CN104593391A

CN104593391A - 褐飞虱生存及生长发育相关的NlPIK3R1基因、编码蛋白及其应用

Info

Publication number: CN104593391A
Application number: CN201510018856.6A
Authority: CN
Inventors: 郝培应; 俞晓平; 陆潮峰; 申屠旭萍; 马正; 许益鹏; 刘光富; 王正亮
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2015-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2035-01-14
Also published as: CN104593391B

Abstract

本发明公开了一种褐飞虱生存及生长发育相关的NlPIK3R1基因、编码蛋白及其应用。编码褐飞虱磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基的基因NlPIK3R1，含有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列及其同源突变序列，该基因在维持褐飞虱的生存及生长发育过程中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降、生长变缓、成虫羽化时间推迟。所述的褐飞虱NlPIK3R1基因编码的蛋白，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列及其同源突变序列，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降、生长变缓、成虫和羽化时间推迟。所述的褐飞虱NlPIK3R1基因的RNA干扰在控制褐飞虱方面的应用。本发明对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的存活率下降，生存及生长发育受到明显抑制，体重减轻，成虫羽化时间延迟。

Description

褐飞虱生存及生长发育相关的NlPIK3R1基因、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种褐飞虱生存及生长发育相关的基因、编码蛋白及其应用。

背景技术

褐飞虱(Nilaparvata lugens)是一种远距离迁飞性水稻害虫，主要以刺吸韧皮部汁液和传播水稻病毒的方式为害水稻植株。近年来，褐飞虱已发展成为亚洲稻区的重要害虫，常年危害面积在2,000万hm²以上，造成稻谷产量损失数十亿公斤(林拥军等，2011)。目前，针对褐飞虱的主要应急防治措施为喷施化学农药。化学农药的大量滥用，不仅严重污染环境，而且长期施用化学农药可诱使褐飞虱产生抗药性(王鹏等，2013)。在防治褐飞虱的农药中，曾经发挥过较好效果的有效农药，如氟虫腈、吡虫啉、噻嗪酮等，均已淘汰出局或限制使用，而近年出现的取代农药品种数量不多，很多地方在开展防治时，在农药的选择上感到策手无策，化学防治面临防不胜防的尴尬局面。究其原因，此类化学农药多以大规模高强度杀灭害虫为目标，但是，由于褐飞虱种群遗传多样性非常复杂等现实原因，其中往往有部分个体能够存活下来，高选择压的作用结果，最终会导致适应性更强的种群形成。另一方面，化学农药在杀死害虫的同时，也会危及包括天敌在内的非靶标生物，不可避免的会给农田生态系统造成负面影响，生态防治功能没有等到应有的发挥。因此，调整目前的褐飞虱防治策略势在必行。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种在褐飞虱生存及生长发育中发挥重要作用的基因NlPIK3R1、编码蛋白及其应用。对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的生存及生长发育受到明显抑制，存活率下降，体重减轻，成虫羽化时间延迟。

本发明根据NlPIK3R1基因编码的蛋白质相对保守但核酸序列与其他生物同源性低的特点，对靶标基因进行RNA干扰，实现了在核酸水平对褐飞虱生存及生长发育的抑制，显著地降低了褐飞虱的存活率，并避免了在蛋白质水平采用的喷施农药等可能给非靶标生物造成的杀伤。另一方面，靶标基因的RNA干扰，也抑制了害虫的生长发育，使得褐飞虱体重减轻，成虫羽化时间延迟，减少了害虫取食的直接为害。

本发明的技术方案如下：

一种调控褐飞虱生存及生长发育的磷脂酰肌醇3激酶P85Α亚基基因NlPIK3R1，含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列及其同源突变序列，该基因在维持褐飞虱正常的生存及生长发育过程中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降，生长变缓，成虫羽化时间推迟。

所述的褐飞虱NlPIK3R1基因编码的蛋白，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列及其同源突变序列，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降，生长变缓，成虫和羽化时间推迟。

