CN110650743A

CN110650743A - 用于选择性消除和替换造血干细胞的组合物和方法

Info

Publication number: CN110650743A
Application number: CN201880031356.8A
Authority: CN
Inventors: E.奥斯特塔; D.舍德洛克; J.D.道恩
Original assignee: Wave Cedar Treatment Co
Current assignee: Wave Cedar Treatment Co
Priority date: 2017-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: JP2020510101A; IL269203B2; KR102708285B1; US20200078402A1; WO2018169948A1; CN110650743B; US11744861B2; CA3056227A1; SG11201908418RA; SG10202109731YA; EP3595682A1; IL311608A; IL269203A; CN117959418A; AU2018235756B2; US20240131067A1; US20240226153A9; JP2023026580A; AU2018235756A1; IL269203B1

Abstract

公开了消除受试者中的至少一种靶细胞的方法，其包括向受试者施用有效量的包含多种免疫细胞的组合物，其中所述多种中的各免疫细胞表达一种或多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体，其中一种或多种CLR与靶标的特异性结合活化免疫细胞，且其中活化的免疫细胞诱导靶细胞的死亡。示例性靶细胞包括，但不限于，造血干细胞(HSC)。

Description

用于选择性消除和替换造血干细胞的组合物和方法

相关申请

本申请要求2017年3月13日提交的临时申请USSN 62/470,814和2017年12月7日提交的临时申请USSN 62/596,062的权益，所述临时申请的内容各自通过引用以其整体并入本文。

序列表的并入

命名为“POTH-026_001WO_SeqList.txt”的文本文件的内容，其于2018年3月2日创建，文件大小为229 KB，通过引用以其整体并入本文。

本发明的领域

本发明涉及分子生物学，且更特别地涉及表达选择性靶向造血干细胞(HSC)的嵌合配体受体的细胞，以及制备和使用它们的方法。

背景

在本领域中对于以下方法存在长期感到、但未满足的需求：在用治疗性HSC组合物替换内源性造血干细胞(HSC)前选择性消除受试者中的这些内源性HSC的方法(例如，在骨髓移植的背景下)。本发明提供了选择性消除受试者中的内源性造血干细胞(HSC)的组合物和方法。

概述

本发明提供了消除受试者中的至少一种靶细胞的方法，其包括向受试者施用有效量的包含多种免疫细胞的组合物，其中所述多种中的各免疫细胞表达一种或多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体，其中一种或多种CLR与靶配体的特异性结合活化免疫细胞，且其中活化的免疫细胞诱导靶细胞的死亡。在某些实施方案中，所述方法进一步包括消除多种免疫细胞的步骤。

本发明提供了移植受试者的免疫系统的方法，其包括：(a)向受试者施用有效量的包含多种免疫细胞的组合物，其中所述多种中的各免疫细胞表达一种或多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体，其中一种或多种CLR与靶配体的特异性结合活化免疫细胞，且其中活化的免疫细胞诱导靶细胞的死亡；(b)消除多种免疫细胞；和(c)向受试者施用有效量的包含多种治疗性造血干细胞(HSC)的组合物。

如本文所用，术语“治疗性HSC”意在描述在选择性消除本发明的靶细胞后向受试者施用的多种HSC或HSC的群体。治疗性HSC可以包括健康的或无疾病的自体或同种异体HSC，其替换经消除的靶HSC。或者，治疗性HSC可包括HSC，其以临床相关的方式不同于靶HSC，以改善HSC功能，调节生态位或微环境，调节另一种细胞或细胞类型，或耐受受试者的免疫系统用于随后用来自与治疗性HSC相同的来源的细胞、组织或器官移植。治疗性HSC可以分离或源自任何人来源，包括但不限于本发明的方法的受试者，双胞胎(例如，不携带受试者的一个或多个偶发突变的人)，遗传相关的个体或遗传相关的个体的组合，以及具有相容的MHCI/MHCII概况的个体，或具有相容的MHCI/MHCII概况的个体的组合。治疗性HSC可包括自体或同种异体HSC，其不包括疾病或病症的一种或多种遗传或表观遗传标记。在某些实施方案中，未对治疗性HSC进行基因修饰。在某些实施方案中，对治疗性HSC进行基因修饰。可对治疗性HSC进行基因修饰以消除疾病或病症的一种或多种遗传或表观遗传标记。可替代地或另外，可对治疗性HSC进行基因修饰，使其在细胞表面表达或分泌一种或多种离子、小分子、肽或蛋白来影响另一种细胞或细胞类型(例如，癌细胞、干细胞或祖细胞(成骨细胞、间充质干细胞、神经祖细胞或神经胶质细胞)或免疫细胞)的活性或调节特定的生物学生态位或微环境(细胞外基质、损伤部位、干细胞生态位)以创建更有利的条件用于植入治疗性HSC。此外，在例如治疗性HSC中的一种或多种与受试者的免疫系统不相容或经历恶性转化的情况下，可对治疗性HSC进行基因修饰以含有本发明的诱导型促凋亡多肽(即安全开关)。在某些实施方案中，将治疗性HSC施用于受试者以耐受受试者的免疫系统以随后用来自与治疗性HSC相同的供体的细胞、组织、移植物或器官移植。一旦治疗性HSC耐受受试者的免疫系统，免疫系统将对随后移植反应低下，并且不应排斥随后的移植。

在本发明的方法的某些实施方案中，诱导靶细胞的死亡包括诱导靶细胞的细胞裂解。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞是多种靶细胞。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞是多种靶细胞。在某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含造血干细胞(HSC)。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞是多种靶细胞。在某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是T淋巴细胞(T细胞)。在某些实施方案中，T细胞表达CD4或CD8。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞是多种靶细胞。在某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是T淋巴细胞(T细胞)。在某些实施方案中，T细胞是辅助T (T_H)细胞。在某些实施方案中，辅助T细胞(T_H)是I型辅助T (T_H1)细胞。在某些实施方案中，辅助T细胞(T_H)是2型辅助T (T_H2)细胞。在某些实施方案中，辅助T细胞(T_H)是T辅助17 (T_H17)细胞。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞是多种靶细胞。在某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是T淋巴细胞(T细胞)。在某些实施方案中，T细胞是调节性T (T_REG)细胞。在某些实施方案中，T细胞是诱导的调节性T (iT_REG)细胞或天然调节性T (nT_REG)细胞。在某些实施方案中，T细胞是诱导的调节性T (iT_REG)细胞。在某些实施方案中，T细胞是天然调节性T (nT_REG)细胞。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞是多种靶细胞。在某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞是多种靶细胞。在某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC和免疫细胞。在某些实施方案中，包括其中至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC和免疫细胞的那些中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC细胞和T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，包括其中至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC和免疫细胞的那些中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC细胞和T细胞和NK细胞。在某些实施方案中，其中至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC，其中至少一种靶细胞或多种靶细胞进一步包含免疫细胞，且其中所述受试者处于排斥包含多种免疫细胞(其各自表达一种或多种CLR)的组合物的风险中。在某些实施方案中，其中至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC，其中至少一种靶细胞或多种靶细胞进一步包含免疫细胞，且其中所述受试者处于排斥包含多种治疗性HSC的组合物的风险中。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物是同种异体的。在某些实施方案中，同种异体组合物源自健康供体。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物是自体的。在某些实施方案中，包括其中包含多种免疫细胞的组合物是自体的那些中，受试者具有疾病或病症，并且自体组合物衍生自在发展疾病或病症之前、在从疾病或病症缓解的时段期间或在治疗疾病或病症之后从受试者获得的生物学样品。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种免疫细胞中的至少一种免疫细胞包含基因修饰，且其中基因修饰减少或抑制T-细胞受体或主要组织相容性复合物(MHC)的表达。在某些实施方案中，多种免疫细胞中的一部分免疫细胞包含基因修饰，且其中基因修饰减少或抑制T-细胞受体或主要组织相容性复合物(MHC)的表达。在某些实施方案中，该部分占多种免疫细胞中的至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比。在某些实施方案中，多种免疫细胞中的每种免疫细胞包含基因修饰，且其中基因修饰减少或抑制T-细胞受体(TCR)或主要组织相容性复合物(MHC)的表达。在某些实施方案中，MHC由MHC I、MHC II或其组合组成或包含MHCI、MHC II或其组合。在某些实施方案中，MHC由MHC I组成或包含MHC I。在某些实施方案中，MHC由MHC II组成或包含MHC II。在某些实施方案中，基因修饰是单链断裂、双链断裂、序列缺失、序列插入、序列取代或其任何组合。在某些实施方案中，序列缺失、序列插入、序列取代或其组合包含编码内含子、外显子、启动子、增强子、转录阻遏物、CpG位点或其任何组合的序列。在某些实施方案中，基因修饰包含编码β-2微球蛋白(β2M)的序列，且其中基因修饰减少或抑制MHC I的表达。在某些实施方案中，基因修饰包含编码HLA-DRα、CIITA或其组合的序列，且其中基因修饰减少或抑制MHC II的表达。在某些实施方案中，基因修饰包含编码α链(TCRα)、β链(TCRβ)或其组合的序列，且其中基因修饰减少或抑制TCR的表达。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种免疫细胞中的至少一种免疫细胞包含基因修饰且其中基因修饰减少或抑制T-细胞受体或主要组织相容性复合体(MHC)的表达的那些中，通过包含DNA结合结构域和内切核酸酶结构域的组合物引入基因修饰。在某些实施方案中，DNA结合结构域包含指导RNA。在某些实施方案中，DNA结合结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、着丝粒和启动子因子1 (Cpf1)或锌指核酸酶(ZFN)的序列。在某些实施方案中，Cas9是催化失活的Cas9 (dCas9)或短且催化失活的Cas9 (dsCas9)。

在某些实施方案中，本发明的dCas9包含分离或衍生自化脓性葡萄球菌的dCas9。在某些实施方案中，dCas9包含在失活催化位点的dCas9的氨基酸序列的位置10和840处具有取代的dCas9。在某些实施方案中，这些取代是D10A和H840A。在某些实施方案中，dCas9序列的位置1处的“ X”残基是甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，dCas9的氨基酸序列包含以下序列：

在某些实施方案中，本发明的dCas9包含分离或衍生自金黄色葡萄球菌的dCas9。在某些实施方案中，dCas9包含在失活催化位点的dCas9的氨基酸序列的位置10和580处具有取代的dCas9。在某些实施方案中，这些取代是D10A和N580A。在某些实施方案中，dCas9是小且失活的Cas9 (dSaCas9)。在某些实施方案中，dSaCas9的氨基酸序列包含以下序列：

在某些实施方案中，内切核酸酶结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或IIS型内切核酸酶的序列。在某些实施方案中，IIS型内切核酸酶是AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I、FokI或Clo051。在某些实施方案中，IIS型内切核酸酶是Clo051。在某些实施方案中，共价或非共价连接DNA结合结构域和内切核酸酶结构域。在某些实施方案中，共价连接DNA结合结构域和内切核酸酶结构域作为融合蛋白。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种免疫细胞中的至少一种免疫细胞包含基因修饰且其中基因修饰减少或抑制T-细胞受体或主要组织相容性复合体(MHC)的表达的那些中，多种免疫细胞包含静息细胞、活化的细胞或其组合。在某些实施方案中，多种免疫细胞包含活化的细胞。在某些实施方案中，多种免疫细胞包含静息细胞。在某些实施方案中，多种免疫细胞包含静息的CAR-T细胞、活化的CAR-T细胞或其组合。在某些实施方案中，多种免疫细胞包含活化的CAR-T细胞。在某些实施方案中，多种免疫细胞包含静息的CAR-T细胞。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种免疫细胞中的至少一种免疫细胞表达两种或更多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体。在某些实施方案中，多种免疫细胞中的一部分免疫细胞表达两种或更多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体。在某些实施方案中，该部分占多种免疫细胞中的至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比。在某些实施方案中，多种免疫细胞中的各免疫细胞表达两种或更多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体。在某些实施方案中，例如，第一CAR特异性结合第一靶配体，第二CAR特异性结合第二靶配体，且第一靶配体和第二靶配体是不同的。在某些实施方案中，第一靶配体和第二靶配体不是同源的。在某些实施方案中，第三或后续CAR特异性结合第三或后续靶配体。在某些实施方案中，第一靶配体、第二靶配体和第三或随后靶配体是不同的。在某些实施方案中，第一靶配体、第二靶配体和第三或随后靶配体不是同源的。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC，且靶HSC上的靶配体包含c-KIT/CD117、CD45、CD34、Thy1/CD90、c-mpl/CD110、CD133、CD49f、ABCG2/CD338、碳酸酐酶IX/CA9、CD123和CD150中的一种或多种。在某些实施方案中，消除靶HSC的多种免疫细胞中的至少一种包含特异性结合c-KIT的CAR，且，任选地，CAR包含以下氨基酸序列：

在某些实施方案中，消除靶HSC的多种免疫细胞中的至少一种包含特异性结合c-KIT的CAR，且，任选地，CAR包含以下氨基酸序列：

其中所述序列包含特异性结合c-KIT的scFv。在某些实施方案中，消除靶HSC的多种免疫细胞中的至少一种包含特异性结合c-KIT的CAR，且，任选地，CAR包含以下氨基酸序列：

其中所述序列包含特异性结合c-KIT的scFv。在某些实施方案中，消除靶HSC的多种免疫细胞中的至少一种包含特异性结合CD133的CAR，且，任选地，CAR包含以下氨基酸序列：

其中所述序列包含特异性结合CD133的scFv。在某些实施方案中，消除靶HSC的多种免疫细胞中的至少一种包含特异性结合CD133的CAR，且，任选地，CAR包含以下氨基酸序列：

其中所述序列包含特异性结合CD133的scFv。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含免疫细胞，且靶免疫细胞上的靶配体包含CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、TCRα、TCRβ、TCRαβ、TCRγλ、CD52、NK1.1、CD16、CD30、CD31、CD38、CD56、CD94、NKG2A、NKG2C、NKp30、NKp44、NKp46、CD9、CD103和KIR中的一种或多种。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC和免疫细胞，靶HSC上的靶配体包含c-KIT/CD117、CD45、CD34、Thy1/CD90、c-mpl/CD110、CD133、CD49f、ABCG2/CD338、碳酸酐酶IX/CA9、CD123和CD150中的一种或多种，且靶免疫细胞上的靶配体包含CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、TCRα、TCRβ、TCRαβ、TCRγλ、CD52、NK1.1、CD16、CD30、CD31、CD38、CD56、CD94、NKG2A、NKG2C、NKp30、NKp44、NKp46、CD9、CD103和KIR中的一种或多种。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR各自包含(a)包含配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，所述配体识别区包含蛋白支架、Centyrin、单链可变片段(scFv)、VHH、免疫球蛋白和抗体模拟物中的一种或多种。在某些实施方案中，免疫球蛋白是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM同种型的抗体或其片段。在某些实施方案中，抗体片段是互补决定区(CDR)、重链CDR(包括CDR1、CDR2和/或CDR3)、轻链CDR(包括CDR1、CDR2和/或CDR3)、抗原结合片段(Fab)、可变结构域(Fv)、重链可变区、轻链可变区、完整重链、完整轻链、一个或多个恒定结构域、Fc(可结晶片段)或其任何组合。在某些实施方案中，抗体模拟物包含affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin和avimer、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、Fynomer、Kunitz结构域肽和单体中的一种或多种。在某些实施方案中，CLR中的至少一种是双特异性的。在某些实施方案中，CLR各自是双特异性的。在某些实施方案中，CLR中的至少一种是三特异性的。在某些实施方案中，CLR各自是三特异性的。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR各自包含(a)包含配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含信号肽。在某些实施方案中，信号肽包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR各自包含(a)包含配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含信号肽。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含在配体识别区和跨膜结构域之间的铰链。在某些实施方案中，铰链包含衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR各自包含(a)包含配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含信号肽。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含在配体识别区和跨膜结构域之间的铰链。在某些实施方案中，跨膜结构域包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR各自包含(a)包含配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含信号肽。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含在配体识别区和跨膜结构域之间的铰链。在某些实施方案中，胞内域包含人CD3ζ胞内域。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR各自包含(a)包含配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含信号肽。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含在配体识别区和跨膜结构域之间的铰链。在某些实施方案中，胞内域包含人CD3ζ胞内域。在某些实施方案中，至少一个共刺激结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88、人OX-40细胞内区段，或其任何组合。在某些实施方案中，至少一个共刺激结构域包含人CD28和/或人4-1BB共刺激结构域。在某些实施方案中，4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物中的至少一种免疫细胞包含分裂CLR。在某些实施方案中，分裂CLR包含具有不同细胞内结构域的两种或更多种CLR，当在至少一种免疫细胞中同时表达时，与不表达分裂CLR的免疫细胞或不表达CLR的免疫细胞相比，其增加或降低免疫细胞的活性。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物中的至少一种免疫细胞包含分裂CLR。在某些实施方案中，包括其中同时表达增加免疫细胞的活性的那些中，分裂CLR包含：(a)第一CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由初级细胞内信号传导结构域组成的胞内域，和(b)第二CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由次级细胞内信号传导结构域组成的胞内域。在某些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域。在某些实施方案中，次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88或人OX-40细胞内区段。在某些实施方案中，次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB和人CD28。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物中的至少一种免疫细胞包含分裂CLR。在某些实施方案中，包括其中同时表达降低免疫细胞的活性的那些中，分裂CLR包含：(a)第一CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和包含初级细胞内信号传导结构域、次级细胞内信号传导结构域的胞内域，和(b)第二CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由抑制性细胞内信号传导结构域组成的胞内域。在某些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域，且次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88或人OX-40细胞内区段。在某些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域，且次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB和人CD28。在某些实施方案中，抑制性细胞内信号传导结构域包含衍生自PD1、CTLA4、LAG3、B7-H1、B7-1、CD160、BTLA、PD1H、LAIR1、TIM1、TIM3、TIM4、2B4和TIGIT的信号传导结构域。来自这些抑制性细胞内信号传导结构域和可以全部或部分使用的其他分子的另外细胞内信号传导组分，包括但不限于，ITIM、ITSM、YVKM、PP2A、SHP2、KIEELE和Y265。在某些实施方案中，第二CLR选择性结合非靶细胞上的靶标，由此诱导第二CLR抑制第一CLR的活性。在某些实施方案中，第二CLR抑制第一CLR诱导靶细胞或非靶细胞的死亡的能力。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR以选自以下的至少一种亲和力结合配体：小于或等于10⁻⁹M、小于或等于10⁻¹⁰M、小于或等于10⁻¹¹M、小于或等于10⁻¹²M、小于或等于10⁻¹³M、小于或等于10⁻¹⁴M和小于或等于10⁻¹⁵M的K_D。在某些实施方案中，K_D由表面等离振子共振测定。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。

在本发明的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用动员组合物。在某些实施方案中，依次施用包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物和动员组合物。在某些实施方案中，其中在施用包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物之前施用动员组合物。在某些实施方案中，在施用包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物之前一定时间段施用动员组合物，其中所述时间段足以允许HSC从骨髓迁移至例如循环血液，以增加包含多种免疫细胞的组合物进入靶HSC。在某些实施方案中，在施用包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物之前1天和7天之间(包括端点)施用动员组合物。在某些实施方案中，所述动员组合物包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、普乐沙福或其组合。

在本发明的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用有效量的预调节组合物，以增强包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物的植入和通过包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物消除至少一种靶细胞的效率。在某些实施方案中，预调节组合物抑制免疫系统。在某些实施方案中，预调节组合物包含化学疗法、放射疗法(包括但不限于局部放射和全身放射)、自身免疫疗法或抗排斥药。在某些实施方案中，预调节组合物不包含放射疗法、局部放射或全身放射。在某些实施方案中，预调节组合物包含一种或多种淋巴清除剂、清髓剂、化学治疗剂或其组合。在某些实施方案中，预调节组合物包含淋巴清除剂。示例性淋巴清除剂包括但不限于环磷酰胺和氟达拉滨。在某些实施方案中，预调节组合物包含清髓剂。示例性清髓剂包括但不限于低剂量和/或局部放射疗法。在某些实施方案中，预调节组合物包含选自白消安、曲奥舒凡、美法仑和噻替帕的化学治疗剂。

在本发明的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用有效量的预调节组合物，以增强包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物的植入和通过包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物消除至少一种靶细胞的效率。在某些实施方案中，在向受试者施用包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物之前向受试者施用预调节组合物。在某些实施方案中，在向受试者施用包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物之前1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟或其之间的任何分钟数向受试者施用预调节组合物。在某些实施方案中，在向受试者施用包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物之前1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时或其之间的任何小时数向受试者施用预调节组合物。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种免疫细胞中的至少一种免疫细胞在施用于受试者之前进行预辐照。在本发明的方法的某些实施方案中，多种免疫细胞中的一部分免疫细胞在施用于受试者之前进行预辐照。在某些实施方案中，该部分占多种免疫细胞中的至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比。在某些实施方案中，多种免疫细胞中的每种免疫细胞在施用于受试者之前进行预辐照。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种免疫细胞中的至少一种或每种免疫细胞在施用于受试者之前进行预辐照的那些中，消除多种免疫细胞的步骤包括向受试者施用有效量的多种预辐照的免疫细胞，由此防止多种预辐照的免疫细胞的增殖和/或缩短多种预辐照的免疫细胞的存活。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种免疫细胞中的每种免疫细胞包含诱导型胱天蛋白酶多肽或编码诱导型胱天蛋白酶多肽的序列。在某些实施方案中，诱导型胱天蛋白酶多肽包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)截短的胱天蛋白酶9多肽。在某些实施方案中，诱导型胱天蛋白酶多肽不包含非-人序列。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种免疫细胞中的每种免疫细胞包含诱导型胱天蛋白酶多肽或编码诱导型胱天蛋白酶多肽的序列的那些中，消除多种免疫细胞的步骤包括向受试者施用有效量的诱导剂以诱导胱天蛋白酶多肽，由此起始免疫细胞的死亡。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种治疗性HSC中的每种HSC包含诱导型胱天蛋白酶多肽或编码诱导型胱天蛋白酶多肽的序列。在某些实施方案中，诱导型胱天蛋白酶多肽包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)截短的胱天蛋白酶9多肽。在某些实施方案中，诱导型胱天蛋白酶多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用包含诱导剂的组合物，由此起始多种治疗性HSC的死亡。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种免疫细胞中的每种免疫细胞包含诱导型胱天蛋白酶多肽或编码诱导型胱天蛋白酶多肽的序列的那些中，包含多种免疫细胞(其各自包含一种或多种CLR)的组合物进一步包含诱导剂。在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种免疫细胞中的每种免疫细胞包含诱导型胱天蛋白酶多肽或编码诱导型胱天蛋白酶多肽的序列的那些中，包含多种治疗性HSC的组合物进一步包含诱导剂。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC包含基因修饰。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的一部分HSC包含基因修饰。在某些实施方案中，该部分占多种治疗性HSC中的至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的每种HSC包含基因修饰。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种治疗性HSC中的至少一种HSC包含基因修饰的那些中，基因修饰是单链断裂、双链断裂、序列缺失、序列插入、序列取代或其任何组合。在某些实施方案中，序列缺失、序列插入、序列取代或其组合包含编码内含子、外显子、启动子、增强子、转录阻遏物、CpG位点或其任何组合的序列。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种治疗性HSC中的至少一种HSC包含基因修饰的那些中，通过包含DNA结合结构域和内切核酸酶结构域的组合物引入基因修饰。在某些实施方案中，DNA结合结构域包含指导RNA。在某些实施方案中，DNA结合结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、着丝粒和启动子因子1 (Cpf1)或锌指核酸酶(ZFN)的序列。

在某些实施方案中，内切核酸酶结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或IIS型内切核酸酶的序列。在某些实施方案中，IIS型内切核酸酶是AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I、FokI或Clo051。在某些实施方案中，IIS型内切核酸酶是Clo051。在某些实施方案中，共价或非共价连接DNA结合结构域和内切核酸酶结构域。在某些实施方案中，共价连接DNA结合结构域和内切核酸酶结构域作为融合蛋白。在本发明的某些实施方案中，核酸酶结构域可以包含dSaCas9和Clo051，基本上由其组成或由其组成。示例性Clo051核酸酶结构域可包含以下氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：

示例性dCas9-Clo051核酸酶结构域可以包含以下氨基酸序列(Clo051序列加下划线(SEQ ID NO:34)，接头为粗体斜体，dCas9序列为斜体)，基本上由其组成或由其组成：

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中多种治疗性HSC中的至少一种HSC包含基因修饰的那些中，通过诱导同源重组、插入单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)或转座事件来引入基因修饰。在某些实施方案中，基因修饰导致序列的插入。在某些实施方案中，转座事件导致功能性转基因的插入。在某些实施方案中，转座子包含功能性转基因，且其中转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，包含转座子的HSC进一步包含超级piggyBac转座酶。

在本发明的方法的某些实施方案中，至少一种靶HSC包含基因修饰，通过诱导同源重组、插入单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)或转座事件来引入基因修饰。在某些实施方案中，基因修饰导致序列的插入。在某些实施方案中，转座事件导致功能性和/或治疗性转基因的插入。在某些实施方案中，转座子包含功能性和/或治疗性转基因，且其中转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，包含转座子的至少一种靶HSC进一步包含超级piggyBac转座酶。在某些实施方案中，至少一种靶HSC是受试者的内源性HSC。

