CN110702836A - 一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法及其应用 - Google Patents

一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法及其应用。该质量控制方法包括利用薄层色谱法对类神经酰胺发酵提取物进行Mel‑A、Mel‑B和Mel‑C的鉴别；利用高效液相色谱法对类神经酰胺发酵提取物进行Mel‑A、Mel‑B和Mel‑C的含量测定。本发明提供的鉴别方法直观、准确；采用高效液相法对类神经酰胺发酵提取物中主要活性成分Mel‑A、Mel‑B和Mel‑C指标进行含量测定，并限定含量标准，具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好、能快速定量等优点，保证了产品的有效性和安全性；能较好地控制类神经酰胺Mels发酵提取物的质量，具有较强的专属性和良好的重现性，可真正体现安全有效、质量可控。

Description

一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法及其应用
技术领域
本发明属于质量检测领域，尤其涉及一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法及其应用。
背景技术
神经酰胺(Ceramide)，即N-脂酰神经鞘氨醇，是由神经鞘氨醇(Sphingosine)和长链脂肪酸缩合而成的一类酰胺类化合物，神经酰胺是一类化合物而不是一种化合物，主要存在于角质层的细胞膜和细胞间基质中。神经酰胺最早是从动物的神经鞘中分离得到，由此而得名。一八八四年德国医生Thudichunm发现在人脑中存在神经鞘脂质，近年来从许多植物中亦发现了神经酰胺。神经酰胺类化合物根据侧链基团、不饱和度以及羟基数目的不同分为神经鞘氨醇类、神经酰胺类、糖鞘脂类和鞘磷脂类，其中以神经酰胺类、糖鞘脂类为主。四类神经酰胺类化合物的组成分别是：⑴神经鞘氨醇类(亦称鞘氨醇类或神经醇类，Sphingoid)是最简单的鞘脂类化合物，也是其他鞘脂类化合物的基本部分(长链碱基部分)，它是鞘脂类化合物的特征性结构；⑵神经酰胺类(神经酰胺Ceramide)，即N-脂酰基鞘氨醇(N-Acyl sphingosine)，是由一分子鞘氨醇类与一分子脂肪酸类通过酰胺键结合的化合物：其中鞘氨醇部分、脂肪酸部分的碳链长度、不饱和度和羟基数目都不是固定的，目前发现的神经酰胺类按其饱和度和羟基数的不同至少有7种以上；⑶糖鞘脂类是指神经酰胺的1-位羟基与糖基(D-半乳糖或D-葡萄糖)以β-糖苷键结合形成的一类鞘脂类化合物，目前在植物魔芋中已鉴定出5个同分异构体的糖鞘脂类神经酰胺；⑷鞘磷脂类是指神经酰胺的1-位羟基与磷酸胆碱(或磷酸)以酯键结合而成的一类鞘脂类化合物。神经酰胺的结构特点是除酰胺结构外，还含有亲脂性的二条长链烷基和亲水性的二个羟基基团。神经酰胺主要具有以下作用与应用：在日化美容行业，神经酰胺用于加强抗衰老功能，令肌肤保持弹性，光滑细致，减少面部皱纹形成；具有屏障、保湿、持水等作用；在医学方面，神经酰胺在多种细胞因子、维生素D3、Fas及CD28配体等诱导生物效应中起重要信使作用，其介导细胞凋亡作用日益受到关注，具有抗肿瘤、免疫促进等生理活性，有着广泛的使用价值。目前，神经酰胺主要是通过动植物分离得到，存在产量很低、生产成本极高、应用上受到限制等问题。
甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸酯类(Mannosylerythritol lipids，Mels)是一类糖脂类生物表面活性剂成分，可作为高级生物表面活性剂。Mels具有与神经酰胺相似的空间结构，含有与神经酰胺相似的亲脂性的二条长链烷基和亲水性的二个或以上羟基基团。此外，Mels易于渗入皮肤角质层的细胞间隙，形成液体结晶，维持皮肤水分，起到保湿、润肤及皮肤屏障修复功效，具有与神经酰胺相似的部分功效。本公司利用橄榄油为唯一碳源，首次通过乳化发酵法制备了神经酰胺替代品--类神经酰胺Mels提取物，并克服了Mels目前产量不高，难以工业化生产，生产的Mels产物难以分离提取、Mels合成量低、不宜连续生产、原料生产成本高等缺点。类神经酰胺Mels提取物主要含有Mel-A(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯)、Mel-B(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯)和Mel-C(甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯)等成分，其成分的有无与含量的高低决定类神经酰胺Mels提取物的质量与功效，然而，目前尚未见到有关类神经酰胺发酵提取物质量控制方法的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法。该方法能够快速、准确的鉴别类神经酰胺Mels发酵提取物中的Mel-A、Mel-B和Mel-C，并通过高效液相色谱法测定类神经酰胺Mels发酵提取物中Mel-A(C34H60O13)、Mel-B(C32H58O12)和Mel-C(C32H58O12)的含量。