一种所述的褐飞虱NlPIK3R1基因的RNA干扰在控制褐飞虱方面的应用。

所述NlPIK3R1基因的RNA干扰抑制褐飞虱的生长，导致褐飞虱存活率下降，体重减轻，减轻褐飞虱的取食量和危害程度。

所述NlPIK3R1基因的RNA干扰迟滞褐飞虱的羽化，延长世代周期，抑制种群增长速度，减轻褐飞虱危害程度。

所述的应用，基于该核酸和蛋白序列用于农药研发和生物防治。

本发明的有益效果：(1)褐飞虱存活率下降，生长受到抑制，可以减轻害虫取食对水稻作物的直接危害。(2)褐飞虱为r-对策者，采取最大生殖策略，因此，世代更替速度对种群的放大具有非常重要的作用。本发明可以迟滞褐飞虱的羽化时间，减缓了褐飞虱世代更替的速度，降低了在有限时间窗口虫灾爆发的风险。(3)本发明利用靶标基因的核苷酸序列与天敌核苷酸序列同源性低的特点，在核酸水平上进行RNA干扰，避免了由于蛋白质结构保守对天敌等非靶标生物的伤害，有望在实现抑制害虫的同时，充分发挥生态防治的功能。

附图说明

图1褐飞虱，赤拟谷盗和顶切叶蚁p85α结构图，

SAM:山姆结构；C1:蛋白激酶C保守区结构域；RhoGAP:RhoGTP酶激活蛋白结构域；SH2:

Src同源结构域。

图2褐飞虱及其他昆虫p85α的进化树，

昆虫名称及其p85α的GenBank登录号:丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis(XP_001606345.2)；大蜜蜂Apis dorsata(XP_006619973.1)；小蜜蜂Apis florea(XP_003691681.1)；佛罗里达弓背蚁Camponotus floridanus(EFN63874.1)；顶切叶蚁用Acromyrmex echinatior(EGI59407.1)；行军蚁Cerapachys biroi(EZA49782.1)；人体虱Pediculus humanus corporis(XP_002431096.1)；赤拟谷盗用Tribolium castaneum(XP_008193465.1)；隆头蛛Stegodyphus mimosarum(KFM82969.1)。

图3褐飞虱不同发育阶段NlPIK3R1表达量的变化，

1-2N:1-2龄褐飞虱若虫；3-4N:2-4龄褐飞虱若成；5N:5龄褐飞虱若虫；EF:刚羽化的雌性褐飞虱；GF:怀卵褐飞虱；M:雄成虫。

图4褐飞虱取食dsNlPIK3R1对NlPIK3R1基因表达量的影响，

褐飞虱取食dsNlPIK3R1后NlPIK3R1基因表达量的变化。图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，柱上单星号表示在统计分析上空白对照组与该组之间存在显著差异(T检验，P<0.05)。双星号表示在统计分析上空白对照组与改组之间存在极显著差异(T检验，P<0.01)。L：低浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组；H：高浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组。

图5褐飞虱取食dsNlPIK3R1对存活率的影响，

褐飞虱取食dsNlPIK3R1后存活率的变化。图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，柱上单星号表示在统计分析上空白对照组与该组之间存在显著差异(T检验，P<0.05)。双星号表示在统计分析上空白对照组与改组之间存在极显著差异(T检验，P<0.01)。L：低浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组；H：高浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组。

图6褐飞虱取食dsNlPIK3R1对羽化率的影响，

褐飞虱取食dsNlPIK3R1后羽化率的变化。图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，柱上单星号表示在统计分析上空白对照组与该组之间存在显著差异(T检验，P<0.05)。双星号表示在统计分析上空白对照组与改组之间存在极显著差异(T检验，P<0.01)。L：低浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组；H：高浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组。

图7褐飞虱取食dsNlPIK3R1对体重的影响，

褐飞虱取食dsNlPIK3R1后体重的变化。图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，不同小写字母代表不同组之间的差异显著(T检验，P<0.01)。L：低浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组；H：高浓度dsNlPIK3R1喂养的实验组。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1

