CN110658268A - 同时检测血斑中多种乙醇非氧化代谢物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属司法鉴定领域，涉及一种同时检测血斑中多种乙醇非氧化代谢物的方法，本方法对血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物同时进行定性和定量分析，其主要包括血液样品预处理，将人血液检材滴于

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Description

同时检测血斑中多种乙醇非氧化代谢物的方法

技术领域

本发明属司法鉴定领域，涉及同时检测血斑中多种乙醇非氧化代谢物的方法，尤其是一种同时测定血斑中4类共计10种乙醇的非氧化代谢物的方法。

背景技术

乙醇非氧化代谢物是判断乙醇摄入的可靠标志物，目前已被研究人员证实可用于判断近期及较长时间内的饮酒行为，以及区分尸体血液中所检测到的乙醇来源于生前饮酒还是死后腐败。血液是司法鉴定中最为常用的生物样本，在前期研究中，本研究团队已建立人血液中四类乙醇非氧化代谢物同时检测的方法。然而，实践显示，在样本的保存过程中，尤其是尸体血液样本的保存中，受血液中微生物的干扰，常会出现各乙醇非氧化代谢物不稳定的情况。文献表明，在室温条件下保存，血液中脂肪酸乙酯(FAEE)含量会明显增加，而血液中磷脂酰乙醇(PEth)在-20℃条件下保存有自发生成现象。

有研究将血液制备成血斑(DBS)进行检测，可弥补采用血液作为检测样本的不足，有效避免血液中微生物的干扰，提高待测物的稳定性，易于保存和运输；近年来，血斑在法医毒物检测方面的应用也越来越广泛。

目前，血斑中乙醇非氧化代谢物的检测，仅针对单种代谢物的分析(FAEE，PEth)或两种代谢物的同时分析(EtG和EtS)。然而，乙醇的各类非氧化代谢物具有不同的检测时限，如，乙基葡萄糖醛酸酯、乙基硫酸酯的检测时限大于18h；脂肪酸乙酯的检测时限长达24h；磷脂酰乙醇的检测时限大于1周，且根据其含量可对单次饮酒与长期饮酒做出区分；迄今，尚未有能够适用于血斑中4类乙醇非氧化代谢物同时检测的方法的文献报道，因而无法实现一次检测同时得到当事人饮酒时间和饮酒习惯等多方面的信息，直接影响到司法鉴定的效率。

因此，在司法鉴定领域，迫切需要建立一种分析方法，可以用于血斑中乙醇的4类非氧化代谢物的同时测定。基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种同时检测血斑中4类共计10种乙醇非氧化代谢物的方法。该方法旨在弥补单独检测乙醇非氧化代谢物所得信息量有限的问题，同时能够提高样品存储的稳定性，为司法鉴定中判断当事人是否摄入乙醇提供一种了准确可靠的新方法。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种同时检测血斑中多种乙醇非氧化代谢物的方法，尤其是一种能同时测定血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物的方法。

本发明所述代谢物包括乙基葡萄糖醛酸酯(EtG)、乙基硫酸酯(EtS)、十四酸乙酯(E14：0)、十六酸乙酯(E16：0)、十八酸乙酯(E18：0)、油酸乙酯(E18：1)、亚油酸乙酯(E18：2)、花生四烯酸乙酯(E20：4)、磷脂酰乙醇(16：0/18：1)和磷脂酰乙醇(18：1/18：1)。

本方法能弥补单独检测乙醇非氧化代谢物所得信息量有限的缺陷，同时能提高样品存储的稳定性，为司法鉴定中判断当事人是否摄入乙醇提供准确可靠的新方法。

具体的，本发明的同时检测血斑中多种乙醇非氧化代谢物的方法，对血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物(乙基葡萄糖醛酸酯(EtG)、乙基硫酸酯(EtS)、十四酸乙酯(E14：0)、十六酸乙酯(E16：0)、十八酸乙酯(E18：0)、油酸乙酯(E18：1)、亚油酸乙酯(E18：2)、花生四烯酸乙酯(E20：4)、磷脂酰乙醇(16：0/18：1)和磷脂酰乙醇(18：1/18：1))同时进行定性和定量分析，其主要包括步骤：

