CN110650957B - 5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基化合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了式I化合物或其可药用盐，以及式I化合物用于治疗神经变性疾病和病症例如阿尔茨海默氏病的用途。

Description

5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基化合物

本发明涉及新的5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基化合物，包含该化合物的药物组合物，使用该化合物治疗生理学障碍的方法，以及用于合成该化合物的中间体和方法。

本发明属于治疗阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹(PSP)和其他涉及tau介导的神经变性的疾病和病症(统称为tau病变)的领域。

阿尔茨海默氏病是一种危害性很大的神经变性疾病，影响全球数百万患者。由于市场上当前批准的药物仅对患者提供短暂的、对症的益处，在治疗阿尔茨海默氏病方面仍存在大量未满足的需求。

微管相关蛋白tau寡聚化为丝状结构例如成对的螺旋丝(PHF)和直或扭曲的丝是阿尔茨海默氏病和其他tau病变的定义性病理特征之一，这些丝状结构会导致神经原纤维缠结(NFT)和神经丝缠结(NT)。已发现阿尔茨海默氏病患者大脑中NFT的数量与疾病的严重程度密切相关，这表明tau在神经元功能障碍和神经变性中起关键作用(Nelson等,JNeuropathol Exp Neurol.,71(5),362-381(2012))。已证实tau病理学与PSP的病程有关；疾病更具侵袭性的病例比疾病进展较慢的病例有更高的tau负荷。(Williams等人,Brain,130,1566-76(2007))。

最近的研究(Yuzwa等人,Nat Chem Biol,4(8),483-490(2008))支持O-GlcNAcase(OGA)抑制剂在限制tau蛋白过度磷酸化和聚集成病理性tau蛋白从而治疗阿尔茨海默氏病和相关的tau介导的神经变性病症中的治疗潜力。具体而言，已证实OGA抑制剂Thiamet-G与延缓JNPL3 tau小鼠模型的运动神经元丢失有关(Yuzwa等人,Nat Chem Biol,8,393-399(2012))，并且与Tg4510 tau小鼠模型中tau病理学和营养不良性神经轴突的减少有关(Graham等人,Neuropharmacology,79,307-313(2014))。因此，OGA抑制剂被认为是减少tau的过度磷酸化病理形式的积累的有效治疗方法。

美国专利9,120,781公开了具有OGA抑制活性的六氢苯并

唑和六氢苯并噻唑衍生物，并进一步公开了这些化合物可用于治疗与OGA缺乏或过表达和/或2-乙酰氨基-2-脱氧-5β-D-吡喃葡萄糖苷(O-GlcNAc)积累或缺乏有关的疾病和病症。另外，US 2016/0031871公开了某些用于治疗阿尔茨海默氏病的糖苷酶抑制剂。

需要脑渗透性的OGA抑制剂以治疗tau介导的神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病和PSP。本发明提供了一些新的化合物，它们是OGA的抑制剂。

因此，本发明提供了式I的化合物：

或其可药用盐。

此外，本发明还提供了式Ia的化合物：

或其可药用盐。

本发明还提供了在需要治疗的患者中治疗阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向患者施用有效量的式I或Ia化合物或其可药用盐。

本发明进一步提供了一种在需要治疗的患者中治疗轻度认知障碍发展为阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向患者施用有效量的式I或Ia化合物或其可药用盐。

本发明还提供了一种在需要治疗的患者中治疗进行性核上性麻痹的方法，该方法包括向患者施用有效量的式I或Ia化合物或其可药用盐。本发明还提供了治疗患者中tau介导的神经变性疾病的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的式I或Ia化合物或其可药用盐。

此外，本发明还提供了用于治疗，特别是用于治疗阿尔茨海默氏病或用于预防轻度认知障碍发展为阿尔茨海默氏病的式I或Ia化合物或其可药用盐。另外，本发明还提供了用于治疗进行性核上性麻痹的式I或Ia化合物或其可药用盐。本发明还提供了用于治疗tau介导的神经变性疾病的式I或Ia化合物或其可药用盐。

更进一步地，本发明提供了式I或Ia化合物或其可药用盐在生产用于治疗阿尔茨海默氏病或预防轻度认知障碍发展为阿尔茨海默氏病的药物中的用途。另外，本发明提供了式I或Ia化合物或其可药用盐在生产用于治疗进行性核上性麻痹的药物中的用途。本发明还提供了式I或Ia化合物或其可药用盐在生产用于治疗tau介导的神经变性疾病的药物中的用途。

本发明进一步提供了药物组合物，其包含式I或Ia化合物或其可药用盐以及一种或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。本发明进一步提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将式I或Ia化合物或其可药用盐与一种或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂混合。本发明还包括用于合成式I和Ia化合物的新的中间体和方法。例如，本发明进一步提供以下式IIIa的中间体化合物：

其中Pg是合适的保护基。合适的保护基包括羧酸叔丁酯等。

本发明还提供了式IIa的中间体化合物：

基于临床表现以及表现出轻度认知障碍的患者随着时间推移向阿尔茨海默氏痴呆的进展，轻度认知障碍曾被定义为与阿尔茨海默氏病相关的痴呆的潜在前驱阶段。术语“预防轻度认知障碍发展为阿尔茨海默氏病”包括限制、减缓、停止或逆转患者的轻度认知障碍发展为阿尔茨海默氏病。