1材料和方法

1.1供试褐飞虱

供试褐飞虱虫源是在人工气候室内用感虫水稻品种TN1上长期饲养的种群，温度为26±2℃，相对湿度为80％±5％，光周期为16L:8D。

1.2褐飞虱PIK3R1基因核心片段的克隆及验证

根据转录组序列信息，获得褐飞虱NlPIK3R1基因的核心序列，经NCBI网站序列比对鉴定。应用Primer Premier 5.0软件设计引物NlPIK3R1-F和NlPIK3R1-R(表1)，对序列进行验证。PCR扩增采用50μL反应体系，其中包括PCR Mix 25μL，10μmol/L正反引物各2μL，模板2μL，ddH₂O 19μL。PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃3min,30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR扩增得到的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，用AxyPrep^TM DNA Gel Extraction Kit(Axygen,USA)回收目的片段，连接到载体PMD-18T(TaKaRa,Japan)4℃过夜，转化到JM109感受态细胞中加1ml LB液体培养基37℃摇床培养2h，取200μL菌液涂布在含有1％Amp的LB固体培养基37℃倒置培养9小时，随机挑取5个单菌落于含1％Amp的LB液体培养基1ml的1.5ml离心管中37℃摇床培养12小时，取1μL菌液进行菌液PCR鉴定阳性克隆菌株并送到上海桑尼生物科技有限公司测序。测序结果用DNAMAN软件和原序列比对，进行验证。

1.3褐飞虱PIK3R1基因全长的克隆

根据前述研究(1.2)获得的褐飞虱NlPIK3R1基因核心序列信息，采用RACE法克隆基因全长。取不同龄期和不同性别成虫的褐飞虱为样本，用TRIzol法进行总RNA的抽提，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，以及使用Nanodrop2000(Thermo，USA)对RNA纯度和浓度的测定。选取质量检测符合要求的RNA样品，用BD SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech,USA)合成5'-RACE和3'-RACE的模板。分别设计外围引物5O-PIK3R1和3O-PIK3R1(表1)，以及内围引物5I-PIK3R1和3I-PIK3R1(表1)。

采用巢式PCR对目的基因的2端进行扩增。扩增体系同上。PCR反应程序为：外围PCR反应条件：94℃ 4min；94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 3min,30个循环；72℃ 10min；4℃保存。内围PCR所用的模板为第一轮PCR得到的产物。内围PCR反应条件：94℃ 4min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 3min,30个循环；72℃ 10min；4℃保存。电泳，胶回收，连接，转化等同上。

根据测序结果用DNAMAN软件拼接得到序列全长，并设计全长验证引物PIK3R1-FL-F和PIK3R1-FL-R(表1)对拼接的全长序列进行验证。

表1基因克隆、荧光定量PCR及合成dsRNA的引物

1.4褐飞虱PIK3R1基因表达分析

分别对饲养在TN1上褐飞虱按照1-2龄若虫、3-4龄若虫、5龄若虫、刚羽化雌成虫、怀卵雌成虫、雄成虫等类型进行取样，用荧光定量PCR进行基因表达量分析。总RNA的提取及检测方法同上，用于荧光定量PCR检测的cDNA模板按照PrimeScript RT Reagent Kit withgDNA Eraser(Takara,Japan)反转录试剂盒说明步骤操作。荧光定量PCR特异性引物为QPIK3R1-F和QPIK3R1-R(表1)，扩增片段经过测序和原序列比对，以β-actin基因为内参(Chen et al.,2010)，检测褐飞虱NlPIK3R1基因的相对表达量。荧光定量PCR参考马艳等(2013)的反应体系及方法，其中退火温度改为58℃。

1.5dsRNA的合成

根据cDNA全长序列设计用于合成dsRNA干扰片段的引物dsPIK3R1-F和dsPIK3R1-R(表1)，dsGFP及引物修饰参照马艳等(2013)的方法。按照T7 High YieldTranscription Kit(Ambion，USA)试剂盒说明书合成dsRNA。

