CN110658343A - 免疫球蛋白的检测试剂在制备结直肠癌诊断剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及免疫球蛋白检测试剂在制备结直肠癌诊断或预后试剂/试剂盒中的应用。本发明研究发现，特定免疫球蛋白在结肠直肠癌中差异表达，且具有很大的差异性和可信度。将单一免疫球蛋白及不同免疫球蛋白组合作为结直肠癌诊断生物标记物，有利于提高结肠直肠癌的诊疗水平，有效防治结直肠癌。

Description

免疫球蛋白的检测试剂在制备结直肠癌诊断剂的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及免疫球蛋白的检测试剂在制备结肠直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用和一种结肠直肠癌诊断的试剂/试剂盒。
发明背景
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤，是世界第二大癌症，其高发病率和致死率分别位于第三位和第四位。近年来随着我国人民生活水平的提高、生活方式的改变以及人口老龄化，结直肠癌在我国的发病率呈现逐渐上升的趋势，居我国恶性肿瘤发病率第三位和死亡率第五位，严重威胁着人们的健康和生命。早发现、早诊断、早治疗是治疗结直肠癌的关键。但是结直肠癌初期多数没有明显症状，随病情进展多以“肠炎”就诊，使得大部分结直肠癌患者确诊时已处于肿瘤进展期，失去了最佳的治疗时机，导致其五年生存率不到20％，预后较差。因此，探索结直肠癌早期、快速、大规模的诊断方法，提高诊疗水平，是目前防治结直肠癌亟待解决的问题。
人的血清中含有大量的免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，免疫球蛋白是一种主要由浆细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等病原体的大型Y形蛋白质，具有多种免疫球蛋白亚型；更重要的是，免疫球蛋白的不同亚型在机体遭受感染时会出现波动变化；且与其他蛋白分子相比，免疫球蛋白具有更稳定的性质及更长的半衰期，这些特点使得血浆中不同免疫球蛋白亚型表达水平在感染及肿瘤等疾病诊断应用上具有广阔的前景。
Ig根据Y字形结构的数量和重链的类型的不同，可以分为五类，即IgA、IgG、 IgM、IgD、IgE，它们的重链分别是γ、μ、α、δ、ε。各类Ig在生物学特性、功能区域以及结合不同抗原的能力上有所不同。其中，IgA是高度糖基化的蛋白质，主要由IgA1和IgA2两种形式存在。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，占70％-75％，也是最重要的抗感染分子。IgG根据其分子主链(γ链)抗原性的差别及二硫键数目和位置的不同，可分为4个亚型，分别是IgG1，IgG2，IgG3 和IgG4。IgM、IgD、IgE则只有一种形态。
Ig的每种亚型都具有不同的功能，其含量过低或过高或者缺陷都会导致相应的免疫功能低下，造成相应的疾病的发生。如果只检测某一种Ig的总体含量，不检测各亚型的含量，往往会导致误诊。因为很多患者某一种Ig总体含量正常，但个别亚型缺陷或含量不正常。如果只给予抗生素治疗，而没有及时给予免疫治疗，将会给患者造成不必要的麻烦。因此，对每种Ig的各亚型进行检测，在临床上具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结肠直肠癌的分子标志物，以及该分子标志物的诊断试剂及其应用。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一方面，本发明提供了免疫球蛋白的检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用，所述免疫球蛋白包含IgD和/或IgE。
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白包含IgD和IgE。
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白为IgD和IgE。
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白还包含IgG1，IgG3或IgA1中的一种或多种；
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3。
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3。
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1。
本发明发明人收集了健康人血液(优选采用血浆样本)和结直肠癌患者的血浆样本进行检测，通过数据处理分析，得到标准化的不同血浆促/抑炎因子丰度，非显而易见地发现，免疫球蛋白亚型——不同免疫球蛋白差异表达，可以作为结直肠癌诊断生物标记物。
需要说明的是，所述的免疫球蛋白检测试剂，当所述免疫球蛋白为一种时，检测试剂针对该种免疫球蛋白进行检测；当所述的免疫球蛋白为至少两个时，所述的检测试剂对每一个免疫球蛋白都进行检测。
上述免疫球蛋白的检测试剂包含检测免疫球蛋白的mRNA的表达量；或者检测免疫球蛋白的表达量，或者检测免疫球蛋白的生物活性中的一种或几种。作为本发明中一种优选的实施方式，所述的免疫球蛋白的检测试剂包含检测免疫球蛋白的表达量。
作为优选的实施方式免疫球蛋白的表达量即表示免疫球蛋白在检测样品中的浓度；作为更优选的实施方式，表示免疫球蛋白在血浆中的浓度。
