本发明不同实施方式中，各个半透膜优选为透明的半透膜，以方便对板栗与真菌离体共生培养过程的实时观测。在实际应用中，可采用一层半透膜或采用多层半透膜叠放。

本发明采用的半透膜材质可以为聚碳酸酯、玻璃纤维等。

优选的，第一半透膜、第二半透膜和第三半透膜为玻璃纤维膜。更优选的，玻璃纤维膜为Gel drying frames Extra cellophane sheets，厂商为Sigma公司，规格为Z377600-1PAK。

本发明通过协同配合半透膜种类与培养基成分，保证真菌、板栗种子等培养基在单独培养和共培养时，营养成分能够均匀自由通过半透膜，为其提供养分，保证正常生长等。

优选的，所述共培养的培养基为P20培养基。具体的，P20培养基的组分包括：Di-NH₄-tartrat，0.5g·L^-1；KH₂PO₄ 1g·L^-1；MgSO₄·7H₂O 0.5g·L^-1；葡萄糖1g·L^-1；微量元素母液(1000×)1mL·L^-1；盐酸硫铵母液(1000×)1mL·L^-1；MES 1g·L^-1；琼脂为15g·L^-1。在具体配制时，使用0.25N KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。

优选的，所述真菌培养基为P20培养基。与上述共培养的培养基成分相同。

优选的，所述板栗培养基为WPM培养基。具体的，WPM培养基的组分包括：NH₄NO₃400mg·L^-1；Ca(NO₃)₂.4H₂O 556mg·L^-1；K₂SO₄ 990mg·L^-1；CaCl₂·2H₂O 96mg·L^-1；KH₂PO₄170mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1；MgSO₄·7H2O 370mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 22.4mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1；CuSO₄·5H₂O 0.25mg·L^-1；FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1；Na₂-EDTA37.3mg·L^-1；肌醇100mg·L^-1；维生素B1 1.0mg·L^-1；烟酸0.5mg·L^-1；维生素B₆ 0.5mg·L^-1；甘氨酸2mg·L^-1；蔗糖30g·L^-1；琼脂7g·L^-1。在具体配制时，使用0.25N KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。

在本发明各步骤中，涉及植物组培技术、真菌培养技术、真菌接种技术等相关步骤均需要无菌操作。

上述涉及的避光材料可以为铝箔纸，使得根系、真菌等避光。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的板栗根系和真菌离体共生培养的方法，采用特定的半透膜将培养基与共培养体系中的板栗根系和纯菌丝物理分离，并能够保证培养基能够提供养分给板栗根系和纯菌丝，不影响板栗根系和纯菌丝的正常生长；

(2)本发明的离体共生培养方法，能够有效排除其它微生物等对根系和真菌的干扰，提高了真菌侵染率，提高板栗根系与真菌互作效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供板栗与真菌离体共生培养共培养时的侧视示意图；

图2为本发明实施例提供板栗与真菌离体共生培养共培养时的正视示意图；

图3为本发明实施例的离体共生培养后得到的互作系统实物图，其中，图中箭头表示菌根的菌套结构。

附图标记：

1-培养皿； 2-培养基； 3-板栗无菌苗；

4-一级侧根； 5-二级侧根； 6-菌丝；

7-半透膜； 8-真菌菌丝； 9-板栗根系。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

图1为本发明实施例提供的板栗与真菌离体共生培养共培养时的侧视示意图；图2为本发明实施例提供板栗与真菌离体共生培养共培养时的正视示意图。如图1和2所示，本实施例提供的板栗与真菌离体共生培养的方法，包括如下步骤：

在培养皿1中加入配制好的共培养培养基2，待培养基完全凝固后，铺上大小约为培养基一半的半透膜7，用两张膜覆盖整个培养皿1；

将真菌的纯菌丝6接种与培养基2且位于半透膜7上，将板栗无菌苗3的板栗根系与纯菌丝6接触或有一小段距离，将纯菌丝6和板栗根系共培养。优选当板栗无菌苗3的板栗根系在萌发一级侧根4后，萌发二级侧根5时，纯菌丝6的大小为2-2.5cm时，将二者共培养。

