CN110680921B - 一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用，属于纳米药物技术领域。将盐酸多巴胺溶解于Tris‑HCl缓冲溶液中，添加葡萄糖氧化酶后快速搅拌，过0.45μm水系滤膜过滤，过滤后溶液继续快速搅拌，过0.45μm水系滤膜过滤，将第二次过滤后液体与等体积制备的银立方体溶液离心后沉淀混合，混合溶液超声、静置，离心取沉淀，将沉淀物重悬于PBS缓冲溶液中，得到负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体。该粒子葡萄糖氧化酶负载量为10％‑25％，平均粒径为100～150nm，并且可以在肿瘤部位为酸性及过氧化氢环境下降解，既能实现EPR效应同时具有体内快速清除功能，同时葡萄糖氧化酶消耗肿瘤部位葡萄糖的饥饿疗法与纳米银立方体的光热疗法结合表现出优异的肿瘤治疗效果。

Description

一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用，属于纳米药物技术领域。
背景技术
癌症相比于其他疾病发病率高、治愈率低，如今已经超越心血管疾病成为全球人类健康的最大威胁。目前全球平均每年新增约1410万例癌症病例(不包括黑色素瘤以外的皮肤癌)，造成约880万人死亡，占每年全球死亡总人数的近15.7％，新病例数量预计将在2035年增加到2400万。传统的治疗模式例如化疗、放疗等虽能够达到一定的治疗效果，但是往往存在着脱发、免疫力低下等毒副作用。
21世纪以来，随着纳米科学的发展，纳米材料在医药领域的应用引起了人们的广泛关注，并逐渐发展成纳米医学这一独立的学科。由于纳米微粒的超小体积和巨大比表面，纳米药物具有较高的载药量，容易穿透血管而不引起血管内皮损伤，保护药物免受酶降解，药物在体内局部聚集浓度高，从而能提高疗效。纳米药物还具有缓释特性，能够延长药物作用时间，靶向输送药物，保证药物作用前提下减少给药剂量，提高药物作用稳定性，利于药物储存。
目前纳米颗粒在应用中仍面临许多挑战。具有较大尺寸的纳米颗粒可以具有较好的增强渗透滞留效应(EPR效应)，从而在肿瘤内蓄积，但可能引起潜在的体内毒性。较小纳米颗粒虽能实现快速肾清除，但其肿瘤蓄积和滞留较差，从而影响治疗效果。因此，亟需开发一种既能实现EPR效应同时具有体内快速清除功能的纳米药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物及其制备方法与应用。本发明利用银纳米立方体具有光热转换效果，并在肿瘤酸性条件下可以与过氧化氢反应生成易于代谢的银离子，同葡萄糖氧化酶在肿瘤部位通过消耗葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，一方面阻断肿瘤细胞营养供应导致肿瘤细胞凋亡坏死，另一方面可以加速银纳米立方体的降解，制备出既能实现EPR效应同时具有体内快速清除功能的纳米药物，同时葡萄糖氧化酶消耗肿瘤部位葡萄糖的饥饿疗法与纳米银立方体的光热疗法结合表现出优异的肿瘤治疗效果。
本发明提供了一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将醋酸奥曲肽溶于盐酸溶液中，制得醋酸奥曲肽盐酸溶液；
(2)将AgNO3溶液和抗坏血酸溶液混合，超声后得到银胶体溶液；
(3)将AgNO3溶液、步骤(1)所得醋酸奥曲肽盐酸溶液和步骤(2)所得银胶体溶液混合，恒温震荡孵育；将NaBH4溶液逐滴加入到孵育好的混合溶液中，震荡混匀，制得银纳米立方体溶液；
(4)将盐酸多巴胺溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，得到盐酸多巴胺溶液；
(5)将葡萄糖氧化酶添加至步骤(4)得到的溶液中，得到盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液；
(6)将步骤(5)所得的盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液避光搅拌，过滤，过滤后溶液继续避光搅拌，再次过滤，将步骤(3)所得的银纳米立方体溶液离心，所得沉淀与第二次过滤后液体混合；
(7)将步骤(6)所得混合溶液经超声、静置、离心后取沉淀，将沉淀物重悬于 PBS缓冲溶液中，得到可降解抗肿瘤纳米药物。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中制备得到的醋酸奥曲肽盐酸溶液的浓度为0.2～0.4mM、pH值为1～2。
