CN110684095A - 褐飞虱雄虫特异表达的蛋白磷酸基因NlPPP1-Y及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及褐飞虱雄虫特异表达的褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1‑Y、该基因编码的蛋白，以及根据该基因设计的dsRNA，以及其在防治褐飞虱虫害中的应用。该基因在维持褐飞虱正常的生长发育和繁殖过程中发挥重要功能，其功能在若虫早期1‑3龄受到抑制会导致褐飞虱若虫发育受阻，而最终死亡。在4龄末期后受阻会引起雄虫内生殖器发育受阻而导致雄性不育。本发明为褐飞虱防治提供了新的防治策略和靶标位点，为建立利用RNA干扰技术控制害虫提供了基础，具有较好应用前景。

Description

褐飞虱雄虫特异表达的蛋白磷酸基因NlPPP1-Y及其应用

(一)技术领域

本发明涉及褐飞虱雄虫特异表达的褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y、该基因编码的蛋白，以及根据该基因设计的dsRNA，以及其在防治褐飞虱虫害中的应用。

(二)背景技术

褐飞虱(Nilapavata lugens

)是一种以稻属植物为食的单食性昆虫，是我国以及亚洲国家水稻生产中最为严重的害虫之一。主要通过吸食水稻韧皮部汁液、产卵和传播病毒等方式为害水稻，严重时甚至能够使粮食大幅度减产。而长期大量的使用化学农药来防治褐飞虱不仅危害天敌、污染环境也会刺激褐飞虱的繁殖引发褐飞虱的再猖獗，诱导褐飞虱产生农药抗性。目前虽已有30多个水稻抗飞虱基因或位点已被鉴定或克隆，遗憾的是，由于褐飞虱致害性易于变异的特性造成了水稻抗飞虱品种的培育和可持续应用受到了严重的困扰。基于与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术可用来实现对昆虫关键基因进行下调，进而达到使害虫致死的潜能。RNAi介导的虫害抗性是依赖于RNA序列的杂交配对而不是依靠蛋白间的相互作用，这种RNA分子间的作用不会因为少数的核苷酸突变而被抑制。因此昆虫克服这种抗性的可能性比较小。同时由于该技术抗害虫的高效性、安全性以及可兼顾特异性与广谱性等优点使其成为新的抗虫策略的首选。因此，挖掘褐飞虱重要的功能基因将对发现潜在的杀虫靶标，设计有效地防治策略具有重要的现实意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种从褐飞虱雄虫特异表达的褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y、该基因编码的蛋白，以及根据该基因设计的dsRNA，以及其在防治褐飞虱虫害中的应用，该基因在维持褐飞虱正常的生存和雄虫内生殖器的发育中发挥重要功能，其表达或功能受到部分抑制会导致褐飞虱存活率下降，雄虫内生殖器发育异常，雄虫与雌虫交配后雌虫繁殖力显著下降，为抗稻飞虱转基因水稻的研究开发提供了新的基因来源。