如本文所用，术语“治疗”包括抑制、减慢、停止或逆转现有症状或病症的进展或严重程度。

如本文所用，术语“患者”是指人。

如本文所用，术语“有效量”是指在向患者单次或多次给药后，在诊断或治疗的患者中提供期望的效果的本发明化合物或其可药用盐的量或剂量。

本领域技术人员可以通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果来容易地确定有效量。在确定对于患者的有效量时，要考虑许多因素，包括但不限于：患者的种类；患者的体型大小、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的程度或受累程度或严重程度；个体患者的反应；施用的具体化合物；施用方式；施用的制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；联合用药；和其他相关情况。

本发明化合物在每天约0.1至约15mg/kg体重范围内的剂量下是有效的。在某些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是足够的，而在其他情况下，可采用更大的剂量而仍然具有可接受的副作用，因此上述剂量范围无意以任何方式限制本发明的范围。

本发明的化合物被配制成药物组合物，所述药物组合物通过使该化合物可被生物利用的任何途径给药，包括口服和透皮途径。最优选地，所述组合物用于口服施用。所述药物组合物及其制备方法是本领域众所周知的(参见，例如，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，L.V.Allen编辑，第22版，Pharmaceutical Press，2012)。

式I和Ia的化合物或其可药用盐在本发明的治疗方法中特别有用，但某些构型是优选的。以下段落描述了这些优选的构型。应当理解，这些优选的内容既适用于治疗方法，也适用于本发明的化合物。

本发明的化合物包括:

及其可药用盐。

本发明包括其中哌啶环上的甲基和氧取代基为顺式或反式构型的式I化合物或其可药用盐，其中顺式构型是优选的。例如，本领域普通技术人员将理解，如以下方案A所示，相对于4位的氧，2位的甲基为顺式构型：

方案A

另外，本领域普通技术人员将理解，如以下方案B所示，其中相对于哌啶环上4位的氧，2位的甲基为反式构型：

方案B

进一步优选其中哌啶环2位的手性中心为S构型的化合物。尽管本发明涵盖所有单独的对映异构体和非对映异构体以及所述化合物的对映异构体的混合物(包括外消旋体)，但是特别优选具有以下绝对构型的化合物：

N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺及其可药用盐，进一步优选游离碱N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。

N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的结晶形式是特别优选的。更优选如下N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的晶体形式，其特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为13.5°的一个峰与一个或多个选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的峰的组合，其中衍射角公差为0.2度。

本领域普通技术人员可以在本发明化合物的合成中的任何方便的时候，通过诸如选择性结晶技术或手性色谱法(参见，例如，J.Jacques等人，“Enantiomers,Racemates,andResolutions”，John Wiley&Sons,Inc.,1981，以及E.L.Eliel和S.H.Wilen，“Stereochemistry of Organic Compounds”，Wiley-Interscience,1994)来分离或拆分各个异构体、对映异构体和非对映异构体。

本发明化合物的可药用盐可以例如通过在适当的溶剂中在本领域众所周知的标准条件下使本发明化合物的合适的游离碱与合适的可药用的酸反应而形成。这种盐的形成是本领域众所周知的并且是人们所理解的。参见，例如，Gould,P.L.，“Salt selection forbasic drugs,”International Journal of Pharmaceutics,33:201-217(1986)；Bastin,R.J.等人，“Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical NewChemical Entities,”Organic Process Research and Development,4:427-435(2000)；和Berge,S.M.等人,“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences,66:1-19,(1977)。

本发明的化合物或其盐可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法来制备，其中一些方法在以下方案、制备例和实施例中举例说明。本领域普通技术人员知晓，所描述的每种路线的具体合成步骤可以以不同的方式组合或与来自不同方案的步骤结合，以制备本发明的化合物或其盐。可以通过本领域公知的常规方法回收以下方案中每个步骤的产物，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研制和结晶。除非另有说明，以下方案中的所有取代基均如先前所定义。试剂和起始原料是本领域普通技术人员容易获得的。在不限制本发明范围的情况下，提供以下方案、制备例和实施例以进一步说明本发明。另外，本领域普通技术人员应理解，式Ia、Ib、Ic和Id的化合物可通过使用可由本领域技术人员制备的具有相应立体化学构型的起始原料来制备。例如，以下方案利用具有最终对应于式Ia的构型的起始原料。

通常，式Ia的化合物可以由式IIa的化合物制备(方案1)。更具体地讲，在合适的还原剂如三乙酰氧基硼氢化钠的存在下，在合适的溶剂中，用N-(4-氟-5-甲酰基噻唑-2-基)乙酰胺将式IIa的化合物还原烷基化，得到式Ia的化合物。合适的溶剂包括乙酸乙酯。N-(4-氟-5-甲酰基噻唑-2-基)乙酰胺可以通过化学领域已知的方法以及制备例和实施例中提供的方法来制备。

