CN102590511A - 基于igfbp-2自身抗体或其与igfbp-2联合的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒及应用 - Google Patents
基于igfbp-2自身抗体或其与igfbp-2联合的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了基于IGFBP-2自身抗体或其与IGFBP-2的联合的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，或者包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，以及IGFBP-2自身抗体的检测或其与IGFBP-2的联合检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明中IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤，和结直肠肿瘤I-IV级。
Description
技术领域
本发明涉及基于IGFBP-2自身抗体(IGFBP-2-Abs)的检测或其与IGFBP-2联合的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，以及IGFBP-2自身抗体的检测或其与IGFBP-2的联合检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用。具体而言，本发明中对IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，对IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤，和结直肠肿瘤I-IV级。
背景技术
手术切除是治疗早期肿瘤最有效的手段。然而因为肿瘤早期没有明显症状，且没有有效的早期肿瘤筛查方法，所以大多数肿瘤病人在就诊时已具有不可切除，不能治愈的肿瘤。医学影像和内视镜技术可能提高肿瘤的早诊，但是其高昂的费用和复杂的技术要求限制了它们的应用。然而，血液检测是早期筛查和诊断肿瘤的一种简便而经济实用的方法。
文献报道，恶性肿瘤患者能够产生对其肿瘤携带的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的自身抗体，因此，肿瘤相关抗原的自身抗体具有肿瘤诊断的价值，尤其在对早癌的诊断。因为外周血中肿瘤相关抗原的自身抗体出现能够在标准的临床检查前报道恶变的发生(1-4)。研究最多的是p53自身抗体(p53-Abs)。其已在临床诊断出肿瘤之前的患癌高危个体血清中检测到。例如：重度吸烟者和患有长期慢性阻塞性肺病的患者得肺癌之前(5)，巴雷特食管病人患食道癌之前(6)，具有口腔癌前病变的病人患口腔癌之前都能检测到p53自身抗体(7)。有肝硬化的病人在后来发展成肝癌之前，能检测到抗核自身抗体(8)。最近发现，抗annexin I，14-3-3theta和LAMR1 的自身抗体，在没有肺肿瘤状发生和临床确诊之前一年的高危患者血清中被检测到(9)。
胰岛素样生长因子结合蛋白-2(Insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2)是一种分泌性蛋白，其编码基因如基因ACCESSION NM_000597，VERSION NM_000597.2 GI：55925575所示。最近报道，IGFBP-2是一种肿瘤抗原，能够在乳腺癌，宫颈癌，和结肠癌患者体内诱导T细胞和B细胞免疫反应(10-11)。IGFBP-2在30％-80％的多种恶性肿瘤中过表达，如脑胶质瘤，结直肠肿瘤，前列腺癌，宫颈癌，乳腺癌，及甲状腺癌；而且IGFBP-2过表达程度与肿瘤级别相关(12-17)。IGFBP-2能促进癌细胞转移和侵袭，并且能通过调控PI3K/Akt/PTEN信号传导通路促进肿瘤发展(18-21)。常有报道外周血中IGFBP-2的浓度与恶性肿瘤的复发，转移和预后相关。但是，IGFBP-2在早癌患者血中浓度与正常人差别不大。因此，IGFBP-2诊断早癌不理想，如：脑胶质瘤(22-25)。
因此，目前需要发现敏感性和/或特异性更高、能够诊断早期肿瘤和/或能够诊断和监测肿瘤的发展的肿瘤检测标记物。
发明内容
本发明首次证明了IGFBP-2自身抗体(IGFBP-2-Abs)能够作为早期肿瘤诊断标志物、同时IGFBP-2-Abs和IGFBP-2联合检测能有效诊断各期肿瘤，监测肿瘤从低级别向高级别进展，即肿瘤的早、中、晚期，从而解决了上述问题。
本发明的一个目的在于提供基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
本发明的另一个目的在于提供基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。
其中，所述IGFBP-2自身抗体选自由抗IGFBP-2的IgG自身抗体、抗IGFBP-2的IgA自身抗体、抗IGFBP-2的IgM自身抗体、抗IGFBP-2的IgD自身抗体和抗IGFBP-2的IgE自身抗体组成的组，优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体和抗IGFBP-2 的IgM自身抗体，最优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体。