本发明采用的技术方案是：

一种褐飞虱雄虫特异表达的褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

SEQ ID NO.1序列如下：

GCATGTGAACGAACTAACAGGAGGTAAACTTTACTTTTATTAATCTTTACAAAGTTTTCGTTTATGAGAAAAACCTGACAGATTCGAAAACAAGACCAAAAATGTTTATGTCAGCGGCTCAAAACAGTATCACAGTGAGAACAGATCGCATAATCGACAAACTGCTAAAAGTGCAGAACGTTTACAACCCTCTGGTGAGTCTGAGTAGTGATGACATCACCTTTCTCTGTCTGACAGTGAGGGAGATACTTCTCAACGAACCCAGTCTCCTGGAGATATCTCCTCCCGTCAAGATATGTGGAGATATCCACGGACAGTATCCTGACCTTGTGAACTGGTTCAATGTAGCTGGGTTCCCTCCTACTACGAGATATCTCTTTTTGGGAGATTATGTCGATCGCGGCCGGCAGAGTATTGAAGTTATGTCGCTGTTATTCGCGTTCAAGATAAGATACAAGAGCAGCATCTACTTGGTACGAGGCAACCACGAGTCAGCGAGCGTGAACAAGGTGTACGGCTTCTATGACGAGTGTAAACGACGCTACAGCGTCAAATTGTGGAAGAGCTTCGTCGACTGCTTCAACTGTCTGCCTGTGGCTGCCATTGTGGAACACAAGATATTCTGCTGTCACGGCGGTATCAGTCCGGCGCTCAAGGATTTGCAACAGATAAAAGACATAGTACGACCAACTACAGTGCCGGACAAGGGAGTGATGTGCGACCTGCTATGGGCTGACCCCAGTAGCCTGGTGGATGGGTGGGCTCCCAATGACAGGGGGGTCTCCTACACCTTTGGGGCCAATGCGGTATACGAGTTCCTATTCAAGTTTGATTTGGAACTGATCTGTCGCGCCCACCAAGTGGTGGAGGATGGCTACGAGTTCTTCGCCAACCAATCACTGGTGACCATTTTCTCGGCGCCCAACTACTGCGGCGAATTCGACAATGCAGGCGCACTGATGGCCGTCGACGAGAACTTGGTCTGCTCGTTTGTGCTGGTCAAGAGCAGCACTGACAAGGAGAACAGGAGCAACAAGAAGGAGATGAAGACAGAGTCCAAGACAATGTGGAGCGATCAGTTCAAAAATGTTGACGATTTCGAGTGAAAGAGGAAGAAGGACCGAGAACG

现有的用于褐飞虱防止的靶标基因均存在不同程度的序列保守，基于RNAi的防治技术存在脱靶效应等不足，本发明根据雄虫特异表达基因进化速率快，在物种间同源性低的特点，提供了一种在雄虫中特异表达的蛋白磷酸酶基因NlPPP1-Y，合成该基因的dsRNA，对该基因进行RNAi，实现了在转录水平上对该基因表达的抑制，从而造成褐飞虱存活率和繁殖力的显著降低。避免了蛋白水平上易于产生抗性和非靶标生物伤害的不足。

该基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因编码磷酸蛋白酶为磷酸蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases，PPPs)家族的重要成员之一，是褐飞虱正常生长和雄虫内生殖器正常发育所必需，其功能受抑制会导致褐飞虱存活率、繁殖力下降。

SEQ ID NO.2序列如下：

MFMSAAQNSITVRTDRIIDKLLKVQNVYNPLVSLSSDDITFLCLTVREILLNEPSLLEISPPVKICGDIHGQYPDLVNWFNVAGFPPTTRYLFLGDYVDRGRQSIEVMSLLFAFKIRYKSSIYLVRGNHESASVNKVYGFYDECKRRYSVKLWKSFVDCFNCLPVAAIVEHKIFCCHGGISPSLKDLQQIKDIVRPTTVPDKGVMCDLLWADPSSLVDGWAPNDRGVSYTFGANAVYEFLFKFDLELICRAHQVVEDGYEFFANQSLVTIFSAPNYCGEFDNAGALMAVDENLVCSFVLVKSSTDKENRSHKKEMKTESKTMWSDQFKNVDDFE

本发明所述褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y的克隆方法如下：

1)收集田间褐飞虱成虫，提取总RNA。

2)以步骤1)所得RNA为模板，使用试剂盒反转录合成cDNA。

3)以步骤1)所得不同龄期的混合褐飞虱cDNA为模板，以N1PPP1-Y-F：GCATGTGAACGAACTAACAGGAG为上游引物，N1PPP1-Y-R：CGTTCTCGGTCCTTCTTCCTCTT为下游引物进行RT-PCR扩增。RT-PCR扩增体系为25uL，其中包括3.0uL稀释10倍的cDNA模板，上下游引物各40pmol，0.2mMdNTP，1XPCR反应缓冲液，2.5units的r-Taq DNApolymerase(Takara)。PCR反应体系为：95℃变性2min；35个循环的94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50min；最后72℃延伸10min。