式IIa的化合物可以由式IIIa的化合物制备，其中Pg是合适的胺保护基。更具体地讲，使Pg为羧酸叔丁酯(t-BOC)的式IIIa化合物与酸例如盐酸或三氟乙酸在溶剂例如二恶烷或二氯甲烷中反应以提供式IIa的化合物。可以理解，式IIa的化合物可以以游离碱的形式或以与所用酸试剂相对应的酸加成盐的形式分离。合适的胺保护基在化学领域是已知的，包括t-BOC和Cbz以及在T.W.Green,P.G.M.Wuts,"Protective Groups in OrganicSynthesis"Wiley-Interscience,纽约,1999中讨论的那些。

方案1

可以从式IVa化合物制备其中Pg为合适的胺保护基的式IIIa化合物(方案2)。更具体地讲，在碱例如叔丁醇钠的存在下，将Pg为羧酸叔丁酯的式IVa化合物与2-(氯甲基)-5-甲基-1,3,4-

二唑反应得到式IIIa化合物。该反应方便地在溶剂如乙腈或二甲基甲酰胺中进行。

Pg为羧酸叔丁酯的式IVa化合物可通过在氢化物或酶促条件下还原式Va化合物来制备。更具体地讲，使式Va化合物与氢化物还原剂例如三(仲丁基)硼氢化锂在溶剂例如四氢呋喃中反应，得到其中Pg为羧酸叔丁酯的式IVa化合物。或者，使式Va化合物与酶还原剂如酮还原酶在溶剂例如DMSO中反应，得到其中Pg为羧酸叔丁酯的式IV化合物。其中Pg是合适的胺保护基的式Va化合物可以通过化学领域已知的方法、包括在WO2004/094380 A1中所描述的方法来制备。

方案2

Pg为合适的胺保护基的式IIIa化合物也可以按照方案3所示的一系列步骤由式VIa化合物制备。更具体地讲，使Pg为羧酸叔丁酯的式VIa化合物在碱例如二异丙基乙胺的存在下与对甲苯磺酰氯反应，得到式Ⅲa化合物。该反应方便地在溶剂如乙腈中进行。Pg为羧酸叔丁酯的式VIa化合物可通过在1,1′-羰基二咪唑存在下使式VIIa化合物与乙酰肼反应来制备。该反应通常在溶剂如四氢呋喃中进行。Pg为羧酸叔丁酯的式VIIa化合物可通过首先使式IVa化合物与2-氯-1-吗啉代乙酮和碱如叔丁醇钠在溶剂如乙腈中反应来制备。然后将所得到的式Ⅳa化合物的吗啉代加合物在溶剂如2-丙醇中用碱的水溶液如氢氧化钠水溶液水解，得到其中Pg为羧酸叔丁酯的式VIIa化合物。

方案3

制备例1

N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将氟化铯(227g,1480mmol)在室温下添加到N-(4-氯-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(38.8g,148mmol；N-(4-氯-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯的制备参见，例如，N.Masuda等人,Bioorg Med Chem,12,6171-6182(2004))的DMSO(776mL)溶液中。将反应混合物在145℃的加热块(内部温度为133℃)中搅拌48小时，然后将混合物在冰水浴中冷却。向混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)、盐水(500mL)和乙酸乙酯(500mL)。将混合物在室温下搅拌10分钟，然后通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯(500mL)洗涤。将滤液转移至分液漏斗中并分离各层，然后将水层用乙酸乙酯(1L)萃取。合并的有机物用盐水(1L)洗涤，然后将盐水层用乙酸乙酯(300mL)萃取。合并的有机物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物。使残余物通过硅胶垫(330g)，用5％乙酸乙酯的二氯甲烷溶液(1.5L)洗脱，浓缩滤液得到残余物(24.2g，66％收率(假定100％纯度)或37％收率(基于通过¹H NMR测得的56％的纯度计))。

将残余物(32.7g不同批次的混合物，133mmol)溶于异丙醇(303mL)，过滤，然后通过SFC(超临界流体色谱法)用IC柱(纤维素多糖衍生物：三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯，30x250mm，5u))进行纯化，用10％IPA(无添加剂)以180mL/分钟的速度洗脱，3mL注射量。浓缩含产物的级分得到标题化合物(16.1g,49％)。MS m/z 247.0(M+H)。

制备例2

N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺的合成

在带夹套的容器中，将溴化锌(91.9g,408mmol)在室温下一次性添加到N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(33.5g,136mmol)和二氯甲烷(503mL)的混合物中。将反应混合物在37℃的内部温度下搅拌过夜，然后将夹套温度设定为-10℃，并在15分钟内滴加四氢呋喃(111mL)，保持内部温度低于6℃。然后将夹套温度设定为-30℃，并在5分钟内滴加吡啶(110mL,1360mmol)，保持内部温度低于5℃。将夹套温度设定为0℃，并在5分钟内滴加乙酸酐(116mL,1220mmol)。将反应混合物在内部温度为37℃下搅拌过夜，然后冷却至室温并通过硅藻土短垫，用四氢呋喃(500mL)洗脱。将滤液转移至烧瓶中，将混合物浓缩得到残余物，将其从甲苯(50mL)中浓缩。向残余物中加入柠檬酸一水合物(57.2g,272mmol)在水(400mL)和2-甲基四氢呋喃(400mL)中的溶液，将混合物在40℃下搅拌5分钟，然后使其通过硅藻土短垫，用2-甲基四氢呋喃(100mL)洗脱。将滤液转移至分液漏斗中并分离各层。用2-甲基四氢呋喃(2×250mL)萃取水层并将合并的有机物用水(500mL)稀释。在搅拌下于5分钟内向混合物中分批加入固体碳酸氢钠，直到停止放出气体。将混合物转移至分液漏斗中并分离各层，然后将水层用2-甲基四氢呋喃(200mL和100mL)萃取。将合并的有机物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物，将其用2-甲基四氢呋喃(100mL)稀释并将混合物通过硅胶短垫(250g)，用2-甲基四氢呋喃(2.5L)洗脱。浓缩滤液得到残余物，将其悬浮在二氯甲烷和庚烷的1∶1混合物中(202mL)。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后过滤。将滤出的固体在真空下于40℃干燥2小时得到标题化合物(18.0g,70％)。MS m/z 189.0(M+H)。