其中，所述第一试剂组包括使用通过常规间接ELISA法或短肽标签捕获ELISA法测定IGFBP-2自身抗体的试剂；所述第二试剂组包括通过直接ELISA法测定IGFBP-2的试剂。
其中，所述癌或肿瘤为胶质瘤或结直肠肿瘤。
在基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒中，所述早期肿瘤为星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤，或者为结直肠肿瘤I-II级，所述高级别腺瘤为高级别结直肠息肉。
在基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒中，所述肿瘤为星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤；或者为结直肠肿瘤I-IV级。
其中，所述样品选自由血液、血浆、血清、组织液、细胞间液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、淋巴液和唾液组成的组，优选选自由血液、血清、血浆、组织液和淋巴液组成的组，还更优选选自由血液、血清和血浆组成的组，最优选为血清。
本发明的又一目的在于提供IGFBP-2自身抗体的检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
本发明的还一个目的在于提供IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。
本发明中对IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤(例如星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤)及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，对IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤(即，胶质瘤II级)、间变星形细胞瘤(即胶质瘤III级)和/或胶质母细胞瘤(即，胶质瘤IV级)，以及结直肠肿瘤I-IV级。
附图说明
图1.血清抗IGFBP-2的IgG自身抗体。A-D，比较正常对照与肿瘤、脑胶质瘤 及其不同分期，结直肠息肉，结直肠肿瘤及其不同级别。血清IGFBP-2-Abs浓度的中值和四分位数的范围见箱线图。N，被试验者的数量；点，离群样本。肿瘤包括脑胶质瘤，结直肠息肉和结直肠肿瘤。CRC：结直肠肿瘤；A：星形胶质瘤；AA：间变星形胶质瘤；GBM：胶质母细胞瘤；Polyp：结直肠息肉。
图2.使用IGFBP-2-Abs建立的ROC曲线：用于辨别正常对照与肿瘤、胶质瘤及各期、结直肠肿瘤及各级别的结直肠肿瘤。肿瘤包括脑胶质瘤，结直肠息肉和结直肠肿瘤。
图3.血清IGFBP-2浓度比较：正常对照组与胶质瘤病人组(A)，结直肠息肉病人及结直肠肿瘤病人(B)。血清IGFBP-2的中值和四分位数的范围见箱线图。N，被试者的数量；点，离群样本。
图4.散点图和ROC曲线显示联合检测血清IGFBP-2和IGFBP-2-Abs辨别正常对照组和肿瘤病人(A)，正常对照组和胶质瘤病人(B)，及正常对照组和结直肠肿瘤病人(C)时的诊断价值。肿瘤病人包括胶质瘤，结直肠息肉和结直肠肿瘤病人。
图5.血清稀释度与450nm时的OD值之间的关系。间接ELISA检测一例IGFBP-2-Abs阳性的高级别息肉病人血清的IGFBP-2-Abs浓度。
图6.星形胶质瘤和高级别息肉组织的IGFBP-2表达免疫组化代表性结果(左)和免疫组化结果汇总(右)。A-C，星形脑胶质瘤；D-F，高级别息肉。阳性细胞被染成棕色。放大倍数：星形细胞瘤200倍，息肉100倍。实例表示IGFBP-2不表达(A，D)，低表达(B，E)和高表达(C，F)。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
本发明人发现，IGFBP-2的过表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，在高级别肿瘤中，IGFBP-2的浓度显著高于低级别肿瘤和正常对照组，即IGFBP-2的表达随着肿瘤的进展而升高，因此，IGFBP-2可用作中晚期肿瘤的诊断标志物；但与之相反，发明人意外地发现，在早期肿瘤患者的体液特别是血清、血液、血浆中，IGFBP-2-Abs浓度显著高于晚期肿瘤患者，即IGFBP-2-Abs随着肿瘤从早期(包括癌变前息肉，特别是高级别息肉和多发增生性息肉)到晚期进展呈下降的趋势，因此，IGFBP-2-Abs能够作为早中期肿瘤、特别是早期肿瘤诊断的标志物。由此对 IGFBP-2-Abs和IGFBP-2进行联合检测，能有效诊断各期肿瘤，监测肿瘤发展的各个阶段。
具体而言，如果检测的结果中IGFBP-2浓度显著高于预设阈值，且IGFBP-2-Abs呈阴性，则往往预示着中晚期肿瘤；如果IGFBP-2的检测值与预设阈值相当或略高，且IGFBP-2-Abs呈阳性，则往往预示着早期肿瘤；如果IGFBP-2显著高于预设阈值，且IGFBP-2-Abs呈阳性，则往往预示着中期肿瘤。阴性、阳性以及检测值的高低可以基于预设阈值而确定，预设阈值可以利用取正常对照的平均值，也可以由本领域技术人员基于具体肿瘤根据具体要求进行设定，通常而言，预设阈值越高，检测的敏感性越低，而检测的特异性越高。
基于上述原理，形成了本发明。
本发明的一个目的在于提供一种诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤的方法，所述方法包括检测取自受试对象的样品中的IGFBP-2-Abs。