作为优选的实施方式，所述的检测试剂包含检测每个免疫球蛋白的抗体、抗体功能性片段或者偶联抗体。
其中，所述的抗体可能是单克隆抗体，多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗体(例如：双特异性抗体)，和/或连接在蛋白酶体上的抗体片段。该抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或人型抗体。抗体片段可以是，例如， Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，Fd，单链Fv(scFv)，具二硫键的Fv(sdFv)，或 VL、VH结构域。抗体可能是一个共轭的形式，例如，结合一个标签、一个可检测标记，或一种细胞毒性剂。
作为优选的实施方式，所述的偶联抗体为荧光素偶联抗体或生物酶偶联抗体。
作为优选的实施方式，所述试剂盒为ELISA试剂盒，进一步地，是基于抗人免疫球蛋白偶联抗体的ELISA试剂盒，该检测试剂盒用于检测免疫球蛋白的表达量。
所述的检测试剂的检测方法包含ELISA法、蛋白芯片法、液相色谱法、免疫比浊法、流式细胞法中的任意一种或几种；作为优选的实施方式，所述的检测试剂的检测方法为蛋白芯片法、ELISA法或免疫比浊法中的一种或几种；作为更优选的实施方式，所述的检测试剂的检测方法为蛋白芯片法或ELISA法。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgD蛋白表达量临界值的取值范围为1906.41pg/ml至6168.47pg/ml。
作为优选的实施方式，所述IgD蛋白表达量临界值取值为5842.19pg/ml；当IgD蛋白的表达量≤5842.19pg/ml，则结直肠癌低风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgD蛋白的表达量>5842.19pg/ml，则结直肠癌高风险。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgE时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgE蛋白表达量临界值的取值范围为978.68pg/ml至 1305.34pg/ml。
作为优选的实施方式，所述IgE蛋白表达量临界值取值为991.94pg/ml；当 IgE蛋白的表达量≤991.94pg/ml，则结直肠癌高风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgE蛋白的表达量>991.94pg/ml，则结直肠癌低风险。
作为本发明一种示范性的实施方式，不同免疫球蛋白的表达量的计算方法可以采用标准曲线法。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为至少两个时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.7416。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD和IgE时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.00158CIgE+0.000131CIgD+1.474)))，所述CIgE为IgE 的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5920-0.6418；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.6039。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3时，所述风险指数 X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001602CIgE+0.000119CIgG3+0.0001CIgD+1.091)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.6762；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.5265。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3时，所述风险指数X的计算方法为：X＝ 1/(1+e^(-(-0.001904CIgE+0.000273CIgG3+0.000107CIgD-0.000008CIgG1+2.047)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgG1为IgG1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.6231-0.6659；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.6280。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1时，所述风险指数X的计算方法为：X＝ 1/(1+e^(-(-0.001587CIgE+0.000212CIgG3+0.000110CIgD-0.000019CIgA1+2.769)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgA1为IgA1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5933-0.7416；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.7374。