N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺的替代合成方法

在惰性气氛下，依次溶解四水合四甲基氟化铵(100kg,605mol)和异丙醇(453-459kg)并在<70℃的温度下减压浓缩至体积为150-180L。加入异丙醇(453-459kg)并减压浓缩至150-180L。重复上述操作直至混合物的KF<0.2％。

加入二甲基甲酰胺(546-552kg)，加热至90℃，减压浓缩至150L。再添加二甲基甲酰胺(453-459kg)，减压浓缩至150L。重复上述操作直至混合物中残留的异丙醇限值<60ppm。加入N-(4-氯-5-甲酰基噻唑-2-基)乙酰胺(15kg,73.3mol)和二甲基甲酰胺(149kg)并加热至100℃保持2-4小时。将温度调节至20-25℃，然后添加2-甲基四氢呋喃(248kg)。添加25％(重量)的氯化铵水溶液(458kg)并搅拌30分钟。分离各层并用另外的2-甲基四氢呋喃(248kg)洗涤水层。分离各层，用25％(重量)的氯化铵水溶液(2×458kg)洗涤合并的有机层并搅拌30分钟。

加入乙酸乙酯(180kg)并将反应混合物加热回流1小时得到澄清溶液。在<55℃的温度下减压浓缩混合物至约30L的体积。添加乙酸乙酯(54kg)，在<55℃的温度下减压浓缩混合物至约30L的体积。在氮气下20-25℃搅拌混合物2小时。通过过滤收集固体，在55-65℃下真空干燥10-12小时得到标题化合物(4.5kg，82.5％纯度)。

制备例3

(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成

向烧瓶中加入(2S)-2-甲基-4-氧代-哌啶-1-甲酸叔丁酯(50g,234.44mmol)和四氢呋喃(500mL)。在氮气气氛下将混合物冷却至-65℃并在45分钟内滴加三(仲丁基)硼氢化锂(304.77mL,304.77mmol；1M的四氢呋喃溶液)，保持内部温度低于-60℃。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后冷却至-30℃。向反应混合物中加入水(25.34mL)和四氢呋喃(100.16mL)的混合物，保持内部温度低于-20℃。在1小时内滴加过氧化氢水溶液(118.88mL,1.17mol,30wt/wt％)在水(126.70mL)中的溶液，保持内部温度低于10℃。向混合物中加入氯化氢水溶液(46.89mL,234.44mmol,5M)和甲基叔丁基醚(1.00L)并将混合物温热至室温。分离各层，将有机相与焦亚硫酸钠(222.84g,1.17mol)的水(500mL)溶液一起在室温下搅拌10分钟。分离各层，有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残余物通过快速色谱法纯化(0-50％甲基叔丁基醚/异己烷，硅胶)，合并含产物的级分并浓缩得到标题化合物(40.4g,78％)。ES/MS(m/e)238(M+Na)。

(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯的替代合成方法

在20℃下，向含有去离子水(460L)和磷酸二氢钾(6.5kg,0.41当量)的搪玻璃反应罐中加入DMSO(27.4kg,1.0体积)和D-(+)-葡萄糖一水合物(28.9kg,1.25当量)。将内部温度调节至30℃，并通过加入氢氧化钠水溶液(8％,15L,0.28当量)将反应的pH调节至6.9。向反应罐中加入(2S)-2-甲基-4-氧代-哌啶-1-甲酸叔丁酯(24.9kg,1.0当量(99.1％ee))并将混合物在30℃搅拌15分钟。直接通过敞口向反应混合物中加入酮还原酶(KRED-130,250g,1％w/w)、葡萄糖脱氢酶(GDH-101,250g,1％w/w)和NADP钠盐(63g,0.25％w/w)。将混合物保持在30℃并通过添加8％NaHCO₃水溶液保持pH 7.0±0.2。搅拌16.5小时(99.5％转化率)后，将Celite ^TM(12.5kg,50w/w％)和甲苯(125L,5体积)加入反应物中。在30℃下搅拌30分钟后，将混合物通过管路GAF过滤器(4滤嘴)在1小时内转移到另一个2000L反应罐中。将混合物静置30分钟，不搅拌，分离各层，并用甲苯(2×125L)反萃取水层。过滤合并的有机层(管路GAF过滤器)并在25℃下用氯化钠水溶液(25％,125L,5体积)洗涤甲苯混合物。将得到的甲苯溶液共沸干燥(部分真空，内部温度<60℃)至水分含量为0.10w/w％，然后冷却至20℃。在正氮气压力下，通过筒式过滤器将混合物从反应罐中滤出到干净的大桶中。然后将反应混合物从大桶中转移到500L搪玻璃容器中并在真空(<60℃)下浓缩至56L的目标剩余体积(2.25体积)。在40℃下加入正庚烷(169kg,10体积)并用25g(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯接种该混合物。将所得的稠浆液用额外的正庚烷(25L,1体积)稀释并在4小时内冷却至16℃。通过离心分离产物，用正庚烷洗涤(每次离心用25L；需要离心4次)，在30℃的盘式干燥机中干燥11小时后，得到20.3kg(81％；>99.9％ee)。ES/MS(m/e)238(M+Na)。