1.6RNAi实验

取TN1上2龄褐飞虱若虫，采用Fu等(2001)营养液配方和饲喂装置进行人工饲喂，等到上述若虫发育至5龄时进行RNA干扰处理。RNA干扰设置2个浓度：低浓度组(L)为0.1μg/μL dsNlPIK3R1，高浓度组(H)为0.5μg/μL dsNlPIK3R1，同时设置喂食纯营养液作为空白对照组(CK)，喂食含0.5μg/μL dsGFP的营养液作为dsGFP对照组(dsGFP)。处理时，每管放入20只发育一致的5龄雌性褐飞虱若虫，设置3个重复，每天更换取食液，清理死亡的褐飞虱及其羽化蜕下的皮，当空白对照组开始出现有羽化个体时，开始对各组进行存活率、羽化率等的统计，并在喂食最后一天(7d)对各组进行称重。

此外，设置平行的RNAi实验组，当空白对照组出现羽化个体时，在第1、3、5、7天对各组分别进行取样，每组3只，并进行RNA的抽提及后续NlPIK3R1基因表达量的荧光定量PCR检测。

2结果与分析

2.1褐飞虱NlPIK3R1基因的cDNA全长克隆及序列分析

以褐飞虱cDNA为模板，对NlPIK3R1的核心片段进行PCR扩增，得到一条与预期长度相符的特异性条带，测序结果表明该片段大小为1087bp，并通过序列比对发现与转录组所得该序列一致。Blast X比对发现，克隆的片段与人体虱Pediculus humanus corporis的PI3K的调节亚基p85α氨基酸序列相识度为59％，表明该片段为褐飞虱编码p85α的核心片段。应用RACE法扩增该基因的cDNA全长，获得5'端序列2300bp和3'序列464bp。用DNAMAN进行序列拼接得到PIK3R1基因全长为2694bp(SEQ ID NO：1)，拼接得到的全长序列经两端PCR和测序得到准确验证。

利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析，NlPIK3R1基因cDNA全长包含了94bp的5'非编码区(5'UTR)，2526bp开放阅读框(ORF)和75bp的3'非编码区(3'UTR)，3'端具有典型的polyA结构。NlPIK3R1基因共编码841个氨基酸(SEQ ID NO：2)，利用蛋白分子量及等电点预测工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)，预测得到该蛋白分子量为95.6kDa，等电点为5.84。通过蛋白结构域预测站网(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测发现该蛋白具有山姆结构(Sterile alpha motif，SAM)、蛋白激酶C保守区结构域(Protein kinase Cconserved region 1domains，C1)、RhoGTP酶激活蛋白结构域(GTPase-activator protein for Rho，RhoGAP)和2个Src同源结构域(Src homology 2domains，SH2)(图1)。类比赤拟谷盗Triboliumcastaneum(XP_008193465.1,54％)和顶切叶蚁Acromyrm exechinatior(EGI59407.1,57％)的PI3K p85α发现它们都有共同的结构域(图1)。

用来至膜翅目、鞘翅目、蜘蛛目和虱目的10种昆虫的p85α氨基酸序列与褐飞虱p85α氨基酸序列构建系统进化树。进化树分析表明褐飞虱为单独的一类，与人体虱Pediculushumanus corporis较近(图2)。

2.2褐飞虱NlPIK3R1的表达变化分析

荧光定量PCR检测表明，NlPIK3R1基因在褐飞虱所有龄期和不同性别的褐飞虱中均有不同程度表达。在怀卵雌虫时，NlPI3KR1基因表达量急剧增加并达到最高，而在其他阶段和雄成虫中表达量都很低(图3)。