本发明的另一个目的在于提供一种诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展的方法，所述包括检测取自受试对象的样品中的IGFBP-2-Abs和IGFBP-2。
本发明的另一个目的在于提供一种监测肿瘤的复发的方法，所述方法包括检测取自受试对象的样品中的IGFBP-2-Abs和IGFBP-2。
本发明的另一个目的在于提供基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
本发明的另一个目的在于提供基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，并且所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。
本发明的又一目的在于提供IGFBP-2自身抗体的检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
本发明的还一个目的在于提供IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测在诊断肿瘤以及制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断 不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤从低级别向高级别的进展。
定义
“检测”的含义包括定量检测和定性检测。定性检测的实例包括仅仅测定IGFBP-2自身抗体和/或IGFBP-2是否存在，测定确定IGFBP-2自身抗体和/或IGFBP-2是否大于基线水平，以及测定比较测试样品与另一个样品(例如，对照样品)中IGFBP-2自身抗体和/或IGFBP-2的水平。定量检测的实例包括测定IGFBP-2自身抗体和/或IGFBP-2的浓度和/或水平。
“测试样品”取自生物体例如哺乳动物，进一步优选取自于人。测试样品的实例包括血液、血浆、血清、组织液、细胞间液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、淋巴液和唾液，优选包括血液、血清、组织液、血浆和淋巴液，还更优选包括血液、血清和血浆组成的组，最优选为血清。
“肿瘤”包括原发性癌和转移性癌。举例而言，本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒能够诊断的肿瘤包括，但不限于结直肠肿瘤、胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、子宫内膜癌、胆道癌、肾癌、尿道癌、颈癌、甲状腺癌、脑癌、口癌、子宫癌、腹癌、舌癌、肛门癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、黑素瘤和肉瘤。这些肿瘤，可以在其发展的各个期间，包括第一阶段和第二阶段被诊断出来。本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒可以区分患有肿瘤、患有良性瘤和未患肿瘤的个体。
“高级别腺瘤”为肠镜组织学检查结果显示病变组织带有绒毛状成分、大于或等于1厘米或高级别上皮内瘤变(dysplasia)。
本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒中对IGFBP-2-Abs的检测特别适用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，尤其是胶质瘤或结直肠肿瘤。举例而言，本发明的肿瘤诊断试剂或试剂盒特别适用于诊断鉴别星形胶质细胞瘤(即，胶质瘤II级)和/或间变星形细胞瘤(即胶质瘤III级)，或者高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I级、II级。IGFBP-2-Abs与IGFBP-2联合检测更能用于诊断不同级别的肿瘤(包括癌前息肉，特别是具有癌变风险的高级别息肉和多发增生性息肉)，监测肿瘤从低级别向高级别的进展。
“IGFBP-2自身抗体”或“IGFBP-2-Abs”是指肿瘤或肿瘤受试对象中产生的针对胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)的抗体，该自身抗体选自由抗IGFBP-2的IgG 自身抗体、抗IGFBP-2的IgA自身抗体、抗IGFBP-2的IgM自身抗体、抗IGFBP-2的IgD自身抗体和抗IGFBP-2的IgE自身抗体组成的组，优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体和抗IGFBP-2的IgM自身抗体，最优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体
检测方法和所用试剂
对于本发明的第一试剂组和第二试剂组没有特别限制，只要第一试剂组能够检测样品中胰岛素样生长因子结合蛋白-2自身抗体、第二试剂组能够检测样品中IGFBP-2即可。优选的是，所述第一试剂组包括使用通过常规间接ELISA法或短肽标签捕获ELISA法测定IGFBP-2自身抗体的试剂，所述第二试剂组包括通过直接ELISA法测定IGFBP-2的试剂。
以下举例而言分别对检测IGFBP-2自身抗体和IGFBP-2的方法进行描述，但所列举的方法仅是说明目的，并不意味着检测方法和试剂受这些实例的限制。
检测IGFBP-2自身抗体的方法