本发明的另一目的在于提供上述类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法的应用。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，包括利用薄层色谱法对类神经酰胺发酵提取物进行Mel-A、Mel-B和Mel-C的鉴别；利用高效液相色谱法对类神经酰胺发酵提取物进行Mel-A(C34H60O13)、Mel-B(C32H58O12)和Mel-C(C32H58O12)的含量测定。
所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，包括如下步骤：类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C成分的总量计，其质量百分比不少于45.0％。
所述的薄层色谱法的具体步骤优选如下：
(1)供试品溶液制备：用有机溶剂溶解类神经酰胺发酵提取物，制成每1mL含有类神经酰胺发酵提取物0.01～1g的溶液，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：用有机溶剂分别溶解Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品，制成每1mL含有Mel-A、Mel-B和Mel-C各1～10mg的混合溶液，作为对照品溶液；
(3)薄层色谱鉴定：吸取供试品溶液5～10μL、对照品溶液5～10μL、有机溶剂作为阴性对照品溶液5～10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6.5:2.0:1.4:0.1＝氯仿:乙酸乙酯:甲醇:浓氨水的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以蒽酮显色剂溶液，待薄层板面干燥后于100～105℃加热至Mels成分斑点显清晰；
(4)观察硅胶G薄层板：置日光灯下检视，观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上是否存在相同颜色的斑点，即可鉴定出类神经酰胺发酵提取物含有的Mels的种类。
步骤(1)、(2)和(3)中所述的有机溶剂优选为乙酸乙酯。
步骤(1)中所述的供试品溶液的浓度优选为0.02g/mL。
步骤(2)中所述的对照品溶液的浓度优选为：Mel-A、Mel-B和Mel-C分别为5mg/mL。
步骤(3)中所述的浓氨水优选为以NH3含量为25～28％的氨水。
步骤(3)中所述的蒽酮显色剂溶液优选通过如下步骤配制得到：将100mg蒽酮溶于20mL无水乙醇中，然后加入2mL浓硫酸，混匀，避光保存。
所述的浓硫酸的浓度为质量百分比98％。
步骤(3)中所述的加热的时间优选为5～10min；更优选为10min。
步骤(4)中所述的斑点的颜色优选为蓝颜色。
所述的高效液相色谱法的具体步骤优选如下：
(A)色谱条件选择与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速1.0mL/min，ELSD蒸发光散射检测器检测：漂移管温度79℃，气体流速2.0L/min，压力30psi，理论塔板数按Mel-A(C34H60O13)峰计算≥2000；
(B)对照品溶液制备：分别精密称取Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品各10.0mg，用体积比为1：1的氯仿-甲醇溶液溶解并定容至10mL，用0.22μm的滤膜过滤，即得对照品溶液；
(C)供试品溶液制备：精密称取类神经酰胺发酵提取物50mg，用体积比为1：1的氯仿-甲醇溶液溶解并定容至10mL，用0.22μm的滤膜过滤，即得供试品溶液；
(D)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中Mel-A、Mel-B和Mel-C的总量。
步骤(A)中所述的梯度洗脱如下所示：
Figure BDA0002274128680000041
所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法在类神经酰胺发酵提取物生产中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明提供了类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其中对提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C的快速鉴别方法，直观、准确。
2、本发明采用高效液相法对类神经酰胺发酵提取物中主要活性成分Mel-A(C34H60O13)、Mel-B(C32H58O12)和Mel-C(C32H58O12)指标进行含量测定，并限定含量标准，具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好、能快速定量等优点，保证了产品的有效性和安全性。