作为优选的实施方式，所述的检测试剂的检测结果为：当所述风险指数X≤临界值，则结直肠癌低风险；当所述风险指数X>临界值，则结直肠癌高风险。
作为优选的实施方式，检测试剂所检测样品为血液；作为优选的实施方式，检测试剂所检测样品为血浆。
另一方面，本发明还提供了一种结直肠癌诊断系统，该检测系统含有：
a)检测构件：所述的检测构件用以检测诊断对象的免疫球蛋白的表达量；
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白包含IgD和/或IgE；
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白为IgD和IgE；
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白还包含IgG1，IgG3或IgA1中的一种或多种；
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3；
作为优选的实施方式，所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3；
作为优选的实施方式，所述所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1。
b)结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的免疫球蛋白的表达量得出结直肠癌的患病的可能性或者风险值。
作为优选的实施方式，所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪、流式细胞仪、液相色谱仪中的一种或几种；作为优选的实施方式，所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪中的一种或两种。
作为优选的实施方式，所述的结果判断构件为软件，其含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入免疫球蛋白的表达量；分析模块用于根据免疫球蛋白的表达量，分析出结肠直肠癌患病可能性或者风险值；输出模块用于输出分析模块的分析结果。
其中，所述的系统中，免疫球蛋白的表达量为免疫球蛋白的mRNA的表达量；或者为蛋白的表达量。作为优选的实施方式，所述的检测构件检测的是免疫球蛋白的表达量。
其中，所述的诊断系统的诊断样品为血液；更优选为血浆。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgD蛋白表达量临界值的取值范围为1906.41pg/ml至 6168.47pg/ml。
作为优选的实施方式，所述IgD蛋白表达量临界值取值为5842.19pg/ml；当IgD蛋白的表达量≤5842.19pg/ml，则结直肠癌低风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgD蛋白的表达量>5842.19pg/ml，则结直肠癌高风险。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgE时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgE蛋白表达量临界值的取值范围为978.68pg/ml至1305.34pg/ml。
作为优选的实施方式，所述IgE蛋白表达量临界值取值为991.94pg/ml；当 IgE蛋白的表达量≤991.94pg/ml，则结直肠癌高风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgE蛋白的表达量>991.94pg/ml，则结直肠癌低风险。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为至少两个时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.7416。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD和IgE时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.00158CIgE+0.000131CIgD+1.474)))，所述CIgE为IgE 的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5920-0.6418；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.6039。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3时，所述风险指数 X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001602CIgE+0.000119CIgG3+0.0001CIgD+1.091)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.6762；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.5265。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3时，所述风险指数X的计算方法为：X＝ 1/(1+e^(-(-0.001904CIgE+0.000273CIgG3+0.000107CIgD-0.000008CIgG1+2.047)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgG1为IgG1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.6231-0.6659；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.6280。