制备例4

2-[[(2S,4S)-1-叔丁氧羰基-2-甲基-4-哌啶基]氧基]乙酸的合成

将2-氯-1-吗啉代乙酮(59.4g,363mmol)在室温下添加到(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(52.1g,242mmol)的乙腈(521mL)溶液中。将反应混合物在冰水浴中搅拌并在10分钟内分批加入叔丁醇钠(48.0g,484mmol)，保持内部温度低于15℃。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后在5分钟内在冰水浴冷却下将其加入到另一个装有饱和氯化铵水溶液(250mL)和水(250mL)的烧瓶中，在加料过程中保持内部温度低于15℃。将该混合物温热至室温并用甲基叔丁基醚(2×500mL)萃取，然后将合并的有机物用盐水(300mL)洗涤。然后将合并的有机物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物，将其与2-丙醇(414mL)和2M氢氧化钠水溶液(303mL,605mmol)在室温下合并。将反应混合物在47℃的加热块中搅拌过夜，内部温度为45℃。将反应混合物冷却至室温并浓缩以除去2-丙醇，然后将混合物用水(50mL)稀释。用甲基叔丁基醚(250mL)萃取混合物，然后将水层在冰水浴中冷却并用乙酸(55.6mL,968mmol)酸化。用乙酸乙酯(4×250mL)萃取含水混合物，然后将合并的有机物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物，将其从甲苯(3×100mL)中浓缩，得到标题化合物(79.8g)。MS m/z 272.0(M-H)。

制备例5

(2S,4S)-4-[2-(2-乙酰基肼基)-2-氧代-乙氧基]-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成

将四氢呋喃(798mL)添加到含有2-[[(2S,4S)-1-叔丁氧基羰基-2-甲基-4-哌啶基]氧基]乙酸(79.8g,224mmol,76.6质量％)的烧瓶中并将混合物在冰水浴中搅拌，内部温度为5℃。向混合物中一次性加入1,1′-羰基二咪唑(43.5g,268mmol)并将反应混合物在室温下搅拌2小时。补加1,1'-羰基二咪唑(7.25g,44.7mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。将反应混合物浸没在冰水浴中，一次性加入乙酰肼(21.5g,291mmol)，然后将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在冰水浴中搅拌并在2分钟内加入饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)，同时保持内部温度低于15℃。用水(300mL)稀释混合物，然后浓缩以除去四氢呋喃。用2-甲基四氢呋喃(4×500mL)萃取含水混合物。合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物，将其与乙酸乙酯(200mL)和庚烷(200mL)合并。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后用庚烷(200mL)稀释并将混合物在室温下剧烈搅拌另外30分钟，然后过滤。将过滤的固体在真空下于40℃干燥2小时，得到第一批标题化合物(71.5g)。再次过滤滤液，将过滤的固体在氮气流下室温干燥15分钟，得到第二批标题化合物(1.98g)。将第一批产物的大部分(71.1g,216mmol,纯度未知)和第二批产物(1.97g,5.98mmol,纯度未知)与叔丁基甲基醚(731mL)混合，将混合物在45℃的加热块中于40℃的内部温度下搅拌30分钟，然后在搅拌下经过1小时冷却至室温并将混合物过滤。将过滤的固体在室温下、在氮气流下真空干燥30分钟，得到标题化合物(53.7g)。MS m/z 352.0(M+Na)。

制备例6

(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成

室温下，在氮气下向(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.5g,2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液中分批添加叔丁醇钠(0.92g,9.28mmol)。将所得反应混合物室温搅拌40分钟。将反应混合物冷却至0℃，然后加入2-(氯甲基)-5-甲基-1,3,4-

二唑(0.416g,3.14mmol)。所得溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物用水稀释。用3份乙酸乙酯萃取混合物。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到粗品油。

将残余物溶于二甲亚砜(至总体积2ml)并通过制备型HPLC(Phenomenex Gemini-NX 10Micron 30*100mm C-18)进行纯化(CH₃CN和水，含有用氢氧化铵调至pH 9的10mM碳酸氢铵，在7分钟内从15％至100％CH₃CN，流速50ml/min)(1次进样)(204nm)得到标题化合物(0.028g,0.089mmol,4％)。MS m/z 312.0(M+H)。