检测IGFBP-2自身抗体的方法不受特别限制，只要其能够检测IGFBP-2自身抗体即可。这些方法是本领域已知的，其中优选使用间接ELISA法和短肽标签捕获ELISA法。
间接ELISA法
间接ELISA法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体。
当使用间接ELISA法时，第一试剂组可以包括IGFBP-2蛋白(包括重组IGFBP-2蛋白)、用于建立标准曲线的IGFBP-2抗体(如人IgG及其它Ig抗体)、酶标记的抗IGFBP-2抗体(通常为酶标记的抗人IgG抗体或酶标记的抗其它Ig抗体)以及所述酶的底物。更具体而言，酶标记的抗IGFBP-2抗体可以为羊抗人IgG-辣根过氧化物酶，酶底物可以为四甲基联苯胺(TMB)。
短肽标签捕获ELISA法
当使用短肽标签捕获ELISA法时，第一试剂组可以包括带有各种短肽标记的重组IGFBP-2蛋白(如：his-IGFBP-2蛋白)、用于建立标准曲线的IGFBP-2抗体(如人IgG及其它Ig抗体)、抗各种短肽抗体(如：抗his标签的抗体)、酶标记的抗IGFBP-2抗体(通常为酶标记的抗人IgG抗体或酶标记的抗其它Ig蛋白抗体)以及所述酶的底物。
间接免疫荧光法
免疫荧光技术是将荧光素如异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(rhodamine，RIB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC)等与相应抗体(或抗原)以化学的方法结合，将荧光标记抗体(或抗原)与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在，根据已知的抗体(或抗原)即可推知另一个未知抗原(或抗体)的存在。
在检测本发明的IGFBP-2自身抗体时，通常使用间接免疫荧光法(IIF)，其原理是以荧光素标记抗球蛋白抗体，抗体与相应抗原结合后，荧光标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗体的存在。第一试剂组可以包括IGFBP-2蛋白(包括重组IGFBP-2蛋白)和荧光素标记的抗球蛋白抗体(通常为荧光素标记的抗人IgG抗体或荧光素标记的抗其它Ig蛋白抗体)。
检测IGFBP-2的方法
检测IGFBP-2的方法不受特别限制，只要其能够检测IGFBP-2自身抗体即可。这些方法是本领域已知的，其中优选使用直接ELISA法。
直接ELISA法
当使用直接ELISA法时测定IGFBP-2时，第二试剂组包括未标记和/或酶标记的抗IGFBP-2抗体、IGFBP-2蛋白或重组IGFBP-2蛋白及所述酶的底物。
直接免疫荧光法(DIF)
直接免疫荧光法是利用荧光素如异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明等标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以鉴定未知抗原。
当使用直接免疫荧光法时，第二试剂组包括荧光素标记的IGFBP-2抗体(如人IgG及其它Ig抗体)。
斑点杂交法(Dot blot assay)
将稀释的血清点在硝酸纤维膜上，用抗体和膜上的抗原杂交，分析斑点的亮度用ChemiDocXRS图像系统(Bio-Rad)，根据标准曲线计算抗原浓度。
有益效果
本发明中对IGFBP-2自身抗体的检测能够诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤，特别是能够诊断早中期胶质瘤(例如星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤)及具有癌变风险的高级别结直肠息肉和/或结直肠肿瘤I-II级，对IGFBP-2自身抗体与IGFBP-2的联合检测能够诊断不同级别的肿瘤和监测肿瘤从低级别向高级别进展的各个阶段，如能够诊断和鉴别星形胶质细胞瘤(即，胶质瘤II级)、间变星形细胞瘤(即胶质瘤III级)和/或胶质母细胞瘤(即，胶质瘤IV级)，以及结直肠肿瘤I-IV级。
实施例
以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这些实施例限制。
本发明实施例的概述如下。
研究病人和研究方法：使用脑胶质瘤和结直肠肿瘤为研究模型。检测了260个肿瘤病人(145个胶质瘤病人，45个结直肠息肉病人和70个结直肠肿瘤病人)的血清IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体浓度。使用ROC曲线来评估诊断能力。
研究结果：与正常对照组的血清IGFBP-2-Abs浓度(均值：11ng/ml，中值：0ng/ml，范围：0-212ng/ml)相比，血清IGFBP-2自身抗体浓度(IGFBP-2-Abs)在肿瘤中显著升高(均值：82ng/ml，中值：17ng/ml，范围：0-1387ng/ml)(P＜0.0001)，而且在早癌患者血清中其浓度更高，与血清IGFBP-2的浓度相反。IGFBP-2-Abs能够有效地区分正常对照与病理分级II和III级胶质瘤患者[AUC：0.821-0.864；95％置信区间(CI)＝0.762-0，936；P＜0.0001]，而且还能将正常对照与临床分期I和II期结直肠肿瘤有效地分开(AUC：0.668；95％CI＝0.566-0.770；P＝0.002)，同时还能预示有患结直肠肿瘤高风险的高级别结直肠息肉(AUC：0.72；95％CI＝0.630-0.811；P＜0.0001)。诊断病理分级II和III级胶质瘤的敏感度达到66％-84％，特异度达到81％。IGFBP-2和IGFBP-2-Abs联合检测分别提高了诊断各级别肿瘤(AUC：0.823)，脑胶质瘤(AUC：0.800)和结直肠肿瘤(AUC：0.917)诊断效率。