2.3 RNAi对褐飞虱NlPIK3R1 mRNA表达水平的影响

荧光定量PCR检测结果显示，dsGFP对照组和空白对照组的NlPIK3R1 mRNA表达量没有显著差异，并且这两个对照组的mRNA表达量均随着羽化后的时间的增加而增加。低浓度干扰组中，褐飞虱NlPIK3R1 mRNA也随着羽化后的时间而增加，在5天时达到最高值，第7天时开始下降，并且相较于空白对照组和dsGFP对照组其表达量显著降低(图4)。而高浓度的dsNlPIK3R1干扰，在第1天时即有效的抑制了褐飞虱NlPIK3R1 mRNA的表达，其mRNA的表达量一直处于比较低的状态，而在7天时，由于该组用于取样的褐飞虱全部死亡，因而无法得到相应的表达量数据，这也说明高浓度的NlPIK3R1干扰对褐飞虱影响很大。

2.4 RNAi对褐飞虱存活率的影响

在RNA干扰实验中，连续喂养dsNlPIK3R1，对褐飞虱存活率产生了较为明显的影响，从第2天开始，喂食dsNlPIK3R1的2个实验组与对照组就达到了极显著的差异，高浓度处理组的dsNlPIK3R1干扰对褐飞虱的存活率影响尤其明显，在统计的第7天存活率仅为37.50％，而空白对照组和dsGFP对照组分别为87.00％和76.67％(图5)。由此说明，褐飞虱NlPIK3R1基因对褐飞虱的存活有一定的影响，浓度越高对褐飞虱的存活影响越大。连续喂养dsGFP对褐飞虱的存活率也有一定的影响，但是相较于喂食营养液没有显著差异。

2.5 RNAi对褐飞虱羽化率的影响

通过对每天新蜕的皮统计，对空白对照组，dsGFP对照组，低浓度和高浓度dsNlPIK3R1处理喂养的褐飞虱实验组进行羽化率的观测统计(图6)。由图6可以看出喂养dsGFP和纯营养的实验组褐飞虱的羽化率相当，在第5天时全部羽化，而喂食dsNlPIK3R1的2个处理组在第5天的羽化率分别为73.08％和56.09％，与空白对照组和dsGFP对照组均达到了极显著的差异；低浓度干扰组褐飞虱在第7天才全部羽化，而高浓度组在第7天褐飞虱也没全部羽化，其羽化率为93.75％，相较于对照组和dsGFP对照组而言，推迟了至少3天。这表明褐飞虱NlPIK3R1基因在一定程度上调控褐飞虱的发育。

2.6 RNAi对褐飞虱体重的影响

在第7天分别对各组中存活的褐飞虱进行称重统计和分析(图7)。由图7可以看出空白对照组，dsGFP对照组和喂食低浓度dsNlPIK3R1的实验组中褐飞虱的体重没有明显区别，个体平均体重均在2.0mg以上，而喂食高浓度的dsNlPIK3R1实验组中褐飞虱个体平均体重为1.27mg，与其他几组相比存在着显著的差异，说明高浓度的干扰对褐飞虱的生长有很好的抑制效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国计量学院

<120> 褐飞虱生存及生长发育相关的NlPIK3R1基因、编码蛋白及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2694

