CN108926709B - 一种纳米协同治疗剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种纳米协同治疗剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种纳米协同治疗剂及其制备方法与应用,其中,所述纳米协同治疗剂包括表面羧基化的银纳米颗粒以及结合在所述银纳米颗粒表面羧基上的葡萄糖氧化酶。本发明提供的纳米协同治疗剂可同时实现肿瘤的饥饿治疗与银离子治疗相结合的协同治疗,其治疗效果更佳,在肿瘤的治疗领域将具有良好的应用前景。同时,本发明的制备工艺简单、操作方便,不需要复杂昂贵的设备,易于实现工业化生产。

Description

一种纳米协同治疗剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用纳米材料领域,尤其涉及一种纳米协同治疗剂及其制备方法与应用。
背景技术
金属和金属络合物长期以来一直用于癌症治疗,例如,包括顺铂,卡铂和奥沙利铂在内的铂类抗癌药物比其他类型的抗癌药物更常见于化疗方案中,这是无机化学领域的巨大成功案例之一。铝盐,是多种已批准的人类疫苗的成分之一,包括癌症相关的人乳头瘤病毒(HPV)疫苗,可诱导疫苗抗原而产生大量抗体应答。
由于Ag+离子具有良好的抗菌性能,这使得银纳米颗粒(AgNP)已成为个人护理中不可思议的商业化纳米材料之一。虽然AgNP本身不具有抗菌或抗真菌性质,但是由于赋予这种性质的AgNP具有不稳定性,会释放Ag+,同时Ag+还可通过诱导氧化应激、线粒体损伤和自噬对各种癌细胞系产生细胞毒性。然而,单一的AgNP抗癌能力尚没有达到理想的效果。
因此,现有技术还有待于发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种纳米协同治疗剂及其制备方法与应用,旨在解决现有单一金属纳米颗粒抗癌效果较差的问题。
本发明的技术方案如下:
一种纳米协同治疗剂,其中,包括表面羧基化的银纳米颗粒以及结合在所述银纳米颗粒表面羧基上的葡萄糖氧化酶。
所述的纳米协同治疗剂,其中,所述表面羧基化的银纳米颗粒的形状为球形、立方体形、三角锥形、星形、圆盘形和棒状中的一种或多种。
所述的纳米协同治疗剂,其中,所述葡萄糖氧化酶通过共价偶联、物理吸附或原位仿生合成的方式结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上。
一种纳米协同治疗剂的制备方法,其中,包括步骤:
在碱性条件下,将银纳米颗粒和硫辛酸加入乙醇溶剂中,混合使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液;
将N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及葡萄糖氧化酶加入所述表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,混合使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂。
所述纳米协同治疗剂的制备方法,其中,所述在碱性条件下,将银纳米颗粒和硫辛酸加入乙醇溶剂中,混合使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液的步骤具体包括:
在搅拌条件下,向银纳米颗粒乙醇溶液中加入NaOH,调节溶液pH为9-12;
向银纳米颗粒乙醇溶液中加入硫辛酸,搅拌1-3 h使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液。
所述纳米协同治疗剂的制备方法,其中,所述将N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及葡萄糖氧化酶加入所述表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,混合使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂的步骤具体包括:
将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,静置20-60 min,使所述银纳米颗粒表面的羧基活化;
向所述表面羧基活化后的银纳米颗粒溶液中加入葡萄糖氧化酶,搅拌0.5-1h使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂。
所述纳米协同治疗剂的制备方法,其中,所述N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量质量比为1:1-2。