3、本发明提供的质量控制方法能较好地控制类神经酰胺Mels发酵提取物的质量，具有较强的专属性和良好的重现性，可真正体现安全有效、质量可控。
附图说明
图1是类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C鉴别薄层色谱图：图中，1、2、3为供试品溶液，4为对照品溶液，5为阴性对照品溶液。
图2是类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C含量测定中对照品的高效液相色谱图。
图3是类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C含量测定中供试品的高效液相色谱图。
图4是类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C含量测定中阴性对照品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
在本实施例中使用的供试品分别是经过如下步骤制备得到的：
(A)供试品1：
⑴菌种活化：将-80℃冰箱中保存的优选酵母菌种假丝酵母(Candida antarctic)WHS112取出，量取1.00mL菌种加入含10.00mL种子培养基的100.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内、200rpm震荡培养48h，得活化的一级种子培养菌悬液，含湿菌重约62g/L。
⑵种子扩增：将上述所得活化的一级种子培养菌悬液10.00mL接种于含100.00mL种子培养基的500.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内、210rpm震荡培养48h，得二级种子培养菌悬液，含湿菌重65g/L。
⑶乳化发酵：向清洁消毒好的100L发酵罐内加入50L发酵培养基，并向发酵培养基中接入4L二级种子培养菌悬液，进行乳化发酵培养，维持培养温度28～30℃，pH不控制，空气流速1.5～2vvm或搅拌速度为150rpm(维持溶氧30％以上)。
⑷乳化发酵培养：在乳化发酵培养的第3～6天分别向发酵罐内添加1620g、3337g、5306g、3840g橄榄油。
⑸发酵放罐：乳化发酵培养8天后，得乳化状发酵培养菌悬液约70L，此时乳化状菌悬液中湿菌重为92g/L，发酵液约占罐总体积70％，将所得乳化状发酵培养菌悬液从罐内放出。
⑹菌液分离：将所得乳化状发酵培养菌悬液于沉降式离心机中进行菌液分离，离心分离条件为9000r/min，得到除去菌体的发酵液体56L。
⑺破乳分离：将上述所得除去菌体的发酵液体移入管式双水相离心机中，以15000r/min高速离心，进行破乳及油水初步分离，分取油相，即得类神经酰胺Mels提取物Ⅰ约9.3kg；分出的乳状水相约46L
⑻萃取分离：将步骤⑺中分出的乳状水相置于100L萃取罐中，加入20L 60～90℃的石油醚，继续破乳、振摇萃取并静置分层，分取石油醚层；石油醚层减压回收石油醚；余下的油状物即得类神经酰胺Mels提取物II约3.2kg。
⑼合并干燥：将步骤⑺中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅰ与步骤⑻中获得的类神经酰胺Mels提取物II合并，并进行脱水干燥，得类神经酰胺Mels提取物11.6kg。
(B)供试品2：
⑴菌种活化：将-80℃冰箱中保存的优选酵母菌种蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis)DSMZ70725取出，量取1.00mL菌种加入含10.00mL种子培养基的100.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，200rpm震荡培养48h，得活化的一级种子培养菌悬液，含湿菌重约65g/L。
⑵种子扩增：将上述所得活化的一级种子培养菌悬液10.00mL接种于含100.00mL种子培养基的500.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，210rpm震荡培养48h，得二级种子培养菌悬液，含湿菌重66g/L。
⑶乳化发酵：向清洁消毒好的100L发酵罐内加入50L发酵培养基，并向发酵培养基中接入4L二级种子培养菌悬液，进行乳化发酵培养，维持培养温度28～30℃，pH不控制，空气流速1.5～2vvm或搅拌速度为150rpm(维持溶氧30％以上)。
⑷乳化发酵培养：在乳化发酵培养的第3～6天分别向发酵罐内添加1620g、3337g、5306g、3840g橄榄油。
⑸发酵放罐：乳化发酵培养8天后，得乳化状发酵培养菌悬液约75L，此时乳化状菌悬液中湿菌重为95g/L，发酵液约占罐总体积70％，将所得乳化状发酵培养菌悬液从罐内放出。
⑹菌液分离：将上述所得乳化状发酵培养菌悬液于沉降式离心机中进行菌液分离，离心分离条件为9500r/min，得除去菌体的发酵液体59L。
⑺破乳分离：将上述所得除去菌体的发酵液体移入管式双水相离心机中，以16000r/min高速离心，进行破乳及油水初步分离，分取油相，即得类神经酰胺Mels提取物Ⅰ约10.8kg；分出的乳状水相约47L。