本发明提供了包含本发明的转座子的组合物。在某些实施方案中，组合物可进一步包含含有编码转座酶的序列的质粒。编码转座酶的序列可以是mRNA序列。

本发明的转座子可包含piggyBac转座子。本发明的转座子可包括piggyBac转座酶或相容酶。在某些实施方案中，且尤其是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，且尤其是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。

在本发明的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac™ (PB)转座酶。piggyBac(PB)转座酶可包含与以下序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比同一性的氨基酸序列或由其组成：

在本发明的方法的某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个处的氨基酸取代：

在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™(PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO:1的序列的位置30、165、282或538的两个或更多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO:1的序列的位置30、165、282或538的三个或更多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggyBac™ (PB)转座酶，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO:1的序列的以下位置30、165、282或538的每一个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 1的序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些实施方案中，SEQID NO: 1的序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1的序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。

在本发明的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，本发明的超级piggyBac™ (SPB)转座酶可包含SEQ ID NO: 1的序列的氨基酸序列或由其组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)，且位置538的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，超级piggyBac™ (SPB)转座酶可包含与以下序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比同一性的氨基酸序列或由其组成：

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案中，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列的以下位置中的一个或多个处的氨基酸取代：3、46、82、103、119、125、 177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案中，piggyBac™或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在以下位置中的一个或多个处的氨基酸取代：46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570。在某些实施方案中，SEQID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置82的氨基酸取代是色氨酸(W)取代异亮氨酸(I)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置177的氨基酸取代是组氨酸(H)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 2的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 1或SEQ ID NO: 2的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置200的氨基酸取代是色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置235的氨基酸取代是精氨酸(R)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 2的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代苯丙氨酸(F)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 1或SEQ ID NO: 2的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置296的氨基酸取代是色氨酸(W)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(P)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 2的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ IDNO: 1或SEQ ID NO: 2的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代苏氨酸(T)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置327的氨基酸取代是精氨酸(R)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代酪氨酸(Y)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代半胱氨酸(C)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQID NO: 2的位置421的氨基酸取代是组氨酸(H)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(Y)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)取代亮氨酸(L)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 1的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代缬氨酸(V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(T)取代丙氨酸(A)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代谷氨酰胺(Q)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置591的氨基酸取代是精氨酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的一个或多个处的氨基酸取代。在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ IDNO: 1或SEQ ID NO: 2的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的2、3、4、5、6或更多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含或超级piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置372的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代精氨酸(R)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(A)取代赖氨酸(K)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(G)取代丝氨酸(S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 1的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 1的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案中，piggyBac™转座酶可进一步包含在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 1的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 1的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，和在SEQ ID NO: 1的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBac™转座酶可包含在SEQ ID NO: 1的位置194的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，在SEQ ID NO: 1的位置372的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代，在SEQ ID NO: 1的位置375的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代，和在SEQ ID NO: 1的位置450的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。

在本发明的方法的某些实施方案中，所述受试者是人。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有免疫系统疾病或病症，或受试者处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有自身免疫性疾病或病症。在某些实施方案中，所述自身免疫性疾病或病症是急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生氏病、丙种球蛋白缺乏症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴洛病、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman病、乳糜泻、查加斯病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性脊髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、克罗恩氏病、柯根综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST疾病、基本混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic氏疾病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、埃文斯综合征、纤维化小泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球性肾炎、Goodpasture氏综合征、伴有多血管炎的肉芽肿(GPA)、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜、妊娠疱疹、低血球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木质部结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(SLE、莱姆病、慢性梅尼埃病、显微多发性血管炎、混合性结缔组织病(MCTD)、穆伦氏溃疡、Mucha-Habermann疾病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、嗜睡症、视神经脊髓炎(Devic's)、中性粒细胞减少症、眼部疤痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型自身免疫性多腺综合征、II型自身免疫性多腺综合征、III型自身免疫性多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕激素皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞发育不良、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、赖特氏综合征、复发性多软骨炎、不安腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、Schmidt综合征、巩膜炎、硬皮病、Sjogren氏综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、susac氏综合征、交感性眼炎、Takayasu氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病或白癜风。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者是免疫受损的。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有炎性疾病。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有免疫系统疾病或病症或受试者处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。在某些实施方案中，受试者具有免疫系统疾病或病症的遗传或表观遗传标记。在某些实施方案中，免疫系统疾病或病症由医学干预诱导。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有免疫系统疾病或病症的遗传或表观遗传标记。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，癌症是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或恶性免疫增殖性疾病。在某些实施方案中，所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T-细胞淋巴瘤(AILT)、肝脾性T-细胞淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、网状内皮病、网状细胞增多症、小神经胶质瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、Waldenström氏巨球蛋白血症、结节性边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B-细胞淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿或结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，癌症是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或恶性免疫增殖性疾病。在某些实施方案中，所述白血病是浆细胞白血病(PCL)、急性红红血球增多症和红血球白血病、急性红斑性骨髓病、急性红系白血病、Heilmeyer-Schöner疾病、急性成巨核细胞白血病(AMKL)、肥大细胞白血病、泛髓性白血病、伴有骨髓纤维化的急性骨髓炎(APMF)、淋巴肉瘤细胞白血病、成骨期慢性骨髓性白血病、干细胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、真性红细胞增多症、急性早幼粒细胞性白血病、急性嗜碱性粒细胞白血病、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、伴有成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突细胞白血病、成人T-细胞白血病/淋巴瘤、侵袭性NK-细胞白血病、B-细胞幼淋巴细胞性白血病、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病、B-细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性髓单核细胞性白血病、慢性中性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性特发性骨髓纤维化。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，癌症是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或恶性免疫增殖性疾病。在某些实施方案中，所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤、卡勒氏病、骨髓瘤病、孤立性骨髓瘤、浆细胞白血病、髓外浆细胞瘤、恶性浆细胞肿瘤或浆细胞瘤。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，癌症是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或恶性免疫增殖性疾病。在某些实施方案中，恶性免疫增殖性疾病是α重链疾病或γ重链疾病。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，疾病或病症是贫血。在某些实施方案中，所述贫血是溶血性贫血、自身免疫溶血性贫血、先天性溶血性贫血、再生障碍性贫血、β-地中海贫血、先天性类红细胞发育不全、先天性红细胞生成障碍性贫血、葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症、范可尼贫血、遗传性球形细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性热异形细胞增多症、胎儿血红蛋白的遗传性持续性、遗传性口形红细胞增多症、己糖激酶缺乏症、过度贫血、低色素性贫血、红细胞生成无效、大红细胞贫血、巨成红细胞贫血、骨髓病性贫血、神经棘红细胞增多症、舞蹈性棘红动物增多症(chorea-acanthocytosis)、阵发性夜间血红蛋白尿、丙酮酸激酶缺乏症、Rh缺乏综合征、镰状细胞病、铁粒幼细胞性贫血、造口性卵形红细胞增多症(stomatocytic ovalocytosis)、地中海贫血、磷酸丙糖异构酶(TPI)缺乏或温热的自身免疫性溶血性贫血。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，疾病或病症是凝血病症或出血性病况。在某些实施方案中，疾病或病症是凝血病症。在某些实施方案中，所述凝血病症是去纤维化综合征、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、因子V Leiden、血小板增多、血栓形成、复发性血栓形成、抗磷脂综合征、原发性抗磷脂综合征或血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，疾病或病症是凝血病症或出血性病症。在某些实施方案中，疾病或病症是出血性病况。在某些实施方案中，所述出血性病况是血小板减少症、血友病、血友病A、血友病B、血友病C、冯威勒布兰德病(vWD)、遗传性冯威勒布兰德病(vWD)、1型vWD、2型vWD、3型vWD、Glanzmann氏血小板无力症或Wiskott-Aldrich综合征(WAS)。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在可以被包含多种治疗性HSC的组合物接触的次级靶细胞中显现。在某些实施方案中，次级靶细胞是干细胞或祖细胞。在某些实施方案中，干细胞是体干细胞。在某些实施方案中，干细胞是靶HSC、间充质干细胞、表皮干细胞、上皮干细胞、神经干细胞。在某些实施方案中，次级靶细胞是分化的细胞。在某些实施方案中，分化的细胞是红血细胞、白血细胞、单核细胞、粒细胞、血小板或树突细胞。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在可以被包含多种治疗性HSC的组合物接触的次级靶细胞中显现。在某些实施方案中，次级靶细胞是干细胞或祖细胞。在某些实施方案中，祖细胞是成骨细胞。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种HSC被修饰以分泌增强成骨细胞的活性的配体、肽或蛋白。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物治疗或预防与异常成骨细胞功能相关的疾病或病症。在某些实施方案中，受试者具有与异常成骨细胞功能相关的疾病或病症的一种或多种遗传或表观遗传标记。在某些实施方案中，与异常成骨细胞功能相关的疾病或病症是佩吉特氏病、低磷酸盐血症或骨质疏松症。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在可以被包含多种治疗性HSC的组合物接触的次级靶细胞中显现。在某些实施方案中，次级靶细胞是分化的细胞。在某些实施方案中，分化的细胞是红血细胞、白血细胞、单核细胞、粒细胞、血小板或树突细胞。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种HSC被修饰以分泌增强粒细胞的活性的配体、肽或蛋白。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物治疗或预防与异常粒细胞功能相关的疾病或病症。在某些实施方案中，受试者具有与异常粒细胞功能相关的疾病或病症的一种或多种遗传或表观遗传标记。在某些实施方案中，与异常粒细胞功能相关的疾病或病症是慢性肉芽肿性疾病。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有免疫系统疾病或病症或受试者处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。在某些实施方案中，免疫系统疾病或病症由医学干预诱导。在某些实施方案中，受试者由于过去、现在或将来的医学干预而处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有免疫系统疾病或病症或受试者处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。在某些实施方案中，免疫系统疾病或病症由感染诱导。在某些实施方案中，受试者由于过去、现在或潜在的感染而处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。在某些实施方案中，感染是病毒、细菌和/或微生物感染。在某些实施方案中，感染是病毒感染。在某些实施方案中，感染是病毒感染，且受试者由于感染而变得免疫受损。在某些实施方案中，受试者暴露于HIV或被HIV感染。在某些实施方案中，受试者已发展AIDS。在某些实施方案中，感染是病毒感染。在某些实施方案中，感染是病毒感染，且受试者发展癌症。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物的施用是全身性的。在某些实施方案中，所述组合物经由静脉内途径施用。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物的施用是局部的。在某些实施方案中，所述组合物经由骨内、脊柱内或脑内输注施用。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物的施用是全身性的。在某些实施方案中，所述组合物经由静脉内途径施用。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物的施用是局部的。在某些实施方案中，所述组合物经由骨内输注施用。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物进一步包含诱导剂。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC进行基因修饰。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的每种HSC进行基因修饰。

在本发明的方法的某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC进行基因修饰。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的每种HSC进行基因修饰。在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有免疫疾病或病症，且其中多种治疗性HSC改善免疫疾病或病症的体征或症状。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC进行基因修饰以改善受试者的免疫疾病或病症的体征或症状。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的每种HSC进行基因修饰以改善受试者的免疫疾病或病症的体征或症状。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现，且多种治疗性HSC改善疾病或病症的体征或症状。在某些实施方案中，疾病或病症是凝血病症。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC已被修饰以分泌改善凝血病症的体征或症状的蛋白。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的大多数HSC已被修饰以分泌改善凝血病症的体征或症状的蛋白。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的每种HSC已被修饰以分泌改善凝血病症的体征或症状的蛋白。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC、大多数HSC或每种HSC被修饰以分泌改善凝血病症的体征或症状的蛋白。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC、大多数HSC或每种HSC被修饰以分泌一种或多种凝血因子。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有糖原储存疾病或病症的遗传或表观遗传标记，且多种治疗性HSC改善糖原储存疾病或病症的体征或症状。在某些实施方案中，糖原储存疾病或病症是0型糖原储存疾病(GSD)、I型GSD、II型GSD、III型GSD、IV型GSD、V型GSD、VI型GSD、VII型GSD、IX型GSD、X型GSD、XI型GSD、XII型GSD或XIII型GSD。在某些实施方案中，多种治疗性HSC中的至少一种HSC、大多数HSC或每种HSC被修饰以分泌糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸酶、酸性α-葡糖苷酶、糖原脱支酶、糖原分支酶、肌肉糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖转运蛋白GLUT2、醛缩酶A或β-烯醇酶中的一种或多种，且其中多种治疗性HSC分别改善0型GSD、I型GSD、II型GSD、III型GSD、IV型GSD、V型GSD、VI型GSD、VII型GSD、IX型GSD、X型GSD、XI型GSD、XII型GSD或XIII型GSD的体征或症状。

在本发明的方法的某些实施方案中，受试者具有免疫系统疾病或病症的遗传或表观遗传标记，多种治疗性HSC中的至少一种HSC、一部分HSC或每种HSC包含基因修饰，且多种治疗性HSC中的至少一种HSC、一部分HSC或每种HSC不包含遗传或表观遗传标记。在某些实施方案中，基因修饰除去遗传或表观遗传标记。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种HSC是自体的。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的每种HSC是自体的。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种基因修饰的HSC是自体的。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的每种基因修饰的HSC是自体的。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种HSC是同种异体的。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的每种HSC是同种异体的。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种基因修饰的HSC是同种异体的。在某些实施方案中，包含多种治疗性HSC的组合物中的每种基因修饰的HSC是同种异体的。

在本发明的方法的某些实施方案中，所述方法治疗或预防移植物抗宿主病(GvHD)的发作或进展。在某些实施方案中，治疗GvHD包括减少GvHD的体征或症状。在某些实施方案中，所述GvHD是急性GvHD。在某些实施方案中，所述GvHD是慢性GvHD。在某些实施方案中，GvHD的体征或症状包括皮疹、皮肤起泡、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻、食欲不振、黄疸、口干、喉咽干燥、过度口干、过度喉咽干燥、口腔或咽喉的溃疡、支气管组织干燥、内皮组织干燥、表面组织干燥、皮肤斑块脱落、皮肤变色、皮肤瘢痕形成、伴随皮肤瘢痕形成的关节活动度降低、伴随皮肤损伤的脱发、导致干眼的流泪形成丧失或其任何组合。

在本发明的方法的某些实施方案中，包括其中所述方法治疗或预防移植物抗宿主病(GvHD)的发作或进展的那些中，所述受试者是移植受体。在某些实施方案中，在施用所述移植物之前将所述包含多种治疗性HSC的组合物施用于所述受试者，且其中所述多种治疗性HSC和所述移植物分离或源自同一供体。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在施用足以耐受所述受试者的免疫系统对所述移植物的耐受的包含多种HSC的组合物之后的一段时间。在某些实施方案中，所述移植物包括细胞、组织、组织移植物、器官、器官移植物或其任何组合。在某些实施方案中，所述器官是实体器官。

附图简述

图1是描绘本发明的示例性诱导型截短的胱天蛋白酶9多肽的示意图。

图2A-B是一系列图，其描绘使用示例性诱导剂AP1903评估本发明的诱导型促凋亡多肽(iC9安全开关)的体外效力的结果。将本发明的表达CARTyrin的细胞A)解冻并静置过夜，或B)使用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂活化5天，用指定浓度的AP1903处理指定的时间长度。所有数据点均一式三份收集，并通过将处理组中的活细胞数除以每收集1500个珠事件的未处理组中平均活细胞数来测定相对活力。在测试的所有剂量水平间，在24小时从培养物消除未活化的表达CARTyrin的细胞中的大于80%。在未活化的细胞中，在24小时和48小时时间点之间没有可观察到的差异。然而，在活化的表达CARTyrin的细胞中，观察到剂量应答和时间应答。在施用AP1903后12小时，>65%的细胞被低至1 nM的浓度杀死。数据表明，iC9安全开关在表达CARTyrin的细胞中既功能上表达，又有效。当与未活化的细胞相比时，AP1903/iC9系统当针对活化的细胞使用时更有效。在活化细胞后，CARTyrin的表达增加，并提供载体设计；iC9的表达也可增加。因此，活化的细胞可表达更高水平的iC9，使其对AP1903更敏感。在许多实施方案中，如果且当使用安全开关时，活化的细胞将是靶标。这些数据证实，活化的细胞确实对AP1903更敏感，其中>95%的细胞在48小时时被杀死。

图3是示意图，其将在移植前使用遗传毒性剂如全身辐照或白消安消除HSC的传统方法(顶部序列)与本发明的方法(底部序列)进行对比。如该图中所示，本发明的组合物和方法产生非遗传毒性的方法，所述方法在移植后实现HSC的优异移植，所述移植有功能并维持健康水平的血细胞产生。

图4是描绘用于自体或异源CAR串联靶向以使非HSC(包括造血祖细胞(HPC))的耗竭最小化的可能的表面HSC标记组合的示意图。

图5A是描绘具有针对表达c-kit或CD133的细胞的ScFv序列的CAR构建体的示意图。CAR构建体描绘与示例性信号结构域偶联的示例性CAR序列，所述信号结构域由用于产生CAR-T细胞的mRNA编码。

图5B是示例性c-kit ScFv(1) (SEQ ID NO:69)、c-kit ScFv (2) (SEQ ID NO:70)、c-kit ScFv (3) (SEQ ID NO:71)、c-kit ScFv (4) (SEQ ID NO:72)、c-kit ScFv(5) (SEQ ID NO:73)、c-kit ScFv (6) (SEQ ID NO:74)和c-kit ScFv (7) (SEQ ID NO:75)的一系列序列，其可用于图5A中描绘的示例性CAR中。

图5C是示例性c-kit ScFv (8) (SEQ ID NO:76)；示例性c-kit配体(1) (SEQ IDNO:77)、c-kit配体(2) (SEQ ID NO:78)和小鼠c-kit配体(SEQ ID NO:79)；和示例性CD133scFv(1) (SEQ ID NO:80)、CD133 scFv(2) (SEQ ID NO:81)和CD133 scFv(3) (SEQ IDNO:82)的一系列序列，其可用于图5A中描绘的示例性CAR中。

图5D是示例性CD133 scFv(4) (SEQ ID NO:83)、CD133 scFv(5) (SEQ ID NO:84)、CD133 scFv(6) (SEQ ID NO:85)、CD133 scFv(7) (SEQ ID NO:86)和CD133 scFv(8)(SEQ ID NO:87)的一系列序列，其可用于图5A中描绘的示例性CAR中。还提供了图5A中描绘的示例性CAR CAR的序列(SEQ ID NO:88)。

图6A-E是一系列图，其描绘评估CAR-T细胞在特异性靶向表达c-kit (CD117)或prominin-1 (CD133)的人造血细胞中的体外效力的结果。用编码针对c-kit或CD133的每种CAR候选物的mRNA电穿孔从人外周血分离的CD3/CD28刺激的泛T细胞(图5)。引入mRNA后的第二天，通过抗小鼠IgG染色和流式细胞术测定抗体指导的ScFv序列的CAR表达(图6A)。通过根据在5小时时的CD107a表达的脱粒，证明在靶细胞存在的情况下效应CAR-T细胞的活化(效应物:靶细胞比率为3:1)。当与不表达c-kit的Raji细胞以5%比例混合时，内源性和均一表达c-kit的TF-1细胞引发针对c-kit的CAR-T细胞的最高活化，而活化较少(图6B)。对于与人骨髓细胞的共培养相似地观察到CAR-T细胞活化，但在与表达c-kit的小鼠EML-C1细胞系共培养后，没有观察到超过模拟的CAR-T对照细胞的显著活化(图6B)。电穿孔编码CD133的mRNA后，使得TF-1细胞能够表达CD133，如通过抗CD133抗体染色和流式细胞术所确定(数据未显示)。这些转染的细胞使得能够活化携带八种抗CD133 ScFv序列中的四种的CAR-T细胞。对于与不表达CD133的Raji细胞以5%的比例混合的表达CD133的TF-1细胞或对于人骨髓细胞，显示抗CD133 CAR-T刺激较少(图6C)。在CAR-T细胞与人骨髓共培养2天(效应细胞:靶细胞比率为3:1)后，将细胞用抗人CD34、CD117和CD133抗体染色并通过流式细胞术进行分析，或铺板于补充有人生长因子(MethoCult™, H4434)的甲基纤维素培养物中，用于经12天生成造血集落(CFU)。CD34阳性群体内的流式细胞术分析显示，对于6种抗c-kit CAR-T细胞候选物中的3种，c-kit阳性细胞的比例降低，且对于7种抗CD133 CAR-T候选物中的3种，CD133阳性细胞的比例降低(图6D)。CFU存活测定显示对于8种抗c-kit CAR-T细胞候选物中的7种，功能性造血祖细胞耗竭最高达85%(图6E)。

图7是描绘用于靶向HSC的piggyBac (PB)转座子载体的示意图。延伸因子-1α(EF1α)用作组成型启动子，以驱动由诱导型截短的胱天蛋白酶9 (iCasp9)、嵌合抗原受体(CAR)和二氢叶酸还原酶抗性(DHFR)基因组成的三顺反子盒。CAR区包含来自抗人c-kit和CD133IgG的可变区(VL和VH ScFv序列)，其与由CD8a前导肽、CD8a铰链、CD8a跨膜(TM)结构域、41BB共刺激结构域和CD3 ζ链组成的信号传导结构域偶联。指示SV40多聚A信号和250 bpcHS4染色质绝缘子。在转座期间，共同输送的PB转座酶识别位于转座子载体的两个末端的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并有效地从递送的DNA质粒中的原始位点移除内容物，并将其有效地整合至TTAA染色体位点中。

图8A是一系列图，其描绘piggyBac (PB)转座的抗CD117或抗CD133 CAR-T细胞的流式细胞术分析。先前将人外周血T-细胞用PB转座子pDNA(图7)连同编码超级piggyBac(SPB)转座酶的mRNA电穿孔。使用针对CD3、CD4、CD8、CD56、CD45RA、CD62L、CCR7、CD45RO、PD1、Tim3、Lag3、CD184/CXCR4、CD25、CD127和CD28的抗体进行表型分析。

图8B是一系列图，其描绘在图8A中所示的每种条件下存在的CD4和CD8阳性T细胞的比例。

图8C是一系列图，其描绘piggyBac (PB)转座的抗CD117或抗CD133 CAR-T细胞的流式细胞术分析。先前将人外周血T-细胞用PB转座子pDNA(图7)连同编码超级piggyBac(SPB)转座酶的mRNA电穿孔。使用针对CD3、CD4、CD8、CD56、CD45RA、CD62L、CCR7、CD45RO、PD1、Tim3、Lag3、CD184/CXCR4、CD25、CD127和CD28的抗体进行表型分析。

图8D是一系列图，其描绘在图8C中所示的每种条件下存在的CD4和CD8阳性T细胞的比例。

图9A-B是一对图，其描绘通过piggyBac (PB)转座的CAR-T细胞靶向后骨髓造血祖细胞的存活百分比。在CAR-T细胞与人或猴(猕猴)骨髓细胞共培养2天(效应细胞:靶细胞比率为3:1)后，将细胞铺板于补充有人生长因子(MethoCult™, H4434)的甲基纤维素培养物中，用于经12天生成造血集落(CFU)。CFU存活测定显示对于8种抗c-kit CAR-T细胞候选物中的3种，人功能性造血祖细胞耗竭超过70 %(图9A)。编码这些相同的抗c-kit ScFv序列的CAR-T细胞也耗竭来自猴骨髓的造血祖细胞，以表明与该物种的交叉反应性。

图10A-D是一对图，其显示抗c-kit和抗CD133 CAR-T细胞耗竭鹅卵石区域形成细胞(CAFC)。将人mPB CD34+细胞与编码c-kit ScFv (2)的抗c-kit CAR-T细胞(效应细胞:靶细胞比率为3:1)或编码CD133 ScFv (3)的抗CD133 CAR-T细胞共培养24小时(图5)。然后将共培养物再用10 nM AP1903处理24小时，以除去归因于piggyBac转座子中iC9的共表达的CAR-T细胞(图1)，并将细胞在补充有10^-6 M氢化可的松的MyeloCult培养基(Stem CellTechnologies)中的连续稀释液中铺板于96孔板中的预先建立和辐照(30 Gy)的MS-5骨髓基质细胞层上。在LTC中的第2周和第5周，对CAFC形成阳性或阴性的孔计数，并使用L-Calc软件(Stem Cell Technologies)通过有限稀释分析测定CAFC频率和数目。

图11A-B是描绘示例性PB载体构建体和制造方法的一系列图：(A)组成型启动子用于驱动由安全开关、嵌合抗原受体(CAR)和具有侧接染色质绝缘子的选择基因组成的三顺反子盒；(B)从单采血液分离术产物中分离泛T细胞，且然后用抗CD117或抗CD133 CARpiggyBac™转座子质粒DNA和体外转录的piggyBac™转座酶mRNA电穿孔。然后将电穿孔的细胞活化，扩增，并选择，然后冷冻。该过程产生>1 x 10⁹个细胞，其中CAR表达>95%。

