CN110658275B - 一种用于检测2’-羟基金雀异黄素的前处理用三元复合磁性材料的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测2’‑羟基金雀异黄素前处理用的三元复合磁性材料的制备方法及应用。该三元复合磁性材料由亲水化处理的黄曲霉菌丝球吸附氧化石墨烯水溶液复合氧化石墨烯后,再与铁的前驱物经水热反应得到。所制备的三元复合材料具有磁性,可以用于检测2’‑羟基金雀异黄素的前处理。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料与纳米技术领域,具体涉及一种三元复合磁性材料的制备方法及其应用。
背景技术
大豆因为富含可抵抗人类癌症、降低心血管风险的异黄酮类化合物,而被受人们青睐。金雀异黄素又称染料木素,是常见的异黄酮类化合物中的一种。不少研究表明,金雀异黄素可以通过多种信号通路发挥作用,抑制如前列腺癌等癌症。此外,金雀异黄素也是其他复杂的杂环类天然产物生物合成与代谢的重要中间体。2’-羟基金雀异黄素是大豆合成异黄酮类化合物的重要中间体,对其低剂量的检测方法研究是研究植物体内黄酮类化合物合成、代谢及环境因子对黄酮类化合物合成影响的基础。但是目前关于植物性农产品中检测2’-羟基金雀异黄素的研究不多,主要是其含量不高,提取率不高,开发可用于检测2’-羟基金雀异黄素的前处理材料与应用对开发相关检测方法、探究黄酮类化合物合成、代谢途径具有重要意义。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种可用于检测2’-羟基金雀异黄素的前处理用三元复合磁性材料的制备方法,以及提供一种实施有效、可行的应用该材料进行2’-羟基金雀异黄素前处理的方法。
提供一种用于检测2-羟基金雀异黄素的前处理用三元复合磁性材料的制备方法,包括以下步骤:
步骤(1):将黄曲霉真菌孢子培养得到黄曲霉菌菌丝球;
步骤(2):将上述制备的黄曲霉菌丝球经亲水化处理;
步骤(3):将亲水化处理后的黄曲霉菌丝球转入氧化石墨烯水溶液中,搅拌或超声后振荡,待菌丝完全吸附氧化石墨烯后,过滤出菌球并用大量水冲洗去掉游离的氧化石墨烯片层至滤液成无色透明;
步骤(4):将步骤(3)得到的负载还原氧化石墨烯的菌球与铁的前驱物混合,以抗坏血酸作为还原剂水热法制备得到磁性复合纳米材料。
本发明的方法中,所述黄曲霉菌丝球的制备为:将黄曲霉真菌孢子加入灭菌后的液体培养基中,恒温摇床28℃下培养4-6d,过滤掉液体培养基,然后用大量水冲洗菌丝球,去掉残留的液体培养基。所述的培养基为液体沙氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基。
按上述方案,所述的亲水化处理为:将菌球与0.5M-1M的NaOH水溶液在室温下混合震荡12-24h,过滤出菌球,再重复与0.5M-1M的NaOH水溶液在室温下混合震荡12-24h,用大量去离子水洗至菌球滤液为中性,冷冻干燥即可。
按上述方案,所述的菌球在NaOH水溶液中的浓度2-5mg/mL。
按上述方案,亲水化处理的黄曲霉菌丝球与氧化石墨烯的质量比为25:4-10。
按上述方案,亲水化处理的黄曲霉菌丝球在最终水热体系中的浓度为3-3.5mg/mL。
按上述方案,步骤(3)的搅拌或超声时间为1-2h。
按上述方案,以三氯化铁或六水合三氯化铁和碳酸氢钠为原料,抗坏血酸为还原剂,水热反应合成负载还原氧化石墨烯的Fe3O4磁性菌球复合材料,三氯化铁或六水合三氯化铁以三氯化铁计量,所述负载氧化石墨烯的菌球:三氯化铁:抗坏血酸质量比为:1~1.2:4.86:0.6~1.0;水热反应条件为:140-160℃反应6-8h。抗坏血酸水溶液要现配现用。