结论：我们的研究结果首次证实了IGFBP-2-Abs可以用于早癌的检测，且其与血清IGFBP-2联合检测能够提高肿瘤的诊断率。
下面对该实施例进行详细描述。
材料与方法
患者资料与样本
前瞻性收集401例血液样本。所有患者和正常对照者的血样收取均通过医院伦理委员会的批准、患者和正常者签署知情同意书。胶质瘤患者血清和肿瘤组织样本来源于2008-2010年北京天坛医院收治的患者，共计145例。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)脑胶质瘤分级标准，收集II级星形细胞瘤(Astrocytomas，As)78例、III级间变星形细胞瘤(Anaplastic astrocytomas，AAs)37例和IV级胶质母细胞瘤(Glioblastomas，GBMs)30例。健康人对照(141例)、结直肠息肉(45例：9例多发增生性息肉、7例非高级别腺瘤和29例高级别腺瘤)和结直肠癌血清样本(70例：38例I-II期结直肠癌，32例III-IV期结直肠癌)取自北京世纪坛医院2009-2010年收治的患者。为避免入组时选择性的偏见，凡是未有患癌历史的健康人和新诊断的原发脑胶质瘤、结直肠息肉和结直肠癌患者均可纳入研究对象。
抽取餐前的正常人和餐前、手术前或肠镜检查前的患者血液样本，3,000rpm离心10分钟，上层血清分装并保存在-70℃冰箱直到使用。高级别腺瘤定义为肠镜组织学检查结果显示病变组织带有绒毛状成分、大于或等于1厘米或高级别上皮内瘤变(Dysplasia)。
63例星形细胞瘤组织和32例高级别息肉(23例高级别腺瘤和9例多发增生性息肉)分别来源于手术和肠镜检的病变组织，随后对组织标本进行福尔马林固定、石蜡包埋及免疫组化分析。
间接ELISA法测定血清中抗IGFBP-2的IgG自身抗体
血清中抗IGFBP-2的IgG自身抗体用间接ELISA法检测。实验主要流程是：用50mM碳酸缓冲液(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)稀释的1.0ug/ml重组人IGFBP-2蛋白(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)包埋具有超高效结合表面的immulon 4HBX免疫微量滴定板(Dynex Technologies，Inc.，Chantilly，VA)，空白对照组用碳酸缓冲液包埋，每孔50ul。滴定板的最后两列加入做一系列稀释的人IgG抗体(浓度：25，100，250，500，1,000ng/ml)(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)用于建立标准曲线。根据不同的人IgG抗体的浓度(25ng/ml-1,000ng/ml)，计算出该检测方法对应的的变异系数为0.0998-0.012。
用磷酸盐缓冲液(PBS)中制备的5％牛血清白蛋白液(BSA)封板，每孔加入50ul，室温下封闭2小时。随后用用PBS稀释的0.1％吐温-20清洗4次，然后向每孔加入50ul用1％BSA/PBS稀释的血清((1/10稀释)，轻轻振荡后室温温育2小时。清洗4次后，每孔加入50ul稀释度为1∶30,000的羊抗人IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)室温温育1小时。清洗4次后，每孔加入100ul四甲基邻苯胺(TMB)(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)显色，在波长640nm下读数。当250ng/ml标准品的O.D读数达到0.35时，向每孔加入100ul1N盐酸(HCl)终止反应，立刻在波长为450nm处读数。血清O.D值的计算方法为重组人IGFBP-2蛋白包埋孔的O.D值减去用碳酸盐缓冲液包埋孔的O.D值。根据标准曲线计算血清中IGFBP-2自身抗体的浓度。每份样品重复两孔，样本重复检测两次。
可溶性的IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体可能在血清中形成复合物，有可能影响IGFBP-2自身抗体的检测。但是发生的可能性很小，因为抗体在可溶性和固定化抗原都存在的情况下，与固定化抗原形成更加稳定的复合物，尤其是在血清稀释后。为排除可溶性的IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体在血清中形成复合物的可能性，我们用一例间接ELISA法测得的IGFBP-2自身抗体阳性的息肉患者的血清做稀释度实验。将血清进行一系列浓度的稀释(1/10，1/50，1/100，1/200)，检测O.D值，结果显示稀释度和O.D值之间有负相关的线性关系(参见图5)，表明血清中存在的IGFBP-2蛋白对IGFBP-2自身抗体的检测没有影响。根据稀释度实验的结果，间接ELISA法检测IGFBP-2自身抗体的敏感度可达2ng/ml。
直接ELISA法测定血清IGFBP-2
血清IGFBP-2用商业化的抗IGFBP-2多克隆抗体预包被的IGFBP-2ELISA板检测(RapidBio Lab，Calabasas，CA，USA)，实验方法参见公司说明，同我们以前报道(22)。IGFBP-2标准品的浓度分别为0，2.5，10，25，50，and 100ng/ml，用来构建标准曲线。该实验方法检测的灵敏度可达2.5ng/ml。待检血清40倍稀释，每份样品重复两孔，样本重复检测两次。IGFBP-2均值用于统计分析。