图12A-B是描绘示例性PB CAR-T表型的一系列图：在制造过程之后，通过流式细胞术评估针对CD117和CD133抗原的PB CAR-T细胞的典型T细胞标记。(A)表达CD4、CD8和记忆标记，其表明PB CAR-T细胞的干细胞记忆表型；(B) PB CAR-T细胞表达CXCR4，通常与骨髓归巢相关的标记。

图13A-B是一系列图，其描绘抗CD117或CD133 CAR-T细胞针对CD34⁺CD38^-祖细胞群体的示例性活性和来自动员的外周血CD34⁺细胞的CFU：从动员的人外周血分离的CD34⁺细胞与抗c-kit和CD133 CAR-T细胞孵育48小时，随后进行剩余细胞的FACS表型分析(A)和CFU存活测定(B)。抗CD117 CAR-T耗竭来自原始CD34⁺CD38^-群体的ckit⁺和CD133⁺细胞的> 95%，而抗CD133 CAR-T耗竭来自该群体的CD133+细胞的>90%(A)。抗CD117和CD133 CAR-T细胞在测试的所有E:T比率下也都减少集落形成。

图14是一对图和相应的照片，其描绘抗CD117或CD133 CAR-T细胞针对长期鹅卵石区域形成细胞(CAFC)的示例性活性：在CAR-T细胞与动员的人外周血CD34+细胞共培养2天(效应细胞:靶细胞比率为3:1)后，将细胞经连续稀释液铺板于MS-5基质细胞上，用于经2个月生成CAFC。铺板后5周，两种CAR-T细胞均显著降低CAFC的频率，表明这些CAR-T细胞成功靶向非常原始的细胞。

图15A-C是描绘PB CAR-T细胞的骨髓归巢的一系列图：在有(+)或没有(-)因子的情况下培养PB CAR-T细胞以增加CXCR4表达。来自每个处理组的细胞分别进行标记，混合，且IV注射至4周龄、经辐照的NSG小鼠中。(A)用添加的因子培养24小时后，CXCR4表达增加；(B)输入细胞比率；(C)注射细胞后16h，无论处理如何，均在血液或骨髓中以相等比率发现CAR-T细胞。

详述

本发明的组合物和方法利用表达嵌合配体/抗原受体(CLR/CAR)的基因修饰的免疫细胞来选择性消除受试者中的靶细胞。此外，一旦本发明的组合物和方法具有选择性消除的靶细胞，它们就使得能够选择性消除这些表达CLR/CAR的免疫细胞。尤其感兴趣的是，本发明的组合物和方法使得能够随后移植治疗性细胞，所述治疗性细胞也可已经被基因修饰以校正存在于被选择性破坏的受试者的天然细胞中的遗传缺陷，替换被选择性破坏的细胞群体或补充受试者的天然细胞群体，以治疗基于遗传、免疫和血液的病症，包括癌症。

本发明的组合物和方法提供了“药物可逆的” CAR-T细胞或多种针对受体造血细胞的细胞，作为干细胞移植的选择性调节策略。自体或同种异体造血干细胞(HSC)的移植具有证明的治疗多种多样恶性和非恶性血液病的能力。然而，制备方案通常需要用全身照射和/或化学疗法进行侵袭性和遗传毒性的治疗，这带来严重且甚至危及生命的并发症，限制其更广泛的应用。先前的实验研究已经确定，受体HSC的耗竭是这些调节方案在允许成功植入复合供体HSC中的必不可少的要求。动物和临床研究也已表明，同种反应性抗HSC供体T细胞另外促进干细胞移植，但这经常伴随GvHD的风险。这已促进考虑用于耗竭HSC而毒性副作用较小的替代性调节方法，如抗c-kit和抗CD45抗体指导的治疗。以这种方式，还可以通过将短寿命的基因工程改造的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞应用于干细胞移植调节来实现更精确的HSC靶向。

我们使用非病毒的piggyBac™ (PB)转座子系统开发了一种新型且可控制的用于经由基因修饰的受体HSC靶向的CAR-T方法。与病毒载体递送系统相反，PB的相对大的携带容量允许稳定引入在相同三顺反子转基因盒中编码的至少三个分开的基因。这包括靶向人c-kit(CD117)或prominin-1(CD133)(已知在HSC表面上抗原表达的标记)的第二代CAR。另外，抗药性元件充当选择基因，其与非遗传毒性药物组合，提供了在制造期间纯化CAR-T细胞的有效方法。重要的是，还包括小分子药物诱导型安全开关基因，以促进受体HSC耗竭后和供体HSC移植前CAR-T细胞的快速体内清除。最后，作为制造过程的结果，大多数CAR-T细胞表达趋化因子受体(如CXCR4)，其可以允许更选择性运输至骨髓(BM)，用于根除驻留的HSC。

为了从一组抗HSC CAR构建体选择领先的候选物，首先用编码针对c-kit或CD133的每种CAR候选物的mRNA电穿孔来自人外周血的CD3/CD28刺激的T细胞。通过流式细胞术在转染的T细胞中证实CAR表面表达。通过将mRNA转染的CAR-T细胞与表达c-kit或CD133的小鼠或人细胞系(EML-C1、TF-1和K562)以及小鼠和人原代BM细胞共培养来进行体外功能测定。根据CD107a表达和IFNγ的分泌，通过脱粒作用从CAR-T细胞的特异性活化中鉴定领先的CAR候选物。此外，那些CAR也能够选择性耗竭c-kit或CD133阳性细胞。有趣的是，一些mRNA转染的CAR-T细胞甚至在其可溶性配体、干细胞因子存在的情况下，也保留针对靶标c-kit+ TF-1细胞的效应子活性。接下来，在相同的三顺反子转基因中，将领先的CAR候选物与选择和药物诱导型安全开关基因共表达，且然后使用PB稳定地递送至T细胞。制造过程产生主要为T记忆干细胞(Tscm)表型的CAR-T细胞，如通过CD62L和CD45RA的阳性表达所确定，并且还表达高水平的CXCR4趋化因子受体。与mRNA转染的CAR-T细胞相似，这些稳定转座的细胞能够具有广泛的效应子功能，包括表达c-kit或CD133的靶细胞的特异性耗竭。

未来的研究将在具有预先建立的异种人造血嵌合体的免疫缺陷NSG小鼠中评估PB产生的领先的抗HSC CAR-T细胞，连同标准的白消安或辐照调节对照。该方法构成一种新型的靶向生物疗法，设想其导致耗竭BM中的内源性HSC的最小毒性移植方案的方式，并用移植的同种异体或基因校正的干细胞替代它们。

在HSC移植前的替代的调节疗法的需求：在美国，每年超过5,000个患者在HSC移植前用清髓性调节方案治疗。这些调节方案中的大多数由高剂量的遗传毒性辐照或白消安组成，其主要作为HSC耗竭剂应用，但受重大的威胁生命的并发症的限制。针对HSC上表达的抗原(如c-kit和CD45)的单克隆抗体已被视为替代物。CAR-T细胞可提供骨髓中驻留的HSC的更有效、选择性和更安全的耗竭。PiggyBac™-产生的CAR-T细胞是一种具有大载货容量的非病毒系统，其允许引入多种基因，包括用于选择和安全开关的那些，其可以在供体HSC移植前清除CAR-T细胞。PB CAR-T细胞还表现出用于增强体内功效的干细胞记忆(SCM)表型，并且可更好地归巢至骨髓。

针对CD117或CD133靶向的PB CAR-T细胞耗竭来自人和猴骨髓的造血祖细胞，以及来自人CD34⁺细胞的原始CAFC。PB CAR-T细胞表现出干细胞记忆表型并且自然表达CXCR4，尽管可以通过添加因子进行24小时培养来增加表达。PB CAR-T细胞在注射后16小时内成功归巢至骨髓。该数据支持使用PB CAR-T细胞以靶向BM中的内源性HSC，作为最小的非遗传毒性HSC移植方案。

造血系统通过稀有的原始造血干细胞(HSC)群体维持，所述群体由自我更新的关键特征以及生成多谱系祖细胞群体的能力定义，所述多谱系祖细胞群体最终产生血液和免疫系统的功能细胞。正常的哺乳动物造血系统主要分布在成体周围的骨髓内，并且由静止的干细胞和谱系定型的祖细胞组成。祖细胞进而产生具有确定功能的分化细胞，如红细胞、单核细胞、粒细胞、血小板、树突状细胞、B细胞和T细胞。因此，HSC的增殖潜力是巨大的，因为它们具有通过自我更新而永存自身的独特能力。用于区分干细胞谱系和发育潜能的方法已使用表型和功能特征。已发现有用的造血干细胞(HSC)的定义特征是HSC在移植后、尤其是在全身放射治疗后重新植入受体的造血系统的能力。因此，在治疗涉及HSC的疾病、如癌症、免疫病症和移植排斥中有效地耗竭或失活宿主HSC是重要的。然而，这已被证明是困难的，尤其是因为HSC的频率极低(在竞争性再繁殖实验中，每100,000个骨髓细胞中HSC的频率仅为1至2个，使这些细胞更难以靶向和根除)。目前的治疗通常涉及施用高剂量的细胞毒性剂，其不仅消除HSC，而且消除造血系统中的许多细胞。这些疗法具有明显的缺点和严重的毒性副作用。因此，用于耗竭HSC(例如，在移植供体HSC之前，以建立完整或混合的造血细胞嵌合体)的改进的治疗将是有益的。

临床上，骨髓和造血干细胞移植被广泛用作向患者提供生成血细胞的能力的手段，通常是在患者已通过高剂量化学疗法或放射耗竭内源性干细胞的情况下。骨髓和外周血目前被用作自体和同种异体干细胞的来源。将来，培养的干细胞，包括衍生自胚胎干细胞和诱导的多能干细胞(iPSC)的那些，可为移植物的HSC提供替代方案。

骨髓抑制药物的施用、移植物抗宿主病和移植后早期的感染可引起移植失败或不良的移植功能。不良的移植也可以由与患者的潜在疾病或先前疗法相关的微环境或骨髓基质功能障碍导致。

当受体被适当调节以接受供体移植物时，由于淋巴细胞与一种或多种特定配体如MHC标记或配体模式的相互作用，关于淋巴细胞对所述配体的响应看到无响应性的活跃状态。实现了特异性耐受。接受完整同种异体供体骨髓移植的宿主接受来自相同供体的肾脏同种异体移植，而没有免疫抑制。然而，如目前利用广泛的清髓性调节所实施的完全同种异体骨髓移植在其适用于特定年龄范围和病史的患者方面受到限制。在HSC移植中经常采用包括高剂量全身辐照在内的清髓性调节方案结合经设计以防止免疫排斥的治疗(例如，环磷酰胺)。这种调节用于获得受体中的同种异体供体HSC移植的移植。然而，这些治疗可能具有对受体不期望的副作用，如毒性(例如肠炎、肺炎、肾毒性、高脂血症、骨髓抑制)以及加重的GVHD和免疫缺陷(例如感染和恶性肿瘤)的并发症。这些副作用被认为部分是由于细胞因子诱导的不良反应，并且可导致对受体的器官系统的损害。因此，高度期望毒性较小的移植前和移植后调节方案。本发明提供了用于选择性消除和替换HSC的组合物和方法，所述HSC不诱导由现有治疗选项导致的任何负面副作用。

提供了用于移植HSC的组合物和方法，其中通过过继性转移特异性CAR-T效应细胞来选择性消除内源性干细胞，由此打开生态位用于移植供体干细胞。选择性消除基本上消除靶向组织中的内源性干细胞，而没有组织中细胞的一般消除。与未经预处理获得的移植相比，通过选择性消除显著增强移植的效率。与涉及非选择性消除的方法相比，这种选择性消除允许在植入期间改善靶向组织的功能。因此，本发明的方法提供了有效的HSC移植，而无需使用现有的非选择性消除方法(例如放射或化学疗法)。辐照和化学疗法消除参与靶向组织的功能的分化细胞(例如对维持外周血细胞数量的祖细胞)，诱导对其他组织(例如对胃肠道上皮、肺、肝和肾的细胞)的不期望的副作用，并且增加继发性恶性肿瘤的风险。

在本发明的方法的某些实施方案中，通过在移植供体干细胞前向患者施用能够特异性耗竭内源性HSC的CAR-T细胞来完成选择性消除。消除后，并且在足以从患者基本上清除HSC消除性CAR-T细胞的时间段后，将有效剂量的供体干细胞引入患者。

对于以下非限制性示例性用途，当与用于建立混合的造血细胞嵌合体的建立的非选择性消除方法(例如放射和化学疗法)相比，本发明的组合物和方法提供了无毒或相对毒性较小的调节方案：(a)治疗恶性和非恶性疾病，尤其是血液疾病；(b)促进细胞、组织和/或实体器官移植的免疫学接受性；(c)预防或减少移植物抗宿主病(GvHD)；(d)提供用于施用供体白细胞输注(DLI)的平台；(e)治疗酶缺陷疾病；(f)治疗自身免疫性疾病；(g)影响HSC衍生物的先天性疾病。

干细胞微环境

干细胞与其微环境的相互作用为维持、增殖和分化提供了重要线索。干细胞所处的这种物理环境可以被称为干细胞微环境或生态位。参与该生态位的基质细胞和其他细胞提供了在HSC调节中具有多种作用的可溶的和结合的因子。

已经提出用于干细胞和生态位之间的相互作用的各种模型。以其最简单的形式，已经提出一种模型，其中当干细胞分裂时，只有一个子细胞留在生态位，且另一子细胞离开生态位以分化。

本发明的组合物和方法的特别优点是仅在密切邻近内或仅在特定微环境内活化表达CLR/CAR的T细胞的能力。这种物理选择性使本发明的组合物对不是给定疗法的靶标的细胞、生态位和微环境的影响最小化。

此外，由于微环境可以通过一个或多个靶细胞的分泌组定义，因此可以修饰本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞，使得仅当本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞接触分泌蛋白或接触给定浓度的分泌蛋白时才活化CLR/CAR。此外，可以修饰本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞，使得在接触本发明的细胞凋亡诱导剂或非靶细胞的内源性分泌组的组分后，CLR/CAR被失活或消除。

本发明的微环境可以通过蛋白在一种或多种靶细胞的表面上的表达来定义。因此，可以修饰本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞，使得仅在本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞接触靶细胞上的一种或多种细胞表面结合的蛋白时才活化CLR/CAR。此外，可以修饰本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞，使得在接触本发明的细胞凋亡诱导剂或非靶细胞的细胞表面结合的蛋白后，CLR/CAR被失活或消除。

例如，可以修饰本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞以表达特异性结合靶癌细胞上的一种或多种配体的CLR/CAR，但还可能需要结合待活化的靶癌细胞微环境中存在的一种或多种分泌的蛋白(例如一种或多种细胞因子、一种或多种诱导血管生成的因子，一种或多种分解细胞外基质的因子等)。如同数字世界中一样，此双因子身份验证系统确保本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞仅消除靶细胞，并且不会负面影响非靶细胞或非靶环境。如上所述，如果所需信号中的一种或多种不匹配靶细胞和靶微环境，则可以修饰本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞以诱导凋亡，而不是消除非靶细胞的风险。优于数字世界，可以修饰本发明的表达CLR/CAR的免疫细胞以要求来自例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同配体(可以包括细胞表面结合的配体、分泌的配体或其组合)的多因子身份验证。如本文所用，术语配体可用于描述本发明的CAR特异性结合的任何序列、核酸或氨基酸。

嵌合配体/抗原受体(CLR/CAR)

术语“嵌合配体受体(CLR)”和“嵌合抗原受体(CAR)”在整个公开内容中可互换使用。本发明的嵌合受体可以特异性结合本发明的靶抗原和/或靶配体。

本发明的示例性CLR/CAR包含(a)包含配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，所述配体识别区包含蛋白支架、Centyrin、单链可变片段(scFv)、VHH、免疫球蛋白和抗体模拟物中的一种或多种。在某些实施方案中，免疫球蛋白是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM同种型的抗体或其片段。在某些实施方案中，抗体片段是互补决定区(CDR)、重链CDR(包括CDR1、CDR2和/或CDR3)、轻链CDR(包括CDR1、CDR2和/或CDR3)、抗原结合片段(Fab)、可变结构域(Fv)、重链可变区、轻链可变区、完整重链、完整轻链、一个或多个恒定结构域、Fc(可结晶片段)或其任何组合。在某些实施方案中，抗体模拟物包含affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin和avimer、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、Fynomer、Kunitz结构域肽和单体中的一种或多种。在某些实施方案中，CLR中的至少一种是双特异性的。在某些实施方案中，CLR各自是双特异性的。在某些实施方案中，CLR中的至少一种是三特异性的。在某些实施方案中，CLR各自是三特异性的。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物中的至少一种免疫细胞包含分裂CLR/CAR。在某些实施方案中，分裂CLR/CAR包含具有不同细胞内结构域的两种或更多种CLR/CAR，当在至少一种免疫细胞中同时表达时，与不表达分裂CLR/CAR的免疫细胞或不表达CLR/CAR的免疫细胞相比，其增加或降低免疫细胞的活性。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物中的至少一种免疫细胞包含分裂CLR/CAR。在某些实施方案中，包括其中同时表达增加免疫细胞的活性的那些中，分裂CLR/CAR包含：(a)第一CLR/CAR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由初级细胞内信号传导结构域组成的胞内域，和(b)第二CLR/CAR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由次级细胞内信号传导结构域组成的胞内域。在某些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域。在某些实施方案中，次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88或人OX-40细胞内区段。在某些实施方案中，次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB和人CD28。

在本发明的方法的某些实施方案中，包含多种免疫细胞的组合物中的至少一种免疫细胞包含分裂CLR/CAR。在某些实施方案中，包括其中同时表达降低免疫细胞的活性的那些中，分裂CLR/CAR包含：(a)第一CLR/CAR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和包含初级细胞内信号传导结构域、次级细胞内信号传导结构域的胞内域，和(b)第二CLR/CAR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由抑制性细胞内信号传导结构域组成的胞内域。在某些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域，且次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88或人OX-40细胞内区段。在某些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域，且次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB和人CD28。在某些实施方案中，抑制性细胞内信号传导结构域包含衍生自PD1、CTLA4、LAG3、B7-H1、B7-1、CD160、BTLA、PD1H、LAIR1、TIM1、TIM3、TIM4、2B4和TIGIT的信号传导结构域。来自这些抑制性细胞内信号传导结构域和可以全部或部分使用的其他分子的另外细胞内信号传导组分，包括但不限于，ITIM、ITSM、YVKM、PP2A、SHP2、KIEELE和Y265。在某些实施方案中，第二CLR/CAR选择性结合非靶细胞上的靶标，由此诱导第二CLR/CAR抑制第一CLR/CAR的活性。在某些实施方案中，第二CLR/CAR抑制第一CLR/CAR诱导靶细胞或非靶细胞的死亡的能力。

在本发明的方法的某些实施方案中，一种或多种CLR/CAR以选自以下的至少一种亲和力结合配体：小于或等于10⁻⁹M、小于或等于10⁻¹⁰M、小于或等于10⁻¹¹M、小于或等于10⁻ ¹²M、小于或等于10⁻¹³M、小于或等于10⁻¹⁴M和小于或等于10⁻¹⁵M的K_D。在某些实施方案中，K_D由表面等离振子共振测定。

支架蛋白

本发明的蛋白支架可源自纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白、编码或互补核酸、载体、宿主细胞、构成、组合、制剂、装置，以及制备和使用它们的方法。在一个优选的实施方案中，蛋白支架包含来自人生腱蛋白-C的多个FN3结构域的共有序列(此后为“生腱蛋白”)。在一个更优选的实施方案中，本发明的蛋白支架是15 FN3结构域的共有序列。本发明的蛋白支架可以被设计以结合各种分子，例如，细胞靶蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白支架可以被设计以结合野生型和/或变异形式的配体的表位。

本发明的蛋白支架可包括另外的分子或部分，例如，抗体的Fc区，白蛋白结合结构域，或其他影响半衰期的部分。在进一步的实施方案中，本发明的蛋白支架可结合于可编码蛋白支架的核酸分子。

本发明提供了至少一种在宿主细胞中表达基于多个FN3结构域的共有序列的至少一个蛋白支架的方法，其包括在其中至少一个蛋白支架以可检测和/或可回收的量表达的条件下，培养如本文所述的宿主细胞。

本发明提供了至少一种组合物，其包含(a) 基于多个FN3结构域的共有序列和/或如本文所述的编码核酸的蛋白支架；和(b) 合适的和/或药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明提供了生成基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白，优选地，多个FN3结构域的共有序列，且更优选地，来自人生腱蛋白的多个FN3结构域的共有序列的蛋白支架文库的方法。通过在支架的部分，如环区中改变(通过突变)分子中特定位置的氨基酸或氨基酸的数量，制备连续几代的支架来形成支架文库。通过改变单环或同时改变多个环或支架分子的另外位置的氨基酸组成可生成支架文库。改变后的环可以相应地加长或缩短。这样的库可以生成以在每个位置包含所有可能的氨基酸，或设计出的氨基酸的子集。库成员可用于通过展示进行筛选，如体外或CIS展示(DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母、细菌和噬菌体展示。

本发明的蛋白支架提供增强的生物物理特性，如还原条件下的稳定性和高浓度时的溶解性；它们可以在原核系统中表达和折叠，如大肠杆菌，在真核系统中，如酵母，和在体外转录/翻译系统中，如兔网织红细胞裂解系统。

本发明提供了通过用靶标淘选本发明的支架文库并检测结合剂，生成结合特定靶标的支架分子的方法。在其他相关方面，本发明包括可用于生成或结合成熟的具有所需活性的蛋白支架的筛选方法，例如，能够与具有某种亲和力的靶蛋白结合。亲和力成熟可以通过迭代诱变和选择使用系统完成，如噬菌体展示或体外展示。在此过程中的诱变可能是对特定支架残基的位点定向诱变，由于易错的PCR导致随机突变，DNA改组(shuffling)，和/或这些技术的组合的结果。

本发明提供了基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白的共有序列的分离、重组和/或合成的蛋白支架，包括但不限于，源自哺乳动物的支架，以及组成和编码包含至少一个基于共有FN3序列的多核苷酸编码蛋白支架的核酸分子。本发明还包括，但不限于制备和使用这样的核酸和蛋白支架的方法，包括诊断和治疗组合物、方法和装置。

本发明的蛋白支架提供优于传统疗法的优势，如局部、口服，或越过血脑屏障施用的能力，在大肠杆菌中表达、使得蛋白的表达作为对比哺乳动物细胞表达能力(会被工程改造成结合多个靶标或相同靶标的多个表位的双特异性或串联分子)的函数的资源增加的能力，与药物、聚合物和探针缀合的能力，配制成高浓度的能力，和这样的分子有效穿透病变组织和肿瘤的能力。

而且，蛋白支架具有与它们模拟抗体的可变区的折叠有关的许多抗体特性。这种取向使FN3环能够与抗体相似地暴露于抗体互补决定区(CDR)。它们应该能够与细胞靶标结合，且环可以改变，例如，亲和力成熟，以改善某些结合或相关的特性。

本发明的蛋白支架的6个环中的3个在拓扑上与抗体的互补决定区(CDR 1-3)，即配体-结合区相对应，而其余的三个环以类似于抗体CDR的方式暴露在表面。这些环跨越SEQID NO: 1的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81或在这些残基附近。优选地，为了结合特异性和亲和力而改变在残基22-28、51-54和75-81或它们附近的环区。这些环区的一个或多个与其他环区和/或其他保持其作为骨架部分的序列的链随机化以填充文库，而有效结合剂可从对特定蛋白靶标具有高亲和力的文库中选择。一个或多个环区可与靶蛋白相互作用，类似于抗体CDR与蛋白质的相互作用。

本发明的支架可包含抗体模拟物。

术语“抗体模拟物”旨在描述特异性结合靶序列并具有与天然存在的抗体不同结构的有机化合物。抗体模拟物可包含蛋白、核酸，或小分子。本发明的抗体模拟物特异性结合的靶序列可以是配体。抗体模拟物可提供超过抗体的优异的特性，包括但不限于优异的溶解性、组织渗透性、对热和酶的稳定性(例如对酶降解的抗性)，和较低的生产成本。示例性抗体模拟物包括，但不限于，affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin和avimer (也称为亲合多聚物)、DARPin (设计的锚蛋白重复蛋白)、Fynomer、Kunitz结构域肽和单体。

本发明的affibody分子包含含有或由一个或多个无任何二硫键的α螺旋组成的蛋白支架。优选地，本发明的affibody分子包含或由3个α螺旋组成。例如，本发明的affibody分子可包含免疫球蛋白结合结构域。本发明的affibody分子可包含蛋白A的Z结构域。

本发明的Affilin分子包含通过修饰例如或者γ-B晶体蛋白或者泛素(ubiquitin)的暴露氨基酸产生的蛋白支架。Affilin分子在功能上模拟抗体与配体的亲和力，但不在结构上模拟抗体。在用于制备affilin的任何蛋白支架中，在正确-折叠的蛋白分子中的易接近溶剂或可能的结合配偶体的那些氨基酸被认为是暴露的氨基酸。这些暴露的氨基酸的中任何一个或多个可被修饰以特异性结合靶标配体序列或配体。