实施例1

本实施例提供了一种板栗与硬皮马勃菌离体共生培养的方法，包括如下步骤：

(1)将配制好的真菌培养基倒入13cm×13cm的培养皿中，待培养基完全凝固后铺上大小为培养基一半的无菌玻璃纤维膜(Sigma公司，规格：Z377600-1PAK)，用两张无菌玻璃纤维膜覆盖整个平皿。

其中，上述真菌培养基为P20培养基，组分为：Di-NH₄-tartrat，0.5g·L^-1；KH₂PO₄1g·L^-1；MgSO₄·7H₂O 0.5g·L^-1；葡萄糖1g·L^-1；微量元素母液(1000×)1mL·L^-1；盐酸硫铵母液(1000×)1mL·L^-1；MES 1g·L^-1；琼脂为15g·L^-1；使用0.25N KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。

(2)将纯化的硬皮马勃菌接种到步骤(1)中的培养皿上，每侧的无菌玻璃纤维膜上可接种2个真菌块，25℃条件下暗培养12d，获得生长在玻璃纤维膜上的不含有培养基的纯菌丝。

(3)使用8mm打孔器将步骤(2)中的硬皮马勃菌纯菌丝再接种到只有一张玻璃纤维膜覆盖培养基一侧的步骤(1)中的培养皿上，每侧可接种2个菌丝片，25℃条件下暗培养8天，获得完全不含有培养基的纯菌丝，同时监测真菌生长状态。

(4)将配制好的板栗培养基倒入13cm×13cm培养皿中，待培养基完全凝固后，在培养基的一侧铺上大小为培养基表面一半的无菌玻璃纤维膜；

其中，板栗培养基为WPM培养基，组成成分为：NH₄NO₃ 400mg·L^-1；Ca(NO₃)₂.4H₂O556mg·L^-1；K₂SO₄ 990mg·L^-1；CaCl₂·2H₂O 96mg·L^-1；KH₂PO₄ 170mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg·L^-1；MgSO₄·7H2O 370mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 22.4mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1；CuSO₄·5H₂O 0.25mg·L^-1；FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1；Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1；肌醇100mg·L^-1；维生素B11.0mg·L^-1；烟酸0.5mg·L^-1；维生素B₆ 0.5mg·L^-1；甘氨酸2mg·L^-1；蔗糖30g·L^-1；琼脂7g·L^-1；使用0.25N KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。

(5)将板栗种子修块后消毒接种到步骤(4)中的培养基上，使用铝箔纸包裹根系所在的半个培养皿，使根系避光；培养条件为16小时光照，8小时黑暗，光照时26℃，黑暗时21℃；培养2天后切除下胚轴，刺激侧根生长；每7天将植物转移到新的步骤(4)中的培养基上，培养至一级侧根长度为2-3cm。

(6)将配制好的共培养培养基(与步骤(1)中的真菌培养基相同)倒入13cm×13cm培养皿中，待培养基完全凝固后，在培养基的一侧铺上大小为培养基表面一半的无菌玻璃纤维膜。

(7)将步骤(5)中得到的生根的板栗无菌苗转移到步骤(6)中的培养基上，进行培养，同时观察根系生长状况和分布情况；待步骤(3)中得到的大小为2-2.5cm的纯菌丝时，将开始萌发二级侧根的板栗无菌苗转移到步骤(3)中的培养基上，板栗根系直接与纯菌丝接触，或者离真菌0.5-1.5cm，使用铝箔纸包裹根系和纯菌丝所在的半个培养皿，使根系和纯菌丝避光；将根系和纯菌丝互作体系置于下述条件培养：16小时光照，8小时黑暗，光照时26℃，黑暗时21℃，培养30天；共培养过程中，可通过共生体系培养观察板栗根系与真菌，利用显微技术等观察板栗根系与硬皮马勃菌互作情况以及是否形成菌根；板栗根系与硬皮马勃菌菌丝接触12天即可观察到菌丝包裹根的现象；20天左右可以观察到明显的菌套结构，初步形成外生菌根结构；共生20天后硬皮马勃菌的侵染率大于80％；互作共生体系在培养条件下可保持4个月以上。