作为优选的实施方式，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001587CIgE+0.000212CIgG3+0.000110CIgD-0.000019CIgA1+2.769)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgA1为IgA1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5933-0.7416；作为优选的实施方式，所述风险指数X的临界值为0.7374。
作为优选的实施方式，所述的检测试剂的检测结果为：当所述风险指数X≤临界值，则结直肠癌低风险；当所述风险指数X>临界值，则结直肠癌高风险。
本发明的有益效果：
(1)本发明发现，在众多的免疫球蛋白中，不同免疫球蛋白差异表达，其可作为结肠直肠的生物标志物。
(2)本发明检测试剂的检测对象为血液，可实现动态、大规模筛查。
(3)和血浆中其他蛋白相比，免疫球蛋白半衰期较长，性质稳定，更适于作为疾病诊断的标志物。
附图说明
图1为差异免疫球蛋白火山图。
图2为51例健康人、99例结直肠癌患者血浆中不同免疫球蛋白浓度比较。
图3不同免疫球蛋白指标区分结直肠癌的ROC曲线分析。
图4为免疫球蛋白标准品梯度稀释图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1差异免疫球蛋白的表达分析
实验方法：
本发明首先收集中山大学附属第六医院51例健康人及99例结直肠癌患者血浆，通过以下步骤获得差异免疫球蛋白：
1.通过枸橼酸钠抗凝采血管收取3-5ml健康人或结直肠癌患者全血；
2. 500g转速下离心10分钟，血细胞沉淀后吸取得到血浆上层；
3.收集血浆上层清液再通过2000g转速下离心15min的到去除沉淀后血浆样本；
4.分装冻存于-80℃冰箱；
5.对血浆样本进行瑞博奥蛋白芯片(型号QAH-ISO-1)检测；
(1)玻片芯片的完全干燥
将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
(2)标准品的配置
免疫球蛋白标准品梯度稀释见图4。
添加500μL的样品稀释液(sample diluent)到免疫球蛋白标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下吹打溶解粉末，标记这个小管为Std 1。
分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μL的样品稀释液到每个小管中。
抽取100μL的Std 1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std 2中抽取100μL加入到Std3中，如此梯度稀释至Std7。
抽取100μL的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。
注：因为每种免疫球蛋白的起始浓度是不同的，所以Std1到Std7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的。
(3)芯片操作流程
(a)每个孔中加100μL的样品稀释液，室温摇床上孵育1h，封闭定量抗体芯片。
(b)抽去每个孔中的缓冲液，添加100μL的标准液和样品到孔中，4℃过夜孵育。(样品1万倍稀释)
(c)使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II。
(d)检测抗体混合物的孵育,离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的检测抗体到每个孔中，RT 摇床上孵育2小时。
(e)清洗，同步骤(c)
(f)Cy3-链霉亲和素的孵育,离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，RT摇床上孵育1个小时。
(g)清洗，同步骤(c)
(h)荧光检测,采用激光扫描仪例如InnoScan 300扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，仪器型号：InnoScan 300Microarray Scanner，厂家：Innopsys,扫描参数：WaveLengh：532nm；Resolution：10μm，采用QAH-ISO-1 的数据分析软件来进行数据分析。
6.对检测数据进行标准化处理，对比分析各个免疫球蛋白在三组样本中的表达情况。
分析数据：
1.差异免疫球蛋白火山图分析
差异免疫球蛋白火山图分析的结果见表1和图1。
差异表达蛋白(DEPs)。
为了检测差异表达蛋白，我们对10000倍稀释后样品不同免疫球蛋白的浓度值进行比较，比较后得到两组间每个免疫球蛋白变化倍数(log2倍数变化)和T 检验后P值(-log10 P值)
差异表达蛋白是指P值小于0.05(-log10 P value大于1.3)，并且变化倍数 (log2倍数变化)大于+0.32或小于-0.32(约1.25倍)的蛋白。
表1差异免疫球蛋白对比
结直肠癌对比健康人组