本发明的Affimer分子包含含有高度稳定的蛋白的蛋白支架，所述蛋白经工程改造以展示对特定靶序列提供高亲和力结合位点的肽环。本发明的示例性Affimer分子包含基于胱抑素蛋白或其三级结构的蛋白支架。本发明的示例性Affimer分子可能共有包含平放在反并行的β-片上面的α-螺旋的共有三级结构。

本发明的Affitin分子包含人工蛋白支架，例如，其结构可源自DNA结合蛋白(例如DNA结合蛋白Sac7d)。本发明的Affitins选择性地结合靶序列，其可能是配体的全部或部分。本发明的示例性Affitins通过使DNA结合蛋白的结合表面上的一个或多个氨基酸序列随机化并将所得蛋白进行核糖体展示和选择来制备。本发明的Affitins的靶序列可例如在基因组中或在肽、蛋白、病毒或细菌的表面上发现。在本发明的某些实施方案中，affitin分子可用作酶的特异性抑制剂。本发明的Affitin分子可包括耐热蛋白或其衍生物。

本发明的Alphabody分子也可被称为细胞穿透Alphabody (CPAB)。本发明的Alphabody分子包含结合各种靶序列(包括配体)的小蛋白(一般少于10 kDa)。Alphabody分子能够到达和结合细胞内靶序列。在结构上，本发明的Alphabody分子包含形成单链α螺旋的人工序列(类似于天然存在的卷曲螺旋结构)。本发明的Alphabody分子可包含含有被修饰以特异性结合靶标蛋白的一个或多个氨基酸的蛋白支架。无论分子的结合特异性，本发明的Alphabody分子保持正确的折叠和热稳定性。

本发明的Anticalin分子包含结合蛋白或小分子中的靶序列或位点的人工蛋白。本发明的Anticalin分子可包含源自人脂钙蛋白(lipocalin)的人工蛋白。可使用本发明的Anticalin分子代替，例如，单克隆抗体或其片段。Anticalin分子可显示出优于单克隆抗体或其片段的组织穿透性和热稳定性。本发明的示例性Anticalin分子可包含约180个氨基酸，具有大约20 kDa的质量。结构上，本发明的Anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的反平行β-链的桶状结构。在优选的实施方案中，本发明的Anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的8条反平行β-链的桶状结构。

本发明的Avimer分子包含特异性结合靶序列(其也可以是配体)的人工蛋白。本发明的Avimer可识别相同靶标内或不同靶标内的多个结合位点。当本发明的Avimer识别多于一种靶标时，avimer模拟双特异性抗体的功能。人工蛋白avimer可包含两个或更多个各自大约30-35个氨基酸的肽序列。这些肽可经由一个或多个接头肽连接。Avimer的一个或多个肽的氨基酸序列可源自膜受体的A结构域。Avimer具有可任选地包含二硫键和/或钙的刚性结构。本发明的Avimer可显示与抗体相比更大的热稳定性。

本发明的DARPin (设计的锚蛋白重复蛋白)包含基因工程改造、重组的或嵌合的蛋白，其对靶序列具有高特异性和高亲和力。在某些实施方案中，本发明的DARPin源自锚蛋白，且任选地包含锚蛋白的至少3个重复基序(也称为重复结构单元)。锚蛋白介导高亲和力蛋白-蛋白相互作用。本发明的DARPin包含大的靶标相互作用表面。

本发明的Fynomer包含源自人Fyn SH3结构域并经工程改造以与抗体等同的亲和力和等同的特异性结合靶序列和分子的小结合蛋白(约7 kDa)。

本发明的Kunitz结构域肽包含含有Kunitz结构域的蛋白支架。Kunitz结构域包含抑制蛋白酶活性的活性位点。结构上，本发明的Kunitz结构域包含富含二硫化物的α+β折叠。这种结构以牛胰腺胰蛋白酶抑制剂为例。Kunitz结构域肽识别特定蛋白结构并充当竞争性蛋白酶抑制剂。本发明的Kunitz结构域可包含艾卡拉肽(Ecallantide) (源自人脂蛋白相关的凝血抑制剂(LACI))。

本发明的单体是大小与单链抗体相当的小蛋白(包含约94个氨基酸且具有约10kDa的质量)。这些基因工程改造的蛋白特异性结合包括配体的靶序列。本发明的单体可特异性靶向一种或多种不同的蛋白或靶序列。在优选的实施方案中，本发明的单体包含模拟人纤连蛋白的结构，和更优选地，模拟纤连蛋白的第十细胞外III型结构域的结构的蛋白支架。纤连蛋白的第十细胞外III型结构域，以及其单体模拟物，含有7个形成桶的β片和3个对应于抗体的3个互补决定区(CDR)每一侧上的暴露的环。与抗体的可变结构域的结构形成对比，单体缺乏金属离子的任何结合位点以及中心的二硫键。多特异性单体可通过修饰环BC和FG来优化。本发明的单体可包含adnectin。

这样的方法可包括向需要症状、效果或机制的这样的调节、治疗、缓解、预防或减少的细胞、组织、器官、动物或患者中施用有效量的包含至少一种支架蛋白的组合物或药物组合物。有效量可包含每次单次(如，大剂量)、多次或连续施用的约0.001-500 mg/kg，或每次单次、多次或连续施用达到0.01-5000 μg/ml血清浓度的血清浓度，或其中的任何有效范围或值的量，如使用已知方法(如本文所述的或相关领域已知的)进行和测定。

支架蛋白的产生和生成

本发明的至少一种支架蛋白可任选地通过本领域众所周知的细胞系、混合的细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体生产。参见例如，Ausubel, 等人, 编, CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, ColdSpring Harbor, N.Y. (1989); Harlow和Lane, Antibodies, a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, 等人, 编, Current Protocols inImmunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan等人, CurrentProtocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)。

来自支架蛋白的氨基酸可以被改变、添加和/或缺失以降低免疫原性或减少、增强或修改结合、亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、亲合力(avidity)、特异性、半衰期、稳定性、溶解性或本领域已知的任何其他合适的特征。

任选地，可对支架蛋白进行工程改造以保留对配体的高亲和力和其他有利的生物学特性。为达到这个目标，支架蛋白可任选地通过使用亲本和工程改造的序列的三维模型对亲本序列和各种概念工程改造的产物的分析过程来制备。三维模型是通常可获得的且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序是可获得的，其说明和展示选定候选序列的可能三维构象结构并可测量可能的免疫原性(例如，Xencor, Inc. of Monrovia, Calif.的Immunofilter程序)。对这些展示的检查允许分析残基在候选序列功能中的可能作用，即分析影响候选支架蛋白结合其配体的能力的残基。以这种方式，残基可以从亲本序列和参考序列中选择和组合，使得达到预期的特征，如对靶标配体的亲和力。可替代地，或除上述程序外，可以使用其他合适的工程改造方法。

支架蛋白的筛选

筛选与类似蛋白或片段特异性结合的蛋白支架可以方便地使用核苷酸(DNA或RNA展示)或肽展示文库，例如体外展示来实现。这种方法涉及筛选具有期望功能或结构的单个成员的肽的大量收集物。展示的核苷酸或肽序列的长度可以是3-5000或更多个核苷酸或氨基酸，通常5-100个氨基酸长，且经常为约8-25氨基酸长。除了生成肽文库的直接化学合成方法外，已描述几种重组DNA方法。一种类型涉及肽序列在噬菌体或细胞的表面上的展示。每种噬菌体或细胞含有编码特定展示的肽序列的核苷酸序列。这样的方法描述于PCT专利公开号91/17271、91/18980、91/19818和93/08278中。

用于生成肽文库的其他系统具有体外化学合成和重组方法的方面。参见，PCT专利公开号92/05258、92/14843和96/19256。还参见，美国专利号5,658,754；和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒可从这样的供应商市售获得，如Invitrogen (Carlsbad,Calif.)，和Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)。参见例如，授予Enzon的美国专利号4,704,692、4,939,666、4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889、5,534,621、5,656,730、5,763,733、5,767,260、5856456；授予Dyax的5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500，授予Affymax的5,427,908、5,580,717；授予CambridgeAntibody Technologies的5,885,793；授予Genentech的5,750,373，授予Xoma的5,618,920、5,595,898、5,576,195、5,698,435、5,693,493、5,698,417; Colligan, 同上；Ausubel，同上；或Sambrook, 同上。

本发明的蛋白支架可以广泛范围的亲和力(KD)结合人或其他哺乳动物蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的至少一种蛋白支架可任选地以高亲和力，例如，以等于或少于约10-7 M，如但不限于0.1-9.9 (或其中的任何范围或值) X 10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或值的KD结合靶标配体，如由本领域技术人员通过实施的表面等离振子共振或Kinexa方法所测定。

蛋白支架对配体的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)可以使用任何合适的方法经实验确定(参见，例如，Berzofsky, 等人, “Antibody-Ligand Interactions,” InFundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984);Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)；和本文描述的方法)。如果在不同的条件(例如，盐浓度、pH)下测量，则特定蛋白支架-配体相互作用的测量的亲和力可能不同。因此，亲和力和其他配体-结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量优选地用蛋白支架和配体的标准化溶液和标准化缓冲剂(如本文所述的缓冲剂)进行。

竞争性测定法可以用本发明的蛋白支架执行，以确定哪些蛋白、抗体和其他拮抗剂与本发明的蛋白支架竞争对靶标蛋白的结合和/或共有表位区。这些对本领域普通技术人员来说是很容易知道的测定法可评估拮抗剂或配体之间对有限数量的蛋白上的结合位点的竞争。蛋白和/或抗体在竞争前后是固定或不溶解的，且例如，通过倾倒(其中蛋白/抗体已预先溶解)或通过离心(其中蛋白/抗体在竞争反应后沉淀)，使与靶标蛋白结合的样品与未结合的样品分离。同样，竞争性结合可通过如下确定：蛋白支架与靶标蛋白的结合或缺乏结合是否改变功能，例如，蛋白支架分子是否抑制或增强例如标记的酶促活性。可使用ELISA和其他功能测定法，这是本领域众所周知的。

Centyrins和CARTyrins

本发明提供了嵌合配体/抗原受体(CLR/CAR)，其包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区包含至少一个Centyrin；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。如在整个公开内容中所使用，包含Centyrin的CLR/CAR被称为CARTyrin。在某些实施方案中，配体识别区可包含两个Centyrin以产生双特异性或串联的CLR/CAR。在某些实施方案中，配体识别区可包含三个Centyrin以产生三特异性CLR/CAR。在某些实施方案中，胞外域可进一步包含信号肽。可替代地或另外，在某些实施方案中，胞外域可进一步包含在配体识别区和跨膜结构域之间的铰链。

本发明提供了嵌合配体/抗原受体(CLR/CAR)，其包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区包含至少一个蛋白支架或抗体模拟物；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域。在某些实施方案中，配体识别区可包含两个支架蛋白或抗体模拟物以产生双特异性或串联的CLR/CAR。在某些实施方案中，配体识别区可包含三个蛋白支架以产生三特异性CLR/CAR。在某些实施方案中，胞外域可进一步包含信号肽。可替代地或另外，在某些实施方案中，胞外域可进一步包含在配体识别区和跨膜结构域之间的铰链。

在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，信号肽可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，信号肽可包含编码人CD8α信号肽的序列。人CD8α信号肽可包含含有

的氨基酸序列。人CD8α信号肽可包含含有

的氨基酸序列或与含有

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。人CD8α信号肽可由包含

的核酸序列编码。

在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，跨膜结构域可包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，跨膜结构域可包含编码人CD8α跨膜结构域的序列。CD8α跨膜结构域可包含含有的氨基酸序列或与含有

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。CD8α跨膜结构域可由包含

的核酸序列编码。

在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，胞内域可包含人CD3ζ胞内域。

在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，至少一个共刺激结构域可包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40细胞内区段，或其任何组合。在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，至少一个共刺激结构域可包含CD28和/或4-1BB共刺激结构域。CD28共刺激结构域可包含含有

的氨基酸序列或与含有

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。CD28共刺激结构域可由包含

的核酸序列编码。4-1BB共刺激结构域可包含含有

的氨基酸序列或与含有

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。4-1BB共刺激结构域可由包含

的核酸序列编码。4-1BB共刺激结构域可位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。

在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，铰链可包含衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。在本发明的CLRs/CARs的某些实施方案中，铰链可包含衍生自人CD8α序列的序列。铰链可包含含有

的人CD8α氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。人CD8α铰链氨基酸序列可由包含

的核酸序列编码。

本发明的Centyrin可包含蛋白支架，其中支架能够特异性结合配体。本发明的Centyrin可包含含有至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列的蛋白支架，其中支架能够特异性结合配体。至少一个纤连蛋白III型(FN3)结构域可衍生自人蛋白。人蛋白可以是生腱蛋白-C。共有序列可包含

共有序列可由包含

的核酸序列编码。共有序列可在以下内的一个或多个位置被修饰：(a) 包含在共有序列的位置13-16的氨基酸残基TEDS (SEQ ID NO: 63)或由其组成的A-B环；(b) 包含在共有序列的位置22-28的氨基酸残基TAPDAAF (SEQ ID NO:64)或由其组成的B-C环；(c) 包含在共有序列的位置38-43的氨基酸残基SEKVGE (SEQ ID NO:65)或由其组成的C-D环； (d) 包含在共有序列的位置51-54的氨基酸残基GSER (SEQ ID NO:66)或由其组成的D-E环；(e) 包含在共有序列的位置60-64的氨基酸残基GLKPG (SEQ ID NO:67)或由其组成的E-F环；(f) 包含在共有序列的位置75-81的氨基酸残基KGGHRSN (SEQ IDNO:68)或由其组成的F-G环；或(g) (a)-(f)的任何组合。本发明的Centyrin可包含至少5个纤连蛋白III型(FN3)结构域、至少10个纤连蛋白III型(FN3)结构域或至少15个纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。所述支架可以选自以下的至少一种亲和力结合配体：小于或等于10⁻⁹M、小于或等于10⁻¹⁰M、小于或等于10⁻¹¹M、小于或等于10⁻¹²M、小于或等于10⁻¹³M、小于或等于10⁻¹⁴M和小于或等于10⁻¹⁵M的K_D。K_D可由表面等离振子共振测定。

本发明提供了包含本发明的CLR/CAR和至少一种药学上可接受的载体的组合物。

本发明提供了包含本发明的CLR/CAR的转座子。

本发明的转座子可包含用于鉴定、富集和/或分离表达转座子的细胞的选择基因。示例性选择基因编码为细胞活力和存活所必需的任何基因产物(例如转录物、蛋白和酶)。示例性选择基因编码对于赋予对药物攻击的抗性至关重要的任何基因产物(例如转录物、蛋白和酶)，在选择基因编码的基因产物不存在的情况下，细胞对于药物攻击是敏感的(或者其可能对细胞是致命的)。示例性选择基因编码在缺乏在选择基因不存在的情况下的细胞活力和/或存活所必需的一种或多种营养素的细胞培养基中的活力和/或存活所必需的任何基因产物(例如，转录物、蛋白、酶)。示例性选择基因包括，但不限于，neo (赋予对新霉素的抗性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗性)、TYMS (编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51旁系同源物C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)和NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)。

本发明的转座子以附加体形式维持或整合至重组/修饰的细胞的基因组中。转座子可以是双组分piggyBac系统的一部分，其利用转座子和转座酶用于增强的非病毒基因转移。在该方法的某些实施方案中，转座子是具有编码嵌合配体/抗原受体的序列的质粒DNA转座子，其侧接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，且尤其是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。

在本发明的方法的某些实施方案中，转座子是具有编码配体/抗原受体的序列的质粒DNA转座子，其侧接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，且尤其是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™ (SPB)转座酶。在某些实施方案中，且尤其是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。

诱导型促凋亡多肽

本发明的诱导型促凋亡多肽优于现有的诱导型多肽，因为本发明的诱导型促凋亡多肽免疫原性低得多。尽管本发明的诱导型促凋亡多肽是重组多肽，因此，经重组以产生本发明的诱导型促凋亡多肽的非-天然存在的序列不包含宿主人免疫系统可识别为“非-自身”的非-人序列，且因此在接受本发明的诱导型促凋亡多肽、包含诱导型促凋亡多肽的细胞或包含诱导型促凋亡多肽的组合物或包含诱导型促凋亡多肽的细胞的受试者中诱导免疫应答。

本发明的转座子可包含诱导型促凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 促凋亡多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限制酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本发明的诱导型促凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中，本发明的转座子可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)胱天蛋白酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本发明的转座子可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)胱天蛋白酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本发明的转座子可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)截短的胱天蛋白酶9多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，配体结合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中，包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含

的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含

的核酸序列编码。在某些实施方案中，对配体结合区特异性的诱导剂可包含具有缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)的FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽，包括AP20187和/或AP1903两种合成药物。

在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含GGGGS (SEQ ID NO:47)的氨基酸或包含GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO:48)的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限制酶位点。

在本发明的截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由在该序列的位置87不包含精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可替代地或另外，在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由在该序列的位置282不包含丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由包含

的氨基酸或包含

的核酸序列编码。

在诱导型促凋亡多肽的某些实施方案中，其中多肽包含截短的胱天蛋白酶9多肽，诱导型促凋亡多肽由包含

的氨基酸序列或包含

的核酸序列编码。

转座子和转座酶

本发明的转座子可包含至少一个自我切割肽，其位于，例如，本发明的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本发明的选择基因之间。本发明的转座子可包含至少一个自我切割肽，其位于，例如，本发明的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本发明的诱导型促凋亡多肽之间。本发明的转座子可包含至少两个自我切割肽，第一自我切割肽位于，例如，本发明的诱导型促凋亡多肽的上游或紧邻上游，且第二自我切割肽位于，例如，本发明的诱导型促凋亡多肽的下游或紧邻上游。

至少一个自我切割肽可包含，例如，T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-T2A肽可包含含有的核酸序列。E2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。F2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。

本发明的转座子可包含第一和第二自我切割肽，第一自我切割肽位于，例如，本发明的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个的上游，第二自我切割肽位于，例如，本发明的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个的下游。第一和/或第二自我切割肽可包含，例如，T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的核酸序列。E2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-F2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有的氨基酸序列或与包含的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。

本发明的转座子可包含piggyBac转座子。本发明的转座子可包括piggyBac转座酶或相容酶。在该方法的某些实施方案中，转座子是具有编码嵌合配体/抗原受体的序列的质粒DNA转座子，其侧接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggyBac转座子。本发明的转座子可包括piggyBac转座酶或相容酶。在某些实施方案中，且尤其是在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBac™或超级piggyBac™(SPB)转座酶。在某些实施方案中，且尤其是在其中转座酶是超级piggyBac™ (SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。

载体

本发明提供了包含本发明的CAR的载体。在某些实施方案中，载体是病毒载体。载体可以是重组载体。

本发明的病毒载体可包含从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或其任何组合分离或衍生的序列。病毒载体可包含从腺相关病毒分离或衍生的序列(AAV)。病毒载体可包含重组AAV (rAAV)。本发明的示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包含两个或更多个反向末端重复(ITR)序列，其顺式(cis)紧邻编码本发明的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的序列。本发明的示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包括，但不限于所有血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)。本发明的示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包括，但不限于自我互补的AAV (scAAV)和含有一种血清型的基因组和另一种血清型的衣壳的AAV杂合体(例如AAV2/5、AAV-DJ和AAV-DJ8)。本发明的示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包括，但不限于rAAV-LK03。

本发明的病毒载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞活力和存活所必需的基因产物。当通过选择性细胞培养条件攻击时，选择基因可编码为细胞活力和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞活力或存活有害的化合物，且其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本发明的示例性选择基因可包括，但不限于neo (赋予对新霉素的抗性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗性)、TYMS (编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51旁系同源物C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)或其任何组合。

本发明的病毒载体可包含诱导型促凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 促凋亡多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限制酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本发明的诱导型促凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中，本发明的病毒载体可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 胱天蛋白酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本发明的病毒载体可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 胱天蛋白酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本发明的病毒载体可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 截短的胱天蛋白酶9多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型促凋亡多肽的某些实施方案中，本发明的诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽，配体结合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中，包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含

的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含

的核酸序列编码。在某些实施方案中，对配体结合区特异性的诱导剂可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽，其具有位置36的苯丙氨酸(F)被缬氨酸(V)取代(F36V)，包含AP20187和/或AP1903两种合成药物。

在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含

的氨基酸或包含

的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限制酶位点。

在本发明的截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可替代地，或者另外，在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含该序列位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由包含

的氨基酸或包含

的核酸序列编码。

的氨基酸序列或包含

的核酸序列编码。

本发明的病毒载体可包含至少一个自我切割肽。在一些实施方案中，载体可包含至少一个自我切割肽，其中自我切割肽位于CAR和选择基因之间。在一些实施方案中，载体可包含至少一个自我切割肽，其中第一自我切割肽位于CAR的上游和第二自我切割肽位于CAR的下游。本发明的病毒载体可包含至少一个自我切割肽，其位于例如本发明的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本发明的诱导型促凋亡多肽之间。本发明的病毒载体可包含至少两个自我切割肽，第一自我切割肽位于，例如本发明的诱导型促凋亡多肽的上游或紧邻上游，而第二自我切割肽位于，例如，本发明的诱导型促凋亡多肽的下游或紧邻上游。自我切割肽可包含，例如，T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的核酸序列。E2A肽可包含含有的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。P2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-P2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。

本发明提供了包含本发明的CAR的载体。在某些实施方案中，载体是纳米颗粒。本发明的示例性纳米颗粒载体包括，但不限于核酸(如RNA、DNA、合成核苷酸、修饰合成核苷酸或其任何组合)、氨基酸(L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、修饰氨基酸，或其任何组合)、聚合物(如多聚体)、胶束、脂质(如脂质体)、有机分子(如碳原子、片材、纤维、管)、无机分子(如磷酸钙或金)或其任何组合。纳米颗粒载体可以被动地或主动地穿过细胞膜。

本发明的纳米颗粒载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞活力和存活所必需的基因产物。当通过选择性细胞培养条件攻击时，选择基因可编码为细胞活力和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞活力或存活有害的化合物和其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本发明的示例性选择基因可包括，但不限于neo (赋予对新霉素的抗性)、DHFR (编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗性)、TYMS (编码胸苷酸合成酶)、MGMT (编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1 (编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C (编码RAD51 Paralog C)、GCS (编码葡糖基神经酰胺合酶)、NKX2.2 (编码NK2同源异型框2)或其任何组合。

本发明的纳米颗粒载体可包含诱导型促凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 促凋亡多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限制酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本发明的诱导型促凋亡多肽也可被称为“iC9安全开关”。在某些实施方案中，本发明的纳米颗粒载体可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 胱天蛋白酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本发明的纳米颗粒载体可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 胱天蛋白酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本发明的纳米颗粒载体可包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b) 接头，和(c) 截短的胱天蛋白酶9多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型促凋亡多肽的某些实施方案中，本发明的诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽，配体结合区可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽。在某些实施方案中，包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V)。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含

的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含

的核酸序列编码。在某些实施方案中，对配体结合区特异性的诱导剂可包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽(具有取代位置36的苯丙氨酸(F)的缬氨酸(V)(F36V))，包含AP20187和/或AP1903两种合成药物。

在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含的氨基酸或包含

在本发明的截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。可替代地，或者另外，在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。在本发明的诱导型促凋亡多肽、诱导型胱天蛋白酶多肽或截短的胱天蛋白酶9多肽的某些实施方案中，截短的胱天蛋白酶9多肽由包含

的氨基酸或包含

的核酸序列编码。

的氨基酸序列或包含

的核酸序列编码。

本发明的纳米颗粒载体可包含至少一个自我切割肽。在一些实施方案中，纳米颗粒载体可包含至少一个自我切割肽，其中自我切割肽位于CAR和纳米颗粒之间。在一些实施方案中，纳米颗粒载体可包含至少一个自我切割肽，其中第一自我切割肽位于CAR的上游和第二自我切割肽位于CAR的下游。在一些实施方案中，纳米颗粒载体可包含至少一个自我切割肽，其中第一自我切割肽位于CAR和纳米颗粒之间，而第二自我切割肽位于CAR的下游。在一些实施方案中，纳米颗粒载体可包含至少一个自我切割肽，其中第一自我切割肽位于CAR和纳米颗粒之间和第二自我切割肽位于CAR的下游，例如，CAR和选择基因之间。本发明的纳米颗粒载体可包含至少一个自我切割肽，其位于，例如，本发明的蛋白支架、Centyrin或CARTyrin的一个或多个和本发明的诱导型促凋亡多肽之间。本发明的纳米颗粒载体可包含至少两个自我切割肽，第一自我切割肽位于例如本发明的诱导型促凋亡多肽的上游或紧邻上游，而第二自我切割肽位于，例如，本发明的诱导型促凋亡多肽的下游或紧邻上游。自我切割肽可包含，例如，T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。T2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的核酸序列。E2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。GSG-E2A肽可包含含有

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列或与包含

的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%同一性的序列。

本发明提供了包含本发明的载体的组合物。

表达CAR的细胞

本发明提供了包含本发明的CAR的细胞。本发明提供了包含本发明的转座子的细胞。在某些实施方案中，包含本发明的CAR、转座子，或载体的细胞可在细胞表面上表达CAR。细胞可以是任何类型的细胞。