<212> DNA

<213> Nilaparvata lugens Stal

<400> 1

acatggggag tccggtcata gtgcttctcc gagacgcttg tgtcgactca ctcagtctca 60

actcaaaatt tattcttttt catgctaatc aaaaatgtcg cctcctatta gtttttcgct 120

acaacagcta cagctggaac tggcctacgt acttttcaag ccgataacag agtggacatc 180

tgccaatgtg gttgagtgga tggccgctct caacctatac cgctacgcgg atgtattcaa 240

atccaaagac atcaaaggat cagatcttct gaatttggac cgtgacaaac tgatgaacat 300

gggcatcaaa gatgagtttc atctgaaagc cattctggtg tgcattgacg agttatgccg 360

caaaggaagt gacatgcaga atgagtctgg catggaaaac agcgcagccg catctgatca 420

ttacctcaga aagcatagtt tctcgactct ggaacgctgt gacaagtgcc acaaatacct 480

gagaggttta tcacatcagg gtaacatctg tcaagattgc ggactagtgg ctcaccgcac 540

ttgctcggca actggactgc caccttgctt gcctcctggc attggagctg agcgccatgc 600

tagaagccca ttctgttccg tatttggcct gggtctgtgc ggccaattca acaccaaagg 660

tcagccggct tcctaccttg tgatccgctg tgctgaagaa atcgaggcca gagccaagtc 720

acttcccagt ctcgacctct acaagatgta tcgctcatca ccaccccccg ataaagttga 780

tgaactccgc accaaattca acgaggctga agatattact gcattagatc tgtcagcata 840

cgagcctaac tgcatcacca acatcctcaa caaatatctc agagaacttc ctgatcctgt 900

cattcctgtg cagtggtatg acagattcct agaggcttca agagtttgca atgatgatga 960

gcagtgcagt gtgtgcctga tgcaactagt ccaagaactg cctgaacagc acaaatcaac 1020

tctcacctac ctgatggctc atctttgccg catttgtcag atgcagtaca gtcgcggaat 1080

caaggaagcg cccacaatcc tcattcaagt tctctgccat attttcttgc ggcctccttg 1140

ggaaagtatc atccaagtgg tgtacaacac cgaatcgcac atcagaatca tggagttgct 1200

gctgcttcat ggcgactggg gcgagaagtt acccgaattt gcatccgcac ctgcgctgcc 1260

ccctcgaaag ttgtcgcgtc tcgctccggc ctgcgccatt cagatgctca ctgaaatgga 1320

cccccctgca cccgacgaga tgcacagcaa caaactgagc gatgccgagt ggtactgggg 1380

cgatatcact cgtgatgaag tgaatgaaaa gttgatggat actccagacg gtactttctt 1440

cgtacgaaac gcatcaacaa aatctggaga atacactctc accctgcgca aaggtggctc 1500

aagcaaattg atcaaaattt ctcatcgcag tggcaagtac ggattttctg agccattcaa 1560

gttcaacaca gttgttgaac tagtcaattt ctatcggaat gtatcgctgg cgcaatacaa 1620

cgccacgctt gacatcaagc tgctgtatcc tgtgtcacgt tttcaacagg aggaagaaat 1680

tgccagctcc agtgacatcg aaaaggttgc tacaaaactg ttggagatac atgataccta 1740

tgtggccaaa accaagcagt atgatgagta ctccgaagaa ttcgagaaca tcaacaaaga 1800

gatcaatttg aagcgtcaag ctctggatgc gttcattgaa accgtcatca tgttcgaaga 1860

tcaaatcaaa ctgcaggagc gcttccagaa ggaagcacaa cctcatgagg ttaaaagtct 1920

gatggagaac tctgagatcc tgaaattgcg cctgaaatca atgaacgaaa gcagaaaaac 1980

gttggaagac agcttgaatc agcaggtggc gttcagtcgt gccattgaac gggagatgca 2040

agctctgaaa ccagaggtga ttcagttgtt ccgccagaag gagaagcatg tggcctggtt 2100

ggtgtctcgc ggtgtcaagc agaaccgact catgcagttg ctccagtccg gcggcggtgt 2160

aagggctctg gtgctggggg ttgaggactt gcctcatcag gatgaactca cttggctcct 2220

caacgagtgt tcccgcactg atgctgagca gtacctggct ggtaaaaagg atggaacgtt 2280

ccttgttcgt cccagcagtt cgggccaata tgctctgtct attgcatgca atggaattac 2340

aaatcactgc atcatctaca aaacaaagcg cggttacggg tttgcagagc cttacaacat 2400

atacgagtcg ctcaaagctc tggtcatcca ttacgcgcag aactctctgg aggagcacaa 2460

tgactcgttg accacaaact tggcatttcc ggtgttcgca cctcccaatc caatctcaac 2520

ctccaccgac caaaatgaca acagcaacaa caacagcgtc accgtccctc ccctgctcgg 2580

ctacatcaac ctgggcaaca tcaacaacac tcactactag tgatggcaac atcaacaaca 2640

ttcactacta gtgatggcaa catcaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2694