免疫组化分析
IGFBP-2免疫组化的实验方法同我们以前报道(22)。肿瘤组织切片用IGFBP-2 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)免疫组化染色。选取5个深染区域确定IGFBP-2表达阳性细胞率。0代表没有阳性细胞，+代表阳性细胞率＜30％，++代表阳性细胞率31-60％，+++代表阳性细胞率＞60％。
统计分析
统计分析使用SPSS 13.0软件完成。正常人和患者数据用方差检验的分析方法。健康对照和患者的IGFBP-2自身抗体和血清IGFBP-2蛋白水平的差异用标准非参数Mann-Whitney U检验。血清IGFBP-2抗体水平和临床参数(如年龄、性别、肿瘤级别等)的相关性采用单变量线性回归分析。单或多变量Cox regression分析和Kaplan-Meier plotting分析IGFBP-2抗体和抗原与预后的相关性。ROC曲线分析用来确定血清IGFBP-2抗体和抗原单独诊断肿瘤和预测预后的特异性和敏感性，曲线下方的面积(AUC值)用卡方检验分析。随后的multi-sensor神经网络分析及ROC分析用来评估血清IGFBP-2抗体和抗原联合诊断肿瘤和预测预后的特异性和敏感性。血清IGFBP-2抗体水平与肿瘤组织IGFBP-2表达水平和与免疫因子血清水平的相关性采用Pearson相关性分析。P值小于0.05认为具有统计学意义。
结果
肿瘤患者血清IGFBP-2-Abs浓度升高，且早期高于晚期
各实验组的基本信息汇总于表1.由于入组策略的原因，不同实验组在性别和年龄的分布存在差异。但是，通过回归分析我们发现性别和年龄的分布差异并不明显地影响不同实验组血清IGFBP-2-Abs浓度(见表1)，说明不同实验组间血清IGFBP-2-Abs浓度差异不是由性别和年龄的差异引起。
表1
我们发现，与对照组正常人(Control)的血清IGFBP-2-Abs的浓度(均值：11ng/ml，中值：0ng/ml，范围：0-212ng/ml)相比，肿瘤组病人血清IGFBP-2-Abs浓度显著升高(均值：82ng/ml，中值：17ng/ml，范围：0-1387ng/ml)(P＜0.0001，图1A)。脑胶质瘤组(Glioma)(均值：128ng/ml，中值：24ng/ml，范围：0-1359ng/ml，P＜0.0001)，结直肠息肉组(Colorectal polyps)(均值：32ng/ml，中值：14ng/ml，范围：0-212ng/ml，P＜0.0001)和结直肠肿瘤组(CRC)(均值：22ng/ml，中值：1ng/ml，范围：0-161ng/ml，P＝0.001)的患者血清IGFBP-2-Abs浓度显著高于对照组血清IGFBP-2-Abs的浓度(图1B)。脑胶质瘤组IGFBP-2-Abs浓度明显高于结直肠息肉组和结直肠肿瘤组。
将脑胶质瘤组按照WHO2007-中中枢神经系统肿瘤分类标准进行分类和结直肠肿瘤组按照美国癌症联合会(AJCC)的分级标准进行分类，我们惊喜地发现早癌组病人的血清IGFBP-2-Abs浓度显著高于晚癌组(图1C-D)。星形胶质细胞瘤(A)病人(均值：171ng/ml，中值：25ng/ml)和间变星形细胞瘤(AA)(均值：120ng/ml，中值：46ng/ml)病人的血清IGFBP-2-Abs浓度显著高于胶质母细胞瘤(GBM)病人组(均值：23ng/ml，中值：0ng/ml)(A：P＝0.001，AA：P＜0.0001)和正常对照组(P＜0.0001for A and AA)，但是在GBM病人组和正常对照组之间，血清IGFBP-2-Abs浓度仅有微小的变化(P＝0.064)(图1C)。同样地，结直肠息肉病人(polyps)组(均值：32ng/ml，中值：14ng/ml)和结直肠肿瘤I-II级(CRCI-II)病人组(均值：30ng/ml，中值：5ng/ml)的血清IGFBP-2-Abs浓度高于结直肠肿瘤III-IV级(CRC III-IV)病人组(均值：17ng/ml，中值：0ng/ml)(polyps：P＜0.0001；CRCI-II：P＝0.089)和正常对照组(polyps和CRC I-II：P＜0.0001)。但是在CRCIII-IV病人组和正常对照组之间，血清IGFBP-2-Abs浓度没有差别(P＝0.135)(图1D)。
血清IGFBP-2-Abs作为诊断早癌的生物标志物
我们采用血清IGFBP-2-Abs的浓度进行ROC曲线分析，用于分辨病人和正常人。使用血清IGFBP-2-Abs作为诊断生物标志物来诊断所有肿瘤病人、脑胶质瘤病人和结直肠肿瘤病人，其AUC值分别是0.729(95％CI＝0.679-0.779；P＜0.0001)、0.783(95％CI＝0.729-0.836；P＜0.0001)和0.632(95％CI＝0.550-0.774；P＝0.002)(图3A-D)。按肿瘤级别对脑胶质瘤分类后，使用血清IGFBP-2-Abs诊断不同级别胶质瘤病人时，诊断A、AA和GBM的AUC值分别是0.82(95％CI＝0.762-0.880；P＜0.0001)、0.864(95％CI＝0.792-0.936；P＜0.0001)和0.583(95％CI＝0.464-0.701；P＝0.156)(图3E)，表明与诊断GBM相比，血清IGFBP-2-Abs能够更准确地诊断A和AA。