进一步地，上述技术方案中，步骤(2)中AgNO3溶液的浓度为0.8～1.0mM，抗坏血酸溶液的质量浓度为2.8～3.1％；AgNO3溶液和抗坏血酸溶液的体积比为1:1～1:1.2，超声时间为15～30s。
进一步地，上述技术方案中，步骤(3)中AgNO3溶液的浓度为5～7mM，恒温震荡孵育的条件为180～200rpm、20℃条件下孵育16～20h；NaBH4溶液的浓度为 60～80mM；步骤(3)中的AgNO3溶液、步骤(1)所得醋酸奥曲肽盐酸溶液和步骤 (2)所得银胶体溶液的体积比为1:1:3。
进一步地，上述技术方案中，步骤(4)中Tris-HCl缓冲溶液的pH为8～9，所配置的盐酸多巴胺溶液浓度为1～2mg/mL。
进一步地，上述技术方案中，步骤(5)中盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液中葡萄糖氧化酶浓度为0.05～0.2mg/mL。
进一步地，上述技术方案中，步骤(6)中两次搅拌的时间均为20～30min，搅拌速度均为150～200rpm；步骤(6)中两次过滤的手段均为用0.45μm水系滤膜过滤；步骤(6)中用于离心的银纳米立方体溶液的体积与第二次过滤后液体的体积相等；。
进一步地，上述技术方案中，步骤(7)的具体步骤为：将步骤(6)所得混合溶液超声为8～10min，超声后于20～28℃下静置5～20min，再于7500～8500rpm离心5min 取沉淀物，将沉淀物按离心前体积比1:1重悬于pH7.4的PBS缓冲溶液中，即得可降解抗肿瘤纳米药物。
本发明还提供了一种利用上述制备方法制备得到的可降解抗肿瘤纳米药物，所述可降解抗肿瘤纳米药物的葡萄糖氧化酶负载量为10％～25％，平均粒径为100～150nm。
本发明还提供了一种可降解抗肿瘤纳米药物在抗肿瘤中的应用。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.本发明制备的纳米药物利用聚多巴胺的还原性及黏性，使纳米粒子具有较高的葡萄糖氧化酶负载量，达到10％-25％，常见文献中葡萄糖氧化酶负载量一般为 5％-10％；
2.本发明制备的纳米药物基于葡萄糖氧化酶的饥饿疗法使银纳米立方体具有更快的降解速率；
3.本发明制备的纳米粒子平均粒径为100～150nm，粒径均一、形貌规则，具有极强的光热转换能力，具有良好的EPR效应，同时在肿瘤部位可以特异性降解，加快体内代谢，降低体内毒性表现出了极高的抗肿瘤活性及生物安全性；
4.本发明在温和的条件下完成，原料天然绿色，制备方法简单，反应易控制，重复性高，利于实现大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1获得的抗肿瘤纳米药物的TEM图；
图2为本发明实施例1获得的抗肿瘤纳米药物的粒径分布图；
图3为本发明实施例1获得的抗肿瘤纳米药物的Zeta电位图；
图4为本发明实施例1获得的抗肿瘤纳米药物的时间温度曲线图；
图5为本发明实施例2获得的抗肿瘤纳米药物在葡萄糖存在下降解的TEM图；
图6为本发明实施例3获得的抗肿瘤纳米药物在葡萄糖存在下降解的紫外可见光光谱图；
图7为本发明实施例3获得的抗肿瘤纳米药物结合激光照射治疗后肿瘤照片；
图8为本发明实施例2获得的抗肿瘤纳米药物结合激光照射治疗后小鼠体重变化。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
将醋酸奥曲肽(上海肽仕生物科技有限公司)溶于盐酸(永飞化工厂)溶液中，制得浓度为0.3mM、pH值为1的醋酸奥曲肽盐酸溶液，分别配置浓度为0.9mM的 AgNO3(北京北化精细化学品有限责任公司)溶液与质量浓度为3％的抗坏血酸(北京拜尔迪生物技术有限公司)溶液，以1:1体积比将它们混合，超声处理30s，超声功率90W，得到银胶体溶液。配置浓度为7mM的AgNO3(北京北化精细化学品有限责任公司)溶液，与上述醋酸奥曲肽溶液和银胶体溶液以1:1:3的体积比混合，放置到数显双层气浴恒温震荡器中，于200rpm、20℃条件下孵育20h。配置浓度为80mM的 NaBH4(北京中胜华腾科技有限公司)溶液，逐滴加入到上述孵育好的混合溶液中，震荡混匀，制得银纳米立方体溶液。