⑻萃取分离：将步骤⑺中分出的乳状水相置于100L萃取罐中，加入25L 60～90℃的石油醚，继续破乳、振摇萃取并静置分层，分取石油醚层；石油醚层减压回收石油醚；余下的油状物即得类神经酰胺Mels提取物II约3.6kg。
⑼合并干燥：将步骤⑺中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅰ与步骤⑻中获得的类神经酰胺Mels提取物II合并，并进行脱水干燥，得类神经酰胺Mels提取物13.2kg。
(C)供试品3：
⑴菌种活化：将-80℃冰箱中保存的优选酵母菌种假丝酵母(Candida antarctic)WHS112取出，量取1.00mL菌种加入含10.00mL种子培养基的100.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，200rpm震荡培养48h，得活化的一级种子培养菌悬液，含湿菌重约63g/L。
⑵种子扩增：将上述所得活化的一级种子培养菌悬液10.00mL接种于含100.00mL种子培养基的500.00mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱内，200rpm震荡培养48h，得二级种子培养菌悬液，含湿菌重64g/L。
⑶乳化发酵：向清洁消毒好的200L发酵罐内加入100L的发酵培养基，并向发酵培养基中接入8L二级种子培养菌悬液，进行乳化发酵培养，维持培养温度28～30℃，pH不控制，空气流速1.5～2vvm或搅拌速度为170rpm(维持溶氧30％以上)。
⑷乳化发酵培养：在乳化发酵培养的第3～6天分别向发酵罐内添加3240g、6675g、10612g、7680g橄榄油。
⑸发酵放罐：乳化发酵培养8天后，得乳化状发酵培养菌悬液约142L，此时乳化状菌悬液中湿菌重为91g/L，发酵液约占罐总体积71％，将所得乳化状发酵培养菌悬液从罐内放出。
⑹菌液分离：将上述所得乳化状发酵培养菌悬液于沉降式离心机中进行菌液分离，离心分离条件为10000r/min，得除去菌体的发酵液体113L。
⑺破乳分离：将上述所得除去菌体的发酵液体移入管式双水相离心机中，以16000r/min高速离心，进行破乳及油水粗步分离，分取油相，即得类神经酰胺Mels提取物Ⅰ约18.2kg；分出的乳状水相约93L
⑻萃取分离：将步骤⑺中分出的乳状水相置于200L萃取罐中，加入40L乙酸乙酯，继续破乳、振摇萃取并静置分层，分取乙酸乙酯层；石油醚乙酸乙酯层减压回收乙酸乙酯；余下的油状物即得类神经酰胺Mels提取物II约6.1kg。
⑼合并干燥：将步骤⑺中获得的类神经酰胺Mels提取物Ⅰ与步骤⑻中获得的类神经酰胺Mels提取物II合并，并进行脱水干燥，得类神经酰胺Mels提取物22.5kg。
本发明实施例中所涉及的Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品由本公司通过乳化发酵法得到的类神经酰胺发酵提取物经硅胶柱层析法进行分离纯化而得，经NMR(1HNMR、13CNMR)结构解析、MS结构表征等方法鉴定Mel-A、Mel-B和Mel-C分别为甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4,6-二乙酸酯、甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-6-乙酸酯和甘露糖-1-赤藓糖醇-2,3-二葵酸-4-乙酸酯，分子式分别为C34H60O13、C32H58O12和C32H58O12，分子量分别为676.4034、634.3938和634.3938，Mel-B与Mel-C互为同分异构体；并经归一化法含量测定，测得Mel-A、Mel-B和Mel-C纯度分别为98.89％、99.12％和98.36％，具体步骤如下：将5×70cm的玻璃层析柱洗净烘干，并用氯仿润湿。用氯仿浸泡200目硅胶，除去杂质，湿法装柱，用氯仿平衡。Mels提取物粗样品(供试品2)溶于氯仿，缓慢上样，样品先用氯仿洗脱，再用氯仿和甲醇按照体积比例进行梯度洗脱，即氯仿：甲醇＝10:1、10:2、10:3、10:4、和10:5逐步洗脱，控制洗脱速率为2.0mL/min。每管收集30mL。分离后的各组分，用TLC鉴定，并将相同组份合并，得到三个较纯样品合并流份。将收集得到的三个较纯样品合并流份，分别低温挥发浓缩，浓缩液于1～5℃冰箱中放置析晶，即得到三个类神经酰胺Mels成分A、B、C，纯度分别为98.89％、99.12％、98.36％。
本发明实施例中所涉及的阴性对照品溶液为乙酸乙酯溶液。
本发明实施例中所涉及的蒽酮显色剂溶液的配制方法如下：取100mg蒽酮，溶于20mL无水乙醇中，然后加入2mL浓硫酸(98％)，混匀、避光保存。
浓氨水为NH3含量为25～28％的氨水。
实施例1类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C的鉴别