在本发明的某些实施方案中，细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞(例如细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。

在本发明的某些实施方案中，免疫细胞是T-细胞。T细胞可以是辅助性T细胞、辅助性1型T细胞、辅助性2型T细胞、辅助性17 T细胞、调节性T细胞、天然调节性T细胞或诱导的调节性T细胞。T细胞可以是CD4⁺。

在本发明的某些实施方案中，细胞可以是人工配体呈递细胞，其可以任选地用来刺激和扩增本发明的修饰免疫细胞或T细胞。

在本发明的某些实施方案中，细胞可以是肿瘤细胞，其可以任选地用作人工或修饰的抗原呈递细胞。

可用于过继治疗的本发明的修饰细胞可以是自体的或同种异体的。

制备表达CAR的细胞的方法

本发明提供了在细胞表面上表达嵌合配体/抗原受体(CAR)的方法，其包括：(a) 获得细胞群体，(b) 使细胞群体与包含本发明的CAR或编码CAR的序列的组合物，在足以使CAR转移穿过细胞群体中至少一个细胞的细胞膜的条件下接触，由此产生修饰的细胞群体；(c)在适合转座子的整合条件下培养修饰的细胞群体；和(d) 从修饰的细胞群体扩增和/或选择至少一个在细胞表面上表达CAR的细胞。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，细胞群体可包含白细胞和/或CD4+和CD8+白细胞。细胞群体可包含优化比率的CD4+和CD8+白细胞。优化比率的CD4+与CD8+白细胞并不在体内自然发生。细胞群体可包含肿瘤细胞。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，转座子或载体包含CAR或编码CAR的序列。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，足以转移编码CAR的序列穿过细胞群体中至少一个细胞的细胞膜的条件包括核转染。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，其中足以转移编码CAR的序列穿过细胞群体中至少一个细胞的细胞膜的条件包括以下至少一种：在指定电压下一个或多个电流脉冲的施加、缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中，缓冲剂可包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实施方案中，一种或多种补充因子可包含(a) 重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合；(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c)细胞培养基；(d)细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一种或多种凋亡途径或其组合的抑制剂；和(e) 修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合可包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5，或其任何组合。细胞培养基可包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一种或多种凋亡途径或其组合的抑制剂包含TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂、糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，适合于整合本发明的CAR或编码CAR的序列的条件包括以下至少一种：缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中，本发明的转座子或载体包含本发明的CAR或编码CAR的序列。在某些实施方案中，缓冲剂可包含PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实施方案中，一种或多种补充因子可包含(a) 重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合；(b) 盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c)细胞培养基； (d)细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一种或多种凋亡途径或其组合的抑制剂；和(e) 修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合可包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5，或其任何组合。细胞培养基可包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA感应、代谢、分化、信号转导、一种或多种凋亡途径或其组合的抑制剂包括TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂、糖原合酶激酶-3β(GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包括pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增和选择步骤依次发生。扩增可在选择之前发生。扩增可在选择之后发生，且任选地，进一步的(即第二)选择可在扩增之后发生。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增和选择步骤可同时发生。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增可包括使修饰的细胞群体的至少一个细胞与配体接触，以通过CAR刺激至少一个细胞，由此产生扩增细胞群体。配体可在基质表面上呈递。基质可具有任何形式，包括，但不限于表面、孔、珠或其中的多种和基质。基质可进一步包含顺磁性或磁性组分。在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，配体可在基质表面上呈递，其中基质是磁珠，且其中磁体可以用于从修饰和扩增的细胞群体去除或分离磁珠。配体可在细胞或人工配体呈递细胞表面上呈递。本发明的人工配体呈递细胞可包括，但不限于肿瘤细胞和干细胞。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，其中转座子或载体包含选择基因，且其中选择步骤包括使修饰的细胞群体的至少一个细胞与选择基因赋予抗性的化合物接触，由此将表达选择基因的细胞鉴定为在选择中存活和将未能表达选择基因的细胞鉴定为未能在选择步骤中存活。

在表达CAR的这种方法的某些实施方案中，扩增和/或选择步骤可持续10-14天的时段，包括端点。

本发明提供了包含用本发明的方法修饰、扩增和选择的细胞群体的组合物。

造血干细胞

本发明的组合物可包含多种造血干细胞(HSC)，用于在从受试者中选择性除去天然HSC后进行移植。

造血干细胞(HSC)是多能的、自我更新的祖细胞。来自淋巴样和髓样谱系的所有分化的血细胞均来自HSC。HSC可以在成人骨髓、外周血和脐带血中发现。

通常，呈骨髓移植的形式的HSC移植失败，因为受试者的免疫系统的残余物攻击移植的细胞或产生不利于移植细胞的存活的条件。在开发本发明的组合物和方法之前，在骨髓移植之前消除HSC或者无效，或者引起对除了预期HSC之外的细胞群体的伤害。本发明的组合物和方法提供了通过用表达特异性靶向HSC表面配体的嵌合配体受体(CAR)的免疫细胞靶向这些HSC来选择性消除HSC的方法，所述HSC受损、功能障碍或携带遗传缺陷，其引起疾病。一旦包含表达CAR的免疫细胞的组合物执行其功能，就可以通过预先辐照免疫细胞或通过进一步修饰这些细胞以含有诱导型促凋亡多肽来消除它们，所述诱导型促凋亡多肽在施用诱导剂后起始含有诱导型促凋亡多肽的仅表达外源CAR的免疫细胞的凋亡(否则称为“安全开关”)。

本发明的组合物和方法进一步提供了多种HSC的移植。优选地，本发明的移植的HSC是基因修饰的。

本发明的HSC可以通过包含DNA定位结构域和效应结构域的组合物来修饰。在某些实施方案中，DNA定位结构域可包含Cas9、失活的Cas9、短Cas9、短且失活的Cas9、TALEN或锌指蛋白的DNA结合结构域。在某些实施方案中，效应子包含内切核酸酶。优选地，内切核酸酶是IIS型内切核酸酶。在某些实施方案中，IIS型内切核酸酶是AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I、FokI或Clo051中的一种或多种。对于关于基因组编辑工具的更多详情，参见PCT/US2016/037922，其内容通过引用以其整体并入本文)。包含DNA定位结构域和效应结构域的组合物可以包含在转座子中。包含DNA定位结构域和效应结构域的组合物，包括载体中包含的那些，可以进一步包含在载体中用于表达和/或递送至细胞。

可以修饰本发明的HSC以除去疾病或病症的遗传或表观遗传标记。

可以修饰本发明的HSC以表达或过表达核酸或蛋白或分泌分子、肽、蛋白或化合物以治疗本发明的疾病或病症。

可以修饰本发明的HSC以表达或过表达核酸或蛋白或分泌分子、肽、蛋白或化合物以修改本发明的免疫应答。

可以修饰本发明的HSC以表达或过表达细胞表面配体以修改本发明的表达CAR的免疫细胞的活性。例如，移植的HSC可以表达配体，其在结合本发明的表达CAR的免疫细胞后使免疫细胞失活，以防止任何残余的表达CAR的免疫细胞选择性消除移植的HSC细胞。

核酸分子

本发明编码蛋白支架的核酸分子可呈RNA的形式，诸如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或呈DNA的形式，包括，但不限于CDNA和通过克隆获得的或合成产生的基因组DNA，或其任何组合。DNA可以是三链、双链或单链的，或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或者它可以是非-编码链，也称为反义链。

本发明的分离的核酸分子可包括包含开放阅读框(ORF)的核酸分子，任选地具有一个或多个内含子，例如，但不限于至少一个蛋白支架的至少一个特定的部分；包含结合靶标蛋白的蛋白支架或环区的编码序列的核酸分子；和包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码如本文所述的和/或如本领域已知的蛋白支架的核酸分子。当然，遗传密码是本领域众所周知的。因此，对于本领域技术人员来说，生成这样的简并核酸变体将是常规的，所述核酸变体编码本发明的特定蛋白支架。参见例如，Ausubel, 等人, 同上，这样的核酸变体被包括在本发明内。

如本文所指明，本发明的包含核酸编码蛋白支架的核酸分子可包括，但不限于编码蛋白支架片段自身的氨基酸序列的那些；完整蛋白支架或其部分的编码序列；蛋白支架、片段或部分的编码序列，以及另外序列，如至少一个信号前导或融合肽的编码序列，有或没有前面提到的另外编码序列，如至少一个与另外的非-编码序列一起的内含子，包括但不限于非-编码5′和3′序列，如在转录、mRNA加工，包括剪接和多腺苷化信号(例如，mRNA的核糖体结合和稳定性)中起作用的转录的、非翻译的序列；编码另外的氨基酸的另外编码序列，例如提供另外功能的那些。因此，编码蛋白支架的序列可融合至标记序列，如编码促进包含蛋白支架片段或部分的融合蛋白支架纯化的肽的序列。

与如本文所述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸

本发明提供了在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含这样的多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于在保藏的文库中鉴定、分离或扩增部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸是基因组的或分离的cDNA序列，或者另外，与来自人类或哺乳动物核酸库的cDNA互补。

优选地，cDNA文库包含至少80%的全长序列，优选至少85%或90%的全长序列，且更优选至少95%的全长序列。cDNA文库可以标准化以增加稀有序列的表示。低或中度严格性的杂交条件通常但不排除地用于相对于互补序列具有减少序列同一性的序列。中和高严格性条件可任选地用于具有更大同一性的序列。低严格性条件允许具有约70%序列同一性的序列的选择性杂交并可用于鉴定正向同源或共生同源序列。

任选地，本发明的多核苷酸将编码由本文描述的多核苷酸编码的蛋白支架中的至少一部分。本发明的多核苷酸包含可用于与编码本发明的蛋白支架的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如，Ausubel, 同上；Colligan, 同上，各自通过引用全文并入本文。

核酸的构建

本发明的分离的核酸可使用以下方法制备：(a) 重组方法，(b) 合成技术；(c) 纯化技术，和/或(d) 其组合，如本领域众所周知的。

除了本发明的多核苷酸外，所述核酸可方便地还包含其他序列。例如，包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点可插入核酸中以帮助分离多核苷酸。同样，可以插入可翻译的序列，以帮助分离本发明的翻译的多核苷酸。例如，六聚-组氨酸标记序列提供了纯化本发明的蛋白的便利方法。本发明的核酸(不包括编码序列)可任选地为用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、适配体或接头。

另外序列可被加入这样的克隆和/或表达序列中，以优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改善多核苷酸在细胞中的导入。克隆载体、表达载体、适配体和接头是本领域众所周知的(参见例如，Ausubel, 同上；或Sambrook, 同上)。

构建核酸的重组方法

本发明的分离的核酸组合物，如RNA、CDNA、基因组DNA，或其任何组合，可以使用本领域技术人员已知的任意数量的克隆方法从生物来源获得。在一些实施方案中，在严格的条件下，与本发明的多核苷酸选择性地杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的期望的序列。RNA的分离，和cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员众所周知的(参见例如，Ausubel, 同上；或Sambrook, 同上)。

核酸筛选和分离方法

cDNA或基因组文库可使用基于本发明多核苷酸的序列的探针进行筛选。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离同一或不同生物中的同源基因。本领域技术人员将意识到，该测定中可采用不同程度的杂交强度；且无论是杂交还是洗涤介质都可能是严格的。因为杂交的条件变得更严格，探针和靶标之间必须有更大程度的互补性，才能形成双链。严格程度可由温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一种或多种控制。例如，通过改变反应物溶液的极性，可以例如通过操纵甲酰胺的浓度在0%-50%的范围内，方便地改变杂交的严格性。为可检测的结合所需的互补性(序列同一性)程度将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而不同。互补性程度将最好为100%，或70-100%，或其中的任何范围或值，然而，应该理解，探针和引物中的微小序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性来补偿。

扩增RNA或DNA的方法是本领域众所周知的并可依据本发明基于本文的教导和指导采用，而无需不适当的实验。

DNA或RNA扩增的已知的方法包括，但不限于聚合酶链式反应(PCR)和相关扩增过程(参见例如，授予Mullis, 等人的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor, 等人的4,795,699和4,921,794；授予Innis的5,142,033；授予Wilson, 等人的5,122,464；授予Innis的5,091,310；授予Gyllensten, 等人的5,066,584；授予Gelfand, 等人的4,889,818；授予Silver, 等人的4,994,370；授予Biswas的4,766,067；授予Ringold的4,656,134)和RNA介导的扩增(其使用对作为双链DNA合成模板的靶序列的反义RNA) (授予Malek, 等人的美国专利号5,130,238，商品名NASBA)，其参考文献的全部内容通过引用并入本文(参见例如，Ausubel, 同上；或Sambrook, 同上)。

例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于扩增本发明的多核苷酸的序列和直接来自基因组DNA或cDNA文库的相关基因。PCR和其他体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达的蛋白的核酸序列，制备用作检测期望的mRNA在样品中的存在，对核酸测序，或用于其他目的的探针的核酸。通过体外扩增方法足以指导技术人员的技术的实例见于Berger, 同上, Sambrook, 同上，和Ausubel, 同上，以及Mullis, 等人, 美国专利号4,683,202(1987)；和Innis, 等人, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications,Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)。用于基因组PCR扩增的市售的试剂盒是本领域已知的。参见例如，优等-GC基因组PCR试剂盒(Advantage-GC Genomic PCRKit) (Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可用于提高长PCR产物的收率。

构建核酸的合成方法

本发明的分离的核酸也可以通过已知的方法，通过直接化学合成来制备(参见例如，Ausubel, 等人, 同上)。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板，用DNA聚合酶聚合而转化成双链DNA。本领域技术人员将认识到，尽管DNA的化学合成可能限制至约100个或更多碱基的序列，但更长的序列可以通过连接较短的序列获得。

重组表达盒

本发明进一步提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如，编码本发明的蛋白支架的cDNA或基因组序列，可用于构建可引入至少一个期望的宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常包含可操作地连接至转录起始调控序列的本发明的多核苷酸，所述调控序列将指导预期宿主细胞中多核苷酸的转录。异源的和非-异源的(即，内源的)启动子都可能用于指导本发明的核酸的表达。

在一些实施方案中，充当启动子、增强子或其他元件的分离的核酸可以在本发明的多核苷酸的非-异源形式的适当位置(上游、下游或在内含子中)引入，以便上调或下调本发明的多核苷酸的表达。例如，内源性启动子可以在体内或体外通过突变、缺失和/或取代而改变。

载体和宿主细胞

本发明也涉及包括分离的本发明的核酸分子的载体、用重组载体进行基因工程改造的宿主细胞，和通过重组技术产生至少一种蛋白支架，这是本领域众所周知的。参见例如，Sambrook, 等人, 同上；Ausubel, 等人, 同上，其各自通过引用全文并入本文。

例如，可使用PB-EF1a载体。载体包含以下核苷酸序列：

多核苷酸可任选地连接至包含可选择标记的载体，用于在宿主中增殖。一般来说，将质粒载体引入沉淀物，如磷酸钙沉淀，或在一个带电荷脂质的复合物中。如果载体是病毒，它可以使用适当的包装细胞系在体外包装，然后转导入宿主细胞。

DNA插入应该可操作地连接至适当的启动子。表达构建体还将包含转录起始、终止的位点，并在转录区包含用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选地包括从开头开始的翻译和适当定位在待翻译的mRNA的末端的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，其中UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞表达。

表达载体将优选地(但任选地)包含至少一种可选择的标记。这样的标记包括，例如，但不限于氨苄西林、博来霉素(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、麦考酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS, 美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)、杀稻瘟菌素(bsd基因)，对真核细胞培养以及氨苄西林、博来霉素(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B (hygB基因)、G418/新霉素(neo基因)、卡那霉素、大观霉素、链霉素、羧苄西林、博莱霉素、红霉素、多粘菌素B或四环素的耐药基因，对在大肠杆菌和其他细菌或原核生物中培养的耐药基因(以上专利通过引用全部并入本文)。对于上述宿主细胞的适当的培养基和条件是本领域已知的。对于技术人员而言，合适的载体将是显而易见的。将载体构建体引入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知的方法进行。这样的方法描述于本领域中，如Sambrook, 同上, 章节1-4和16-18; Ausubel, 同上, 章节1、9、13、15、16。

表达载体将优选地(但任选地)包括至少一种可选择的细胞表面标记，用于分离通过本发明的组合物和方法修饰的细胞。本发明的可选择的细胞表面标记包含表面蛋白、糖蛋白或区分细胞或细胞的子集与另一个定义的细胞子集区的蛋白组。优选地，可选择的细胞表面标记将通过本发明的组合物和方法修饰的那些细胞与未通过本发明的组合物和方法修饰的那些细胞区分开来。这样的细胞表面标记包括，例如，但不限于“指定簇”或“分类决定子”蛋白(通常缩写为“CD”)，如截短的或全长形式的CD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52或其任何组合。细胞表面标记还包括自杀基因标记RQR8 (Philip B 等人Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87)。

表达载体将优选地(但任选地)包括至少一种可选择的耐药标记，用于分离通过本发明的组合物和方法修饰的细胞。本发明的可选择的耐药标记可包含野生型或突变体Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2，或其任何组合。

至少一种本发明的蛋白支架可以以修饰的形式表达，如融合蛋白，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括另外的异源功能区。例如，另外的氨基酸区，特别是带电荷的氨基酸，可被加入蛋白支架的N-末端，以提高在纯化期间，或在随后的处理和储存期间的稳定性和在宿主细胞中的持久性。同样，肽部分可加入本发明的蛋白支架以促进纯化。在最后制备蛋白支架或其至少一个片段之前，可以移除这样的区域。这样的方法描述于许多标准实验室手册，如Sambrook, 同上, 章节17.29-17.42和18.1-18.74; Ausubel, 同上, 章节16, 17和18。

本领域普通技术人员对大量可用于表达编码本发明的蛋白的核酸表达系统非常了解。或者，通过在含有编码本发明的蛋白支架的内源性DNA的宿主细胞中打开(通过操作)，本发明的核酸可在宿主细胞中表达。这样的方法是本领域众所周知的，例如，如在美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述，通过引用全部并入本文。

可用于产生蛋白支架、其特定部分或变体的说明性细胞培养，是本领域已知的细菌、酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统经常以单层细胞的形式存在，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬液或生物反应器。本领域中已经开发许多能够表达完整糖基化蛋白的合适的宿主细胞系，并包括COS-1 (例如，ATCC CRL 1650)、COS-7 (例如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如，ATCC CRL-10)、CHO (例如，ATCC CRL 1610)和BSC-1 (例如，ATCCCRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),Manassas, Va. (www.atcc.org)容易地获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登录号CRL-1851)。在一个特别优选的实施方案中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。

用于这些细胞的表达载体可包括以下表达控制序列中的一种或多种，如，但不限于复制起点；启动子(如，晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062; 5,385,839)、HSV tk启动子、pgk (磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一种人启动子；增强子，和/或加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag聚A添加位点)，和转录终止子序列。参见例如，Ausubel等人, 同上；Sambrook, 等人, 同上。可用于产生本发明的核酸或蛋白的其他细胞是已知的和/或可得自例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(American TypeCulture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas) (www.atcc.org)或其他已知的或商业来源。

当利用真核宿主细胞时，多腺苷酸化或转录终止子序列通常被并入载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。也可以包括转录物的准确剪接的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague, 等人, J. Virol. 45:773-781(1983))。另外，控制宿主细胞复制的基因序列可以并入载体中，如本领域已知的。

蛋白支架的纯化

可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化蛋白支架，所述方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和层析、羟基磷灰石色谱和凝集素层析。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如，Colligan, Current Protocols in Immunology，或CurrentProtocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 例如，章节1、4、6、8、9、10，各自通过引用全文并入本文。

本发明的蛋白支架包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主，包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和表达细胞生产的产物。取决于重组生产程序中所用的宿主，本发明的蛋白支架可以被糖基化或可以被非-糖基化。这样的方法被描述于许多标准实验室手册，如Sambrook, 同上, Sections 17.37-17.42;Ausubel, 同上, 章节10、12、13、16、18和20, Colligan, Protein Science, 同上, 章节12-14，所有通过引用全部并入本文。

氨基酸密码

构成本发明的蛋白支架的氨基酸通常是缩写的。氨基酸命名可以通过用其单字母代码、其三个字母代码、名称或本领域普遍理解的三个核苷酸密码子指定氨基酸来表示(参见Alberts, B., 等人,Molecular Biology of The Cell, 第3版, Garland Publishing,Inc., New York, 1994)。本发明的蛋白支架可包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，无论是来自自然突变还是人为操纵，如本文所指定。本发明的蛋白支架中为功能所必需的氨基酸，可以通过本领域已知的方法来鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(如，Ausubel,同上, 章节8, 15; Cunningham和Wells, Science 244:1081-1085 (1989))。后一种程序在分子中的每一个残基上都引入单一丙氨酸突变。然后对所得的突变分子进行生物活性测试，如，但不限于至少一种中和活性。蛋白支架结合的关键位点也可以通过结构分析来确定，如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith, 等人, J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)和de Vos, 等人, Science 255:306-312 (1992))。

如技术人员所意识到，本发明包括至少一种本发明的生物活性的蛋白支架。生物活性的蛋白支架具有天然的(非-合成)、内源的或相关和已知的蛋白支架的比活性的至少20%、30%，或40%，和优选至少50%、60%，或70%，且最优选至少80%、90%，或95%-99%或更多的比活性。酶活性和底物特异性的测定和定量测量的方法是本领域技术人员众所周知的。

在另一方面，本发明涉及如本文所述的蛋白支架和片段，其通过有机分子的共价附着修饰。这样的修饰可产生具有改进的药代动力学特性(如，增加的体内血清半衰期)的蛋白支架片段。有机部分可以是线性或支化的亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基。在具体实施方案中，亲水性聚合物基团可具有约800-约120,000道尔顿的分子量并且可以是聚链烷二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基可包含约8至约40个碳原子。

本发明的修饰蛋白支架和片段可包含一个或多个与抗体直接或间接地共价结合的有机部分。结合至本发明的蛋白支架或片段的每个有机部分可独立地为亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基。如本文所用，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。如本文所用的术语“亲水性聚合物基团”，是指比在辛烷中更易溶于水的有机聚合物。例如，聚赖氨酸比在辛烷中更易溶于水。因此，本发明涵盖通过聚赖氨酸的共价附着修饰的蛋白支架。适合于修饰本发明的蛋白支架的亲水性聚合物可以是线性或支化的并且包括，例如，聚链烷二醇(例如，PEG，单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如，葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷烃氧化物(例如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明的蛋白支架的亲水性聚合物作为单独的分子实体具有约800-约150,000道尔顿的分子量。例如，可以使用PEG5000和PEG 20,000，其中下标是聚合物的平均分子量(以道尔顿计)。亲水性聚合物基团可用1-约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基取代。用脂肪酸或脂肪酸酯基取代的亲水性聚合物可通过采用合适的方法制备。例如，包含胺基的聚合物可以偶联至脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸盐，而脂肪酸或脂肪酸酯上的活化的羧酸盐(如，用羰基二咪唑活化)可以偶联至聚合物的羟基。

适合于修饰本发明的蛋白支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可以含有一个或多个不饱和单位。适合于修饰本发明的蛋白支架的脂肪酸包括，例如，正-十二烷酸(C12，月桂酸)、正-十四烷酸(C14，豆蔻酸)、正-十八烷酸(C18、硬脂酸)、正-二十烷酸(C20、花生酸)、正-二十二烷酸(C22、山萮酸)、正-三十烷酸(C30)、正-四十烷酸(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸(C18、油酸)、所有顺式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四碳二酸、十八碳二酸、二十二碳二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含线性或支化的低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可包含1-约12，优选1-约6个碳原子。

修饰的蛋白支架和片段可使用合适的方法，如通过与一个或多个修饰剂反应来制备。如本文所用的术语“修饰剂”，是指包含活化基团的合适的有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或官能团，其可在适当的条件下与第二化学基团反应，由此在修饰剂和第二个化学基团之间形成共价键。例如，胺-反应性活化基团包括亲电基团，如甲苯磺酸、甲磺酸、卤代(氯代、溴代、氟代、碘代)、N-羟基琥珀酰基酯(NHS)等。可与硫醇反应的活化基团包括，例如，马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶二硫醚(pyridyl disulfides)、5-硫羟基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能团可偶联至含有胺或酰肼的分子，而叠氮基可与三价磷基团反应以形成氨基磷酸酯(phosphoramidate)或磷酰亚胺键(phosphorimide linkages)。将活化基团引入分子的合适的方法是本领域已知的(参见例如，Hermanson, G. T., Bioconjugate Technoques；Academic Press: San Diego, Calif. (1996))。活化基团可直接连接至有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通过接头部分，例如，二价C1-C12基团，其中一个或多个碳原子可被杂原子，如氧、氮或硫替代。合适的接头部分包括，例如，四乙二醇(tetraethylene glycol)、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。例如，通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在的情况下，使单-Boc-烷基二胺(如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，以形成在游离胺和脂肪酸羧酸盐之间的酰胺键，可制备包含接头部分的修饰剂。Boc保护基团可通过如下从产物除去：用三氟乙酸(TFA)处理，以暴露于可偶联至另一个羧酸盐的伯胺，如所述，或可与马来酸酐反应，并使所得的产物环化生成活化的马来酰亚胺脂肪酸的衍生物(参见，例如，Thompson, 等人, WO 92/16221，其中的全部教导都通过引用并入本文)。