4)PCR扩增产物经琼脂糖电泳分离，回收1129bp处的目标DNA条带。

5)回收片段在T3连接酶的作用下插入PCR2.1载体中，转化到大肠杆菌DN5a，涂布于含有x-gal和IPTG和卡那霉素的LB培养基上，37℃过夜培养。

6)挑选白色阳性克隆，用汗50mg/L卡那霉素的LB培养液将阳性克隆进行扩繁，提取克隆质粒pTOP-NlPPP1-Y。

7)质粒pTOP-NlPPP1-Y测序，得到SEQ ID NO.1所示的NlPPP1-Y基因片段。

本发明还涉及褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

SEQ ID NO.3序列如下：

GCGGCTCAAAACAGCATCACAGTGAGAACAGATCGCATAATCGACAAACTGCTGAAAGTGCAAAACGTTTACAACCCTCTGGTGAGTCTGAGTAGTGATGACATCACCTTTCTCTGTCTGACAGTGAGGGAGATACTCCTCAACGAACCCAGTCTCCTGGAGATATCTCCTCCCGTCAAGATATGTGGAGATATCCATGGACAGTATCCTGACCTTGTGAACTGGTTCAATGTAGCTGGGTTCCCTCCCACTACGAGATATCTCTTTTTGGGAGATTATGTCGATCGCGGCCGGCAGAGTATTGAAGTTATGTCGCTGTTATTCGCGTTCAAGATAAGATACAAGAGCAGCATCTACTTGGTACGAGGCAACCACGAGTCAGCGAGCGTGAACAAGGTGTACGGCTTCTATGACGAGTGTAAACGACGCTACAGCGTCAAACTGTGGAAGAGCTTCGTCGACTGCTTCAACTGTCTGCCTGTGGCTGCCATTGTGGAACACAAGATATTCTGCTGTCACGGCGGTATCAGTCCATCGCTCAAGGATTTGCAACAGATAAAAGACATAGTACGACCAACAACAGTGCCGGACAAGGGAGTGATGTGCGACCTGCTATGGGCTGACCCCAGTAGCCTGGTGGATGGGTGGGCTCCCAATGACAGGGGGGTCTCCTACACCTTTGGGGCCAATGCGGTCTACGAGTTCCTATTCAAGTTTGATTTGGAACTGATCTGTCGCGCCCACCAAGTGGTGGAAGACGGCTACGAGTTCTTCGCC

该dsRNA合成方法如下：

1)根据cDNA全长序列设计用于合成dsRNA的引物，dsN1PPP1-Y-F:TAATACGACTCACTATAGGGGCGGCTCAAAACAGTATCACAG和dsN1PPP1-Y-R：TAATACGACTCACTATAGGGGGCGAAGAACTCGTAGCCAT。以质粒pTOP-NlPPP-Y为模板，扩增得到含有T7启动子的名为dsN1PPP1-Y的dsDNA片段。

质粒PCR扩增体系为：1.0μL质粒DNA，上下游引物各40pmol，0.2mM dNTP，1×PCRbuffer，2.5units的r-Taq DNA polymerase(Takara)，共25μL。

扩增程序为：95℃变性3min，40个循环的94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。

2)回收扩增得到777bp的dsDNA片段。以此回收的dsDNA为模板采用MEGAscript T7high yield transcription Kit试剂盒说明书合成SEQ ID NO.3所示的dsRNA。合成体系为：模板约1.5-2.0μg，2.0μL 10×T7 buffer，2.0μL ATP，2.0μL GTP，2.0μL CTP，2.0μLUTP，2.0μL T7 enzyme，共20.0μL。37℃保温5小时，72℃灭活5分钟；合成dsRNA经降解去除DNA和单链RNA后，纯化获得dsRNA。

3)合成dsRNA经电泳和浓度检测其质量和完整性，dsRNA浓度调整为500ng/uL。

本发明还涉及所述褐飞虱雄虫NlPPP1-Y在防治褐飞虱中的应用。实验发现将合成的dsRNA以每虫50ng的量注射3龄褐飞虱时，注射后第4天褐飞虱若虫死亡率与对照相比达到显著差异，第10天时存活率低于10％。以每虫50ng的量注射4龄末褐飞虱时，羽化后褐飞虱雄虫与正常雌虫交配，雌虫产卵量和子代数与对照相比达到显著差异。每雌产卵量平均为163.3，对照为304.8。以上实验结果提示该dsRNA可用于制备防治褐飞虱的药物。