(1)供试品溶液制备：取类神经酰胺Mels发酵提取物0.1g，加入乙酸乙酯5mL溶解，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液制备：取Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品各5mg，加入乙酸乙酯1mL，混合液即作为对照品溶液。
(3)薄层色谱鉴定：吸取供试品溶液5μL、对照品溶液5μL、阴性对照品溶液(即乙酸乙酯)5μL，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6.5:2.0:1.4:0.1＝氯仿:乙酸乙酯:甲醇:浓氨水的混合溶液为展开剂，，展开，取出，晾干，喷以蒽酮显色剂溶液，于105℃加热5-10min，至Mels成分斑点显清晰。
(4)检识：观察硅胶G薄层板，置日光灯下检视结果如图1所示，图中1，2、3为供试品，4为Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品，5为阴性对照品。图中供试品1，2、3色谱中，在与对照品4色谱相应的Mel-A、Mel-B和Mel-C位置上，显相同蓝颜色的斑点。阴性对照品色谱中，在与Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品色谱相应位置上，未见对应的斑点。表明类神经酰胺Mels发酵提取物中含有Mel-A、Mel-B和Mel-C三种成分。
实施例2类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C的含量测定
一、含量测定
Mel-A(C34H60O13)、Mel-B(C32H58O12)和Mel-C(C32H58O12)成分为类神经酰胺Mels发酵提取物中的主要活性成分，本法采用高效液相色谱法对其进行含量测定。
(1)色谱条件选择与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速1.0mL/min，ELSD蒸发光散射检测器检测：漂移管温度79℃，气体流速2.0L/min，压力30psi，理论塔板数按Mel-A(C34H60O13)峰计算≥2000。
梯度洗脱如下表1所示：
表1
Figure BDA0002274128680000091
(2)对照品溶液制备：分别精密称取Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品各5.0mg，置5mL的量瓶中，加氯仿-甲醇(CHCl3:MeOH＝1:1,v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀制成混合溶液，用0.22μm的滤膜滤过，即得对照品溶液。
(3)供试品溶液制备：精密称取类神经酰胺发酵提取物50mg，至10mL量瓶中，加氯仿-甲醇(CHCl3:MeOH＝1:1,v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀制成混合溶液，用0.22μm的滤膜滤过，过滤液为供试品溶液。
(4)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中Mel-A、Mel-B和Mel-C的总量。
本发酵提取物中以质量百分比计算，Mel-A、Mel-B和Mel-C的总量不少于45％。
二、含量测定的方法学研究
(1)色谱条件的确定：Mel-A(C34H60O13)、Mel-B(C32H58O12)和Mel-C(C32H58O12)在紫外光200-400nm范围内无最大吸收，故选用ELSD(蒸发光散射检测器)检测：当漂移管温度79℃、气体流速2.0L/min、压力30psi时，能较好地检测Mels类成分。
(2)系统适用性试验：在上述色谱条件下，分别取按实施例2步骤一制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液(溶剂)，各进样10μL，记录色谱图，测定结果如图2-图4所示。样品中Mel-A理论塔板数计算：n＝3870(＞2000)；主峰与其他峰的分离度均＞1.50；阴性对照溶液在对照品吸收峰处无吸收；表明对照品峰之间及各种其他产物对主峰干扰较小，符合系统适用性试验的要求。
(3)线性关系试验：分别精密称取Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品，置于同一量瓶，配制成Mel-A、Mel-B和Mel-C的对照品溶液(含Mel-A 3.36mg/mL、Mel-B 3.32mg/mL和Mel-C3.34mg/mL)，分别精密量取1、2、3、4、5mL，置于10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，分别命名为1号、2号、3号、4号、5号溶液。精密量取上述溶液各10μL，照上述色谱条件分别注入液相色谱仪，测定峰面积，结果如表2所示。以峰面积(Y)对进样浓度(X，mg/mL)进行线性回归：Mel-A回归方程为Y＝11860748.2X-3581.2，相关系数R＝0.9999；Mel-B回归方程为Y＝11794534.0X-1416.5，相关系数R＝0.9999；Mel-C回归方程为Y＝11665267.4X-1373.7，相关系数R＝0.9999。结果表明，Mel-A浓度在0.336-1.680mg/mL范围内，Mel-B浓度在0.332-1.660mg/mL范围内，Mel-C浓度在0.334-1.670mg/mL范围内，与峰面积具有良好的线性关系。