IgD IgE IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA1 IgA2
健康人均值 3532.730 997.697 82426.548 159917.865 300268.839 3605.952 12362.652 115275.407 7311.010
结直肠癌组均值 5803.357 773.677 84178.415 178090.202 321280.143 5467.267 18390.989 116087.194 5048.217
log2倍数(结直肠/健康) 0.716 -0.367 0.030 0.155 0.098 0.600 0.573 0.010 -0.534
-log10 P值 1.980 2.899 0.169 0.677 0.415 2.282 1.300 0.061 1.092
由表1和图1说明：和健康人组相比，IgD，IgG3，IgG4免疫球蛋白在结直肠癌患者组中显著高表达，IgE在结直肠癌组中显著低表达。
2.健康人和结直肠癌患者血浆不同免疫球蛋白浓度比较
51例健康人，99例结直肠癌患者血浆不同免疫球蛋白浓度比较(见图2)。
IgD(P＝0.011)，IgG3(P＝0.0052)，IgG4(P＝0.050)，IgE(P＝0.0013)在结直肠癌组和健康人之间有较大差异。
3.多因子组合诊断模型中自变量的选择
对回归模型进行假设检验的结果：卡方＝34.422，P＜0.001，Logistic回归模型有统计学意义。
表2
模型系数的Omnibus检验
Figure BDA0002231719430000111
表3
方程中的变量
Figure BDA0002231719430000112
a.在步骤1输入的变量：IgD，IgE，IgM，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2。
根据结果，可知部分变量目前没有统计学意义，因此需要对自变量进行筛选。
我们采取最大偏似然估计的似然比检验(向前：LR)构建Logistic回归模型筛选自变量，经过多次筛选，得到结果。
表4
方程中的变量
Figure BDA0002231719430000121
a.在步骤1输入的变量：IgE。
b.在步骤2输入的变量：IgG3。
c.在步骤3输入的变量：IgG1。
d.在步骤4输入的变量：IgD。
e.在步骤5输入的变量：IgA1。
去除没有统计学意义的自变量之后，回归模型中保留的自变量有IgD、IgE、 IgG1、IgG3以及IgA1，可以认为它们是回归模型中可以用于诊断结直肠癌的相关因素。
4.单个免疫球蛋白及不同免疫球蛋白组合的ROC曲线分析
1及2结果提示，IgD，IgG3，IgG4，IgE可作为区分结直肠癌的差异指标。 3的回归结果提示IgD、IgE、IgG1、IgG3以及IgA1可以作为结直肠癌诊断指标，结合1，2，3的结果，我们将两种分析中的相关自变量进行合并，合并后IgD、 IgE、IgG1、IgG3、IgG4、IgA1可作为自变量，通过多因子联合的方式构建模型进行结直肠癌诊断。
为了评估不同免疫球蛋白区分结直肠癌/健康人的能力，我们对13种不同免疫球蛋白及其组合进行了ROC曲线分析，结果如图3及表5所示。
表5
指标 AUC P值 灵敏度 特异度
IgD 0.619 0.017 0.384 0.843
IgE 0.62 0.017 0.471 0.768
IgG1 0.566 0.184 0.788 0.392
IgG3 0.644 0.004 0.586 0.706
IgG4 0.614 0.022 0.545 0.667
IgA1 0.520 0.693 0.444 0.686
IgD+IgE 0.706 <0.001 0.778 0.608
IgG3+IgA1 0.676 <0.001 0.788 0.549
IgG2+IgE 0.673 0.001 0.646 0.686
IgG4+IgE 0.672 0.001 0.778 0.49
IgD+IgE+IgG3 0.733 <0.001 0.859 0.51
IgE+IgG3+IgA1 0.72 <0.001 0.727 0.667
IgD+IgE+IgG1+IgG3 0.751 <0.001 0.697 0.725
IgD+IgE+IgG3+IgA1 0.74 <0.001 0.505 0.863
IgD+IgE+IgG1+IgG3+IgG4 0.748 <0.001 0.707 0.706
从图3和表5的结果可知，在有差异的单个免疫球蛋白中，IgG3的效果最好，其AUC值为0.644，当灵敏度为0.586时，特异度能达到0.706。多个免疫球蛋白组合的与单个免疫球蛋白相比，显示出了更好的区分结直肠癌/健康人的能力，AUC值均在0.67以上。
在两个免疫球蛋白的组合中，非显而意见地，IgD+IgE的组合显示出最高的区分结直肠癌/健康人的能力，AUC值为0.706；其它两个的组合的AUC值均在0.7以下，其中，IgG3+IgA1的组合仅为0.676，而IgG3在单个的免疫球蛋白中 AUC值是最高的。
在超过两个免疫球蛋白的组合中，包含IgD+IgE的组合才显示出更好的区分结直肠癌/健康人的能力，AUC值较其它组合更高。其中，四个免疫球蛋白 (IgD+IgE+IgG1+IgG3，AUC为0.751)的组合显示出较好的结果，比五个免疫球蛋白(IgD+IgE+IgG1+IgG3+IgG4，AUC为0.748)的组合AUC值更高。出于简化模型和保证检测准确率的平衡考虑，IgD+IgE、IgD+IgE+IgG3、以及 IgD+IgE+IgG1+IgG3、IgD+IgE+IgG3+IgA1均是较佳的组合。