按肿瘤分期标准对CRC分类后，血清IGFBP-2-Abs诊断CRC I-II和CRCIII-IV时的AUC值分别是0.668(95％CI＝0.566-0.770；P＝0.002)和0.590(95％CI＝0.477-0.703；P＝0.113)(图3I)，这说明血清IGFBP-2-Abs在一定程度上能诊断CRC I-II，但是不能诊断CRC III-IV。而诊断polyps时，AUC值是0.72(95％CI＝0.630-0.811，P＜0.0001)(图3I)，揭示polyps中存在部分有发展成CRC的高风险患者。
血清IGFBP-2-Abs浓度的阈值设定成11ng/ml时(正常对照的均值)，诊断A的敏感度是66％，特异度是81％，阳性预测值和阴性预测值分别是65％和81％；诊断AA时，敏感度是81％，特异度是81％，阳性预测值和阴性预测值分别是53％和94％；诊断CRC I-II时，敏感度是40％，特异度是81％，阳性预测值和阴性预测值分别是39％和83％。当血清IGFBP-2-Abs浓度的阈值设定成130ng/ml时，诊断A的敏感度是25％，特异度是99％，阳性预测值和阴性预测值分别是91％和71％；诊断AA时，敏感度是32％，特异度是99％，阳性预测值和阴性预测值分别是86％和85％。
血清IGFBP-2和血清IGFBP-2-Abs联合检测提高肿瘤诊断效率
前面已经提及，IGFBP-2的过表达与肿瘤的恶性程度呈正相关(12-17)。因此，我们也检测了401例血清中IGFBP-2的浓度。发现在高级别肿瘤中，IGFBP-2的浓度显著高于低级别肿瘤和正常对照组(胶质瘤组：P＝＜0.005；polyp组和CRC组：P ＜0.0001)(图3A-B)。因为IGFBP-2在肿瘤的发生和发展中起着非常重要的作用，那么，血清IGFBP-2和IGFBP-2-Abs联合检测应该能提高肿瘤的诊断率。
如图4所示，血清IGFBP-2和IGFBP-2-Abs联合检测有效地把被实验者分成三组：一组IGFBP-2和IGFBP-2-Abs的浓度都较低，二组IGFBP-2-Abs的浓度高，三组IGFBP-2的浓度高。ROC曲线分析表明将血清IGFBP-2和IGFBP-2-Abs联合检测时，其诊断肿瘤(AUC：0.823；95％CI＝0.78-0.866)(图4A)，胶质瘤(AUC：0.800；95％CI＝0.749-0.852)(图4B)和CRC(AUC：0.917；95％CI＝0.870-0.964)(图4C)的能力大大提高；而单独检测IGFBP-2或IGFBP-2-Abs时，其诊断能力要小很多：诊断肿瘤(AUC：0.672or 0.730)，诊断胶质瘤(AUC：0.551or 0.784)以及诊断CRC(AUC：0.916or 0.622)。
星形胶质细胞瘤和高级别结直肠息肉病人血清IGFBP-2-Abs与其肿瘤组织IGFBP-2表达的关系
血清抗IGFBP-2的自身抗体的存在应该反映患者对其肿瘤组织中IGFBP-2过表达产生的抗体免疫反应，特别是具有相对较强免疫能力的早癌病人。因此，我们采用免疫组化检测了IGFBP-2在63例星形胶质细胞瘤和32例高级别结直肠息肉组织中的表达(图6)。图6中免疫组化结果汇总于表2和表3。
表2星形胶质细胞瘤的免疫组化结果
| 表达 | 无 | 低 | 高 | 非常高 | |
| 强度 | 0 | + | ++ | +++ | 数量 |
| 数量 | 17 | 29 | 13 | 4 | 63 |
高(非常高+高)表达：27％；低表达：46％
表3高级别息肉组织的免疫组化结果
| 表达 | 无 | 低 | 高 | 非常高 | |
| 强度 | 0 | + | ++ | +++ | 数量 |
| 数量 | 14 | 7 | 7 | 4 | 32 |
高(非常高+高)表达：34％；低表达：22％
我们发现，73％(46/63)的星形胶质细胞瘤表达较低水平(46％)到较高水平(27％)的IGFBP-2。在这46例中，71％(33/46)的患者血清IGFBP-2-Abs浓度高于前面设定的阈值(11ng/ml)。相似地，56％(18/32)的高级别大结直肠息肉表达较低(22％)到较高(34％)水平的IGFBP-2。在这18例表达IGFBP-2的病人中(7例高级别结直肠腺瘤和9例多发增生性息肉)，50％(9/18)的IGFBP-2-Abs浓度高于前面设定的阈值(11ng/ml)。
讨论
IGFBP-2在30％-80％的多种恶性肿瘤中过表达(12-17)，而过表达IGFBP-2预示患者预后差(22-25)，表明诊断IGFBP-2过表达的恶性肿瘤的必要性。本研究首次报道血清IGFBP-2-Abs诊断早期脑胶质瘤和结直肠肿瘤，甚至可能预测癌变前息肉及与血清IGFBP-2联合检测诊断不同级别肿瘤的价值。
星形脑胶质瘤是一种弥散、侵润性低级别脑胶质瘤(LGGs)，比其他两种侵润性低级别LGGs(少枝胶质细胞瘤，oligodendrogliomas，和少枝星形胶质细胞瘤，oligoastrocytomas)的恶性程度更大(27)。核磁共振成像(MRI)仍是诊断临床症状出现的星形脑胶质瘤的标准方法，但是大多数病人最初并没有临床症状表现。我们在星形脑胶质瘤病人血清检测到IGFBP-2-Abs的发现表明了采用血清检测手段检测血清IGFBP-2-Abs用于诊断星形胶质瘤的潜力。而且，在间变星形胶质细胞瘤患者血清中，IGFBP-2-Abs浓度继续升高，因此，检测IGFBP-2-Abs还可能用来监测星形脑胶质瘤向间变星形脑胶质瘤的进展。在胶质母细胞瘤病人血清中IGFBP-2-Abs浓度降低，这可能是由于这类病人增加的免疫抑制所造成。