(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的替代合成方法

向烧瓶中加入(2S,4S)-4-[2-(2-乙酰基肼基)-2-氧代-乙氧基]-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(53.7g,163mmol)和乙腈(537mL)并将浆液在室温下搅拌。在5分钟内，在水浴冷却下向混合物中一次性加入N,N-二异丙基乙胺(114mL,652mmol)并分三批加入对甲苯磺酰氯(77.7g,408mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后在冰水浴中冷却，并在保持内部温度低于15℃的情况下，在10分钟内逐滴加入N',N'-二甲基乙烷-1,2-二胺(21.8g,245mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后在室温下用饱和柠檬酸水溶液(50mL)、乙酸乙酯(500mL)和水(450mL)稀释。分离各层，将有机层用饱和柠檬酸水溶液(50mL)和水(450mL)的混合物洗涤。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)洗涤，然后将水层用乙酸乙酯(500mL)萃取。将合并的有机物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物，将其通过硅胶短垫(400g)，先后用25％乙酸乙酯的庚烷溶液(2×500mL)和乙酸乙酯(5×500mL)洗脱。浓缩含产物的级分，得到标题化合物(53.3g)。MS m/z 312.2(M+H)。

制备例7

5-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-

二唑.2,2,2-三氟乙酸的合成

在氮气下，向(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.0275g,0.0883mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中加入三氟乙酸(0.035mL,0.45mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物减压浓缩得到标题化合物(0.04g,84％)。MS m/z 212.0(M+H)。

制备例8

2-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-

二唑的合成

在室温下，向烧瓶中加入(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(52.9g,170mmol)和二氯甲烷(265mL)。将反应混合物在冰水浴中搅拌(内部温度为5℃)并在5分钟内滴加三氟乙酸(3500mmol,265mL)，保持内部温度低于10℃。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后浓缩得到残余物，将其用水(300mL)和甲基叔丁基醚(300mL)稀释。分离各层，将水层在冰水浴中搅拌并用50％氢氧化钠水溶液(20mL)碱化，在添加过程中保持内部温度低于10℃。混合物用二氯甲烷(4×300mL)萃取，合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到标题化合物(30.5g)。MS m/z 212.2(M+H)。

实施例1

N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的合成

在氮气下，向2-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-

二唑.2,2,2-三氟乙酸(0.16g,0.7mmol)的乙酸乙酯(1mL)溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(0.021mL,0.12mmol)并将溶液搅拌5分钟。加入N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺(0.04g,0.122mmol)并搅拌5分钟，加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.055g,0.25mmol)并将反应混合物温热至40℃搅拌过夜。将混合物减压浓缩得到褐色固体。

将残余物溶于二甲亚砜(至1ml的总体积)并通过制备型HPLC纯化(PhenomenexGemini-NX 10Micron 30*100mm C-18)(CH₃CN和水，含有用氢氧化铵调至pH 9的10mM碳酸氢铵，在12分钟内从15％至100％CH₃CN，流速100ml/min)(1次进样)(271/204nm)得到标题化合物(0.007g,14％)。MS m/z 384.2(M+H)。

结晶状N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的替代合成方法

将三乙酰氧基硼氢化钠(59.1g,279mmol)在室温下添加到2-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-

二唑(23.3g,93.0mmol)、乙酸乙酯(438mL)和N,N-二异丙基乙胺(32.4mL,186mmol)的混合物中。将反应混合物在31℃的加热块中搅拌15分钟(内部温度为30℃)，然后在5分钟内分批加入N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺(17.5g,93.0mmol)。将反应混合物在31℃的加热块中搅拌过夜(内部温度为30℃)，然后在冰水浴中冷却至内部温度为5℃。在15分钟内向混合物中添加2M盐酸水溶液(140mL)，保持内部温度低于10℃。将混合物在室温下搅拌15分钟，然后用水(50mL)和乙酸乙酯(20mL)稀释并分离各层。有机层用2M盐酸水溶液(35mL)在水(100mL)中的混合物萃取。将合并的水层在冰水浴中搅拌，并在10分钟内逐滴加入50％氢氧化钠水溶液(19.5mL)，保持内部温度低于10℃。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)稀释，然后用2-甲基四氢呋喃(3×200mL)萃取。合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物，将其通过快速色谱法纯化，用0-15％2-丙醇的二氯甲烷溶液洗脱。浓缩包含产物的级分得到残余物，将其从庚烷(100mL)中浓缩。将浓缩的物质与40％乙酸乙酯的庚烷溶液(457mL)混合并将该混合物在50℃的加热块中搅拌1小时，然后冷却至室温并过滤。将过滤出的固体在40℃下真空干燥1小时得到第一批产品(22.9g)。将滤液浓缩得到残余物，将其与40％乙酸乙酯的庚烷溶液(50mL)混合并将该混合物在50℃的加热块中搅拌30分钟，然后冷却至室温并过滤。将过滤出的固体与50％乙酸乙酯的庚烷溶液(33mL)混合并将混合物在50℃的加热块中搅拌1小时，然后冷却至室温并过滤。将过滤出的固体在40℃下真空干燥1小时，得到第二批产品(2.50g)。