需要说明的是，目前常用的结直肠癌肿瘤标志物主要有以下两类：(1)肿瘤相关抗原检测，如CEA,CA199,CA125等；(2)肿瘤相关游离核酸检测，如甲基化DNA，miRNA等。
肿瘤相关抗原由于与多种癌症相关，导致其检测结果敏感性差，假阴性率高，据Yanfeng Gao等的报导，单个检测肿瘤相关抗原CEA、CA199、CA72-4、CA125 和血清铁蛋白，其中CEA的灵敏性最高，但仍然仅为46.59％；肿瘤相关游离核酸的检测因为核酸稳定性差，对样品保存及处理要求高(如PCR)，单个样品的处理步骤复杂且成本较高，难以在临床及门诊检验中普及。
5.免疫球蛋白组合最佳诊断界限值的选取
5.1 IgD最佳诊断界限值的选取
将ROC曲线分析中的诊断界限值进行约登指数(Youden’s index)排序，如表6所示，选取约登指数排前10的界限值进行分析发现：当以IgD浓度5842.19 pg/ml为临界值时，显示出了最高的区分结直肠癌的能力(灵敏度＝0.38，特异度＝0.84)。
表6 IgD最佳诊断界限值
Figure BDA0002231719430000141
Figure BDA0002231719430000151
由表6和图3A的结果，判断结直肠癌高风险或低风险的IgD蛋白表达量临界值的取值范围为1906.41pg/ml至6168.47pg/ml。
结合图3A结果，我们将10000倍稀释后的血浆浓度IgD＝5842.19pg/ml作为临界值，当IgD蛋白的表达量≤5842.19pg/ml，则结直肠癌低风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgD蛋白的表达量>5842.19pg/ml，则结直肠癌高风险。 5.2IgE最佳诊断界限值的选取
将ROC曲线分析中的诊断界限值进行约登指数(Youden’s index)排序，如表7所示，选取约登指数排前10的界限值进行分析发现：当以IgE浓度991.94 pg/ml为临界值时，显示出了最高的区分结直肠癌的能力(灵敏度＝0.47，特异度＝0.77)。
表7 IgE最佳诊断界限值
Figure BDA0002231719430000152
由表7和图3A的结果，判断结直肠癌高风险或低风险的IgE蛋白表达量临界值的取值范围为978.68pg/ml至1305.34pg/ml。
根据图2结果可知结直肠癌组IgE血浆浓度显著低于健康对照组，结合图 3A结果，我们将10000倍稀释后的血浆浓度IgE＝991.94pg/ml作为临界值，当IgE蛋白的表达量≤991.94pg/ml，则结直肠癌高风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgE蛋白的表达量>991.94pg/ml，则结直肠癌低风险。
5.3至少两个以上的免疫球蛋白最佳诊断界限值的选取
根据4中不同诊断模型中ROC曲线分析中的判断结直肠癌高风险或低风险的风险指数X的临界值进行约登指数(Youden’s index)排序，选取约登指数排前10的界限值进行分析并确定界限值范围，结果如表8所示。
表8
Figure BDA0002231719430000161
将结直肠癌患者10000倍稀释后的血浆中各免疫球蛋白的浓度做Logistic回归后得到多因素预测模型公式，表格中CIgE为IgE的浓度，CIgD为IgD的浓度， CIgG3为IgG3的浓度，CIgG1为IgG1的浓度，CIgA1为IgA1的浓度。
当免疫球蛋白为IgD和IgE时，风险指数X的计算方法为：X＝ 1/(1+e^(-(-0.00158CIgE+0.000131CIgD+1.474)))，风险指数X的临界值取值范围为 0.5920-0.6418；优选地，所述风险指数X的临界值为0.6039。
当免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3时，风险指数X的计算方法为：X＝ 1/(1+e^(-(-0.001602CIgE+0.000119CIgG3+0.0001CIgD+1.091)))，风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.6762；优选地，所述风险指数X的临界值为0.5265。
当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3时，风险指数X的计算方法为： X＝1/(1+e^(-(-0.001904CIgE+0.000273CIgG3+0.000107CIgD-0.000008CIgG1+2.047)))，风险指数X的临界值取值范围为0.6231-0.6659；优选地，所述风险指数X的临界值为0.6280。
当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1时，风险指数X的计算方法为： X＝1/(1+e^(-(-0.001587CIgE+0.000212CIgG3+0.000110CIgD-0.000019CIgA1+2.769)))，风险指数X的临界值取值范围为0.5933-0.7416；优选地，所述风险指数X的临界值为0.7374。
检测试剂的检测结果为：当所述风险指数X≤临界值，则结直肠癌低风险；当所述风险指数X>临界值，则结直肠癌高风险。
本发明发现了免疫球蛋白可以作为存在于血浆的标记物，以血液采样的方式即可实现较好的预诊效果，这对减轻待测人群的取样痛苦，以及实现较为普及性的预诊筛查，具有非常重大的意义。
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1.Yanfeng Gao.et al.Evaluation of Serum CEA,CA19-9,CA72-4,CA125 andFerritin as Diagnostic Markers and Factors of Clinical Parameters forColorectal Cancer.Scientific Reports,(2018)8:2732。