将10mg盐酸多巴胺(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于pH 为8的Tris-HCl缓冲溶液5ml中，得到盐酸多巴胺溶液。向盐酸多巴胺溶液中加入1mg葡萄糖氧化酶(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，得到盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液。将盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液置于磁力搅拌器上避光200rpm搅拌 20min，然后用0.45μm水系滤膜过滤，过滤后溶液继续置于磁力搅拌器上避光200rpm 搅拌20min，再次用0.45μm水系滤膜过滤，将第二次过滤后所得液体与等体积制备的银立方体溶液离心后的沉淀混合。将所得混合溶液置于超声清洗仪中200W超声8min，超声后溶液20℃环境下放置5-20min，然后8000rpm离心5min取沉淀，将沉淀物按离心前体积比1:1重悬于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得到负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体(即为本发明所述的可降解抗肿瘤纳米药物)。
应用透射电子显微镜对负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体进行形貌表征，如图1所示，从该图片可以看出，银纳米立方体表面均匀包裹一层聚多巴胺，粒径大约在 120nm左右，形貌规则，粒径均一。如图2所示，从该图可以看出，负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的平均粒径为125nm，与透射电镜结果相符合。如图3所示，银纳米立方体电位约为31mV，葡萄糖氧化酶的Zeta电位约为-18mV，负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的Zeta电位约为-13mV，负载葡萄糖氧化酶使银立方体发生电位翻转，说明葡萄糖氧化酶成功负载到银立方体表面。如图4所示，在5分钟1.5W cm-2强度的激光照射下，该纳米药物温度升高到62℃，表现出极佳的光热转换能力。
实施例2
将醋酸奥曲肽(上海肽仕生物科技有限公司)溶于盐酸(永飞化工厂)溶液中，制得浓度为0.3mM、pH值为1的醋酸奥曲肽盐酸溶液，分别配置浓度为0.9mM的 AgNO3(北京北化精细化学品有限责任公司)溶液与质量浓度为3％的抗坏血酸(北京拜尔迪生物技术有限公司)溶液，以1:1体积比将它们混合，超声处理30s，超声功率90W，得到银胶体溶液。配置浓度为7mM的AgNO3(北京北化精细化学品有限责任公司)溶液，与上述醋酸奥曲肽溶液和银胶体溶液以1:1:3的体积比混合，放置到数显双层气浴恒温震荡器中，于200rpm、20℃条件下孵育20h。配置浓度为80mM的 NaBH4(北京中胜华腾科技有限公司)溶液，逐滴加入到上述孵育好的混合溶液中，震荡混匀，制得银纳米立方体溶液。
将5mg盐酸多巴胺(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于pH 为8.5 的Tris-HCl缓冲溶液5ml中，得到盐酸多巴胺溶液。向盐酸多巴胺溶液中加入2mg葡萄糖氧化酶(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，得到盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液。将盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液置于磁力搅拌器上避光快速搅拌 25min，然后用0.45μm水系滤膜过滤，过滤后溶液继续置于磁力搅拌器上避光快速搅拌25min，再次用0.45μm水系滤膜过滤，将第二次过滤后液体与等体积制备的银立方体溶液离心后沉淀混合。将所得混合溶液置于超声清洗仪中超声9min，超声后溶液 25℃环境下放置10min，然后8000rpm离心5min取沉淀，将沉淀物按离心前体积比1:1重悬于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得到负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体。