在室温下，将包括第一批和第二批产品的批次组合(29.3g,76.4mmol)与乙酸乙酯(117mL)和庚烷(117mL)混合。将混合物在51℃的加热块中搅拌30分钟(内部温度50℃)，然后冷却至室温并过滤。将过滤出的固体在40℃下真空干燥过夜，得到结晶固体状标题化合物(26.7g)。MS m/z 384.0(M+H),[α]_D ²⁰＝+39°(C＝0.2,甲醇)。

结晶状N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的X射线粉末衍射(XRPD)

将结晶状N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺(218mg)在60℃下溶于1.25mL甲醇中5分钟。在搅拌下将溶液冷却至环境温度20分钟。通过真空过滤分离形成的固体。最终的固体产物为163mg(75％收率)。

结晶固体的XRD图谱是在配备有CuKa光源

和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪上获得的，其工作电压为35kV和50mA。样品在4至40°2θ之间进行扫描，步长为0.0087°2θ，扫描速度为0.5秒/步，发散度为0.6毫米，固定防散射为5.28毫米，检测器狭缝为9.5毫米。将干粉末装在石英样品架上，并用载玻片获得光滑的表面。在晶体学领域众所周知，对于任何给定的晶形，由于诸如晶体形态和习性等因素而导致的优选取向，衍射峰的相对强度可能变化。当存在优选取向的影响时，峰强度会改变，但多晶型物的特征峰位置不会改变。参见例如，美国药典38-国家处方集35第<941>章，通过X射线粉末衍射(XRPD)对结晶和部分结晶的固体进行表征，2015年5月1日正式公布。此外，在晶体学领域还众所周知，对于任何给定的晶形，角度峰值位置可能会略有变化。例如，由于分析样品时温度或湿度的变化、试样位移或内标的存在与否，峰位置可能会发生位移。在本案中，2θ中±0.2的峰位置变化将考虑这些潜在的变化而不会妨碍对所指晶型的明确鉴定。可以基于特征峰(以2θ为单位)(通常是较强的峰)的任何独特组合来确定晶型。根据8.85和26.77度2θ的NIST 675标准峰，修正在环境温度和相对湿度下收集的晶形衍射图。

因此，结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的特征在于使用CuKa辐射的XRD图具有如表1中所述的衍射峰(2-θ值)。更具体地讲，该图优选包含在13.5°处的峰与一个或多个选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的峰的组合，其中衍射角公差为0.2度。

表1：结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的X射线粉末衍射峰

体外人OGA酶测定

OGA蛋白的产生

将编码全长人O-GlcNAc-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NM_012215)的核苷酸序列插入带有N端聚组氨酸(HIS)标签的pFastBac1(Invitrogen)载体中。杆状病毒的产生根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)规程进行。以1.5x 10⁶细胞/mL的密度感染Sf9细胞，每升培养物使用10mL P1病毒并在28℃下孵育48小时。离心细胞，用PBS冲洗，沉淀在-80℃下保存。上述OGA蛋白(His-OGA)的纯化方法如下：将4L细胞溶解于200mL包含50mM Tris,pH 8.0、300mM NaCl、10％甘油、10mM咪唑、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1％Triton^TMX-100、4片蛋白酶抑制剂片剂(完全不含EDTA，Roche)的缓冲液中，在4℃下放置45分钟。然后将细胞裂解液在4℃下以16500rpm旋转40分钟，然后将上清液与6mL Ni-NTA树脂(镍-次氮基三乙酸)一起在4℃下孵育2小时。

然后将树脂填充到色谱柱上并用50mM Tris,pH 8.0，300mM NaCl，10％甘油，10mM咪唑，0.1％Triton^TMX-100，1mM DTT洗涤，然后用50mM Tris,pH 8.0，150mM NaCl，10mM咪唑，10％甘油，1mM DTT洗涤。蛋白质用50mM Tris,pH 8.0，150mM NaCl，300mM咪唑，10％甘油，1mM DTT洗脱。将合并的含His-OGA的级分浓缩至6ml并加载到Superdex75(16/60)上。蛋白质用50mM Tris,pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，2mM DTT洗脱。合并含有His-OGA的级分并用BCA(Bradford比色测定法)测量蛋白质浓度。

OGA酶测定

OGA酶催化从核质蛋白中去除O-GlcNAc。为了测量该活性，使用荧光素二-N-乙酰基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷(FD-GlcNAc,Kim,Eun Ju；Kang,Dae Ook；Love,Dona C.；Hanover,John A.Carbohydrate Research(2006),341(8),971-982)作为底物，其最终浓度为10μM(96孔测定形式)或6.7μM(384孔测定形式)。该荧光底物在被OGA切割后可发出荧光，因此可以通过在535nm处(在485nm激发)检测到的荧光的增加来测量酶活性。

在pH值为7的水中制备测定缓冲液，获得50mM H₂NaPO₃-HNa₂PO₃、0.01％牛血清白蛋白和0.01％Triton^TMX-100的终浓度。最终酶浓度为3nM(96孔测定形式)或3.24nM(384孔测定形式)。两种测定形式产生基本相同的结果。

使用十点浓度响应曲线在纯二甲亚砜(DMSO)中稀释待测试的化合物。反应混合物中的最大化合物浓度为30μM。将适当浓度的化合物与OGA酶一起预孵育30分钟，然后通过添加底物开始反应。使反应在室温下进行60分钟。然后，在不停止反应的情况下读取荧光。通过将归一化数据对化合物的对数作图并使用四参数对数方程拟合数据来计算IC₅₀值。