<210> 2

<211> 841

<212> PRT

<213> Nilaparvata lugens Stal

<400> 2

Met Ser Pro Pro Ile Ser Phe Ser Leu Gln Gln Leu Gln Leu Glu Leu

1 5 10 15

Ala Tyr Val Leu Phe Lys Pro Ile Thr Glu Trp Thr Ser Ala Asn Val

20 25 30

Val Glu Trp Met Ala Ala Leu Asn Leu Tyr Arg Tyr Ala Asp Val Phe

35 40 45

Lys Ser Lys Asp Ile Lys Gly Ser Asp Leu Leu Asn Leu Asp Arg Asp

50 55 60

Lys Leu Met Asn Met Gly Ile Lys Asp Glu Phe His Leu Lys Ala Ile

65 70 75 80

Leu Val Cys Ile Asp Glu Leu Cys Arg Lys Gly Ser Asp Met Gln Asn

85 90 95

Glu Ser Gly Met Glu Asn Ser Ala Ala Ala Ser Asp His Tyr Leu Arg

100 105 110

Lys His Ser Phe Ser Thr Leu Glu Arg Cys Asp Lys Cys His Lys Tyr

115 120 125

Leu Arg Gly Leu Ser His Gln Gly Asn Ile Cys Gln Asp Cys Gly Leu

130 135 140

Val Ala His Arg Thr Cys Ser Ala Thr Gly Leu Pro Pro Cys Leu Pro

145 150 155 160

Pro Gly Ile Gly Ala Glu Arg His Ala Arg Ser Pro Phe Cys Ser Val

165 170 175

Phe Gly Leu Gly Leu Cys Gly Gln Phe Asn Thr Lys Gly Gln Pro Ala

180 185 190

Ser Tyr Leu Val Ile Arg Cys Ala Glu Glu Ile Glu Ala Arg Ala Lys

195 200 205

Ser Leu Pro Ser Leu Asp Leu Tyr Lys Met Tyr Arg Ser Ser Pro Pro

210 215 220

Pro Asp Lys Val Asp Glu Leu Arg Thr Lys Phe Asn Glu Ala Glu Asp

225 230 235 240

Ile Thr Ala Leu Asp Leu Ser Ala Tyr Glu Pro Asn Cys Ile Thr Asn

245 250 255

Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Arg Glu Leu Pro Asp Pro Val Ile Pro Val