上述碳酸氢钠的最佳用量为按三氯化铁:碳酸氢钠的质量比计为4.86:7.56,即两者摩尔比为理论摩尔比1:3,可使六水合三氯化铁或三氯化铁充分转化生成Fe(OH)3沉淀,在抗坏血酸作用下转化为Fe3O4磁性菌球。
按上述方案,水热反应完成后,将反应后的黑色菌球倒在尼龙纱布上进行洗涤,先水洗至溶液呈无色,用无水乙醇冲洗5次以上,再用去离子水冲洗5次以上,最后进行冷冻干燥。
上述用于检测2’-羟基金雀异黄素的前处理用三元复合磁性材料的应用,将上述三元复合磁性材料加入到样品提取液中混合10-30min后,磁分离去掉样品提取液,然后加入一定体积的甲醇溶液混合震荡5-10min,后经过磁分离,保留甲醇洗脱液,氮吹至尽干后复溶于流动相,即可上机检测。
按上述方案,所述的样品提取液为含有2’-羟基金雀异黄素的植物性农产品或植株体的甲醇水或乙醇水的提取液。
按上述方案,所述的样品提取液甲醇水或乙醇水溶液中,甲醇或乙醇的含量为15%以下;三元复合磁性材料在样品提取液中的浓度在0.5-1.5mg/mL之间;三元复合磁性材料在甲醇洗脱液中的浓度不高于5mg/mL即可。
提供一种用于检测2’-羟基金雀异黄素的前处理用三元复合磁性材料,为微球结构,包括由黄曲霉菌菌丝缠绕成的负载还原氧化石墨烯的黄曲霉菌菌丝球和均匀地分散在菌丝球上、尺寸均一的Fe3O4磁性纳米颗粒,其是由黄曲霉菌菌丝球经亲水化处理后吸附氧化石墨烯,然后水热反应负载磁性纳米颗粒而得。
所述Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为20nm左右(见图2D);所述的微球粒径为2-3mm(见图3c)。所述的黄曲霉菌菌丝球内部由菌丝构成,菌丝直径1.5-3μm,长度20μm以上(见图2E),菌丝表面附着有还原氧化石墨烯(见图2C)。
本发明与现有技术相比,其显著优点有:
(1)制备成本低廉,菌丝繁殖快,合成的三元复合材料原料易获得,制备条件耗能低,可以大规模制备。
(2)本发明提供的用于检测2’-羟基金雀异黄素的前处理用三元复合磁性材料具有微米级球结构,且在微米级球上负载了大量的磁性纳米颗粒,便于材料在富集过程中的收集,同时大量官能化处理后的菌丝表现出了对2’-羟基金雀异黄素的吸附能力,石墨烯负载协同提升了其对2’-羟基金雀异黄素的吸附能力,可以针对特定的目标物2’-羟基金雀异黄素进行富集和洗脱,可以用于微量的物质检测。
附图说明
图1是实施例1制备的亲水化处理的黄曲霉菌丝球、氧化石墨烯负载的黄曲霉菌丝球和三元复合磁性材料的XRD图,其中:a亲水化处理的黄曲霉菌丝球,b氧化石墨烯负载的黄曲霉菌丝球,c三元复合磁性材料;
图2是实施例1制备的黄曲霉菌丝球(A)、亲水化处理的黄曲霉菌丝球(B)、氧化石墨烯负载的黄曲霉菌丝球(C)及三元复合磁性材料不同放大倍数(D)和(E)的扫描电镜图(SEM)照片。
图3是实施例1制备的亲水化处理的黄曲霉菌丝球(a)、氧化石墨烯负载的黄曲霉菌丝球(b)、三元复合磁性材料(c)以及其在水中的照片(d)。
具体实施方式
实施例1
称取50g液体沙氏培养基溶于1000mL水中,混匀,于115℃的条件下灭菌20min。将纯化好的3.4408黄曲霉菌孢子液加入到40mL的沙氏培养基中,使得孢子液在终体积的浓度为105个/mL,28℃下摇床培养5d,用尼龙纱布过滤掉培养液,将纱布上的菌球浸泡在2.5%戊二醛磷酸缓冲液中1d,杀活菌,再用纱布滤出菌球,用大量水冲洗干净,冷冻干燥得到黄曲霉菌球(图2A)。