(1)血液样品预处理

将少量人血液检材(50μL)滴于

#903蛋白质保护纸上，室温下干燥2-3小时后，制备成血斑；放置于装有干燥剂的密封袋中，-20℃保存；

检测样品时，将血斑转移至加入10μL内标(含EtG-d5，EtS-d5，E14：0-d5及1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphopropanol各5μg/mL)的离心管中，随后加入甲醇500μL，浸泡1h随后轻摇30min，涡旋离心，取上清液吹干，200μL异丙醇复溶；

本发明的实施例中，将完整的血斑剪下并剪碎(6-8片左右)置于2mL离心管中。用500μL含有内标的甲醇溶液浸泡提取1小时，随后，轻度涡旋30min并置于高速离心机中离心(12000rpm，10min)，转移上清液于25℃条件下空气吹干，并用200μL异丙醇进行复溶，转移离心后上清液100μL于进样小瓶中进样5μL；

(2)采用液相色谱-质谱联用法测定血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物的浓度，

本发明的实施例中，采用的色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18 column(2.1mm×100mm，1.9μm)，柱温47℃。

本发明方法采用液相色谱-质谱联用法对血斑中4类共10种性质差异大的乙醇非氧化代谢物同时进行定性和定量分析，检测的灵敏度高、准确度均符合要求；

本发明同时对血斑保存的稳定性进行了考察，分别将制备成的血斑置于-20℃，4℃和室温(25℃)下保存，考察其在保存时间3d，7d，15d，30d，60d，90d的稳定性，结果显示，本方法能显著提高乙醇非氧化代谢物的稳定性，其中EtS和EtG在-20℃，4℃和室温3种储存温度下，其稳定性均能达到90天，PEth的稳定性可达到15天。

本发明中，所述的血液样品用量少，仅为50μL即可；前处理过程简便、快速，且将血斑作为检材，适用于实际检案中仅能够获得血斑的情况，易于操作和推广。

表1显示了检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰。

表1 检测目标物的色谱保留时间和质谱参数

注：粗体为定量离子对。

本发明方法对血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物进行定性和定量分析，结果准确、可靠，各化合物检测限、定量限及线性范围如表2所示，提取回收率在25-107％范围内，准确度在86-110％范围内，批内精密度的RSD值不超过11％，批间精密度的RSD值不超过10％。

表2 检测目标物的检测限、定量限及线性范围

本发明方法与现有技术的方法相比，具有以下明显优势：

(1)现有技术关于血斑中乙醇非氧化代谢物检测的方法仅针对单种或两种(EtG和EtS)代谢物的分析，本方法同时定性及定量分析血斑中乙醇的4类共10种非氧化代谢物，灵敏度和线性范围满足司法鉴定的要求。

(2)本方法使用的生物检材用量少且应用范围广，本方法采用50μL血液制备成血斑作为检材，在实际检案中，尤其是涉及到死亡的案例中，可以应对检材量非常有限的情况，本方法也适用于仅能获得血斑的实际案例。

(3)与在血液中相比，制成血斑后显著提高了乙醇非氧化代谢物的稳定性，其中血斑中EtS和EtG在-20℃，4℃和室温(25℃)下稳定性均达到90天(司法鉴定规定生物检材的保存期限一般为90天)，因而能够准确客观地反映采样当时乙醇非氧化代谢物的信息，保证司法鉴定结果的可靠性。

附图说明

图1显示了空白样品中添加4类10种乙醇非氧化代谢物标准品提取后进样的标准色谱图，其中，定量限浓度，从左至右，从上到下分别为：EtG、EtS、E14：0、E16：0、E18：2、E18：1、E18：0、E20：4、PEth16：0/18：1、PEth18：1/18：1。

图2显示了实测样品(血液中乙醇浓度为2.24mg/ml)4类(10种)乙醇非氧化代谢物提取后进样的标准色谱图，其中，从左至右，从上到下分别为：EtG、EtS、E14：0、E16：0、E18：2、E18：1、E18：0、E20：4、PEth16：0/18：1、PEth18：1/18：1。

具体实施方式

实施例1

色谱条件如下：

色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18column(2.1mm×100mm，1.9μm)；柱温：47℃；

流动相：5％乙腈-水(A相)；90％甲醇-水(0.1％甲酸)(B相)；甲醇(0.1％甲酸)(C相)；异丙醇(5mM醋酸铵)(D相)，梯度洗脱(见表3)，流速0.2mL/min；