260 265 270

Gln Trp Tyr Asp Arg Phe Leu Glu Ala Ser Arg Val Cys Asn Asp Asp

275 280 285

Glu Gln Cys Ser Val Cys Leu Met Gln Leu Val Gln Glu Leu Pro Glu

290 295 300

Gln His Lys Ser Thr Leu Thr Tyr Leu Met Ala His Leu Cys Arg Ile

305 310 315 320

Cys Gln Met Gln Tyr Ser Arg Gly Ile Lys Glu Ala Pro Thr Ile Leu

325 330 335

Ile Gln Val Leu Cys His Ile Phe Leu Arg Pro Pro Trp Glu Ser Ile

340 345 350

Ile Gln Val Val Tyr Asn Thr Glu Ser His Ile Arg Ile Met Glu Leu

355 360 365

Leu Leu Leu His Gly Asp Trp Gly Glu Lys Leu Pro Glu Phe Ala Ser

370 375 380

Ala Pro Ala Leu Pro Pro Arg Lys Leu Ser Arg Leu Ala Pro Ala Cys

385 390 395 400

Ala Ile Gln Met Leu Thr Glu Met Asp Pro Pro Ala Pro Asp Glu Met

405 410 415

His Ser Asn Lys Leu Ser Asp Ala Glu Trp Tyr Trp Gly Asp Ile Thr

420 425 430

Arg Asp Glu Val Asn Glu Lys Leu Met Asp Thr Pro Asp Gly Thr Phe

435 440 445

Phe Val Arg Asn Ala Ser Thr Lys Ser Gly Glu Tyr Thr Leu Thr Leu

450 455 460

Arg Lys Gly Gly Ser Ser Lys Leu Ile Lys Ile Ser His Arg Ser Gly

465 470 475 480

Lys Tyr Gly Phe Ser Glu Pro Phe Lys Phe Asn Thr Val Val Glu Leu

485 490 495

Val Asn Phe Tyr Arg Asn Val Ser Leu Ala Gln Tyr Asn Ala Thr Leu

500 505 510

Asp Ile Lys Leu Leu Tyr Pro Val Ser Arg Phe Gln Gln Glu Glu Glu

515 520 525

Ile Ala Ser Ser Ser Asp Ile Glu Lys Val Ala Thr Lys Leu Leu Glu

530 535 540

Ile His Asp Thr Tyr Val Ala Lys Thr Lys Gln Tyr Asp Glu Tyr Ser

545 550 555 560

Glu Glu Phe Glu Asn Ile Asn Lys Glu Ile Asn Leu Lys Arg Gln Ala

565 570 575

Leu Asp Ala Phe Ile Glu Thr Val Ile Met Phe Glu Asp Gln Ile Lys

580 585 590

Leu Gln Glu Arg Phe Gln Lys Glu Ala Gln Pro His Glu Val Lys Ser

595 600 605

Leu Met Glu Asn Ser Glu Ile Leu Lys Leu Arg Leu Lys Ser Met Asn

610 615 620

Glu Ser Arg Lys Thr Leu Glu Asp Ser Leu Asn Gln Gln Val Ala Phe

625 630 635 640

Ser Arg Ala Ile Glu Arg Glu Met Gln Ala Leu Lys Pro Glu Val Ile

645 650 655

Gln Leu Phe Arg Gln Lys Glu Lys His Val Ala Trp Leu Val Ser Arg

660 665 670

Gly Val Lys Gln Asn Arg Leu Met Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly

675 680 685

Val Arg Ala Leu Val Leu Gly Val Glu Asp Leu Pro His Gln Asp Glu

690 695 700

Leu Thr Trp Leu Leu Asn Glu Cys Ser Arg Thr Asp Ala Glu Gln Tyr

705 710 715 720

Leu Ala Gly Lys Lys Asp Gly Thr Phe Leu Val Arg Pro Ser Ser Ser

725 730 735

Gly Gln Tyr Ala Leu Ser Ile Ala Cys Asn Gly Ile Thr Asn His Cys

740 745 750

Ile Ile Tyr Lys Thr Lys Arg Gly Tyr Gly Phe Ala Glu Pro Tyr Asn

755 760 765

Ile Tyr Glu Ser Leu Lys Ala Leu Val Ile His Tyr Ala Gln Asn Ser

770 775 780

Leu Glu Glu His Asn Asp Ser Leu Thr Thr Asn Leu Ala Phe Pro Val

785 790 795 800

Phe Ala Pro Pro Asn Pro Ile Ser Thr Ser Thr Asp Gln Asn Asp Asn

805 810 815

Ser Asn Asn Asn Ser Val Thr Val Pro Pro Leu Leu Gly Tyr Ile Asn

820 825 830

Leu Gly Asn Ile Asn Asn Thr His Tyr

835 840

Claims

1.一种调控褐飞虱生存及生长发育的磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基的编码基因NlPIK3R1，其特征在于，含有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列及其同源突变序列，该基因在维持褐飞虱正常的生存及生长发育过程中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降，生长变缓，体重减轻，成虫羽化时间推迟。

2.一种如权利要求1所述的褐飞虱NlPIK3R1基因编码的蛋白，其特征在于，含有SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列及其同源突变序列，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降，生长变缓，体重减轻，成虫羽化时间推迟。

3.一种如权利要求1所述的褐飞虱NlPIK3R1基因的RNA干扰在控制褐飞虱方面的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述NlPIK3R1基因的RNA干扰导致褐飞虱的存活率下降，生长变缓，体重减轻，成虫羽化时间推迟，减轻褐飞虱的取食量和危害程度。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述NlPIK3R1基因的RNA干扰迟滞褐飞虱的羽化，延长世代周期，抑制种群增长速度，减轻褐飞虱危害程度。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，基于该核酸和蛋白序列用于农药研发和生物防治。