所述的黄曲霉孢子为购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的A.flavus3.4408。
将黄曲霉菌球浸泡在100mL的1M的NaOH水溶液中,室温下混合震荡24h,用尼龙纱布过滤出菌球,再重复NaOH处理一次,再用纱布滤出菌球,用大量去离子水洗至菌球滤液为中性,冷冻干燥,得到亲水化处理的黄曲霉菌丝球(图2B)。
称取1g亲水化处理的黄曲霉菌丝球与80mL的3mg/mL的氧化石墨烯水溶液超声1h后振荡3d,用尼龙纱布过滤出菌丝球,经过大量去离子水冲洗至滤液无水透明,以去掉多余的氧化石墨烯,将菌球冷冻干燥,得到氧化石墨烯负载的黄曲霉菌丝球(图2C)。
称7.5610gNaHCO3,用水定容至200mL,配成浓度为0.45M溶液,备用。称8.109gFeCl36H2O,用水定容至100mL,配成浓度为0.3M溶液,备用。称0.88g抗坏血酸用20mL水溶解,混匀,配成浓度为0.25M溶液,备用。称取1g亲水化处理的黄曲霉菌丝球与80mL的3mg/mL的氧化石墨烯水溶液超声1h后振荡3d,用尼龙纱布过滤出菌丝球,经过大量去离子水冲洗至滤液无水透明,以去掉多余的氧化石墨烯,将菌球直接转入100mL的0.3M FeCl3溶液中,摇床上震荡24h(28℃,180rpm),随后缓慢加入200mL的0.45M NaHCO3溶液,边滴边搅拌,加完以后搅拌2h,再缓慢加入20mL的0.25M抗坏血酸水溶液,边滴边搅拌,加完以后搅拌0.5h,将混合体系倒入2个200mL反应釜中,放入150℃烘箱反应8h,将反应后的黑色菌球倒在尼龙纱布上进行洗涤,先水洗至溶液呈无色,再用无水乙醇冲洗8次,再用去离子水冲洗8次,最后进行冷冻干燥,即得到三元复合磁性材料(图2D-E)。
图1显示亲水化处理的菌丝球和氧化石墨烯负载的菌丝球均呈现出无定型结构,制备的三元复合磁性材料的XRD的图谱显示出复合材料有晶体结构颗粒存在,其晶体结构与四氧化三铁的晶体衍射峰一致,表明三元复合磁性材料上负载的磁性颗粒为四氧化三铁。
图2中A图与B图对比可见通过氢氧化钠处理后,菌丝上的纤维素被部分破坏。C图可见氧化石墨烯片层负载在菌丝上,菌丝上呈现一层绸缎状的氧化石墨烯片层,即菌丝表面附着有还原氧化石墨烯。D图显示经过水热后,磁性颗粒四氧化三铁被均一负载在菌丝上的石墨烯上,表层呈现颗粒状,所述Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为20nm左右(见图2D),所述的黄曲霉菌菌丝球内部由菌丝构成,菌丝直径1.5-3μm,长度20μm以上(见图2E)。
图3显示未负载磁珠前的菌球直径大小在2mm左右,磁性菌球的直径大小在3mm左右。
实施例2
称量5mg的2’-羟基金雀异黄素用甲醇溶解到25mL溶液中,配成200μg/mL标准溶液,备用。取两个离心管,分别称量1g大豆加入0.5mL配好的200μg/mL的2’-羟基金雀异黄素甲醇标准溶液,静置30min,让甲醇挥发。然后加入15mL 70%的乙醇水,在50℃,水浴超声30min。同步操作一个不加标的样品提取液。将3个样品提取液分别离心后取各取1mL,分别加入6mL水,混匀后,分别称量1个10mg制备的三元复合磁性材料和一个10mg不负载石墨烯其他操作一样制备得到的磁性菌球分别加入2个加标样品提取液中,再称取1个10mg制备的三元复合磁性材料加入不加标的样品提取液中,涡旋混匀20min,磁分离去掉样品提取液,在剩余的磁性材料中各加入2mL的甲醇溶液混合震荡10min,再磁分离,将甲醇洗脱液氮吹至尽干后复溶于流动相,上液相质谱检测。加标大豆测的2’-羟基金雀异黄素含量扣减大豆样品中的2’-羟基金雀异黄素的含量,除以理论加标量(6.67ng)计算得到加标回收率,其中采用三元复合磁性材料的加标回收率为95.32%,不负载氧化石墨烯其他操作一样制备得到的二元磁性菌球的回收率为43.54%。