进样量：5μL

表3显示了梯度洗脱条件；

表3 梯度洗脱条件

质谱条件：

ESI；喷雾电压：3.6kV(+)/2.8kV(-)；鞘气：35Arb；辅助气：10Arb；离子传输管温度：350℃；脱溶剂温度：300℃；

扫描方式：多反应监测(MRM)

检测目标物的色谱保留时间和质谱数据如表1所示；

样品处理：

将人血液检材(50μL)滴于

#903

蛋白质保护纸上，室温下干燥3h，制备成干血斑；

将完整的血斑剪下并剪碎(6-8片左右)置于2mL离心管中。用500μl含有内标的甲醇溶液浸泡提取1小时，随后，轻度涡旋30min并置于高速离心机中离心(12000rpm，10min)，转移上清液，25℃条件下空气吹干，并用200μl异丙醇进行复溶，进样5μL。

线性试验：

取混合标准系列工作液，加入空白人血液，涡旋混匀，制备成含待测物浓度分别为0.5，2，5，20，50，100，1000，5000，8000，10000ng/ml的血斑样品，按“样品处理”项下操作，制备标准曲线，并同时制备空白样品，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行回归运算，绘制标准曲线；

精密度和准确度试验：

分别取定量限浓度的混合标准溶液和低、中、高浓度的质控工作液，加入空白人血液，涡旋混匀，制备成含待测物浓度分别为定量限浓度及3个质控浓度的血斑样品，每批每个浓度配制5份，共做3批；按“样品处理“项下操作；根据每批的线性回归方程计算其实测浓度，计算每个浓度的准确度、批内和批间精密度，精密度以相对标准偏差(RSD)表示；

提取回收率试验：

配制含待测物浓度分别为低、中、高质控浓度的血斑样品各5份，按“样品制备”项下操作，记录样品及内标峰面积并计算均值AS1；另以空白血斑按“样品制备”项下操作所得空白基质液，加入混合标准工作液，配制成3个相同浓度，每个浓度平行配制5份，记录样品及内标峰面积并计算均值AS2，以AS1/AS2×100％计算提取回收率；

表4是血斑中待测物的批内和批间精密度、准确度及提取回收率的数据；

表4 血斑中待测物的批内和批间精密度、准确度及提取回收率的数据

检测结果表明，本发明方法同时定性及定量分析血斑中乙醇的4类共10种非氧化代谢物，灵敏度和线性范围满足司法鉴定的要求；所使用的生物检材用量少，50μL血液制备成血斑作为检材，可以应对检材量有限的情况，制成血斑后显著提高了乙醇非氧化代谢物的稳定性，其中血斑中EtS和EtG在-20℃，4℃和室温(25℃)下稳定性均达到90天，能够准确客观地反映采样的信息，保证司法鉴定结果的可靠性。

Claims (5)

1.一种同时检测血斑中多种乙醇非氧化代谢物的方法，其特征在于，该方法对血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物同时进行定性和定量分析，其主要包括步骤：

(1)血液样品预处理

将人血液检材滴于

#903

蛋白质保护纸上，室温下干燥2-3h，制备成血斑；

(2)采用液相色谱-质谱联用法测定血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物的浓度；采用的色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18 column(2.1mm×100mm，1.9μm)，柱温47℃；

所述血斑中4类共10种乙醇非氧化代谢物为：乙基葡萄糖醛酸酯(EtG)、乙基硫酸酯(EtS)、十四酸乙酯(E14：0)、十六酸乙酯(E16：0)、十八酸乙酯(E18：0)、油酸乙酯(E18：1)、亚油酸乙酯(E18：2)、花生四烯酸乙酯(E20：4)、磷脂酰乙醇(16：0/18：1)和磷脂酰乙醇(18：1/18：1)。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，血液检材为50μL。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，检测样品时，将血斑转移至加入10μL内标的离心管中，其中，含EtG-d5，EtS-d5，E14：0-d5及1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphopropanol各5μg/mL，随后加入甲醇500μL，浸泡1h后轻摇30min，涡旋离心，取上清液吹干，200μL异丙醇复溶；转移离心后上清液100μL于进样小瓶中进样5μL。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中对血斑保存的稳定性进行考察，分别将制成的血斑置于-20℃，4℃和室温(25℃)下保存，考察其在保存时间3d，7d，15d，30d，60d，90d的稳定性。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述血斑保存的稳定性为：其中EtS和EtG在-20℃，4℃和室温3种储存温度下，其稳定性能达到90天，PEth的稳定性达到15天。

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