超过95％的结直肠肿瘤是由腺瘤性息肉发展而来，而且高级别腺瘤和多发增生性息肉有更大的恶性潜能(28-29)。本研究发现IGFBP-2-Abs浓度在结直肠息肉病人血清中显著高于正常对照。50％的高级别息肉组织表达从低到高的IGFBP-2，而这些患者血清的IGFBP-2-Abs的浓度都高于11ng/ml阈值(正常对照组IGFBP-2-Abs浓度均值)。这一发现表明，IGFBP-2-Abs不仅能用来诊断早期脑胶质瘤，而且还可能预示癌前病变的高级别腺瘤和多发增生性息肉。
我们的结果显示，尽管结直肠肿瘤病人血清IGFBP-2浓度高于胶质瘤病人，但是胶质瘤病人的血清IGFBP-2-Abs浓度明显高于结直肠肿瘤病人。这说明与结直肠肿 瘤相比，脑胶质瘤表达的IGFBP-2具有更好的免疫原性。这一现象可能与肿瘤的微环境和肿瘤细胞诱发的免疫抑制机制相关(30)，也可能是不同肿瘤相关抗原在不同类型的肿瘤发展中所起的作用不同而造成的。P53自身抗体在乳腺癌，结肠癌，口腔癌，肺癌和胃癌中被报道存在，并与高级别肿瘤和较差预后相关(31)。但是，p53自身抗体在III和IV级胶质瘤病人的血清中却不存在(32)。这可能是由于血脑屏障和p53蛋白主要是细胞内定位所造成，然而分泌性的IGFBP-2蛋白更可能被免疫系统识别。
使用肿瘤相关抗原的自身抗体诊断肿瘤时，相对较低的敏感度是大家主要关注的问题(31)。在我们的星形胶质瘤病例中，73％的病人过表达IGFBP-2，其中，71％的病人血清的IGFBP-2-Abs浓度高于11ng/ml，提示IGFBP-2-Abs能有效地诊断大多数星形胶质瘤病例。肿瘤相关抗原的自身抗体的特异性一般较高，这是因为在正常人中这样的自身抗体几乎不存在，使得其能够成为诊断肿瘤的可依赖的生物标志物(31)。IGFBP-2-Abs的阈值设为11ng/ml和130ng/ml时，诊断星形胶质瘤的特异性分别是81％和99％。我们的文献检索发现，除了肿瘤以外还没有在其他疾病中发现IGFBP-2过表达的一致报道。
我们以前报道在胶质母细胞瘤病人肿瘤切除后，血浆IGFBP-2浓度降低，但是复发后，IGFBP-2浓度重新升高(22)。因此，将血清IGFBP-2和IGFBP-2-Abs结合检测不仅能增强对不同级别肿瘤的诊断能力，而且还能用来监测肿瘤的复发和进展。
综上所述，我们首次提供IGFBP-2-Abs能够作为早癌诊断标志物、同时IGFBP-2-Abs和IGFBP-2联合检测能有效诊断各期肿瘤的实验证据。
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Claims (10)
1.基于IGFBP-2自身抗体的检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
2.基于IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒包括能够检测样品中IGFBP-2自身抗体的第一试剂组和能够检测样品中IGFBP-2的第二试剂组，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。
3.如权利要求1或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述IGFBP-2自身抗体选自由抗IGFBP-2的IgG自身抗体、抗IGFBP-2的IgA自身抗体、抗IGFBP-2的IgM自身抗体、抗IGFBP-2的IgD自身抗体和抗IGFBP-2的IgE自身抗体组成的组，优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体和抗IGFBP-2的IgM自身抗体，最优选为抗IGFBP-2的IgG自身抗体。
4.如权利要求1或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一试剂组包括使用通过常规间接ELISA法或短肽标签捕获ELISA法测定IGFBP-2自身抗体的试剂；所述第二试剂组包括通过直接ELISA法测定IGFBP-2的试剂。
5.如权利要求1或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤为胶质瘤或结直肠肿瘤。
6.如权利要求1所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述早期肿瘤为星形胶质细胞瘤和间变星形细胞瘤，或者为结直肠肿瘤I-II级，所述高级别腺瘤为高级别结直肠息肉。
7.如权利要求2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤为星形胶质细胞瘤、间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤；或者结直肠肿瘤I-IV级。
8.如权利要求1或2所述的肿瘤诊断试剂或试剂盒，其特征在于，所述样品选自由血液、血浆、血清、组织液、细胞间液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、淋巴液和唾液组成的组，优选选自由血液、血清、血浆、组织液和淋巴液组成的组，还更优选选自由血液、血清和血浆组成的组，最优选为血清。
9.IGFBP-2自身抗体的检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述诊断试剂或试剂盒用于诊断早期肿瘤或具有癌变风险的高级别腺瘤。
10.IGFBP-2和IGFBP-2自身抗体的联合检测在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肿瘤诊断试剂或试剂盒用于诊断不同级别的肿瘤和/或监测肿瘤的进展。
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