CN110655575A - 一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用，其中弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体，是以弓形虫Actin氨基酸序列中C端227‑237为特异性较好的抗原决定簇肽段，获得弓形虫抗原决定簇多肽，进而制备的弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体。本发明设计的多肽抗原表位成分简单，引发的免疫反应针对性强，能特异性检测识别弓形虫Actin蛋白，主要在检测弓形虫蛋白的表达水平方面作为内参对照，能较为准确地确定目的蛋白的相对表达量；也可以通过免疫荧光对入侵细胞中的弓形虫进行定位，对其分子作用机制的进一步研究提供很大的帮助。

Description

一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。
背景技术
弓形虫是一种人兽间广为流行的胞内寄生原虫，其感染严重危害人类健康和畜牧业的发展。现有研究结果表明弓形虫的菱形体蛋白(rhomboids，ROMs)、肌动蛋白(Actin)和微线体蛋白(micronemeproteins，MICs)等多个分子参与入侵过程。
肌动蛋白Actin是一种重要的骨架蛋白，大致可分为六种，其中β-Actin广泛分布于各种组织中，大小在42kDa-43kDa之间，表达量丰富且相对恒定，是PCR的常用内参，其抗体是Western Blot很好的内参指数。
遗憾的是，由于Actin在不同物种之间高度保守，很难获得较好的针对特定物种的Actin抗血清，迄今尚没有商业化的弓形虫Actin抗体问世，在检测弓形虫蛋白的表达水平方面缺少内参对照，无法准确地确定目的蛋白的相对表达量，限制了对其分子作用机制的进一步研究。
发明内容
本发明旨在提供一种弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体及其应用，为弓形虫的入侵机制及入侵分子间的作用关系研究奠定基础。
本发明弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体，是以弓形虫Actin氨基酸序列中C端227-237为特异性较好的抗原决定簇肽段，获得弓形虫抗原决定簇多肽，进而制备弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体。具体包括如下步骤：
步骤1：通过分析弓形虫Actin氨基酸序列中的抗原表位，与人、小鼠、猴、鸡等物种的Actin氨基酸序列做同源性比对，确定C端227-237为特异性较好的抗原决定簇肽段，再在序列前加一个半胱氨酸C，偶联KLH，获得弓形虫抗原决定簇多肽；
步骤2：将1mg弓形虫抗原决定簇多肽溶于1ml无菌PBS缓冲液(pH值7.4)中，制备多肽溶液；取1ml多肽溶液加入2.5ml无菌注射针筒中，再加入1ml弗氏完全佐剂(第二次免疫和第三次免疫换为弗氏不完全佐剂)，于冰上反复推拉30min进行乳化，直至形成油包水滴(滴入水面不立即散开)；取两只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，免疫3-4次后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对多肽的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清；
步骤3：采用Protein G纯化，将步骤2所得抗血清与PBS缓冲液(pH值7.4)等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸缓冲液(pH值7.4)洗脱，即得到纯化抗体。
步骤1中，所述弓形虫抗原决定簇多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体的应用，是在特异性检测识别弓形虫Actin蛋白的过程中作为检测试剂使用。
本发明的有益效果体现在：
本发明采用生物信息软件，通过推断弓形虫Actin蛋白的序列，根据其亲水性、可塑性及抗原性等多参数预测的结果，设计的多肽抗原表位成分简单，引发的免疫反应针对性强，能特异性检测识别弓形虫Actin蛋白。主要在检测弓形虫蛋白的表达水平方面作为内参对照，能较为准确地确定目的蛋白的相对表达量；也可以通过免疫荧光对入侵细胞中的弓形虫进行定位，对其分子作用机制的进一步研究提供很大的帮助。
附图说明
图1为抗原表位同源性比对。从图1中可以看出该段抗原表位与人Actin同源性较低。
图2为抗体效价测定。从图2中可以看出获得了高效价单克隆抗体。
图3为抗体SDS-PAGE分析。从图3可见抗体纯化后纯度在85％以上。
图4为抗体Western Blot鉴定。左图为弓形虫Actin多抗，右图为小鼠Actin单抗。从图4中可以看出弓形虫Actin表位多克隆抗体能特异性识别弓形虫Actin蛋白，与人、小鼠、猴、鸡等物种的Actin无交叉反应。
图5为抗体Immunofluorescence鉴定。从图5中可以看出弓形虫Actin多克隆抗体能特异性识别弓形虫。
具体实施方式
1、利用在线软件BepiPred 1.0 Server分析Actin氨基酸序列中的抗原表位，确定C端227-237抗原决定簇肽段，再在序列前加一个半胱氨酸C，偶联KLH，公司合成。
Figure BDA0002232015680000021
2、动物免疫
将1mg弓形虫ROP18抗原决定簇多肽(连接KLH)溶于1ml无菌PBS缓冲液中，制备多肽溶液。取2.5ml无菌注射器两支，拔去针头，用输液管连接下端出口，然后将准备好的多肽溶液1ml加入针筒中，再加入1ml弗氏完全佐剂(第二次免疫和第三次免疫换为弗氏不完全佐剂)，于冰上反复推拉30min进行乳化，直至形成油包水滴(滴入水面不立即散开)。取两只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次。免疫3-4次后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对多肽的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。
3、抗体纯化
采用Protein G纯化，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
4、抗体鉴定
4.1纯化抗体间接ELISA效价检测
(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。
(2)用PBS包被液将多肽稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100μl，4℃冰箱过夜。
包被抗原；多肽
包被浓度；5μg/ml，100μl/孔
包被缓冲液；磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)
(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
(4)纯化抗体按1：500，2倍稀释，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。
(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗兔-HRP，1:5000。37℃恒温箱1h。
(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，向每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。
(7)每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。可见抗体效价在1:12800。
4.2利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定
抗体浓度：3.20mg/ml
体积：10ml
缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)
4.3抗体纯度鉴定
纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。可见抗体纯化后纯度在85％以上。
4.4抗体特异性鉴定
提取弓形虫(TgWH6)、人(HFF)、猴(Vero)、鸡(DF-1)、小鼠(RAW)细胞蛋白进行Western Blot，分别使用弓形虫Actin多抗和小鼠Actin单抗作为一抗孵育，通过对比鉴定弓形虫Actin多抗特异性。
5、抗体在免疫荧光中的应用
(1)取HFF细胞计数铺板，每孔约1x104个。
(2)4h后镜下观察发现细胞贴壁约70％，将新鲜取得的GFP-RH速殖子计数，每孔加速殖子约1x104个。
(3)24h后镜下观察到速殖子进入细胞内并形成纳虫泡，吸弃孔内培养液，PBS洗涤3次，每孔加200μl 4％多聚甲醛，4℃固定30min后，PBS洗涤三次，每次3min。
(4)每孔加400μl 0.2％TritonX-100，透膜后PBS洗涤3次，每次3min。
(5)每孔加200μl 5％山羊血清，37℃封闭1h后PBS洗涤3次，每次5min。
(6)用1％BSA将一抗稀释为1:200，每孔加200μl，4℃过夜孵育后PBS洗涤5次，每次3min。
(7)用1％BSA将二抗稀释为1:100，每孔加200μl，37℃孵育1h，PBS洗涤5次，每次3min。
(8)每孔加100μl DAPI染核5min，PBS洗涤5次，每次3min。
(9)制片观察。
由图5免疫荧光结果可以看出，弓形虫虫体被染成红色，抗体能与弓形虫Actin蛋白发生特异性反应，且与宿主细胞无明显交叉反应。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽医科大学
<120> 一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用
<130> 2019.09.04
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<400> 1
Glu Met Lys Ala Ala Glu Asp Ser Ser Asp Ile
1 5 10