应用透射电子显微镜对负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体进行形貌表征，可知银纳米立方体表面均匀包裹一层聚多巴胺，粒径大约在120nm左右，形貌规则，粒径均一。应用激光粒度仪对负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的粒径和Zeta电位进行分析，可知负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的平均粒径为125nm，银纳米立方体电位约为 31mV，葡萄糖氧化酶的Zeta电位约为-18mV，负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的 Zeta电位约为-13mV，负载葡萄糖氧化酶使银立方体发生电位翻转，说明葡萄糖氧化酶成功负载到银立方体表面。在5分钟1.5W cm-2强度的激光照射下，该纳米药物温度升高到62℃，表现出极佳的光热转换能力。应用透射电子显微镜对负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体在葡萄糖存在下降解后形貌，如图5所示，向负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体溶液中添加1mg/mL葡萄糖溶液1mL放置2小时后，负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体既可降解成粒径约5-20nm易于代谢的小粒子。如图8所示，研究负载葡萄糖氧化酶的银立方体对宫颈癌U14荷瘤鼠的抗肿瘤效果，以尾静脉注射的方式给药14天，每天给药量为100μL，荷瘤鼠的照射功率为1.5W/cm2，照射时间为3min，注射负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体激光照射后小鼠跟生理盐水组相比体积体重没有明显差别，说明生物安全性较高。
实施例3
将醋酸奥曲肽(上海肽仕生物科技有限公司)溶于盐酸(永飞化工厂)溶液中，制得浓度为0.3mM、pH值为1的醋酸奥曲肽盐酸溶液，分别配置浓度为0.9mM的AgNO3(北京北化精细化学品有限责任公司)溶液与质量浓度为3％的抗坏血酸(北京拜尔迪生物技术有限公司)溶液，以1:1体积比将它们混合，超声处理30s，超声功率90W，得到银胶体溶液。配置浓度为7mM的AgNO3(北京北化精细化学品有限责任公司)溶液，与上述醋酸奥曲肽溶液和银胶体溶液以1:1:3的体积比混合，放置到数显双层气浴恒温震荡器中，于200rpm、20℃条件下孵育20h。配置浓度为80mM的 NaBH4(北京中胜华腾科技有限公司)溶液，逐滴加入到上述孵育好的混合溶液中，震荡混匀，制得银纳米立方体溶液。
将5mg盐酸多巴胺(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于pH 为9的Tris-HCl缓冲溶液20ml中，得到盐酸多巴胺溶液。向盐酸多巴胺溶液中加入2mg葡萄糖氧化酶(购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，得到盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液。将盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液置于磁力搅拌器上避光快速搅拌 30min，然后用0.45μm水系滤膜过滤，过滤后溶液继续置于磁力搅拌器上避光快速搅拌30min，再次用0.45μm水系滤膜过滤，将第二次过滤后液体与等体积制备的银立方体溶液离心后沉淀混合。将所得混合溶液置于超声清洗仪中超声10min，超声后溶液 28℃环境下放置20min，然后8000rpm离心5min取沉淀，将沉淀物按离心前体积比 1:1重悬于pH7.4的PBS缓冲溶液中，得到负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体。
应用透射电子显微镜对负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体进行形貌表征，可知银纳米立方体表面均匀包裹一层聚多巴胺，粒径大约在120nm左右，形貌规则，粒径均一。应用激光粒度仪对负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的粒径进行分析，可知负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的平均粒径为125nm。应用激光粒度仪对负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的Zeta电位进行分析，可知银纳米立方体电位约为31mV，葡萄糖氧化酶的Zeta电位约为-18mV，负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体的Zeta电位约为-13mV，负载葡萄糖氧化酶使银立方体发生电位翻转，说明葡萄糖氧化酶成功负载到银立方体表面。