Claims (10)

1.免疫球蛋白的检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用，其特征在于，所述免疫球蛋白包含IgD和/或IgE。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫球蛋白包含IgD和IgE；
优选地，所述免疫球蛋白为IgD和IgE；
优选地，所述免疫球蛋白还包含IgG1，IgG3或IgA1中的一种或多种；
优选地，所述免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3；
优选地，所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3；
优选地，所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂包含检测免疫球蛋白的mRNA的表达量；或者检测免疫球蛋白的表达量，或者检测免疫球蛋白的生物活性的试剂；优选地，所述的检测试剂包含检测免疫球蛋白的表达量的试剂；优选地，所述的检测试剂的检测样品为血液；更优选为血浆。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂包含每个免疫球蛋白的抗体、抗体功能性片段或者偶联抗体；优选地，所述的偶联抗体为荧光素偶联抗体或生物酶偶联抗体。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂的检测方法包含ELISA法、蛋白芯片法、液相色谱法、流式细胞法中的任意一种或几种；优选地，为蛋白芯片法或ELISA法。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当免疫球蛋白为IgD时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgD蛋白表达量临界值的取值范围为1906.41pg/ml至6168.47pg/ml；
优选地，所述IgD蛋白表达量临界值取值为5842.19pg/ml；当IgD蛋白的表达量≤5842.19pg/ml，则结直肠癌低风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgD蛋白的表达量>5842.19pg/ml，则结直肠癌高风险。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当免疫球蛋白为IgE时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgE蛋白表达量临界值的取值范围为978.68pg/ml至1305.34pg/ml；
优选地，所述IgE蛋白表达量临界值取值为991.94pg/ml；当IgE蛋白的表达量≤991.94pg/ml，则结直肠癌高风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgE蛋白的表达量>991.94pg/ml，则结直肠癌低风险。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当免疫球蛋白为至少两个时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.7416；
优选地，当免疫球蛋白为IgD和IgE时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.00158CIgE+0.000131CIgD+1.474)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5920-0.6418；优选地，所述风险指数X的临界值为0.6039；
优选地，当免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001602CIgE+0.000119CIgG3+0.0001CIgD+1.091)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.6762；优选地，所述风险指数X的临界值为0.5265；
优选地，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001904CIgE+0.000273CIgG3+0.000107CIgD-0.000008CIgG1+2.047)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgG1为IgG1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.6231-0.6659；优选地，所述风险指数X的临界值为0.6280；
优选地，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001587CIgE+0.000212CIgG3+0.000110CIgD-0.000019CIgA1+2.769)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgA1为IgA1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5933-0.7416；优选地，所述风险指数X的临界值为0.7374；