一种纳米协同治疗剂的应用,其中,将所述的纳米协同治疗剂用于肿瘤治疗。
有益效果:本发明提供的纳米协同治疗剂包括表面羧基化的银纳米颗粒以及结合在所述银纳米颗粒表面羧基上的葡萄糖氧化酶。所述纳米协同治疗剂可同时实现肿瘤的饥饿治疗与银离子治疗相结合的协同治疗,其治疗效果更佳,在肿瘤的治疗领域将具有良好的应用前景。同时,本发明的制备工艺简单、操作方便,不需要复杂昂贵的设备,易于实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明一种纳米协同治疗剂的制备方法较佳实施例的流程图。
图2为本发明实施例1中,纳米协同治疗剂的合成路线图。
图3为本发明实施例2中,纳米协同治疗剂对4T1肿瘤细胞的杀伤效果图。
图4为本发明实施例3中,纳米协同治疗剂对4T1肿瘤中血氧饱和浓度的影响图。
图5为本发明实施例3中,纳米协同治疗剂对4T1肿瘤中双氧水浓度的影像图。
图6为本发明实施例4中,在不同治疗组中肿瘤体积随时间的变化结果图。
图7为本发明实施例4中,在不同治疗组中老鼠的生存周期随时间的变化结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种纳米协同治疗剂及其制备方法与应用,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
现有技术通常采用金属或金属络合物来制备抗癌药物,例如,银纳米颗粒可释放Ag+,所述Ag+虽然可通过诱导氧化应激、线粒体损伤和自噬对各种癌细胞系产生细胞毒性,但是这种单一的抗癌方式并没有取得良好的抗癌效果。
基于此,本发明提供一种纳米协同治疗剂,其中,包括表面羧基化的银纳米颗粒以及结合在所述银纳米颗粒表面羧基上的葡萄糖氧化酶。所述纳米协同治疗剂可同时实现肿瘤的饥饿治疗与银离子治疗相结合的协同治疗,其治疗效果更佳,在肿瘤的治疗领域将具有良好的应用前景。
具体来讲,肿瘤的饥饿治疗主要是通过栓塞血管来阻断肿瘤的营养供给,从而抑制肿瘤生长。由于葡萄糖是肿瘤代谢的主要能源物质,因此通过控制葡萄糖的代谢反应,即在葡萄糖氧化酶的催化下将葡萄糖转变为葡萄糖酸和双氧水(H2O2),从而大量消耗肿瘤内的葡萄糖,起到肿瘤的饥饿治疗效果。此外,葡萄糖氧化酶降解葡萄糖所产生的H2O2可显著增加肿瘤细胞内H2O2的浓度,从而导致肿瘤细胞在高浓度H2O2下死亡。
更进一步地,所述高浓度的H2O2还可用于分解银纳米颗粒并产生大量Ag+,用于肿瘤的金属离子治疗。
显然,单一的金属离子治疗或肿瘤的饥饿治疗均具有较多的局限,其肿瘤疗效不够显著,而本发明提供的纳米协同治疗剂可将现有的肿瘤治疗单一疗法转向为协同疗法,其肿瘤治疗效果显著。
作为其中一实施方式,所述表面羧基化的银纳米颗粒的形状为球形、立方体形、三角锥形、星形、圆盘形和棒状中的一种或多种,但不限于此。优选地,所述表面羧基化的银纳米颗粒的形状为直径等于45-55 nm的球形,便于吸附葡萄糖氧化酶并发挥较佳的协同作用。
更优选地,所述葡萄糖氧化酶通过共价偶联、物理吸附或原位仿生合成的方式结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上。
进一步地,本发明还提供一种纳米协同治疗剂的制备方法,其中,如图1所示,包括步骤:
S10、在碱性条件下,将银纳米颗粒和硫辛酸加入乙醇溶剂中,混合使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液;
S20、将N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及葡萄糖氧化酶加入所述表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,混合使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂。
具体来讲,本发明需要预先制备银纳米颗粒乙醇溶液,然后在搅拌条件下,向银纳米颗粒乙醇溶液中加入NaOH,调节溶液pH为9-12;然后向碱性的银纳米颗粒乙醇溶液中加入硫辛酸,搅拌1-3 h后使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液。
进一步地,将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,静置20-60 min,使所述银纳米颗粒表面的羧基活化。优选地,所述N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作为催化剂,其用量质量比为1:1-2。在该比例范围内,其催化效果最佳;
向所述表面羧基活化后的银纳米颗粒溶液中加入葡萄糖氧化酶,搅拌0.5-1h使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂。