本发明的修饰的蛋白支架可通过使蛋白支架或片段与修饰剂反应来制备。例如，通过使用胺-反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯，可以非-位点特异性方式使有机部分结合至蛋白支架。包含结合至本发明的蛋白支架的特定位点的有机部分的修饰蛋白支架和片段可使用合适的方法，如反向蛋白水解(Fisch 等人, Bioconjugate Chem., 3:147-153(1992); Werlen 等人, Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran 等人,Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh 等人, Bioorg. Chem., 24(1): 59-68(1996); Capellas 等人, Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997))，和在Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques；Academic Press: San Diego, Calif.(1996)中描述的方法制备。

从白细胞去除术(Leukapheresis)产物分离T细胞

使用封闭系统和标准方法(例如，COBE Spectra Apheresis System)，白细胞去除术产物或血液可在临床场所从受试者收集。优选地，依据标准医院或机构白细胞去除术程序，在标准白细胞去除术收集袋中收集产物。例如，在本发明的方法的优选实施方案中，在白细胞去除术期间通常使用的那些之外，不包括另外抗凝血剂或血液添加剂(肝素等)。

或者，白细胞(WBC)/外周血单核细胞(PBMC) (使用Biosafe Sepax 2 (密闭的/自动化的))或T细胞(使用CliniMACS® Prodigy (密闭的/自动化的))可直接分离自全血。然而，在某些受试者(例如诊断和/或治疗癌症的那些)中，WBC/PBMC从全血中分离的产率可能比通过白细胞去除术分离时显著更低。

白细胞去除术程序和/或直接细胞分离程序可用于本发明的任何受试者。

白细胞去除术的产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物应用绝缘容器包装，并应依据为用于临床方案批准的标准医院机构血液收集程序，保持在受控制的室温下(+19℃至+25℃)。白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物不应冷藏。

在运输期间，细胞浓缩白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物不应超过0.2x10⁹细胞/mL。应避免白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的强烈混合。

如果白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物必须储存例如过夜，其应该保持在受控制的室温下(与上文相同)。在储存期间，白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的浓度决不应超过0.2x10⁹个细胞/mL。

优选地，白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的细胞应储存在自体血浆中。在某些实施方案中，如果白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的细胞浓度高于0.2x10⁹个细胞/mL，产物应用自体血浆稀释。

优选地，当开始标记和分离程序时，白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物不应超过24小时。白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物可使用密闭和/或自动化系统(如，CliniMACS Prodigy)处理和/或准备细胞标记。

自动化的系统可能通过渗漉(ficolation)和/或洗涤细胞产物来进行另外的血沉棕黄层(buffy coat)分离(例如，白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物)。

密闭的和/或自动化的系统可用于制备和标记细胞用于T-细胞分离(从例如白细胞去除术产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物)。

尽管WBC/PBMC可以直接核转染(这更容易且保存其他步骤)，本发明的方法可以包括在核转染之前首先分离T细胞。直接核转染PBMC的更简单策略要求经由CAR信号传导介导的CAR+细胞的选择性扩增，这本身证明是一种较差的扩增方法，其通过使T细胞功能耗竭，直接降低产物的体内效率。产物可以是CAR+细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞或其任何组合的异质组合物，这增加从患者至患者的产物的可变性，并且使得给药和CRS管理更困难。因为T细胞被认为是肿瘤抑制和杀伤的主要效应物，T细胞分离用于制造自体产物可能导致超过其他更异质组合物的显著的好处。

T细胞可以通过富集标记细胞或在单向标记程序中耗竭标记细胞来直接分离，或者在两步标记程序中间接地分离。根据本发明的某些富集策略，T细胞可以收集在细胞收集袋，而未标记的细胞(非-靶细胞)在负级分袋中收集。与本发明的富集策略相反，未标记的细胞(靶细胞)在细胞收集袋中收集，而标记的细胞(非-靶细胞)分别在负级分袋或非-靶细胞袋中收集。选择试剂可包括，但不限于抗体包被的珠。抗体包被的珠可或者在修饰和/或扩增步骤之前除去，或者在修饰和/或扩增步骤之前保留在细胞上。细胞标记的以下非-限制性实例中的一种或多种可用于分离 T-细胞：CD3、CD4、CD8、CD25、抗-生物素、CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-γ、TCRα/β和/或其任何组合。用于分离T-细胞的方法可包括一种或多种试剂，所述试剂特异性结合和/或可检测地标记可用于分离T-细胞的细胞标记的以下非-限制性实例中的一种或多种：CD3、CD4、CD8、CD25、抗-生物素、CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-γ、TCRα/β和/或其任何组合。这些试剂可能是或可能不是“良好操作规范” (“GMP”)级别。试剂可包括，但不限于ThermoDynaBeads和Miltenyi CliniMACS产物。分离本发明的T-细胞的方法可包括标记和/或分离步骤的多次迭代。在分离本发明的T-细胞的方法的任何点，不需要的细胞和/或不需要的细胞类型可通过正性或负性选择不需要的细胞和/或不想要的细胞类型，从本发明的T细胞产物组合物中耗竭。本发明的T细胞产物组合物可含有另外的可表达CD4、CD8和/或另一种T细胞标记的细胞类型。

本发明的用于T细胞的核转染的方法可通过例如将WBC/PBMC的群体或组合物中的T细胞核转染的方法消除T细胞分离的步骤，其在核转染后包括分离步骤或经由TCR信号传导的选择性扩增步骤。

某些细胞群体可在T细胞富集和/或分选之前或之后，通过正性或负性选择来消除。可从细胞产物组合物中耗竭的细胞组合物的实例，可包括髓细胞、CD25+调节T细胞(TRegs)、树突细胞、巨噬细胞、红细胞、肥大细胞、γ-δT细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)-样细胞(例如细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、诱导型天然杀伤(iNK) T细胞、NK T细胞、B细胞或其任何组合。

本发明的T细胞产物组合物可包括CD4+和CD8+ T-细胞。在分离或选择程序期间，CD4+和CD8+ T-细胞可被分离至分开的收集袋中。CD4+ T细胞和CD8+ T细胞可被进一步地分开处理，或在重构(组合至相同组合物中)后以特定比率处理。

可重构CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的的特定比率可取决于所用扩增技术的类型和效力、细胞培养基和/或用于扩增T-细胞产物组合物的生长条件。可能的CD4+: CD8+比率的实例包括，但不限于50%:50%、60%:40%、40%:60% 75%:25%和25%:75%。

CD8+ T细胞表现出强大的杀死肿瘤细胞的能力，而CD4+ T细胞提供支持CD8+ T细胞增殖能力和功能所需的许多细胞因子。因为从正常供体分离的T细胞主要是CD4+，T-细胞产物组合物在体外根据CD4+:CD8+比率进行人工调节，以提高CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率，其在体内以其他方式出现。优化的比率也可用于自体T-细胞产物组合物的离体扩增。鉴于人工调节的T-细胞产物组合物的CD4+:CD8+比率，重要的是注意到，本发明的产物组成与任何天然存在的T-细胞群体相比，可能存在显著差异，并提供了更大的优势。

用于T细胞分离的优选的方法可包括负性选择策略，用于产生未接触的泛T细胞，意味着所得的T-细胞组合物包括未被操纵并且含有天然存在的T-细胞的种类/比率的T-细胞。

可用于正性或负性选择的试剂包括但不限于磁性细胞分离珠。在进行本发明的T-细胞分离方法中的下一步骤之前，磁性细胞分离珠可能或不可能从选择的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞群体或CD4+和CD8+ T细胞二者的混合群体中移除或耗竭。

可以制备T细胞组合物和T细胞产物组合物用于冷冻保存、标准T细胞培养基中储存和/或基因修饰。

T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息的T细胞组合物或其任何部分可以用标准的冷冻保存方法进行冷冻保存，所述冷冻保存方法经优化用于储存和回收具有高回收率、活力、表型和/或功能能力的人细胞。可使用市售的冷冻保存介质和/或方案。本发明的冷冻保存方法可包括无DMSO的冷冻保存剂(例如CryoSOfree™无DMSO冷冻保存介质)，减少冷冻-相关毒性。

T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分可保存在培养基中。可优化本发明的T细胞培养基用于细胞储存、细胞基因修饰、细胞表型和/或细胞扩增。本发明的T细胞培养基可包括一种或多种抗体。因为在细胞培养基内包含抗生素可能降低经由核转染的基因修饰后的转染效率和/或细胞产率，特定抗生素(或其组合)和它们各自的浓度可能改变，以在经由核转染的基因修饰后获得最佳的转染效率和/或细胞产率。

本发明的T细胞培养基可包括血清，并且而且，血清组成和浓度可能改变，以获得最佳的细胞结果。人AB血清比FBS/FCS更适合于T细胞的培养，因为，尽管考虑在本发明的T细胞培养基中使用，但FBS/FCS可引入异种蛋白。血清可从意欲施用于受试者培养的T-细胞组合物的血液中分离出，因此，本发明的T细胞培养基可包含自体血清。无血清培养基或血清-代用品也可用于本发明的T细胞培养基中。在本发明的T-细胞培养基和方法的某些实施方案中，无血清培养基或血清-代用品可提供超过用异种血清补充培养基的优势，包括，但不限于，具有更高活力的更健康的细胞，以更高效率进行核转染，表现出核转染后更大的活力，展现更期望的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。

T细胞培养基可包括市售的细胞生长培养基。示例性市售的细胞生长培养基包括，但不限于PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTSOpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。

可制备T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分用于基因修饰。用于基因修饰的T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分的制备可包括细胞洗涤和/或再悬浮于期望的核转染缓冲剂中。可以解冻和制备冷冻保存的T-细胞组合物用于通过核转染进行基因修饰。冷冻保存的细胞可依据标准或已知的方案解冻。可优化冷冻保存的细胞的解冻和准备以产生具有更大活力、以更高效率核转染、核转染后表现出更大活力、展现更期望的细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。例如，Grifols Albutein (25%人白蛋白)可用于解冻和/或制备过程。

T细胞的基因修饰

T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分可使用例如核转染策略如电穿孔进行基因修饰。可以优化待进行核转染的细胞总数，核转染反应的总体积和制备样品的精确时间以产生具有更大活力、以更高效率核转染、核转染后表现出更大的活力、表现出更期望的细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。

核转染和/或电穿孔可使用，例如，Lonza Amaxa、MaxCyte PulseAgile、HarvardApparatus BTX和/或Invitrogen Neon完成。非-金属电极系统，包括但不限于塑料聚合物电极，对于核转染可能是优选的。

在通过核转染的基因修饰之前，T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分可再悬浮于核转染缓冲液中。本发明的核转染缓冲液包括市售的核转染缓冲液。可以优化本发明的核转染缓冲液以产生具有更大活力、以更高效率核转染、核转染后表现出更大的活力、表现出更期望的细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。本发明的核转染缓冲液可包括，但不限于PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲剂和其任何组合。本发明的核转染缓冲液可包含一种或多种补充因子，以产生具有更大活力、以更高效率核转染、核转染后表现出更大的活力、表现出更期望的细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快扩增的细胞。示例性补充因子包括，但不限于重组人细胞因子、趋化因子、白介素和其任何组合。示例性细胞因子、趋化因子，和白介素包括，但不限于、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性盐、矿物质和代谢物包括，但不限于HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于培养基如PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括，但不限于TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂，糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于以增强细胞递送、增强核递送或转运、增强促进核酸转运入细胞核、增强表染色体核酸的降解和/或降低DNA-介导的毒性的方式，修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。修饰或稳定一种或多种核酸的示例性试剂包括，但不限于pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、带有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶，和其任何组合。

转座试剂，包括转座子和转座酶，可在将细胞加入核转染缓冲剂(任选地，包含在核转染反应小瓶或比色杯中)之前、同时或之后加入本发明的核转染反应中。本发明的转座子可包含质粒DNA、线性质粒DNA、PCR产物、DOGGYBONE™ DNA、mRNA模板、单链或双链DNA、蛋白-核酸组合或其任何组合。本发明的转座子可包含一个或多个序列，其编码一个或多个TTAA位点、一个或多个反向末端重复(ITRs)、一个或多个长尾重复(LTRs)、一个或多个绝缘子、一个或多个启动子、一个或多个全长或截短的基因、一个或多个聚A信号、一个或多个自我切割2A肽切割位点、一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)、一个或多个增强子、一个或多个调节基因、一个或多个复制起点和其任何组合。

本发明的转座子可包含一个或多个序列，其编码一个或多个全长或截短的基因。由本发明的转座子引入的全长和/或截短的基因可编码一个或多个信号肽、Centyrin、单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域、嵌合配体/抗原受体(CLR/CAR)、嵌合T-细胞受体(CAR-T)、CARTyrin (包含Centyrin的CAR-T)、受体、配体、细胞因子、耐药性基因、肿瘤配体、同种异体配体或自体配体、酶、蛋白、肽、多肽、荧光蛋白、突变蛋白或其任何组合。

本发明的转座子可在水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培养基、本发明的补充因子或其任何组合中制备。

可设计本发明的转座子以优化临床安全性和/或提高可制备性。作为一个非限制性实例，可设计本发明的转座子以通过消除不必要的序列或区域和/或包括非抗生素选择标记，优化临床安全性和/或提高可制备性。本发明的转座子可能是或可能不是GMP级。

本发明的转座酶可通过质粒DNA、mRNA、蛋白、蛋白-核酸组合或其任何组合的一个或多个序列编码。

本发明的转座酶可在水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培养基、本发明的补充因子或其任何组合中制备。本发明的转座酶或编码或递送它们的序列/构建体可能是或可能不是GMP级。

本发明的转座子和转座酶可通过任何方式递送至细胞。

尽管本发明的组合物和方法包括通过质粒DNA (pDNA)将本发明的转座子和/或转座酶递送至细胞，但使用质粒用于递送可允许转座子和/或转座酶被整合至细胞的染色体DNA中，这可导致连续的转座酶表达。因此，本发明的转座子和/或转座酶可作为mRNA或蛋白被递送至细胞，以除去任何染色体整合的可能性。

本发明的转座子和转座酶可在转座子和/或转座酶引入核转染反应之前，单独或联合进行预孵育。可以优化每种转座子和转座酶的绝对量，以及相对量，例如，转座子与转座酶的比例。

在准备核转染反应后，任选地，在小瓶或比色杯中，根据制造商的方案，反应可能被加载至核转染仪装置中，并被活化用于递送电流脉冲。可优化用于递送本发明的转座子和/或转座酶(或编码本发明的转座子和/或转座酶的序列)至细胞的电流脉冲条件以产生具有增强的活力、更高核转染效率、核转染后的更大的活力、更期望的细胞表型和/或增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。对于Amaxa 2B或4D核转染仪，考虑每种不同的核转染程序。

在本发明的核转染反应后，细胞可以轻轻地添加至细胞培养基中。例如，当T细胞经历核转染反应时，T细胞可加入T细胞培养基中。本发明的核转染后细胞培养基可包含任何一个或多个市售的培养基。可优化本发明的核转染后细胞培养基(包括本发明的核转染后T细胞培养基)以产生具有更大活力、更高核转染效率、核转染后表现出更大活力、展示更期望的细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。本发明的核转染后细胞培养基(包括本发明的核转染后T细胞培养基)可包含PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基和其任何组合。本发明的核转染后细胞培养基(包括本发明的核转染后T细胞培养基)可包含本发明的一种或多种补充因子，以增强活力、核转染效率、效率核转染后的活力、细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。示例性补充因子包括，但不限于，重组人细胞因子、趋化因子、白介素和其任何组合。示例性细胞因子、趋化因子和白介素包括，但不限于，IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性盐、矿物质和代谢物包括，但不限于HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于培养基如PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTSOpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括，但不限于TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNApol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂、糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK及其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于以增强细胞递送、增强核递送或转运、增强促进核酸转运入细胞核、增强表染色体核酸的降解和/或降低 DNA-介导的毒性的方式修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。修饰或稳定一种或多种核酸的示例性试剂包括，但不限于pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、CaPO4、带有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶，和其任何组合。

本发明的核转染后细胞培养基(包括本发明的核转染后T细胞培养基)可在室温使用或预热至，例如32℃-37℃之间(包括端点)。本发明的核转染后细胞培养基(包括本发明的核转染后T细胞培养基)可预热至维持或提高细胞活力和/或表达本发明的转座子或其部分的任何温度。

本发明的核转染后细胞培养基(包括本发明的核转染后T细胞培养基)可包含在组织培养烧瓶或培养皿、G-Rex烧瓶、生物反应器或细胞培养袋，或任何其他标准贮器中。本发明的核转染后细胞培养物(包括本发明的核转染后T细胞培养)可保持不动，或者，可替代地，它们也可以被搅动(例如震动、旋转或摇动)。

核转染后细胞培养物可包含基因修饰的细胞。核转染后T细胞培养物可包含基因修饰的T细胞。本发明的基因修饰细胞可以静息一段定义的时间段，或通过例如添加T细胞Expander技术来刺激扩增。在某些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞可以或者静息一段特定的时间，或者立即刺激扩增，例如，通过加入T细胞Expander技术。本发明的基因修饰细胞可以静息以允许它们有足够的时间适应，足够的时间发生转座，和/或正性或负性选择的时间，产生具有增强的活力、更高的核转染效率、更大的核转染后的活力、期望的细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。本发明的基因修饰细胞可以静息，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时。在某些实施方案中，本发明的基因修饰细胞可以静息，例如过夜。在某些方面，过夜是约12小时。本发明的基因修饰细胞可以静息，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

本发明的基因修饰细胞可在核反应之后和加入expander技术之前进行选择。为了基因修饰细胞的最佳选择，可允许细胞在核转染后细胞培养基中静息至少2-14天，以便于鉴定修饰的细胞(例如，区分修饰与非-修饰细胞)。

在早至核转染后24-小时，本发明的CAR/CARTyrin和选择标记的表达在本发明的转座子的成功核转染后，可在修饰的T细胞中检测到。由于转座子的表染色体表达，单独的选择标记的表达不能将修饰的T细胞(其中转座子已经成功地整合的那些细胞)与未修饰的T细胞(其中转座子未成功整合的那些细胞)区分开。当转座子的表染色体表达遮蔽通过选择标记检测修饰细胞时，核转染的细胞(修饰和未修饰的细胞二者)可以静息一段时间(例如2-14天)，以使细胞停止表达或丧失所有表染色体转座子表达。在该延长的静息期后，只有修饰的T细胞应保持选择标记的表达阳性。该延长的静息期的长度可针对每种核转染反应和选择过程进行优化。当转座子的表染色体表达遮蔽通过选择标记检测修饰细胞时，选择可以在没有该延长的静息期的情况下进行，然而，可以在后来的时间点包括另外的选择步骤(例如或者在扩增阶段期间或在扩增阶段之后)。

本发明的基因修饰的细胞的选择可用任何方式执行。在本发明的方法的某些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞的选择可通过分离表达特定选择标记的细胞执行。本发明的选择标记可由转座子中的一个或多个序列编码。本发明的选择标记可能是由于成功的转座而由修饰的细胞表达(即转座子中的一个或多个序列未编码)。在某些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞含有选择标记，其赋予对核转染后细胞培养基的靶标化合物的抗性。靶标化合物可包含，例如，抗生素或药物，其在选择标记赋予修饰细胞的抗性缺乏时，会导致细胞死亡。示例性选择标记包括，但不限于野生型(WT)或以下基因中的一种或多种的突变形式：neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS和NKX2.2。示例性选择标记包括，但不限于，表面-表达的选择标记或表面-表达的标签可分别通过Ab-包被磁珠技术或柱选择来靶向。可切割的标签例如用于蛋白纯化的那些可加入本发明的选择标记中，以便进行有效的柱选择、洗涤和洗脱。在某些实施方案中，本发明的选择标记不由天然修饰的细胞(包括修饰的T细胞)表达，因此，可用于修饰细胞的物理分离(例如，通过细胞分选技术)。本发明的示例性选择标记不由天然修饰的细胞(包括修饰的T细胞)表达，包括，但不限于全长、突变的或截短形式的CD271、CD19、CD52、CD34、RQR8、CD22、CD20、CD33和其任何组合。

本发明的基因修饰的细胞可在核转染反应后选择性扩增。在某些实施方案中，包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞可通过CAR/CARTyrin刺激而选择性扩增。包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞可通过与靶标覆盖的试剂接触来刺激(如肿瘤细胞系或正常细胞系，其表达靶标或在靶标中覆盖的扩张珠)。或者，包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞可通过与辐照的肿瘤细胞、辐照的同种异体正常细胞、辐照的自体PBMC接触来刺激。为了使用于刺激的靶标-表达细胞对本发明的细胞产物组合物的污染最小化，例如，当细胞产物组合物可以直接施用于受试者时，可以用涂覆有CAR/CARTyrin靶蛋白的扩张珠进行刺激。可优化通过CAR/CARTyrin刺激对包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞的选择性扩增，以避免在功能上耗竭修饰的T-细胞。

选择的本发明的基因修饰的细胞可冷冻保存，静息定义的时间段，或通过加入细胞Expander技术来刺激扩增。选择的本发明的基因修饰的细胞可冷冻保存，静息定义的时间段，或立即通过加入细胞Expander技术来刺激扩增。当选择的基因修饰的细胞是T细胞时，T细胞可通过加入T-细胞Expander技术刺激扩增。选择的本发明的基因修饰细胞可静息，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时。在某些实施方案中，选择的本发明的基因修饰细胞可静息，例如过夜。在某些方面，过夜是约12小时，选择的本发明的基因修饰细胞可静息，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。选择的本发明的基因修饰的细胞可静息任何时间段，产生具有增强的活力、更高的核转染效率、核转染后更大的活力、更期望的细胞表型和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。

选择的基因修饰细胞(包括本发明的选择的基因修饰的T细胞)可使用任何标准冷冻保存方法冷冻保存，其可经优化用于储存和/或以高回收率、活力、表型和/或功能能力回收人细胞。本发明的冷冻保存方法可包括市售的冷冻保存介质和/或方案。

选择的基因修饰的细胞(包括选择的本发明的基因修饰的T细胞)的转座效率可通过任何手段评价。例如，在应用expander技术之前，由选择的基因修饰的细胞(包括本发明的选择的基因修饰的T细胞)表达的转座子可通过荧光-活化的细胞分选(FACS)测量。选择的基因修饰的细胞(包括本发明的选择的基因修饰的T细胞)的转座效率的测定可包括测定选择的表达转座子(例如CAR)的细胞的百分比。可替代地，或者另外地，T细胞的纯度、转座子表达(例如CAR表达)的平均荧光强度(MFI)、CAR (转座子中递送)介导表达CAR配体的靶细胞的脱粒和/或杀伤的能力，和/或选择的基因修饰的细胞(包括本发明的选择的基因修饰的T细胞)的表型可用任何方法评价。

本发明的细胞产物组合物可在符合某些释放标准后被释放用于施用于受试者。示例性释放标准可包括，但不限于，在细胞表面上表达可检测水平的CAR的修饰、选择和/或扩增的T细胞的特定百分比。

表达CAR的T细胞的产生

本发明的基因修饰的细胞(包括基因修饰的T细胞)可使用Expander技术扩增。本发明的Expander技术可包含市售的Expander技术。本发明的示例性Expander技术包括经由TCR刺激本发明的基因修饰的T细胞。尽管考虑刺激本发明的基因修饰T细胞的所有方式，但经由TCR刺激本发明的基因修饰的T细胞是优选的方法，产生具有优异杀伤力水平的产物。

为了经由TCR刺激本发明的基因修饰的T细胞，Thermo Expander DynaBeads可以3:1珠:T细胞比率使用。如果expander珠是不是可生物降解的，则可将珠从expander组合物中除去。例如，在约5天后，珠可从expander组合物中除去。为了经由TCR刺激本发明的基因修饰的T细胞，可以使用Miltenyi T细胞活化/扩增试剂(Miltenyi T Cell Activation/Expansion Reagent)。为了经由TCR刺激本发明的基因修饰的T细胞，可以使用StemCellTechnologies的ImmunoCult Human CD3/CD28或CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂试剂。该技术可能是优选的，因为可溶性四聚体抗体复合物会在一段时间后降解，并且不需要将其从工艺中移除。

人工配体呈递细胞(APCs)可经工程改造以共同表达靶标配体并且可用于通过本发明的TCR和/或CAR刺激本发明的细胞或T-细胞。人工APC可包含或可源自肿瘤细胞系(包括，例如，永生化髓系白血病细胞系K562)并可经工程改造以共同表达多种共刺激分子或技术(如 CD28、4-1BBL、CD64、mbIL-21、mbIL-15、CAR靶标分子等)。当本发明的人工APC与共刺激分子组合时，可优化条件以防止发展或出现不期望的表型和功能能力，即终末分化的效应T细胞。