表2 Mel-A、Mel-B和Mel-C线性关系试验结果
Figure BDA0002274128680000101
(4)最小检出量试验：取线性关系试验项下的1号溶液，精密量取2mL，置10mL量瓶中，加流动相(乙腈)稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL，分别注入液相色谱仪，测定，色谱图中，信噪比＞10:1，所以最小检出量＜0.2μg/mL。
(5)精密度试验：取线性关系试验项下的3号溶液，精密量取10μL，重复进样6次，测定Mel-A、Mel-B和Mel-C的峰面积，计算RSD值，结果如表3所示，表明精密度良好。
表3精密度试验结果
测定次数 Mel-A Mel-B Mel-C
1 11884355 11767623 11675306
2 11894588 11683175 11531208
3 11860617 11788125 11616256
4 11881863 11672033 11590152
5 11905583 11742945 11600074
6 11799615 11691795 11650822
平均值 11871104 11724283 11610636
RSD％ 0.32 0.41 0.43
(6)稳定性试验：取类神经酰胺Mels发酵提取物，按实施例2中的方法制备得供试品溶液与对照品溶液，于0h、1h、2h、4h、8h及24h分别进样，每次进样量10μL，记录峰面积值，计算RSD值，结果见表4，对照品及样品供试液在24h内稳定性良好。
表4稳定性试验结果
测定时间 Mel-A Mel-B Mel-C
0 7678217 10107590 12519431
1 7358482 10307641 12472144
2 7501775 10293072 12610011
4 7479343 9990326 12460289
8 7583817 10151031 12538759
24 7507163 9957786 12193176
平均值 7518133 10134574 12465635
RSD％ 1.42 1.45 1.13
(7)重现性试验：取类神经酰胺Mels发酵提取物(供试品1)，按实施例2中方法制备6份供试品溶液，分别按实施例2步骤一中方法测定峰面积值，计算含量、RSD值。结果如表5所示，样品平均含量为51.54％，RSD＝0.90％，表明方法重复性良好。
表5重现性试验结果
测定序次 1 2 3 4 5 6
总含量(％) 51.93 51.06 52.04 50.97 51.85 52.07
(8)回收率试验：取已知含量的类神经酰胺Mels发酵提取物样品约25mg，精密称定，加Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品[Mel-A对照品溶液(4.27mg/mL)1mL、Mel-B对照品溶液(4.23mg/mL)1mL和Mel-C对照品溶液(4.34mg/mL)1mL]，按
实施例2中供试品溶液制备方法制备加样回收液，测定峰面积，计算测得量、回收率，结果如表6所示，样品平均回收率为99.62％，RSD为1.07％。
表6回收率试验结果
Figure BDA0002274128680000121
实施例3生产三批类神经酰胺Mels发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C的含量测定
采用高效液相色谱法对三批试制的类神经酰胺Mels发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C进行含量测定：
色谱条件与系统适用性：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速1.0ml/min，ELSD蒸发光散射检测器检测：漂移管温度79℃，气体流速2.0L/min，压力30psi，理论塔板数按Mel-A(C34H60O13)峰计算≥2000；
洗脱梯度如表7所示：
表7
对照品溶液的制备：分别精密称取Mel-A(C34H60O13)、Mel-B(C32H58O12)和Mel-C(C32H58O12)对照品各10.0mg，置10ml的量瓶中，加氯仿:甲醇(CHCl3:MeOH＝1:1,v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀制成混合溶液，过0.22μm滤膜，取续滤液，即得对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取Mels发酵提取物50mg，至10ml量瓶中，加氯仿-甲醇(CHCl3:MeOH＝1:1,v/v)溶解并稀释至刻度，摇匀制成混合溶液，过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中Mel-A(C34H60O13)、Mel-B(C32H58O12)和Mel-C(C32H58O12)的总量；