本发明提供的纳米协同治疗剂的制备工艺简单、操作方便,不需要复杂昂贵的设备,易于实现工业化生产。
下面通过具体实施例对本发明一种纳米协同治疗剂的制备方法以及所述纳米协同治疗剂的治疗原理及效果做进一步的解释说明:
实施例1
图2为本实施例1提供的纳米协同治疗剂的合成线路图,其包括如下步骤:
制备纳米银颗粒溶液:以乙二醇(EG)作为所有试剂的溶剂以及以三氟乙酸银(CF3COOAg)作为纳米银颗粒的前体,具体地,预先加入0.06 mL NaHS(浓度为3 mM),0.5 mLHCl(浓度为3 mM)和1.25 mL的20 mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP,20 mg/mL,MW≈55000);最后,加入0.4 mL CF3COOAg(浓度为282 mM),该反应在150 ℃下搅拌20分钟以获得纳米银颗粒(AgNC);
制备表面羧基化的纳米银颗粒:在搅拌条件下,将34 μL NaOH(浓度为0.5 M)加至5 mL 纳米银颗粒(纯水补至5 mL),将pH值调节至11,缓慢加入500 μL硫辛酸(15 mM,乙醇作为溶剂),搅拌2小时,使纳米银颗粒与硫辛酸(TA)偶联以获得表面羧基化的纳米银颗粒(AgNC-TA);
制备纳米协同治疗剂:将2 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和3 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)分别溶解于1 mL纯水中,分别取10 μL加至表面羧基化的纳米银颗粒溶液中,静置0.5 h。然后将3 mg 葡萄糖氧化酶(GOx)溶解于1 mL纯水中并加到上述制备的溶液中,搅拌1小时,使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂(AgNC-GOx)。
实施例2
MTT法评价本发明中纳米协同治疗剂对4T1细胞存活率的影响:
具体地,将4T1细胞以每孔1×104密度接种到96孔板中,并置于37 ℃、5% CO2条件下培育24 h。接着,吸出96孔板中的旧培养基,分别加入含有5 nM AgNC、AgNC-GOx和GOx的无糖1640培养基以及不同浓度的葡萄糖。继续培养24 h后,吸出96孔板中的旧培养基,在每个孔中加入100 μL MTT的培养基溶液(0.8 mg/mL,继续培养4 h。吸出96孔板中的残余培养基,在每个孔中加入100 μL DMSO溶液,轻轻摇晃后,在Bio-Tel EL×800型酶标仪上检测每孔的OD值(检测波长为570 nm),用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(cellviability)(%)=(样品的OD570值/空白OD570值)×100%,实验结果见图3。
如图3所示,AgNC-GOx会显著降低4T1细胞存活率;并且AgNC-GOx的对细胞的杀伤效果显著优于GOx和AgNC对细胞的杀伤效果。并且细胞杀伤效果随着培养基中葡萄糖浓度的增加而显著提高。
实施例3
本发明纳米协同治疗剂对肿瘤区的血氧饱和浓度和双氧水浓度的的影响:
具体地,本发明中所有的实验操作均按照深圳大学实验动物伦理委员会要求进行,在雌性无胸腺裸鼠(六周, 20-25 g) 前腿皮下注射1×106 4T1肿瘤细胞的PBS溶液建立老鼠肿瘤模型。当肿瘤体积达60 mm3时,将100μL 10 mg/mL AgNC-GOx的PBS溶液,通过瘤内注射的方式,直接注入4T1肿瘤,利用小动物光声成像系统(VisualSonics Vevo LAZRsystem)的“Oxyhemo”模式,检测肿瘤区的血氧饱和浓度(average sO2(%)),观察肿瘤血氧饱和浓度在HMON-GOx注入后4h内的变化。此外,利用硫酸钛检测HMON-GOx注入1后肿瘤区的双氧水浓度。实验结果见图4和图5。
如图4所示,肿瘤血氧饱和浓度(average sO2(%))在AgNC-GOx注入后4h内会显著降低,如图5所示,AgNC-GOx注入1小时后肿瘤区的双氧水浓度显著提高。
实施例4
本发明纳米协同治疗剂对肿瘤生长的影响:
具体地,在雌性无胸腺裸鼠(六周, 20-25 g)前腿皮下注射1×106 4T1肿瘤细胞的PBS 溶液建立老鼠肿瘤模型。当肿瘤体积达60 mm3时,进行治疗实验。4T1肿瘤小鼠随机分为四组:(1)空白组(对照);(2)注射AgNC组;(3)注射GOx组;(4)AgNC-GOx组。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤体积,并按照公式V = AB2/2 计算肿瘤体积,其中A是肿瘤的长径,B是肿瘤的短径(mm)。每次测量结果均通过处理前的起始肿瘤体积归一化,并且观察每组老鼠的生存周期。实验结果见图6和图7。