具体的所述应用为根据所述N1PPP1-Y基因设计dsRNA，以所述dsRNA作为靶标序列制备防治褐飞虱的药物。

优选的所述dsRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还设计所述N1PPP1-Y基因在构建抗褐飞虱转基因水稻中的应用。将该基因所涉及的基因序列克隆到植物用RNAi表达载体中，借助于农杆菌介导等其他转基因手段转入水稻，所得转基因水稻可合成该基因相应的dsRNA，褐飞虱取食该转基因水稻后诱发褐飞虱N1PPP1-Y基因的mRNA特异性降解，阻断该基因在褐飞虱中的正常转录，从而导致褐飞虱发育受阻，引起存活力和繁殖力的下降。

本发明还涉及所述褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y在制备防治褐飞虱的药物中的应用。所述N1PPP1-Y基因的表达蛋白序列可作为靶标应用于农药设计中，该基因表达蛋白为一种蛋白磷酸酶，根据该蛋白的结构特征和活性位点，可设计特异性的破坏该蛋白结构或活性位点的蛋白化学试剂，阻断该蛋白在褐飞虱中的正常功能，从而导致褐飞虱发育受阻，引起存活力和繁殖力的下降。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)褐飞虱存活率和羽化率下降，可以减少水稻田间褐飞虱总量减轻害虫取食水稻的直接危害；(2)雄虫内生殖器发育异常，可以减少与雌虫交配后的产卵量，子代数，减轻水稻田间害虫的发生量；(3)本发明利用该基因同源性低的特点，根据靶基因合成的dsRNA序列与其他昆虫以及天敌的核苷酸序列同源性低，不存在大于20bp的一致性序列，实现了特异性防治褐飞虱的功能。

(四)附图说明

图1为NlPPP1-Y基因在褐飞虱不同龄期(a)以及组织中(b)的荧光定量PCR表达分析；不同字母表示基因表达量在不同组织间有显著差异(p<0.05)。

图2为注射dsRNA对褐飞虱若虫存活率(a)和羽化率(b)的影响；不同字母表示处理与对照在注射后存活率或基因表达量有显著差异(p<0.05)。dsGFP，为注射GFP基因的dsRNA，在本实验中作为对照；每虫注射dsRNA(500ng/uL)量为0.1uL。**表示处理与对照在注射后有显著差异(p<0.01)，注射褐飞虱虫龄为3龄若虫。

图3为注射dsRNA的雄虫与正常雌虫交配后，对雌虫产卵量、子代数(a)以及孵化率(b)的影响；dsGFP，为注射GFP基因的dsRNA，在本实验中作为对照；每虫注射dsRNA(500ng/uL)量为0.1uL。**表示处理与对照在注射后有显著差异(p<0.01)，注射褐飞虱虫龄为4龄末若虫。

图4为注射dsRNA对雄虫内生殖器发育的影响；dsGFP，为注射GFP基因的dsRNA，在本实验中作为对照；每虫注射dsRNA(500ng/uL)量为0.1uL。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：N1PPP1-Y的克隆和dsRNA的合成

1)N1PPP1-Y的克隆

利用艾德莱公司的组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取5～10头褐飞虱成虫RNA，用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover Kit试剂盒合成cDNA序列，取0.5ng RNA 65℃变性5分钟后，置于冰上急速冷却，10μL合成体系含0.5ng已变性RNA，2.0μL 4xDNA mastermix，37℃保温5分钟。消除基因组DNA后，加入2.0μL 5×RTmaster mixII。37℃保温15分钟，50℃5分钟，98℃灭活逆转录酶5分钟。cDNA稀释10倍后作为目标基因cDNA扩增的模板。

根据本实验室褐飞虱转录组数据库信息，获得褐飞虱N1PPP1-Y基因序列，设计上游引物N1PPP1-Y-F：GCATGTGAACGAACTAACAGGAG和下游引物N1PPP1-Y-R：CGTTCTCGGTCCTTCTTCCTCTT。PCR扩增体系25μL：包含3.0μL稀释后的cDNA，上下游引物各40pmol，0.2mM dNTP，1×PCR buffer，2.5 units of r-Taq DNA polymerase(Takara)，共4次重复。PCR扩增程序为：95℃变性2min；35个循环的95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min。扩增产物经2.0％琼脂糖电泳分离。