优选地，所述的检测试剂的检测结果为：当所述风险指数X≤临界值，则结直肠癌低风险；当所述风险指数X>临界值，则结直肠癌高风险。
10.一种结直肠癌诊断系统，其特征在于，所述的检测系统含有：
a)检测构件：所述的检测构件用以检测诊断对象的免疫球蛋白的表达量，所述免疫球蛋白包含IgD和/或IgE；
优选地，所述免疫球蛋白为IgD和IgE；
优选地，所述免疫球蛋白还包含IgG1，IgG3或IgA1中的一种或多种；
优选地，所述免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3；
优选地，所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3；
优选地，所述所述免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1；
b)结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的免疫球蛋白的表达量得出结肠直肠癌的患病的可能性或者风险值；
优选地，所述的检测构件包含酶标仪、激光扫描仪、流式细胞仪、液相色谱仪中的一种或几种；更优选地，所述的检测构件为激光扫描仪、酶标仪中的一种或两种；
优选地，所述的结果判断构件包含软件，其含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入免疫球蛋白的表达量；分析模块用于根据免疫球蛋白的表达量，分析出结肠直肠癌患病可能性或者风险值；输出模块用于输出分析模块的分析结果；
优选地，所述免疫球蛋白的表达量为免疫球蛋白的mRNA的表达量；或者蛋白的表达量；更优选为蛋白的表达量；
优选地，所述的诊断系统的诊断样品为血液样本；更优选血浆样本；
优选地，当免疫球蛋白为IgD时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgD蛋白表达量临界值的取值范围为1906.41pg/ml至6168.47pg/ml；
优选地，所述IgD蛋白表达量临界值取值为5842.19pg/ml；当IgD蛋白的表达量≤5842.19pg/ml，则结直肠癌低风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgD蛋白的表达量>5842.19pg/ml，则结直肠癌高风险；
优选地，当免疫球蛋白为IgE时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgE蛋白表达量临界值的取值范围为978.68pg/ml至1305.34pg/ml；
优选地，所述IgE蛋白表达量临界值取值为991.94pg/ml；当IgE蛋白的表达量≤991.94pg/ml，则结直肠癌高风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgE蛋白的表达量>991.94pg/ml，则结直肠癌低风险；
优选地，当免疫球蛋白为至少两个时，所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.7416；
优选地，当免疫球蛋白为IgD和IgE时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.00158CIgE+0.000131CIgD+1.474)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5920-0.6418；优选地，所述风险指数X的临界值为0.6039；
优选地，当免疫球蛋白为IgD、IgE和IgG3时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001602CIgE+0.000119CIgG3+0.0001CIgD+1.091)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5000-0.6762；优选地，所述风险指数X的临界值为0.5265；
优选地，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG1和IgG3时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001904CIgE+0.000273CIgG3+0.000107CIgD-0.000008CIgG1+2.047)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgG1为IgG1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.6231-0.6659；优选地，所述风险指数X的临界值为0.6280；
优选地，当免疫球蛋白为IgD、IgE、IgG3和IgA1时，所述风险指数X的计算方法为：X＝1/(1+e^(-(-0.001587CIgE+0.000212CIgG3+0.000110CIgD-0.000019CIgA1+2.769)))，所述CIgE为IgE的浓度，所述CIgG3为IgG3的浓度，所述CIgD为IgD的浓度，所述CIgA1为IgA1的浓度，所述浓度为检测样品稀释10000倍后的浓度，所述风险指数X的临界值取值范围为0.5933-0.7416；优选地，所述风险指数X的临界值为0.7374；
优选地，所述的检测试剂的检测结果为：当所述风险指数X≤临界值，则结直肠癌低风险；当所述风险指数X>临界值，则结直肠癌高风险。
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