图6中表示不同治疗组肿瘤体积随时间的变化情况,如图6所示,注射AgNC-GOx组能够显著抑制肿瘤的生长,注射AgNC-GOx组的效果显著优于注射GOx组和注射AgNC组以及空白组;图7表示不同治疗组老鼠的生存周期随时间的变化情况,如图7所示,注射AgNC-GOx组显著提高老鼠的生存周期,注射AgNC-GOx组的效果显著优于注射GOx组、注射AgNC组以及空白组。
通过上述实施例可知,本发明提供的纳米协同治疗剂中,AgNC表面共价接枝的GOx可将细胞内的葡萄糖转变为葡萄糖酸和具有细胞毒性的双氧水(H2O2),从而大量消耗细胞内的能量来源和营养物质,起到饥饿治疗肿瘤的效果。同时AgNC在GOx所产生的酸性环境和H2O2下可氧化产生Ag+,从而实现肿瘤的银离子治疗。因此,所述纳米协同治疗剂可同时实现肿瘤饥饿治疗与银离子治疗相结合的协同治疗。
进一步地,本发明还提供一种纳米协同治疗剂的应用,其中,将所述的纳米协同治疗剂用于肿瘤治疗。
综上所述,本发明提供的纳米协同治疗剂包括表面羧基化的银纳米颗粒以及结合在所述银纳米颗粒表面羧基上的葡萄糖氧化酶。所述纳米协同治疗剂可同时实现肿瘤的饥饿治疗与银离子治疗相结合的协同治疗,其治疗效果更佳,在肿瘤的治疗领域将具有良好的应用前景。同时,本发明的制备工艺简单、操作方便,不需要复杂昂贵的设备,易于实现工业化生产。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种纳米协同治疗剂,其特征在于,包括表面羧基化的银纳米颗粒以及结合在所述银纳米颗粒表面羧基上的葡萄糖氧化酶,所述葡萄糖氧化酶通过共价偶联的方式结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上。
2.根据权利要求1所述的纳米协同治疗剂,其特征在于,所述表面羧基化的银纳米颗粒的形状为球形、立方体形、三角锥形、星形、圆盘形和棒状中的一种或多种。
3.一种纳米协同治疗剂的制备方法,其特征在于,包括步骤:
在碱性条件下,将银纳米颗粒和硫辛酸加入乙醇溶剂中,混合使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液;
将N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及葡萄糖氧化酶加入所述表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,混合使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂。
4.根据权利要求3所述纳米协同治疗剂的制备方法,其特征在于,所述在碱性条件下,将银纳米颗粒和硫辛酸加入乙醇溶剂中,混合使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液的步骤具体包括:
在搅拌条件下,向银纳米颗粒乙醇溶液中加入NaOH,调节溶液pH为9-12;
向银纳米颗粒乙醇溶液中加入硫辛酸,搅拌1-3h使银纳米颗粒与所述硫辛酸偶联,得到表面羧基化的银纳米颗粒溶液。
5.根据权利要求3所述纳米协同治疗剂的制备方法,其特征在于,所述将N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及葡萄糖氧化酶加入所述表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,混合使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂的步骤具体包括:
将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入表面羧基化的银纳米颗粒溶液中,静置20-60min,使所述银纳米颗粒表面的羧基活化;
向所述表面羧基活化后的银纳米颗粒溶液中加入葡萄糖氧化酶,搅拌0.5-1h使葡萄糖氧化酶结合在所述银纳米颗粒表面的羧基上,得到所述纳米协同治疗剂。
6.根据权利要求5所述纳米协同治疗剂的制备方法,其特征在于,所述N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量质量比为1:1-2。
7.一种纳米协同治疗剂制备药物的应用,其特征在于,将权利要求1-2任一所述的纳米协同治疗剂用于制备肿瘤治疗的药物。
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GR01 Patent grant
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