利用天根公司的DNA纯化回收试剂盒(DP214-02)切胶回收PCR产物。称量含目标条带的胶重量，按照重量mg：体积mL(1:1)加入PC溶液混匀，将混合液转移入已经用平衡液处理过的过滤柱中，室温放置1min；12000rpm离心1min，弃去收集管中滤液，加入700μLwashbuffer(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃去收集管中滤液，加入500μLwash buffer(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃去收集管中滤液；不加液体，12000rpm离心2min后，将过滤柱转移到1.5mL离心管中，加入80μL Nuclease-free水，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集得到PCR产物。

取4.0μL回收产物用英俊公司生产的连接试剂盒将PCR产物连接到2.1载体(购自Invitrogen公司)中，连接体系10μL：含1.0μL10×Ligation Buffer，2.0μL

2.1vector(25ng/μL)，2.0μL 水和1.0μL T4 DNA Ligase。16℃连接12h。取6.0μL连接产物转入100μL大肠杆菌DH5а感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，然后冰上放2min后，加入200μL预热到37℃的LB不含琼脂粉的液体培养基，100rpm，37℃复苏1h后均匀的涂板于含有50mg/mL卡那霉素，0.2g/mL IPTG，0.02g/mL X-gal的LB固体培养基上(含15g/L琼脂粉)，37℃过夜培养。LB培养基组成为(胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2)。

随机挑取5个白色阳性克隆至3.0mL含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm，37℃摇菌10h，将阳性克隆利用引物N1PPP1-Y-F和N1PPP1-Y-R进行扩增验证，扩增体系和程序同上，扩增模板为1.0uL菌液。扩增验证阳性的克隆依照罗氏公司的质粒提取试剂盒(11754785001)说明书提取质粒。菌液转入2.0mL离心管中12000rpm离心1min，弃去上清液，菌体沉淀中加入250μL含RNase酶的Suspension buffer，振荡混匀后加入250μLLysis buffer，颠倒混匀3-6次。室温放置5min。加入350μL冰上预冷的Binding buffer，颠倒混匀3-6次，此时溶液变混浊，冰上放5min后12000rpm离心10min。上清液转入过滤柱中，全速离心1min。将收集管中液体倒掉，在过滤柱中加入700μL Wash buffer II，全速离心1min。将收集管中液体倒掉，再重复洗涤一次，倒掉收集管中液体，过滤柱不加液体全速离心2min。将过滤柱转移到1.5mL离心管中，加入100μL Elution buffer，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集得到质粒pTOP-NlPPP1-Y。

质粒pTOP-NlPPP1-Y进行测序(由上海英潍捷基公司完成)，比对确认得到SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的NlPPP1-Y基因片段。该cDNA序列全长1129碱基，含1005碱基的开发阅读框(ORF区)，在褐飞虱基因组进行比对发现只有1个拷贝，基因序列由4个外显子(exon)组成。编码含335个氨基酸的蛋白序列。该基因cDNA序列与其他昆虫进行同源性比对，发现核苷酸序列一致性最高为72.8％，覆盖度45％。蛋白序列与水稻上另一刺吸式害虫灰飞虱的一致度高达89.3％，与其他昆虫一致度最高仅有64.7％。

2)N1PPP1-Y基因表达模式分析

根据克隆所得序列设计该基因用于定量PCR扩增的特异性引物qN1PPP1-Y-F：TCGGACAGTATCCTGACCTTGTG和qN1PPP1-Y-R：TTGTTCACGCTCGCTGACTC。

利用荧光定量PCR技术检测N1PPP1-Y基因在不同龄期的褐飞虱以及褐飞虱雄虫不同组织中的相对表达量。包括1-5龄褐飞虱若虫，褐飞虱雌雄虫，雄虫中肠，唾液腺、脂肪体、内生殖器等组织。以褐飞虱β-actin(EU179846)为内参照基因，荧光定量PCR反应体系为：PCR反应条件为：qPCR master mix

Premix(Toyobo,Japan),NlPPP1-Y基因在褐飞虱4龄开始表达，羽化后雌虫中未检测到该基因的表达而仅在雄虫中有表达(图1a)。进一步解剖雄虫不同组织进行表达分析发现该基因在雄虫内生殖器包括精巢、输精管和射精管以及脂肪体中有显著表达，而在其他组织中无表达(图1b)。