Claims (4)

1.一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体，其特征在于：
是以弓形虫Actin氨基酸序列中C端227-237为特异性较好的抗原决定簇肽段，获得弓形虫抗原决定簇多肽，进而制备的弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体，其特征在于是通过包括如下步骤的方法制备获得：
步骤1：通过分析弓形虫Actin氨基酸序列中的抗原表位，与人、小鼠、猴、鸡等物种的Actin氨基酸序列做同源性比对，确定C端227-237为特异性较好的抗原决定簇肽段，再在序列前加一个半胱氨酸C，偶联KLH，获得弓形虫抗原决定簇多肽；
步骤2：将1mg弓形虫抗原决定簇多肽溶于1mlpH值7.4的无菌PBS缓冲液中，制备多肽溶液；取1ml多肽溶液加入2.5ml无菌注射针筒中，再加入1ml弗氏完全佐剂，于冰上反复推拉30min进行乳化，直至形成油包水滴；取两只2-2.5kg的新西兰白兔，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，免疫3-4次后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对多肽的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清；
步骤3：采用Protein G纯化，将步骤2所得抗血清与pH值7.4的PBS缓冲液等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用pH值7.4的甘氨酸缓冲液洗脱，即得到纯化抗体。
3.根据权利要求2所述的弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体，其特征在于：
步骤1中，所述弓形虫抗原决定簇多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.权利要求1、2或3所述的弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体的应用，其特征在于：所述弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体在特异性检测识别弓形虫Actin蛋白的过程中作为检测试剂使用。
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