基本上如上所述测试实施例1的化合物，其IC₅₀为2.13nM±0.89(n＝5)。该结果证明实施例1的化合物在体外抑制OGA酶活性。

全细胞测定法测定OGA酶活性的抑制

细胞平板培养：

利用本领域已知的标准条件，生成经修饰可诱导表达微管相关蛋白tau的P301S-1N4R形式的TRex-293细胞并将其维持在生长培养基中，所述生长培养基由DMEM高葡萄糖(Sigma#D5796)组成，并补充有10％不含四环素的胎牛血清(FBS,Sigma F2442)，20mMHEPES，5μg/mL杀稻瘟菌素(Blasticidin)(Life Technologies#A11139-03)和200μg/mL博莱霉素(Zeocin)(Life Technologies#R250-01)。对于实验，将细胞以10,000-14,000个细胞/孔的浓度铺板在涂覆有聚D-赖氨酸的Corning Biocoat(356663)384孔板的生长培养基中，并在37℃/5％CO₂的细胞培养箱中培养20-24小时。在不诱导Tau表达的情况下进行实验。

化合物处理:

使用十点浓度响应曲线在纯DMSO中将待测试的化合物依次稀释1/3，然后在生长培养基中进一步稀释。平板培养20-24小时后，用测试化合物在生长培养基中处理细胞；最大化合物浓度为15μM(0.15％DMSO)。最大抑制作用是通过重复测量15uM Thiamet G处理来定义的，最小抑制作用是通过重复测量0.15％DMSO处理来定义的。将细胞返回到37℃/5％CO₂的培养箱中20-24小时。在每个平板中一式两份地测试化合物。

免疫染色法:

化合物处理20-24小时后，从测定板中除去培养基并将25μL溶于DPBS(Sigma#D8537；Dulbecco磷酸盐缓冲液)的3.7％甲醛溶液(Sigma#F1635)加入每个孔中，孵育30分钟。然后将细胞用DPBS洗涤一次，然后用0.1％Triton^TMX-100(Sigma#T9284)透性化。30分钟后，将细胞用DPBS洗涤两次，然后将封闭溶液(1％BSA/DPBS/0.1％Triton^TMX-100)添加到每个孔中并孵育60分钟。除去封闭溶液，将0.40-0.33μg/mL的O-GlcNAc蛋白抗体(RL2克隆，Thermo，MA1072)在封闭溶液中的溶液添加到细胞中，使其在2-8℃下放置过夜。第二天，将细胞用DPBS洗涤两次，向每个孔中加入2ug/mL在DPBS中的二抗Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(Life Technologies#A11001)并在室温下静置90分钟。除去二抗，用DPBS洗涤细胞两次并向每个孔中加入浓度分别为1和50ug/mL的DAPI(Sigma#D9564；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸盐)和RNase(Sigma,R6513)的DPBS溶液。将板密封，孵育一小时并在Acumen eX3hci(TTP Labtech)上进行分析。除一抗外，上述所有孵育和洗涤步骤均在室温下进行。

分析和结果:

在Acumen eX3仪器上使用488和405nm激发激光器以及两个发射滤光片FL2(500-530nm)和FL1(420-490nm)对平板进行分析。FL2滤光片是与O-GlcNAc蛋白抗体(RL2克隆)相对应的信号，FL1滤光片是与细胞核(DAPI)相对应的信号。总FL2/总FL1(没有对象或群体选择的每个孔的总荧光)之比用于数据分析。将数据参照15μM Thiamet G处理所产生的最大抑制作用和0.15％DMSO处理所产生的最小抑制作用进行归一化。将数据通过非线性曲线拟合应用程序拟合(4参数对数方程)并计算和报告IC₅₀值。

基本上如上所述测试实施例1的化合物，其IC₅₀为22.6nM±7.3(n＝3)。该结果证明实施例1的化合物在细胞测定中抑制OGA酶活性。

Claims (12)

1.下式的化合物或其可药用盐：

2.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中相对于哌啶环上4位的氧，2位的甲基为顺式构型：

3.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中相对于哌啶环上4位的氧，2位的甲基为反式构型：

4.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物或盐，其中所述化合物为N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。

5.根据权利要求4所述的化合物，其为N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-

二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。

6.根据权利要求5所述的化合物，其中该化合物是结晶。

7.根据权利要求6所述的化合物，其特征在于X射线粉末衍射光谱中在衍射角2-θ为13.5°的峰与一个或多个选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的峰的组合，其中衍射角公差为0.2度。

8.权利要求1-7中任一项所述的化合物或其可药用盐在生产用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。

9.权利要求1-7中任一项所述的化合物或其可药用盐在生产用于治疗轻度认知障碍发展为阿尔茨海默氏病的药物中的用途。

10.权利要求1-7中任一项所述的化合物或其可药用盐在生产用于治疗进行性核上性麻痹的药物中的用途。

11.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的化合物或其可药用盐以及一种或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

12.一种制备药物组合物的方法，该方法包括将权利要求1-7中任一项所述的化合物或其可药用盐与一种或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂混合。