3)dsRNA合成和纯化、回收

根据已经验证的NlPPP1-Y基因片段序列，用NCBI primer blast设计并合成dsNlPPP1Y-F上游引物，dsNlPPP1Y下游引物，并在上下游引物5′端加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。

dsN1PPP1-Y-F:

TAATACGACTCACTATAGGGGCGGCTCAAAACAGTATCACAGdsN1PPP1-Y-R：TAATACGACTCACTATAGGGGGCGAAGAACTCGTAGCCAT

以含NlPPP1-Y基因的质粒pTOP-NlPPP1-Y为模板，PCR体系为：1.0μL质粒DNA，上下游引物各40pmol，0.2mM dNTP，1×PCR buffer，2.5units的r-Taq DNA polymerase(Takara)，共25μL，重复10次。

PCR扩增程序为：95℃变性3min，40个循环的94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。。PCR产物经2.0％浓度的琼脂糖胶电泳分离，其序列见SEQ IDNO.2。dsDNA序列在NCBI库中比对与其他昆虫包括天敌等100％一致序列最长为18bp，表明该序列在其他昆虫中引起RNAi效应的几率很低。

采用天根公司的DNA纯化回收试剂盒分别回收10次重复的PCR产物，以回收的PCR产物为模板，利用MEGAscript T7 high yield transcription Kit试剂盒合成dsRNA。合成体系为：模板约1.5-2μg，2.0μL 10×T7 buffer，2.0μL ATP，2.0μL GTP，2.0μL CTP，2.0μLUTP，2.0μL T7 enzyme，共20.0μL。37℃保温5小时，72℃灭活5分钟；合成dsRNA 20.0μL中加入21.0μLNuclease-free水，5.0μL 10×digestion buffer，2.0μL DNase，2.0μL RNase。37℃保温45min以降解去除DNA和单链RNA。

在上步50.0μL的含dsRNA的产物中加入150.0μL Nuclease-free水，50.0μL 10×binding buffer，250.0μL100％乙醇，混匀后转移过滤柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，弃去收集管中滤液，过滤柱加入500μL washing buffer，12000rpm离心2min，不加液体，12000rpm离心2min后，将过滤柱转移到1.5mL离心管中，加入50μL预热到95.0℃的Elution buffer，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集得到纯化的dsRNA，电泳检测并测定浓度后。调整dsRNA浓度为500ng/uL，-80.0℃保存备用。

实施例2：注射法进行3龄若虫的RNAi

制作固定褐飞虱的琼脂糖胶凹槽：配制质量浓度为2.0～2.5％的琼脂糖胶，将溶化后的琼脂糖胶倒入直径9cm的培养皿中，琼脂糖胶的高度略高于培养皿，培养皿上方放置4～5根直径0.5～0.8mm的毛细管。待琼脂糖胶冷却后，去掉毛细管，即得到可固定褐飞虱的琼脂糖胶凹槽；选取3龄褐飞虱若虫吹入玻璃试管中，用CO₂麻醉2min后，将褐飞虱倒入提前装有琼脂糖凝胶的培养皿中，用软毛笔将褐飞虱整齐的摆放在琼脂糖胶的凹槽中。

利用艾本德显微注射系统TransferMan NK2在褐飞虱中足和后足之间的胸部注射dsRNA，每虫约注射0.1μL(50ng)的dsRNA，注射条件为：注射压300hPa；时间.5s；补偿压30hPa。以注射同量的GFP基因(ACY56286)的dsRNA为对照。12h内剔除因注射操作造成的死虫。将活虫分笼罩饲养与30～35天龄的水稻品种Taichung Native1上，即每个水稻单株用笼罩罩住，每个笼罩内饲养35头，4次重复。将笼罩放置于带水的大水盆中，控制室内温度在25±1℃，湿度80％左右。每天统计各重复存活虫量，持续10天，结果见图2。结果统计发现注射N1PPP1-Y致死效果显著，注射后第四天的存活率与对照组达到显著差异，第10天时存活率低于10％(图2a)，若虫最终可羽化为成虫的比率也显著低于对照，羽化率平均为10％(图2b)。