辐照的PBMC (自体或同种异体)可表达一些靶标配体，如CD19，并可用于通过本发明的TCR和/或CAR刺激本发明的细胞或T-细胞。可替代地，或者另外地，辐照的肿瘤细胞可表达一些靶标配体并可用于通过本发明的TCR和/或CAR刺激本发明的细胞或T-细胞。

板结合和/或可溶性抗-CD3、抗-CD2和/或抗-CD28刺激可用于通过本发明的TCR和/或CAR刺激本发明的细胞或T-细胞。

配体-包被的珠可展示靶标蛋白并可用于通过本发明的TCR和/或CAR刺激本发明的细胞或T-细胞。可替代地，或者另外地，用CAR/CARTyrin靶标蛋白包被的expander珠可用于通过本发明的TCR和/或CAR刺激本发明的细胞或T-细胞。

扩增方法涉及通过TCR或CAR/CARTyrin和经由表面-表达的CD2、CD3、CD28、4-1BB和/或基因修饰的T细胞上的其他标记刺激本发明的细胞或T-细胞。

扩增技术可在核转染后立即应用于本发明的细胞，直至核转染后大约24小时。尽管各种细胞培养基可在扩增程序期间使用，但本发明的期望的T细胞扩增培养基可产生具有例如更大活力、细胞表型、总扩增或更大的体内持久性、植入性和/或CAR-介导的杀伤的能力的细胞。可优化本发明的细胞培养基以改进/提高本发明的基因修饰的细胞的扩增、表型和功能。扩增的T细胞的优选的表型可包括T干细胞记忆、T中枢和T效应记忆细胞的混合物。Expander Dynabeads可主要产生中枢记忆T细胞，其可导致优异的临床表现。

本发明的示例性T细胞扩增培养基可能包括部分或全部PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基(CellGro DC Medium)、CTS OpTimizer T细胞扩增(T Cell Expansion) SFM、TexMACS培养基(TexMACS Medium)、PRIME-XV T细胞扩增培养基(PRIME-XV T Cell Expansion Medium)、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基(ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium)或其任何组合。本发明的T细胞扩增培养基可进一步包括一种或多种补充因子。可包括在本发明的T细胞扩增培养基中的补充因子增强活力、细胞表型、总扩增，或增加体内持久性、植入性和/或CAR-介导的杀伤能力。可包括在本发明的T细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于重组人细胞因子、趋化因子和/或白介素如 IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。可包括在本发明的T细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于盐、矿物质和/或代谢物，如HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS补充剂、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5或其任何组合。可包括在本发明的T细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导，和/或凋亡途径的抑制剂，例如TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂，糖原合酶激酶-3β (GSK-3 β)的抑制剂(如TWS119)、Bafilomycin、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK，或其任何组合。

可包括在本发明的T细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于以增强细胞递送、增强核递送或转运、增强促进核酸转运入细胞核、增强表染色体核酸的降解和/或降低DNA-介导的毒性的方式修饰或稳定核酸的试剂，如pH调节剂、DNA-结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、CaPO4、带有或没有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。

本发明的基因修饰的细胞可在扩增过程期间通过使用可选择的药物或化合物来选择。例如，在某些实施方案中，当本发明的转座子可编码选择赋予基因修饰细胞对添加至培养基的药物的耐药性时，选择可发生在扩增过程期间并可能需要大约1-14天的培养用于进行选择。可用作由本发明的转座子编码的选择标记的耐药基因实例，包括，但不限于野生型(WT)或突变形式的基因neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS、NKX2.2或其任何组合。可添加至选择标记可赋予抗性的培养基中的相应的药物或化合物实例包括，但不限于G418、嘌呤霉素、氨苄西林、卡那霉素、甲氨蝶呤、美法仑、替莫唑胺、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、苯达莫司汀、氟达拉滨、Aredia (帕米膦酸二钠)、Becenum (卡莫司汀)、BiCNU (卡莫司汀)、硼替佐米(Bortezomib)、卡非佐米(Carfilzomib)、Carmubris (卡莫司汀), 卡莫司汀、Clafen (环磷酰胺)、环磷酰胺、Cytoxan (环磷酰胺)、达雷木单抗、Darzalex (达雷木单抗)、Doxil (盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、lotuzumab、Empliciti (埃罗妥珠单抗(Elotuzumab))、Evacet(盐酸多柔比星脂质体)、Farydak (帕比司他(Panobinostat))、伊沙佐米(Ixazomib)柠檬酸盐、Kyprolis (卡非佐米)、来那度胺、LipoDox (盐酸多柔比星脂质体)、Mozobil (普乐沙福(Plerixafor))、Neosar (环磷酰胺)、Ninlaro (伊沙佐米柠檬酸盐)、帕米膦酸二钠、帕比司他(Panobinostat)、普乐沙福(Plerixafor)、泊马度胺(Pomalidomide)/Pomalyst(泊马度胺)、Revlimid (来那度胺)、Synovir (沙利度胺)、沙利度胺、Thalomid (沙利度胺)、Velcade (硼替佐米)、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zometa (唑来膦酸)或其任何组合。

本发明的T-细胞扩增过程可发生在WAVE生物反应器、G-Rex烧瓶或在任何其他合适的容器和/或反应器中的细胞培养袋中。

本发明的细胞或T-细胞培养可保持稳定、摇动、旋转或震动。

本发明的细胞或T-细胞扩增过程可优化某些条件，包括但不限于培养持续时间、细胞浓度、T细胞培养基添加/除去的时间表、细胞大小、总细胞数、细胞表型、细胞群体的纯度、生长中的细胞群体中的基因修饰的细胞的百分比、补充剂的使用和组成、expander技术的添加/除去或其任何组合。

本发明的细胞或T-细胞扩增过程可继续直至预先定义的端点，然后配制所得的扩增细胞群体。例如，本发明的细胞或T-细胞扩增过程可继续预定量的时间：至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周；至少1、2、3、4、5、6月，或至少1年。本发明的细胞或T-细胞扩增过程可继续直至所得的培养物达到预定的总细胞密度：1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010细胞/每体积(μl、ml、L)或之间的任何密度。本发明的细胞或T-细胞扩增过程可继续直至所得培养物的基因修饰的细胞显示本发明的转座子的预定水平的表达：1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或100%或其之间的任何百分比的阈值水平的表达(最小、最大或平均水平的表达表明所得的基因修饰的细胞是临床上有效的)。本发明的细胞或T-细胞扩增过程可继续直至所得的培养物的基因修饰的细胞的比例与未修饰的细胞的比例达到预定阈值：至少1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、2:1、4:1、5:1、6:1 ,7:1、8:1、9:1 10:1或其之间的任何比例。

施用前的表达CAR的T细胞的质量控制分析

基因修饰的细胞的百分比可在本发明的扩增过程期间或之后评价。本发明的基因修饰的细胞的转座子的细胞表达可通过荧光-活化的细胞分选(FACS)测量。例如，FACS可用于测定本发明的表达CAR的细胞或T细胞的百分比。可替代地，或者另外地，可评价基因修饰细胞或T细胞的纯度，由本发明的基因修饰细胞或T细胞表达的CAR的平均荧光强度(MFI)，CAR介导表达CAR配体的靶细胞脱粒和/或杀伤的能力，和/或CAR+ T细胞的表型。

意欲施用于受试者的本发明的组合物可被要求满足一种或多种“释放标准”，所述标准表明对于配制为药品和/或施用于受试者而言，所述组合物是安全和有效的。释放标准可包括这样的要求，即本发明的组合物(如本发明的T-细胞产物)包含特定百分比的在其细胞表面上表达可检测水平的本发明的CAR的T细胞。

扩增过程应继续直至已满足特定标准(例如实现特定的总细胞数，实现特定记忆细胞数，实现特定大小的群体)。

扩增过程应在该点结束的特定标准信号。例如，细胞一旦达到300fL (否则，达到高于该阈值的大小的细胞可能开始死亡)的细胞大小，就应该将细胞配制、重新活化或冷冻保存。一旦细胞群体达到小于300 fL的平均细胞大小就立即冷冻保存，在解冻和培养后可产生更好的细胞回收，因为细胞在冷冻保存前还没有达到完全静止状态(完全静止的大小是大约180 fL)。扩增前，本发明的T细胞可具有约180 fL的细胞大小，但在扩增后3天，它们的细胞大小可能在四倍以上，至大约900 fL。在接下来的6-12天内，T细胞的群体将缓慢减少细胞大小至180 fL时的完全静止。

用于制备用于制剂的细胞群体的方法可包括，但不限于浓缩细胞群体的细胞，洗涤细胞，和/或经由针对特定表面-表达的标记的耐药性或磁珠分选进一步选择细胞的步骤。用于制备用于制剂的细胞群体的方法还可以包括分选步骤，以确保最终产物的安全性和纯度。例如，如果来自患者的肿瘤细胞已用于刺激本发明的基因修饰的T-细胞或已被工程改造，以刺激正在准备用于配制的本发明的基因修饰T-细胞，则在最终产品中不包括患者的肿瘤细胞是重要的。

表达CAR的细胞的施用和保存

本发明的药物制剂可分装成袋，用于输液、冷冻保存和/或储存。

本发明的药物制剂可使用标准方案和任选地可输注的冷冻保存介质冷冻保存。例如，无DMSO的低温保存剂(如CryoSOfree™无DMSO冷冻保存介质)可用于减少冷冻-相关的毒性。冷冻保存的本发明的药物制剂可以在后来的日期储存用于输注入患者。有效的治疗可需要多次施用本发明的药物制剂，且因此，药物制剂可以包装于预先等分的“剂量”中，所述“剂量”可以被冷冻储存，但可以分开用于单个剂量的解冻。

本发明的药物制剂可在室温下储存。有效的治疗可需要多次施用本发明的药物制剂，且因此，药物制剂可以包装于预先等分的“剂量”中，所述“剂量”可以被储存在一起，但分开用于单个剂量的解冻。

本发明的药物制剂可存档，用途随后重新扩增和/或选择用于在同种异体疗法的情况下为相同患者产生另外剂量，所述患者可能需要在以后的某一天，例如，病情的缓解和复发后，进行施用。

作为过继性细胞疗法的修饰细胞的输注

本发明提供了修饰的免疫细胞和HSC，用于施用于有需要的受试者。本发明的修饰细胞可被配制用于在任何温度(包括室温和体温)下储存。本发明的修饰细胞可被配制用于冷冻保存和随后的解冻。本发明的修饰细胞可在药学上可接受的载体中配制，用于从无菌包装直接施用于受试者。本发明的修饰细胞可在药学上可接受的载体中与细胞活力和/或CAR/CARTyrin表达水平的指示剂一起配制，以确保最小水平的细胞功能和CAR/CARTyrin表达。本发明的修饰细胞可在药学上可接受的载体中以规定的密度与一种或多种抑制进一步扩增和/或防止细胞死亡的试剂一起配制。

实施例

实施例1：piggyBac整合iC9安全开关至人泛T-细胞中的表达和功能

使用Amaxa 4D核转染仪用4个piggyBac转座子之一对人泛T-细胞进行核转染。用空piggyBac转座子对接受“模拟”条件的修饰的T细胞进行核转染。修饰的T细胞接受含有单独治疗剂(编码CARTyrin的序列)的piggyBac转座酶或含有整合的iC9序列和治疗剂(编码CARTyrin的序列)的piggyBac转座酶。

图1提供iC9安全开关的示意图，所述开关含有配体结合区、接头和截短的胱天蛋白酶9多肽。特别地，iC9多肽含有包含FK506结合蛋白12 (FKBP12)多肽(包括缬氨酸(V)取代位置36的苯丙氨酸(F) (F36V))的配体结合区。iC9多肽的FKBP12多肽由包含

的氨基酸序列编码。iC9多肽的FKBP12多肽由包含

的核酸序列编码。iC9多肽的接头区由包含

的氨基酸和包含

的核酸序列编码。编码iC9多肽的接头区的核酸序列由包含

的氨基酸编码。编码iC9多肽的接头区的核酸序列由包含

的核酸序列编码。

为了测试iC9安全开关，4种修饰的T细胞的每一种与0、0.1 nM、1 nM、10 nM、100nM或1000 nM AP1903 (AP1903的诱导剂)一起孵育24小时。使用7-氨基放线菌素D (7-AAD)、荧光嵌入剂(作为细胞经历凋亡的标记)，通过流式细胞术评价活力。

在第12天评价细胞活力(参见图2)。数据表明细胞群体从右下象限迁移到左上象限，诱导剂在含有iC9构建体的细胞中的浓度逐渐增加；然而，该效应在缺乏iC9构建体的细胞(仅接受CARTyrin的那些)中未观察到，其中细胞在这两个区域均匀地分布，而与诱导剂的浓度无关。而且，在第19天评价细胞活力(参见图3)。数据揭示如在图2 (核转染后第12天)所示的相同趋势；然而，在这个较晚的时间点(核转染后第19天)，细胞群体向左上象限的迁移更为明显。

进行聚集结果的定量，并且提供于图4中，其显示在第12天(图2和左图)或第19天(图3和右图)，iC9安全开关对细胞活力百分比的显著影响，所述细胞活力百分比作为每种修饰细胞类型的iC9开关的诱导剂(AP1903)的浓度的函数。iC9安全开关的存在到第12天在绝大多数细胞中诱导细胞凋亡，并且到第19天效果甚至更显著。

该研究的结果显示，iC9安全开关在与诱导剂(如AP1903)接触后，极有效地消除活性细胞，因为AP1903甚至在研究的最低浓度(0.1 nM)下也诱导细胞凋亡。此外，iC9安全开关可以在功能上作为三顺反子载体的一部分表达。

实施例2：通过靶向c-kit (CD117)和prominin-1 (CD133)的CAR-T细胞对造血细胞的耗竭

进行实验研究以表明人CAR-T细胞被特异性活化并耗竭携带人c-kit (CD117)或prominin-1 (CD133)(已知在HSC的表面上抗原性表达的标记)的造血细胞的能力。为了从一组CAR构建体选择领先的候选物，首先用编码针对c-kit或CD133的每种CAR候选物的mRNA电穿孔从人外周血分离的CD3/CD28刺激的泛T细胞(图5)。通过流式细胞术在转染的T细胞中测定CAR表面表达的水平(图6A)。然后通过将mRNA转染的CAR-T细胞与表达c-kit或CD133的小鼠或人细胞系(EML-C1和TF-1)以及人原代BM细胞共培养来进行体外功能测定。根据它们在表面的表达水平以及根据CD107a表达通过脱粒对CAR-T细胞的特异性活化，鉴定领先的抗c-kit和抗CD133 CAR候选物(图6B和C)。进一步，将CAR-T细胞与人骨髓共培养2天以评价CAR-T杀伤能力，随后对CD34、CD117和CD133细胞表面抗原进行流式细胞术分析，并且将细胞铺板在补充有人生长因子(MethoCult™, H4434)的甲基纤维素培养物中，用于经12天生成造血集落(CFU)。用6种抗c-kit CAR-T细胞候选物中的3种进行培养后，看到CD34+/CD117+细胞的比例降低，而对于7种抗CD133 CAR-T候选物中的3种观察到CD34+/CD133+细胞的减少(图6D)。CFU功能测定显示8种抗c-kit CAR-T细胞候选物中的7种对骨髓中的造血祖细胞的有效耗竭(图6E)。因此，这些数据支持我们的用于耗竭BM中的内源性HSC的最小毒性移植方案的新型方法，并允许用移植的同种异体或基因校正的干细胞替代它们。

将针对c-kit或CD133的相同CAR盒(图5)与DHFR基因和iC9基因一起插入三顺反子piggyBac转座子载体(图7)中，所述DHFR基因用于在用甲氨蝶呤离体治疗后选择转座的T-细胞，且所述iC9基因允许在施用例如AP1903后和在移植供体HSC前在体内清除CAR-T细胞。

经由相应的pDNA与编码超级piggyBac (SPB)转座酶的mRNA一起电穿孔，将编码针对c-kit或CD133(图5)的每种选择的CAR候选物的piggyBa转座子(图7)引入从人外周血分离的泛T细胞中。然后使用针对CD3、CD4、CD8、CD56、CD45RA、CD62L、CCR7、CD45RO、PD1、Tim3、Lag3、CD184/CXCR4、CD25、CD127和CD28的抗体，经由流式细胞术对收获的细胞进行针对细胞表面抗原的表型分析(图8)。该分析显示，根据CD45RA和CD62L共表达，大部分CD8+ T细胞具有干细胞记忆(SCM)表型(68.7-88.7%)。大多数CD8+ T细胞还表达CXCR4 (73.1-93.6%)，即已知介导细胞归巢至骨髓的趋化因子CXCL12/SDF-1的受体。

然后，通过如下进行体外功能测定以评价CAR-T杀伤能力：将上述piggyBac转座的CAR-T细胞与人骨髓(HuBM)细胞或猴(恒河猴)骨髓(MoBM)细胞共培养2天，并且将细胞铺板在补充有人生长因子(MethoCult™, H4434)的甲基纤维素培养物中，用于经12天生成造血集落(CFU)。CFU功能测定显示8种抗c-kit CAR-T细胞候选物中的3种对骨髓中的人造血祖细胞的有效耗竭(图9A)，而对于8种抗c-kit CAR-T细胞候选物观察到猴骨髓祖细胞的耗竭(图9B)。

关于针对c-kit或CD133的选择的piggyBac转座的CAR-T细胞的进一步研究在其与从G-CSF动员的外周血(mPB)细胞分离的CD34+细胞共培养后进行，并随后用AP1903处理以除去归因于piggyBac载体中的iC9的CAR-T细胞(图1)，然后经连续稀释在经辐照的MS-5骨髓基质细胞上进行培养。评估这些长期培养物(LTC)是否存在鹅卵石区域形成细胞(CAFC)，其评价随着培养时间的增加原始性的造血细胞亚群的形成。在铺板后2周和5周，使用L-Calc软件(Stem Cell Technologies)通过有限稀释分析测定具有95%置信区间(95%CI)的CAFC频率和数量。先前CD34+细胞与抗c-kit CAR-T细胞的共培养具有显著耗竭LTC中在2周时形成的CAFC数量的作用(图10A)，其中存活分数为13%(图10B)，而与抗CD133 CAR-T共培养时，CAFC的更适度耗竭至43%存活率。在后来的5周的时间点对CAFC频率的评估也显示来自抗c-kit CAR-T细胞的耗竭水平相似，存活率为14%，而该CAFC亚群显示与先前在2周时发育的CAFC相比更高的来自抗CD133 CAR-T细胞的耗竭(22%存活率)(图10 C和D)。抗CD133CAR-T对具有长期生长潜能的原始造血细胞的更具选择性清除，通过允许从原始HSC永久植入，同时保留定型的HPC，允许移植后更快速和瞬时的血液学恢复，为接受后续HSC移植的患者中的改善临床预后提供了基础(图3)。

通过引用并入

本文引用的每份文件，包括任何交叉参照的或相关的专利或申请通过引用以其整体并入本文，除非明确排除或另有限制。任何文件的引用并不承认它是关于本文公开或请求保护的任何本发明的现有技术，或它单独，或与任何其他一个或多个参考文献组合，教导、建议或公开任何这样的发明。此外，在本文件中术语的任何含义或定义与以引用方式合并的文件中同一术语的任何含义或定义达到冲突的程度时，将以本文件中指定给该术语的含义或定义为准。

其他实施方案

尽管已举例说明和描述了本发明的特定实施方案，但各种其他改变和修饰可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行。所附权利要求的范围包括所有这样的落入本发明范围内的改变和修改。

Claims

1.消除受试者中的至少一种靶细胞的方法，其包括向受试者施用有效量的包含多种免疫细胞的组合物，其中所述多种免疫细胞中的各免疫细胞表达一种或多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体，其中一种或多种CLR与靶配体的特异性结合活化免疫细胞，且其中活化的免疫细胞诱导靶细胞的死亡。

2.权利要求1的方法，其进一步包括消除多种免疫细胞的步骤。

3.移植受试者的免疫系统的方法，其包括：

(a)向受试者施用有效量的包含多种免疫细胞的组合物，其中所述多种免疫细胞中的各免疫细胞表达一种或多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体，其中一种或多种CLR与靶配体的特异性结合活化免疫细胞，且其中活化的免疫细胞诱导靶细胞的死亡；

(b)消除多种免疫细胞；和

(c)向受试者施用有效量的包含多种治疗性造血干细胞(HSC)的组合物。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述诱导靶细胞的死亡包括诱导靶细胞的细胞裂解。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述至少一种靶细胞是多种靶细胞。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞包含造血干细胞(HSC)。

7.权利要求5或6的方法，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞包含免疫细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述免疫细胞是T淋巴细胞(T细胞)。

9.权利要求8的方法，其中所述T细胞表达CD4或CD8。

10.权利要求8或9的方法，其中所述T细胞是辅助T (T_H)细胞。

11.权利要求10的方法，其中所述辅助T细胞(T_H)是I型辅助T (T_H1)细胞。

12.权利要求10的方法，其中所述辅助T细胞(T_H)是2型辅助T (T_H2)细胞。

13.权利要求10的方法，其中所述辅助T细胞(T_H)是T辅助17 (T_H17)细胞。

14.权利要求8或9的方法，其中所述T细胞是调节性T (T_REG)细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述T细胞是诱导的调节性T (iT_REG)细胞或天然调节性T(nT_REG)细胞。

16.权利要求14的方法，其中所述T细胞是诱导的调节性T (iT_REG)细胞。

17.权利要求14的方法，其中所述T细胞是天然调节性T (nT_REG)细胞。

18.权利要求8的方法，其中所述免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。

19.权利要求8-18中任一项的方法，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞进一步包含免疫细胞，且其中所述受试者处于排斥包含多种各自表达一种或多种CLR的免疫细胞的组合物的风险中。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物包含T细胞或NK细胞。

21.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物包含T细胞和NK细胞。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物是同种异体的。

23.权利要求22的方法，其中所述同种异体组合物源自健康供体。

24.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物是自体的。

25.权利要求24的方法，其中所述受试者具有疾病或病症，且其中所述自体组合物衍生自在发展疾病或病症之前、在从疾病或病症缓解的时段期间或在治疗疾病或病症之后从受试者获得的生物学样品。

26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的至少一种免疫细胞包含基因修饰，且其中所述基因修饰减少或抑制T-细胞受体或主要组织相容性复合物(MHC)的表达。

27.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的一部分免疫细胞包含基因修饰，且其中所述基因修饰减少或抑制T-细胞受体或主要组织相容性复合物(MHC)的表达。

28.权利要求27的方法，其中所述部分占多种免疫细胞中的至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比。

29.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的每种免疫细胞包含基因修饰，且其中所述基因修饰减少或抑制T-细胞受体(TCR)或主要组织相容性复合物(MHC)的表达。

30.权利要求26-29中任一项的方法，其中所述MHC由MHC I、MHC II或其组合组成或包含MHC I、MHC II或其组合。

31.权利要求26-29中任一项的方法，其中所述MHC由MHC I组成或包含MHC I。

32.权利要求26-29中任一项的方法，其中所述MHC由MHC II组成或包含MHC II。

33.权利要求26-32中任一项的方法，其中所述基因修饰是单链断裂、双链断裂、序列缺失、序列插入、序列取代或其任何组合。

34.权利要求33的方法，其中所述序列缺失、序列插入、序列取代或其组合包含编码内含子、外显子、启动子、增强子、转录阻遏物、CpG位点或其任何组合的序列。

35.权利要求26-34中任一项的方法，其中所述基因修饰包含编码β-2微球蛋白(β2M)的序列，且其中所述基因修饰减少或抑制MHC I的表达。

36.权利要求26-34中任一项的方法，其中所述基因修饰包含编码HLA-DRα、CIITA或其组合的序列，且其中所述基因修饰减少或抑制MHC II的表达。

37.权利要求26-36中任一项的方法，其中所述基因修饰包含编码α链(TCRα)、β链(TCRβ)或其组合的序列，且其中所述基因修饰减少或抑制TCR的表达。

38.权利要求26-37中任一项的方法，其中通过包含DNA结合结构域和内切核酸酶结构域的组合物引入所述基因修饰。

39.权利要求38的方法，其中所述DNA结合结构域包含指导RNA。

40.权利要求38的方法，其中所述DNA结合结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、着丝粒和启动子因子1 (Cpf1)或锌指核酸酶(ZFN)的序列。

41.权利要求40的方法，其中所述Cas9是催化失活的Cas9 (dCas9)或短且催化失活的Cas9 (dsCas9)。

42.权利要求38-41中任一项的方法，其中所述内切核酸酶结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或IIS型内切核酸酶的序列。

43.权利要求42的方法，其中所述IIS型内切核酸酶是AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I、FokI或Clo051。

44.权利要求38-43中任一项的方法，其中共价或非共价连接所述DNA结合结构域和所述内切核酸酶结构域。

45.权利要求44的方法，其中共价连接所述DNA结合结构域和所述内切核酸酶结构域作为融合蛋白。

46.权利要求38-43中任一项的方法，其中所述转座子包含含有DNA结合结构域和内切核酸酶结构域的组合物。

47.权利要求26-46中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞包含静息细胞、活化的细胞或其组合。

48.权利要求26-46中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞包含活化的细胞。

49.权利要求26-46中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞包含静息细胞。

50.权利要求26-46中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞包含静息的CAR-T细胞、活化的CAR-T细胞或其组合。

51.权利要求26-46中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞包含活化的CAR-T细胞。

52.权利要求26-46中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞包含静息的CAR-T细胞。

53.权利要求1-52中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的至少一种免疫细胞表达两种或更多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体。

54.权利要求1-52中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的一部分免疫细胞表达两种或更多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体。

55.权利要求54的方法，其中所述部分占多种免疫细胞中的至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比。

56.权利要求1-52中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的各免疫细胞表达两种或更多种嵌合配体受体(CLR)，所述嵌合配体受体各自特异性结合至少一种靶细胞上的靶配体。

57.权利要求53-56中任一项的方法，其中第一CAR特异性结合第一靶配体，其中第二CAR特异性结合第二靶配体，且其中所述第一靶配体和所述第二靶配体是不同的。

58.权利要求57的方法，其中所述第一靶配体和所述第二靶配体不是同源的。

59.权利要求1-58中任一项的方法，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC，且其中所述至少一种靶HSC上的靶配体包含c-KIT/CD117、CD45、CD34、Thy1/CD90、c-mpl/CD110、CD133、CD49f、ABCG2/CD338、碳酸酐酶IX/CA9、CD123和CD150中的一种或多种。

60.权利要求1-59中任一项的方法，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞进一步包含免疫细胞，且其中所述受试者处于排斥包含多种免疫细胞的组合物的风险中，所述免疫细胞各自表达一种或多种CLR。

61.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞包含HSC，其中所述至少一种靶细胞或多种靶细胞进一步包含免疫细胞，且其中所述受试者处于排斥包含多种治疗性HSC的组合物的风险中。

62.权利要求60或61的方法，其中所述靶免疫细胞上的靶配体包含CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、TCRα、TCRβ、TCRαβ、TCRγλ、CD52、NK1.1、CD16、CD30、CD31、CD38、CD56、CD94、NKG2A、NKG2C、NKp30、NKp44、NKp46、CD9、CD103和KIR中的一种或多种。

63.权利要求1-62中任一项的方法，其中所述一种或多种CLR各自包含

(a)包含配体识别区的胞外域，

(b)跨膜结构域，和

(c)包含至少一个共刺激结构域的胞外域.