计算得生产三批发酵提取物中以质量百分比计算含Mel-A、Mel-B和Mel-C的总量为第一批51.54％(供试品1)、第二批68.08％(供试品2)、第三批56.97％(供试品3)，均未少于45％，具体结果如下表8。
表8三批次类神经酰胺Mels发酵提取物样品中Mels含量测定
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其特征在于：包括利用薄层色谱法对类神经酰胺发酵提取物进行Mel-A、Mel-B和Mel-C的鉴别；利用高效液相色谱法对类神经酰胺发酵提取物进行Mel-A、Mel-B和Mel-C的含量测定。
2.根据权利要求1所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其特征在于包括如下步骤：所述的类神经酰胺发酵提取物中Mel-A、Mel-B和Mel-C成分的总量计，其质量百分比不少于45.0％。
3.根据权利要求1或2所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其特征在于：所述的薄层色谱法的具体步骤如下：
(1)供试品溶液制备：用有机溶剂溶解类神经酰胺发酵提取物，制成每1mL含有类神经酰胺发酵提取物0.01～1g的溶液，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：用有机溶剂分别溶解Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品，制成每1mL含有Mel-A、Mel-B和Mel-C各1～10mg的混合溶液，作为对照品溶液；
(3)薄层色谱鉴定：吸取供试品溶液5～10μL、对照品溶液5～10μL、有机溶剂作为阴性对照品溶液5～10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6.5:2.0:1.4:0.1＝氯仿:乙酸乙酯:甲醇:浓氨水的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以蒽酮显色剂溶液，待薄层板面干燥后于100～105℃加热至Mels成分斑点显清晰；
(4)观察硅胶G薄层板：置日光灯下检视，观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上是否存在相同颜色的斑点，即可鉴定出类神经酰胺发酵提取物含有的Mels的种类。
4.根据权利要求3所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其特征在于：步骤(1)、(2)和(3)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯；
步骤(3)中所述的浓氨水为以NH3含量计为25～28％的氨水。
5.根据权利要求3所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的供试品溶液的浓度为0.02g/mL；
步骤(2)中所述的对照品溶液的浓度为：Mel-A、Mel-B和Mel-C分别为5mg/mL；
步骤(3)中所述的蒽酮显色剂溶液通过如下步骤配制得到：将100mg蒽酮溶于20mL无水乙醇中，然后加入2mL浓硫酸，混匀，避光保存；
所述的浓硫酸的浓度为质量百分比98％；
步骤(3)中所述的加热的时间为5～10min。
6.根据权利要求1或2所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法的具体步骤如下：
(A)色谱条件选择与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速1.0mL/min，ELSD蒸发光散射检测器检测：漂移管温度79℃，气体流速2.0L/min，压力30psi，理论塔板数按Mel-A(C34H60O13)峰计算≥2000；
(B)对照品溶液制备：分别精密称取Mel-A、Mel-B和Mel-C对照品各10.0mg，用体积比为1：1的氯仿-甲醇溶液溶解并定容至10mL，用0.22μm的滤膜过滤，即得对照品溶液；
(C)供试品溶液制备：精密称取类神经酰胺发酵提取物50mg，用体积比为1：1的氯仿-甲醇溶液溶解并定容至10mL，用0.22μm的滤膜过滤，即得供试品溶液；
(D)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中Mel-A、Mel-B和Mel-C的总量。
7.根据权利要求6所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法，其特征在于：
步骤(A)中所述的梯度洗脱如下：
Figure FDA0002274128670000021
8.权利要求1～7任一项所述的类神经酰胺发酵提取物的质量控制方法在类神经酰胺发酵提取物生产中的应用。
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