如图3是本实施例的离体共生培养后得到的互作系统实物图，具体为共培养20天的实物图。其中，图中箭头表示菌根的菌套结构。

从图3中可知，在共培养20天后，真菌菌丝8与板栗根系9之间形成了菌套结构。

实施例2

本实施例参考实施例1的培养方法，区别仅在于：步骤(2)中，将真菌块，在25℃条件下暗培养15d，获得生长在玻璃纤维膜上的不含有培养基的纯菌丝。

实施例3

本实施例参考实施例1的培养方法，区别仅在于：步骤(3)中，将菌丝片，在25℃条件下暗培养5d，获得生长在玻璃纤维膜上的不含有培养基的纯菌丝。

实施例4

本实施例参考实施例1的培养方法，区别仅在于：步骤(7)中，将根系和纯菌丝互作体系置于下述条件培养：每天15h光照，9h黑暗，光照时26℃，黑暗时21℃，培养30天。

实施例5

本实施例参考实施例1的培养方法，区别仅在于：步骤(7)中，将根系和纯菌丝互作体系置于下述条件培养：每天17h光照，7h黑暗，光照时26℃，黑暗时21℃，培养30天。

实施例6

本实施例参考实施例1的培养方法，区别仅在于：步骤(7)中，将根系和纯菌丝互作体系置于下述条件培养：每天18h光照，6h黑暗，光照时26℃，黑暗时21℃，培养30天。

本发明的板栗根系和硬皮马勃菌离体共生培养的方法，采用特定的半透膜将培养基与共培养体系中的板栗根系和纯菌丝物理分离，并能够保证培养基能够提供养分给板栗根系和纯菌丝，不影响板栗根系和纯菌丝的正常生长。本发明的离体共生培养方法，能够有效排除其它微生物等对根系和真菌的干扰，提高了真菌侵染率，提高板栗根系与真菌互作效果。现有技术中采用的土培方式，需要至少1个月至3个月才能实现80％的侵染率，本发明的离体共生培养的方法，显著提高了菌根形成效率，提高板栗根系与真菌互作效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将板栗根系与真菌的纯菌丝共培养，共培养时将板栗根系和纯菌丝使用第一半透膜与共培养的培养基隔离，所述第一半透膜的孔径大小为0.5μm-0.7μm；

所述真菌包括硬皮马勃菌、美味牛肝菌、大红菇、须腹菌中的任一种；

所述第一半透膜为玻璃纤维膜；

所述共培养的方法包括：在板栗无菌苗开始萌发二级侧根时与真菌的纯菌丝共培养；

所述共培养的培养基为P20培养基；所述P20培养基的组分包括：Di-NH₄-tartrat，0.5g·L^-1；KH₂PO₄ 1 g·L^-1；MgSO₄•7H₂O 0.5 g·L^-1；葡萄糖1 g·L^-1；1000×微量元素母液1mL·L^-1；1000×盐酸硫铵母液1mL·L^-1；MES 1 g·L^-1；琼脂为15 g·L^-1；

所述板栗根系的获取方法包括：采用板栗培养基对板栗种子进行培养，培养时采用第三半透膜或滤纸隔离板栗培养基和板栗种子；所述第三半透膜的孔径大小为0.5μm-0.7μm；

对板栗种子培养2d后，切除下胚轴的根尖部位；

待板栗一级侧根生长2-3cm时，转移至真菌培养基中进行培养，直至其萌发二级侧根；

所述共培养的条件包括：采用避光材料包覆板栗根系和纯菌丝，每天光照15-17h，共培养1-4周；共培养过程中，光照时的温度为25-27℃；非光照时，温度为20-22℃。

2.根据权利要求1所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述第一半透膜的孔径为0.55μm-0.65μm。

3.根据权利要求1或2所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述纯菌丝的菌落大小为2-2.5cm。

4.根据权利要求1或2所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述纯菌丝的获取方法包括：采用真菌培养基对真菌进行培养得到纯菌丝，培养时采用第二半透膜隔离真菌培养基和真菌；所述第二半透膜的孔径大小为0.5μm-0.7μm。

5.根据权利要求4所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述真菌的培养条件包括：在25±1℃条件下，暗培养10-15d。

6.根据权利要求4所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述第二半透膜为玻璃纤维膜。

7.根据权利要求1所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述板栗种子的培养条件包括：将板栗种子接种至板栗培养基中，使用避光材料包裹根系所在的培养皿，每天光照15-17h培养。

8.根据权利要求1所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述板栗培养基为WPM培养基。

9.根据权利要求1所述的板栗与真菌离体共生培养的方法，其特征在于，所述第三半透膜为玻璃纤维膜。

Images