实施例3：N1PPP1-Y的dsRNA对4龄虫产卵量，子代数以及雄虫内生殖器的影响

利用所合成的dsN1PPP1-Y注射褐飞虱四龄末若虫，注射和饲养方法同实例2。待褐飞虱若虫羽化后，选择注射后雄虫与未处理的初羽化雌虫一对一配对，并单笼饲养与60～70天龄的水稻品种TN1主分蘖上。共计成功配对15对。每天观察雌雄虫的存活情况，如果4天内雌虫死亡，则该重复剔除。如果雄虫死亡，则随时补充注射后的雄虫。配对8～9天后，每天拍出孵化若虫并计数，直至连续两天无若虫孵出时，解剖水稻茎秆，显微镜下观察并计数为孵化的卵量。其余雄虫与雌虫混合饲养用于取样做RNAi沉默效果分析。实验数据统计分析表明该基因的沉默会导致雌虫产卵量和子代数显著下调，结果见图3。由图可见，其中15个重复中8个子代数低于100，平均产卵量为163.3，显著低于对照(304.8)(图3a)。孵化率与对照相比没有显著差异(图3b)。

分别取羽化后4天、6天的雄虫6头，解剖其内生殖器，显微镜下观察其发育情况并提取其RNA进行基因表达量分析，共三个重复，结果见图4。结果表明与对照相比N1PPP1-Y基因的表达水平下降82.3％。显微镜观察发现该基因的沉默会导致雄虫输精管变细，精巢有畸形，提示N1PPP1-Y基因可作为靶标应用于农药设计中。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 褐飞虱雄虫特异表达的蛋白磷酸基因NlPPP1-Y及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1129

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gcatgtgaac gaactaacag gaggtaaact ttacttttat taatctttac aaagttttcg 60

tttatgagaa aaacctgaca gattcgaaaa caagaccaaa aatgtttatg tcagcggctc 120

aaaacagtat cacagtgaga acagatcgca taatcgacaa actgctaaaa gtgcagaacg 180

tttacaaccc tctggtgagt ctgagtagtg atgacatcac ctttctctgt ctgacagtga 240

gggagatact tctcaacgaa cccagtctcc tggagatatc tcctcccgtc aagatatgtg 300

gagatatcca cggacagtat cctgaccttg tgaactggtt caatgtagct gggttccctc 360

ctactacgag atatctcttt ttgggagatt atgtcgatcg cggccggcag agtattgaag 420

ttatgtcgct gttattcgcg ttcaagataa gatacaagag cagcatctac ttggtacgag 480

gcaaccacga gtcagcgagc gtgaacaagg tgtacggctt ctatgacgag tgtaaacgac 540

gctacagcgt caaattgtgg aagagcttcg tcgactgctt caactgtctg cctgtggctg 600

ccattgtgga acacaagata ttctgctgtc acggcggtat cagtccggcg ctcaaggatt 660

tgcaacagat aaaagacata gtacgaccaa ctacagtgcc ggacaaggga gtgatgtgcg 720

acctgctatg ggctgacccc agtagcctgg tggatgggtg ggctcccaat gacagggggg 780

tctcctacac ctttggggcc aatgcggtat acgagttcct attcaagttt gatttggaac 840

tgatctgtcg cgcccaccaa gtggtggagg atggctacga gttcttcgcc aaccaatcac 900

tggtgaccat tttctcggcg cccaactact gcggcgaatt cgacaatgca ggcgcactga 960

tggccgtcga cgagaacttg gtctgctcgt ttgtgctggt caagagcagc actgacaagg 1020

agaacaggag caacaagaag gagatgaaga cagagtccaa gacaatgtgg agcgatcagt 1080

tcaaaaatgt tgacgatttc gagtgaaaga ggaagaagga ccgagaacg 1129

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Phe Met Ser Ala Ala Gln Asn Ser Ile Thr Val Arg Thr Asp Arg

1 5 10 15

Ile Ile Asp Lys Leu Leu Lys Val Gln Asn Val Tyr Asn Pro Leu Val

20 25 30

Ser Leu Ser Ser Asp Asp Ile Thr Phe Leu Cys Leu Thr Val Arg Glu

35 40 45

Ile Leu Leu Asn Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Ser Pro Pro Val Lys

50 55 60

Ile Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Tyr Pro Asp Leu Val Asn Trp Phe