应用紫外-可见光光谱仪，向负载葡萄糖氧化酶的银纳米立方体溶液中添加1mg/mL葡萄糖溶液1mL对负载葡萄糖氧化酶的银立方体降解情况进行研究，如图6所示，60分钟后即可观察到负载葡萄糖氧化酶的银立方体在750nm处特征性吸收峰消失，说明纳米粒子的空间结构已经发生的改变。研究负载葡萄糖氧化酶的银立方体对宫颈癌U14荷瘤鼠的抗肿瘤效果，以尾静脉注射的方式给药14天，每天给药量为100μL，荷瘤鼠的照射功率为1.5W/cm2，照射时间为3min。如图7所示，注射负载葡萄糖氧化酶的银立方体小鼠在激光照射后的肿瘤体积明显小于注射生理盐水组和不加激光组的小鼠肿瘤体积，说明负载葡萄糖氧化酶的银立方体结合激光照射具有更好的抗肿瘤效果。

Claims (8)

1.一种基于饥饿疗法的可降解抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将醋酸奥曲肽溶于盐酸溶液中，制得醋酸奥曲肽盐酸溶液；
(2)将AgNO3溶液和抗坏血酸溶液混合，超声后得到银胶体溶液；
(3)将AgNO3溶液、步骤(1)所得醋酸奥曲肽盐酸溶液和步骤(2)所得银胶体溶液混合，恒温震荡孵育；将NaBH4溶液逐滴加入到孵育好的混合溶液中，震荡混匀，制得银纳米立方体溶液；
(4)将盐酸多巴胺溶解于pH为8～9的Tris-HCl缓冲溶液中，得到浓度为1～2mg/mL的盐酸多巴胺溶液；
(5)将葡萄糖氧化酶添加至步骤(4)得到的溶液中，得到浓度为0.05～0.2mg/mL的盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液；
(6)将步骤(5)所得的盐酸多巴胺-葡萄糖氧化酶混合溶液避光搅拌，过滤，过滤后溶液继续避光搅拌，再次过滤，将步骤(3)所得的银纳米立方体溶液离心，所得沉淀与第二次过滤后液体混合；
(7)将步骤(6)所得混合溶液经超声、静置、离心后取沉淀，将沉淀物重悬于PBS缓冲溶液中，得到可降解抗肿瘤纳米药物。
2.根据权利要求1所述的可降解抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中制备得到的醋酸奥曲肽盐酸溶液的浓度为0.2～0.4mM、pH值为1～2。
3.根据权利要求1所述的可降解抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中AgNO3溶液的浓度为0.8～1.0mM，抗坏血酸溶液的质量浓度为2.8～3.1％；AgNO3溶液和抗坏血酸溶液的体积比为1:1～1:1.2，超声时间为15～30s。
4.根据权利要求1所述的可降解抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中AgNO3溶液的浓度为5～7mM，恒温震荡孵育的条件为180～200rpm、20℃条件下孵育16～20h；NaBH4溶液的浓度为60～80mM；步骤(3)中的AgNO3溶液、步骤(1)所得醋酸奥曲肽盐酸溶液和步骤(2)所得银胶体溶液的体积比为1:1:3。
5.根据权利要求1所述的可降解抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中两次搅拌的时间均为20～30min，搅拌速度均为150～200rpm；步骤(6)中两次过滤的手段均为用0.45μm水系滤膜过滤；步骤(6)中用于离心的银纳米立方体溶液的体积与第二次过滤后液体的体积相等。
6.根据权利要求1所述的可降解抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤(7)的具体步骤为：将步骤(6)所得混合溶液超声为8～10min，超声后于20～28℃下静置5～20min，再于7500～8500rpm离心5min取沉淀物，将沉淀物按离心前体积比1:1重悬于pH7.4的PBS缓冲溶液中，即得可降解抗肿瘤纳米药物。
7.权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备得到的可降解抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述可降解抗肿瘤纳米药物的葡萄糖氧化酶负载量为10％～25％，平均粒径为100～150nm。
8.权利要求7所述的可降解抗肿瘤纳米药物在制备在抗肿瘤药物中的应用。
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