Claims (8)
1.检测2’-羟基金雀异黄素的前处理方法,其特征在于:将三元复合磁性材料加入到含有2’-羟基金雀异黄素的植物性农产品或植株体的甲醇水或乙醇水的提取液中,三元复合磁性材料在样品提取液中的浓度在0.5-1.5mg/mL之间,混合10-30min后,磁分离去掉样品提取液,然后加入一定体积的甲醇溶液混合震荡5-10min,后经过磁分离,保留甲醇洗脱液,氮吹至尽干后复溶于流动相,即可上机检测,
所述的三元复合磁性材料为微球结构,包括由氧化石墨烯负载的黄曲霉菌丝球和均匀地分散在黄曲霉菌丝球上、尺寸均一的Fe3O4磁性纳米颗粒,由黄曲霉真菌孢子培养得到的黄曲霉菌菌丝球经亲水化处理后吸附氧化石墨烯,然后将负载氧化石墨烯的菌球与铁的前驱物混合,以抗坏血酸作为还原剂水热反应负载Fe3O4磁性纳米颗粒而得,
所述的亲水化处理为:将菌球与0.5M-1M的NaOH水溶液在室温下混合震荡12-24h,过滤出菌球,再重复与0.5M-1M的NaOH水溶液在室温下混合震荡12-24h,用大量去离子水洗至菌球滤液为中性,冷冻干燥即可。
2.根据权利要求1所述的前处理方法,其特征在于:所述的样品提取液甲醇水或乙醇水溶液中,甲醇或乙醇的含量为15%以下;三元复合磁性材料在甲醇洗脱液中的浓度不高于5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的前处理方法,其特征在于:所述的三元复合磁性材料的制备方法包括以下步骤:
步骤(1):将黄曲霉真菌孢子培养得到黄曲霉菌菌丝球;
步骤(2):将上述制备的黄曲霉菌丝球经亲水化处理;
步骤(3):将亲水化处理后的黄曲霉菌丝球转入氧化石墨烯水溶液中,搅拌或超声后振荡,待菌丝完全吸附氧化石墨烯后,过滤出菌球并用大量水冲洗去掉游离的氧化石墨烯片层至滤液成无色透明;
步骤(4):将步骤(3)得到的负载氧化石墨烯的菌球与铁的前驱物混合,以抗坏血酸作为还原剂水热法制备得到磁性复合纳米材料。
4.根据权利要求3所述的前处理方法,其特征在于:所述黄曲霉菌丝球的制备为:将黄曲霉真菌孢子加入灭菌后的液体培养基中,恒温摇床28℃下培养4-6d,过滤掉液体培养基,然后用大量水冲洗菌丝球,去掉残留的液体培养基,所述的培养基为液体沙氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基。
5.根据权利要求1所述的前处理方法,其特征在于:所述的菌球在NaOH水溶液中的浓度2-5mg/mL。
6.根据权利要求3所述的前处理方法,其特征在于:亲水化处理的黄曲霉菌丝球与氧化石墨烯的质量比为25:4-10。
7.根据权利要求3所述的前处理方法,其特征在于:亲水化处理的黄曲霉菌丝球在最终水热体系中的浓度为3-3.5mg/mL。
8.根据权利要求3所述的前处理方法,其特征在于:以三氯化铁或六水合三氯化铁和碳酸氢钠为原料,抗坏血酸为还原剂,水热反应合成负载还原氧化石墨烯的Fe3O4磁性菌球复合材料,三氯化铁或六水合三氯化铁以三氯化铁计量,所述负载氧化石墨烯的菌球:三氯化铁:抗坏血酸质量比为:1~1.2:4.86:0.6~1.0。
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