65 70 75 80

Asn Val Ala Gly Phe Pro Pro Thr Thr Arg Tyr Leu Phe Leu Gly Asp

85 90 95

Tyr Val Asp Arg Gly Arg Gln Ser Ile Glu Val Met Ser Leu Leu Phe

100 105 110

Ala Phe Lys Ile Arg Tyr Lys Ser Ser Ile Tyr Leu Val Arg Gly Asn

115 120 125

His Glu Ser Ala Ser Val Asn Lys Val Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys

130 135 140

Lys Arg Arg Tyr Ser Val Lys Leu Trp Lys Ser Phe Val Asp Cys Phe

145 150 155 160

Asn Cys Leu Pro Val Ala Ala Ile Val Glu His Lys Ile Phe Cys Cys

165 170 175

His Gly Gly Ile Ser Pro Ser Leu Lys Asp Leu Gln Gln Ile Lys Asp

180 185 190

Ile Val Arg Pro Thr Thr Val Pro Asp Lys Gly Val Met Cys Asp Leu

195 200 205

Leu Trp Ala Asp Pro Ser Ser Leu Val Asp Gly Trp Ala Pro Asn Asp

210 215 220

Arg Gly Val Ser Tyr Thr Phe Gly Ala Asn Ala Val Tyr Glu Phe Leu

225 230 235 240

Phe Lys Phe Asp Leu Glu Leu Ile Cys Arg Ala His Gln Val Val Glu

245 250 255

Asp Gly Tyr Glu Phe Phe Ala Asn Gln Ser Leu Val Thr Ile Phe Ser

260 265 270

Ala Pro Asn Tyr Cys Gly Glu Phe Asp Asn Ala Gly Ala Leu Met Ala

275 280 285

Val Asp Glu Asn Leu Val Cys Ser Phe Val Leu Val Lys Ser Ser Thr

290 295 300

Asp Lys Glu Asn Arg Ser His Lys Lys Glu Met Lys Thr Glu Ser Lys

305 310 315 320

Thr Met Trp Ser Asp Gln Phe Lys Asn Val Asp Asp Phe Glu

325 330

<210> 3

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggctcaaa acagcatcac agtgagaaca gatcgcataa tcgacaaact gctgaaagtg 60

caaaacgttt acaaccctct ggtgagtctg agtagtgatg acatcacctt tctctgtctg 120

acagtgaggg agatactcct caacgaaccc agtctcctgg agatatctcc tcccgtcaag 180

atatgtggag atatccatgg acagtatcct gaccttgtga actggttcaa tgtagctggg 240

ttccctccca ctacgagata tctctttttg ggagattatg tcgatcgcgg ccggcagagt 300

attgaagtta tgtcgctgtt attcgcgttc aagataagat acaagagcag catctacttg 360

gtacgaggca accacgagtc agcgagcgtg aacaaggtgt acggcttcta tgacgagtgt 420

aaacgacgct acagcgtcaa actgtggaag agcttcgtcg actgcttcaa ctgtctgcct 480

gtggctgcca ttgtggaaca caagatattc tgctgtcacg gcggtatcag tccatcgctc 540

aaggatttgc aacagataaa agacatagta cgaccaacaa cagtgccgga caagggagtg 600

atgtgcgacc tgctatgggc tgaccccagt agcctggtgg atgggtgggc tcccaatgac 660

aggggggtct cctacacctt tggggccaat gcggtctacg agttcctatt caagtttgat 720

ttggaactga tctgtcgcgc ccaccaagtg gtggaagacg gctacgagtt cttcgcc 777

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatgtgaac gaactaacag gag 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgttctcggt ccttcttcct ctt 23

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg gcggctcaaa acagtatcac ag 42

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg ggcgaagaac tcgtagccat 40

Claims (8)

1.一种褐飞虱雄虫特异表达的褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.水稻褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y在防治褐飞虱虫害中的应用。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：根据所述褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y设计dsRNA，以所述dsRNA制备防治褐飞虱的药物。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述dsRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.权利要求1所述褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y在构建抗褐飞虱转基因水稻中的应用。

8.权利要求1所述褐飞虱蛋白磷酸基因NlPPP1-Y在制备防治褐飞虱的药物中的应用。

Images