权利要求63的方法，其中所述配体识别区包含蛋白支架、Centyrin、单链可变片段(scFv)、VHH、免疫球蛋白和抗体模拟物中的一种或多种。

64.权利要求63的方法，其中所述免疫球蛋白是抗体或其片段。

65.权利要求64的方法，其中所述抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM同种型。

66.权利要求64的方法，其中所述抗体片段是互补决定区(CDR)、重链CDR、重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、抗原结合片段(Fab)、可变结构域(Fv)、重链可变区、轻链可变区、完整重链、完整轻链、一个或多个恒定结构域、Fc(可结晶片段)或其任何组合。

67.权利要求63的方法，其中所述抗体模拟物包含affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin和avimer、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、Fynomer、Kunitz结构域肽和单体中的一种或多种。

68.权利要求1-67中任一项的方法，其中所述CLR中的至少一种是双特异性的。

69.权利要求1-67中任一项的方法，其中所述CLR中的至少一种是三特异性的。

70.权利要求63-69中任一项的方法，其中(a)的胞外域进一步包含信号肽。

71.权利要求70的方法，其中所述信号肽包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。

72.权利要求63-71中任一项的方法，其中(a)的胞外域进一步包含在配体识别区和跨膜结构域之间的铰链。

73.权利要求72的方法，其中所述铰链包含衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。

74.权利要求63-73中任一项的方法，其中所述跨膜结构域包含编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。

75.权利要求63-74中任一项的方法，其中所述胞内域包含人CD3ζ胞内域。

76.权利要求63-75中任一项的方法，其中所述至少一个共刺激结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88、人OX-40细胞内区段，或其任何组合。

77.权利要求63-76中任一项的方法，其中所述至少一个共刺激结构域包含人CD28和/或人4-1BB共刺激结构域。

78.权利要求77的方法，其中所述4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。

79.权利要求63-78中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物中的至少一种免疫细胞包含分裂CLR。

80.权利要求79的方法，其中所述分裂CLR包含具有不同细胞内结构域的两种或更多种CLR，当在至少一种免疫细胞中同时表达时，与不表达分裂CLR的免疫细胞或不表达CLR的免疫细胞相比，其增加或降低免疫细胞的活性。

81.权利要求80的方法，其中所述同时表达增加免疫细胞的活性，且其中所述分裂CLR包含：

(a)第一CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由初级细胞内信号传导结构域组成的胞内域，和

(b)第二CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由次级细胞内信号传导结构域组成的胞内域。

82.权利要求80的方法，其中所述初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域。

83.权利要求81或82的方法，其中所述次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88或人OX-40细胞内区段。

84.权利要求81或82的方法，其中所述次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB和人CD28。

85.权利要求80的方法，其中所述同时表达降低免疫细胞的活性，且其中所述分裂CLR包含：

(a)第一CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和包含初级细胞内信号传导结构域、次级细胞内信号传导结构域的胞内域，和

(b)第二CLR，其包含：包含配体识别区的胞外域、跨膜结构域和由抑制性细胞内信号传导结构域组成的胞内域。

86.权利要求85的方法，其中所述初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域，且所述次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB、人CD28、人CD40、人ICOS、人MyD88或人OX-40细胞内区段。

87.权利要求86的方法，其中所述初级细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ胞内域，且所述次级细胞内信号传导结构域包含人4-1BB和人CD28。

88.权利要求85-87中任一项的方法，其中所述抑制性细胞内信号传导结构域包含衍生自PD1、CTLA4、LAG3、B7-H1、B7-1、CD160、BTLA、PD1H、LAIR1、TIM1、TIM3、TIM4、2B4、TIGIT、ITIM、ITSM、YVKM、PP2A、SHP2、KIEELE和Y265的信号传导结构域。

89.权利要求80-88中任一项的方法，其中所述第二CAR选择性结合非靶细胞上的靶配体。

90.权利要求1-89中任一项的方法，其中一种或多种CLR以选自以下的至少一种亲和力结合配体：小于或等于10⁻⁹M、小于或等于10⁻¹⁰M、小于或等于10⁻¹¹M、小于或等于10⁻¹²M、小于或等于10⁻¹³M、小于或等于10⁻¹⁴M和小于或等于10⁻¹⁵M的K_D。

91.权利要求90的方法，其中K_D由表面等离振子共振测定。

92.权利要求1-91中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。

93.权利要求1-92中任一项的方法，其进一步包括向受试者施用动员组合物。

94.权利要求93的方法，其中所述动员组合物在包含多种各自包含一种或多种CLR的免疫细胞的组合物之前施用。

95.权利要求94的方法，其中所述动员组合物在包含多种各自包含一种或多种CLR的免疫细胞的组合物之前1天和7天之间、包括端点施用。

96.权利要求93-95中任一项的方法，其中所述动员组合物包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、普乐沙福或其组合。

97.权利要求1-96中任一项的方法，其进一步包括向受试者施用有效量的预调节组合物，以增强包含多种各自包含一种或多种CLR的免疫细胞的组合物的植入和通过包含多种各自包含一种或多种CLR的免疫细胞的组合物消除至少一种靶细胞的效率。

98.权利要求97的方法，其中所述预调节组合物抑制免疫系统。

99.权利要求97或98的方法，其中所述预调节组合物包含自身免疫疗法、抗排斥药、淋巴清除剂、清髓剂、化学治疗剂或其组合。

100.权利要求99的方法，其中所述淋巴清除剂包括环磷酰胺或氟达拉滨。

101.权利要求99的方法，其中所述清髓剂包括低剂量的放射或局部放射疗法。

102.权利要求99的方法，其中所述化学治疗剂包括白消安、曲奥舒凡、美法仑、噻替帕或其组合。

103.权利要求1-102中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的每种免疫细胞在施用于受试者之前进行预辐照。

104.权利要求103的方法，其中消除多种免疫细胞的步骤包括向受试者施用有效量的多种预辐照的免疫细胞，由此防止多种预辐照的免疫细胞的增殖或缩短多种预辐照的免疫细胞的存活。

105.权利要求1-104中任一项的方法，其中所述多种免疫细胞中的每种免疫细胞包含诱导型胱天蛋白酶多肽或编码诱导型胱天蛋白酶多肽的序列。

106.权利要求105的方法，其中所述诱导型胱天蛋白酶多肽包含

(a)配体结合区，

(b)接头，和

(c)截短的胱天蛋白酶9多肽。

107.权利要求106的方法，其中所述诱导型胱天蛋白酶多肽不包含非-人序列。

108.权利要求105-107中任一项的方法，其中消除多种免疫细胞的步骤包括向受试者施用有效量的诱导剂以诱导胱天蛋白酶多肽，由此起始免疫细胞的死亡。

109.权利要求105-108中任一项的方法，其中所述包含多种各自包含一种或多种CLR的免疫细胞的组合物进一步包含诱导剂。

110.权利要求3-109中任一项的方法，其中所述多种治疗性HSC中的每种HSC包含诱导型胱天蛋白酶多肽或编码诱导型胱天蛋白酶多肽的序列。

111.权利要求110的方法，其中所述诱导型胱天蛋白酶多肽包含

(a)配体结合区，

(b)接头，和

(c)截短的胱天蛋白酶9多肽。

112.权利要求111的方法，其中所述诱导型胱天蛋白酶多肽不包含非-人序列。

113.权利要求112的方法，其进一步包括向受试者施用包含诱导剂的组合物，由此起始多种治疗性HSC的死亡。

114.权利要求1-113中任一项的方法，其中所述受试者是人。

115.权利要求1-114中任一项的方法，其中所述受试者具有免疫系统疾病或病症或受试者处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。

116.权利要求1-114中任一项的方法，其中所述受试者具有自身免疫性疾病或病症。

117.权利要求116的方法，其中所述自身免疫性疾病或病症是急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生氏病、丙种球蛋白缺乏症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴洛病、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman病、乳糜泻、查加斯病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性脊髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、克罗恩氏病、柯根综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST疾病、基本混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic氏疾病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、埃文斯综合征、纤维化小泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球性肾炎、Goodpasture氏综合征、伴有多血管炎的肉芽肿(GPA)、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜、妊娠疱疹、低血球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木质部结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(SLE、莱姆病、慢性梅尼埃病、显微多发性血管炎、混合性结缔组织病(MCTD)、穆伦氏溃疡、Mucha-Habermann疾病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、嗜睡症、视神经脊髓炎(Devic's)、中性粒细胞减少症、眼部疤痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型自身免疫性多腺综合征、II型自身免疫性多腺综合征、III型自身免疫性多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕激素皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞发育不良、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、赖特氏综合征、复发性多软骨炎、不安腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、Schmidt综合征、巩膜炎、硬皮病、Sjogren氏综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、susac氏综合征、交感性眼炎、Takayasu氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病或白癜风。

118.权利要求1-117中任一项的方法，其中所述受试者是免疫受损的。

119.权利要求1-117中任一项的方法，其中所述受试者具有炎性病症。

120.权利要求1-119中任一项的方法，其中所述受试者具有所述疾病或病症的遗传或表观遗传标记。

121.权利要求1-114中任一项的方法，其中所述受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现。

122.权利要求121的方法，其中所述前体细胞是造血干细胞(HSC)。

123.权利要求120、121或122的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

124.权利要求123的方法，其中所述癌症是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或恶性免疫增殖性疾病。

125.权利要求124的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T-细胞淋巴瘤(AILT)、肝脾性T-细胞淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、网状内皮病、网状细胞增多症、小神经胶质瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、Waldenström氏巨球蛋白血症、结节性边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B-细胞淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿或结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤。

126.权利要求124的方法，其中所述白血病是浆细胞白血病(PCL)、急性红红血球增多症和红血球白血病、急性红斑性骨髓病、急性红系白血病、Heilmeyer-Schöner疾病、急性成巨核细胞白血病(AMKL)、肥大细胞白血病、泛髓性白血病、伴有骨髓纤维化的急性骨髓炎(APMF)、淋巴肉瘤细胞白血病、成骨期慢性骨髓性白血病、干细胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、真性红细胞增多症、急性早幼粒细胞性白血病、急性嗜碱性粒细胞白血病、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、伴有成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突细胞白血病、成人T-细胞白血病/淋巴瘤、侵袭性NK-细胞白血病、B-细胞幼淋巴细胞性白血病、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病、B-细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性髓单核细胞性白血病、慢性中性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性特发性骨髓纤维化。

127.权利要求124的方法，其中所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤、卡勒氏病、骨髓瘤病、孤立性骨髓瘤、浆细胞白血病、髓外浆细胞瘤、恶性浆细胞肿瘤或浆细胞瘤。

128.权利要求124的方法，其中所述恶性免疫增殖性疾病是α重链疾病或γ重链疾病。

129.权利要求120、121或122的方法，其中所述疾病或病症是贫血。

130.权利要求129的方法，其中所述贫血是溶血性贫血、自身免疫溶血性贫血、先天性溶血性贫血、再生障碍性贫血、β-地中海贫血、先天性类红细胞发育不全、先天性红细胞生成障碍性贫血、葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症、范可尼贫血、遗传性球形细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性热异形细胞增多症、胎儿血红蛋白的遗传性持续性、遗传性口形红细胞增多症、己糖激酶缺乏症、过度贫血、低色素性贫血、红细胞生成无效、大红细胞贫血、巨成红细胞贫血、骨髓病性贫血、神经棘红细胞增多症、舞蹈性棘红动物增多症(chorea-acanthocytosis)、阵发性夜间血红蛋白尿、丙酮酸激酶缺乏症、Rh缺乏综合征、镰状细胞病、铁粒幼细胞性贫血、造口性卵形红细胞增多症(stomatocytic ovalocytosis)、地中海贫血、磷酸丙糖异构酶(TPI)缺乏或温热的自身免疫性溶血性贫血。

131.权利要求120、121或122的方法，其中所述疾病或病症是凝血病症或出血性病况。

132.权利要求131的方法，其中所述疾病或病症是凝血病症。

133.权利要求132的方法，其中所述凝血病症是去纤维化综合征、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、因子V Leiden、血小板增多、血栓形成、复发性血栓形成、抗磷脂综合征、原发性抗磷脂综合征或血栓性血小板减少性紫癜(TTP)。

134.权利要求131的方法，其中所述疾病或病症是出血性病况。

135.权利要求134的方法，其中所述出血性病况是血小板减少症、血友病、血友病A、血友病B、血友病C、冯威勒布兰德病(vWD)、遗传性冯威勒布兰德病(vWD)、1型vWD、2型vWD、3型vWD、Glanzmann氏血小板无力症或Wiskott-Aldrich综合征(WAS)。

136.权利要求1-114中任一项的方法，其中所述受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在可以被包含多种治疗性HSC的组合物接触的次级靶细胞中显现。

137.权利要求136的方法，其中所述次级靶细胞是干细胞或祖细胞。

138.权利要求137的方法，其中所述干细胞是体干细胞。

139.权利要求138的方法，其中所述干细胞是靶HSC、间充质干细胞、表皮干细胞、上皮干细胞、神经干细胞。

140.权利要求137的方法，其中所述祖细胞是成骨细胞。

141.权利要求136的方法，其中所述次级靶细胞是分化的细胞。

142.权利要求141的方法，其中所述分化的细胞是红血细胞、白血细胞、单核细胞、粒细胞、血小板或树突细胞。

143.权利要求136、137或140的方法，其中所述包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种HSC被修饰以分泌增强成骨细胞的活性的配体、肽或蛋白。

144.权利要求143的方法，其中所述包含多种治疗性HSC的组合物治疗或预防与异常成骨细胞功能相关的疾病或病症。

145.权利要求144的方法，其中所述受试者具有与异常成骨细胞功能相关的疾病或病症的一种或多种遗传或表观遗传标记。

146.权利要求144或145的方法，其中所述与异常成骨细胞功能相关的疾病或病症是佩吉特氏病、低磷酸盐血症或骨质疏松症。

147.权利要求136、137或142的方法，其中所述包含多种治疗性HSC的组合物中的至少一种HSC被修饰以分泌增强粒细胞的活性的配体、肽或蛋白。

148.权利要求147的方法，其中所述包含多种治疗性HSC的组合物治疗或预防与异常粒细胞功能相关的疾病或病症。

149.权利要求148的方法，其中所述受试者具有与异常粒细胞功能相关的疾病或病症的一种或多种遗传或表观遗传标记。

150.权利要求148或149的方法，其中所述与异常粒细胞功能相关的疾病或病症是慢性肉芽肿性疾病。

151.权利要求1-119中任一项的方法，其中所述免疫系统疾病或病症由医学干预诱导。

152.权利要求1-119中任一项的方法，其中所述受试者由于过去、现在或将来的医学干预而处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。

153.权利要求1-119中任一项的方法，其中所述免疫系统疾病或病症由感染诱导。

154.权利要求1-119中任一项的方法，其中所述受试者由于过去、现在或潜在的感染而处于发展免疫系统疾病或病症的风险中。

155.权利要求1-154中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物的施用是全身性的。

156.权利要求155的方法，其中所述组合物经由静脉内途径施用。

157.权利要求1-154中任一项的方法，其中所述包含多种免疫细胞的组合物的施用是局部的。

158.权利要求157的方法，其中所述组合物经由骨内、脊柱内或脑内输注施用。

159.权利要求3-158中任一项的方法，其中所述包含多种治疗性HSC的组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。

160.权利要求111-159中任一项的方法，其中所述包含多种治疗性HSC的组合物进一步包含诱导剂。

161.权利要求3-160中任一项的方法，其中多种治疗性HSC中的至少一种HSC包含基因修饰。

162.权利要求3-160中任一项的方法，其中多种治疗性HSC中的一部分HSC包含基因修饰。

163.权利要求162的方法，其中所述部分占多种治疗性HSC中的至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其之间的任何百分比。

164.权利要求3-160中任一项的方法，其中多种治疗性HSC中的每种HSC包含基因修饰。

165.权利要求161-164中任一项的方法，其中所述基因修饰是单链断裂、双链断裂、序列缺失、序列插入、序列取代或其任何组合。

166.权利要求167的方法，其中所述序列缺失、序列插入、序列取代或其组合包含编码内含子、外显子、启动子、增强子、转录阻遏物、CpG位点或其任何组合的序列。

167.权利要求161-166中任一项的方法，其中通过包含DNA结合结构域和内切核酸酶结构域的组合物引入所述基因修饰。

168.权利要求167的方法，其中所述DNA结合结构域包含指导RNA。

169.权利要求167的方法，其中所述DNA结合结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、着丝粒和启动子因子1 (Cpf1)或锌指核酸酶(ZFN)的序列。

170.权利要求169的方法，其中所述Cas9是催化失活的Cas9 (dCas9)或短且催化失活的Cas9 (dsCas9)。

171.权利要求167-170中任一项的方法，其中所述内切核酸酶结构域包含分离或衍生自Cas9、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或IIS型内切核酸酶的序列。

172.权利要求171的方法，其中所述IIS型内切核酸酶是AciI、Mn1I、AlwI、BbvI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HgaI、HphI、HpyAV、Mbo1I、My1I、PleI、SfaNI、AcuI、BciVI、BfuAI、BmgBI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmI、BspMI、BsrBI、BsrBI、BsrDI、BtgZI、BtsI、EarI、EciI、MmeI、NmeAIII、BbvCI、Bpu10I、BspQI、SapI、BaeI、BsaXI、CspCI、BfiI、MboII、Acc36I、FokI或Clo051。

173.权利要求167-172中任一项的方法，其中共价或非共价连接所述DNA结合结构域和所述内切核酸酶结构域。

174.权利要求173的方法，其中共价连接所述DNA结合结构域和所述内切核酸酶结构域作为融合蛋白。

175.权利要求161-174中任一项的方法，其中通过诱导同源重组、插入单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)或转座事件来引入所述基因修饰。

176.权利要求175的方法，其中所述基因修饰导致序列的插入。

177.权利要求175或176的方法，其中所述转座事件导致功能性和/或治疗性转基因的插入。

178.权利要求175-177中任一项的方法，其中所述转座子包含功能性和/或治疗性转基因，且其中所述转座子是piggyBac转座子。

179.权利要求178的方法，其中所述包含转座子的HSC进一步包含piggyBac (PB)转座酶。

180.权利要求179的方法，其中所述piggyBac转座酶包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

181.权利要求179或180的方法，其中所述piggyBac转座酶是高活性变体，且其中所述高活性变体包含在SEQ ID NO:1的位置30、165、282和538中的一个或多个处的氨基酸取代。

182.权利要求181的方法，其中SEQ ID NO:1的位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代异亮氨酸(I)(I30V)。

183.权利要求181的方法，其中SEQ ID NO:1的位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)(G165S)。

184.权利要求181的方法，其中SEQ ID NO:1的位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)取代甲硫氨酸(M)(M282V)。

185.权利要求181的方法，其中SEQ ID NO:1的位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)(N538K)。

186.权利要求180-185中任一项的方法，其中所述转座酶是超级piggyBac (SPB)转座酶。

187.权利要求186的组合物，其中所述超级piggyBac (SPB)转座酶包含含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列。

188.权利要求161-187中任一项的方法，其中所述受试者具有免疫疾病或病症，且其中多种治疗性HSC改善免疫疾病或病症的体征或症状。

189.权利要求161-187中任一项的方法，其中所述受试者具有疾病或病症的遗传或表观遗传标记，所述疾病或病症在血细胞、血液中循环的免疫细胞、骨髓细胞或其前体细胞中显现，且其中多种治疗性HSC改善疾病或病症的体征或症状。

190.权利要求189的方法，其中所述疾病或病症是凝血病症。

191.权利要求190的方法，其中多种治疗性HSC已被修饰以分泌改善凝血病症的体征或症状的蛋白。

192.权利要求191的方法，其中多种治疗性HSC已被修饰以分泌一种或多种凝血因子。

193.权利要求161-187中任一项的方法，其中所述受试者具有糖原储存疾病或病症的遗传或表观遗传标记，且其中多种治疗性HSC改善糖原储存疾病或病症的体征或症状。

194.权利要求193的方法，其中所述糖原储存疾病或病症是0型糖原储存疾病(GSD)、I型GSD、II型GSD、III型GSD、IV型GSD、V型GSD、VI型GSD、VII型GSD、IX型GSD、X型GSD、XI型GSD、XII型GSD或XIII型GSD。

195.权利要求193或194的方法，其中多种治疗性HSC已被修饰以分泌糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸酶、酸性α-葡糖苷酶、糖原脱支酶、糖原分支酶、肌肉糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖转运蛋白GLUT2、醛缩酶A或β-烯醇酶中的一种或多种，且其中多种治疗性HSC分别改善0型GSD、I型GSD、II型GSD、III型GSD、IV型GSD、V型GSD、VI型GSD、VII型GSD、IX型GSD、X型GSD、XI型GSD、XII型GSD或XIII型GSD的体征或症状。

196.权利要求161-187中任一项的方法，其中所述受试者具有免疫系统疾病或病症的遗传或表观遗传标记，其中多种治疗性HSC中的至少一种HSC、一部分HSC或每种HSC包含基因修饰，且其中多种治疗性HSC中的至少一种HSC、一部分HSC或每种HSC不包含遗传或表观遗传标记。

197.权利要求196的方法，其中所述基因修饰除去遗传或表观遗传标记。

198.权利要求196或197的方法，其中所述修饰的HSC是自体的。

199.权利要求196或197的方法，其中所述修饰的HSC是同种异体的。

200.权利要求3-199中任一项的方法，其中所述方法治疗或预防移植物抗宿主病(GvHD)的发作或进展。

201.权利要求200的方法，其中所述治疗包括减少GvHD的体征或症状。

202.权利要求200或201的方法，其中所述GvHD是急性GvHD。

203.权利要求200或201的方法，其中所述GvHD是慢性GvHD。

204.权利要求200-203中任一项的方法，其中GvHD的体征或症状包括皮疹、皮肤起泡、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻、食欲不振、黄疸、口干、喉咽干燥、过度口干、过度喉咽干燥、口腔或咽喉的溃疡、支气管组织干燥、内皮组织干燥、表面组织干燥、皮肤斑块脱落、皮肤变色、皮肤瘢痕形成、伴随皮肤瘢痕形成的关节活动度降低、伴随皮肤损伤的脱发、导致干眼的流泪形成丧失或其任何组合。

205.权利要求200-204中任一项的方法，其中所述受试者是移植受体。

206.权利要求205的方法，其中在施用所述移植物之前将所述包含多种治疗性HSC的组合物施用于所述受试者，且其中所述多种治疗性HSC和所述移植物分离或源自同一供体。

207.权利要求206的方法，其进一步包括在施用足以耐受所述受试者的免疫系统对所述移植物的耐受的包含多种HSC的组合物之后的一段时间。

208.权利要求200-207中任一项的方法，其中所述移植物包括细胞、组织、组织移植物、器官、器官移植物或其任何组合。

209.权利要求208的方法，其中所述器官是实体器官。