JP2023026580A

JP2023026580A - 造血幹細胞の選択的除去と置換のための組成物と方法

Info

Publication number: JP2023026580A
Application number: JP2023000120A
Authority: JP
Inventors: オスタータグエリック; Ostertag Eric; シェッドロックデボン; Shedlock Devon; デイビッドダウンジュリアン; David Down Julian
Original assignee: Poseida Therapeutics Inc
Current assignee: Poseida Therapeutics Inc
Priority date: 2017-03-13
Filing date: 2023-01-04
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: JP2020510101A; IL269203B2; KR102708285B1; US20200078402A1; WO2018169948A1; CN110650743A; CN110650743B; US11744861B2; CA3056227A1; SG11201908418RA; SG10202109731YA; EP3595682A1; IL311608A; IL269203A; CN117959418A; AU2018235756B2; US20240131067A1; US20240226153A9; AU2018235756A1; IL269203B1

Abstract

【課題】急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のための組成物を提供する。【解決手段】ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現する複数のＴ細胞を含む組成物を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１７年３月１３日に提出された仮出願ＵＳＳＮ６２／４７０，８１４号、及び２０１７年１２月７日に提出されたＵＳＳＮ６２／５９６，０６２号の利益を主張し、その内容全体をそれぞれ参照により本明細書に取り込む。

配列リストの取り込み
２０１８年３月２日に作成されたサイズが２２９ＫＢの「ＰＯＴＨ－０２６＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前のテキストファイルの内容を、参照によりその全体を本明細書に取り込む。

開示の分野
本開示は、分子生物学、より具体的には、造血幹細胞（ＨＳＣ）を選択的に標的とするキメラリガンド受容体を発現する細胞、及びその作製と使用方法に関する。

内因性ＨＳＣを治療用ＨＳＣ組成物で置換（例えば、骨髄移植の状況）する前に、被験体における内因性造血幹細胞（ＨＳＣ）を選択的に除去する方法について、当該分野では長い間所望されてきたが満たされていない必要性があった。本開示は、被験体における内因性造血幹細胞（ＨＳＣ）を選択的に除去する組成物及び方法を提供する。

本開示は、複数の免疫細胞を含む組成物の有効量を被験体に投与することを含む、被験体中の少なくとも１種の標的細胞を除去する方法であって、複数の免疫細胞のそれぞれが、少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドにそれぞれ特異的に結合する１つ以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現し、標的リガンドへの１つ以上のＣＬＲの特異的結合が免疫細胞を活性化し、活性化された免疫細胞が、標的細胞の死を誘発する上記方法を提供する。特定の実施態様において、この方法は複数の免疫細胞を除去する工程をさらに含む。

本開示は、被験体の免疫系を移植する方法を提供し、本方法は、（ａ）複数の免疫細胞を含む組成物の有効量を被験体に投与することを含み、ここで、複数の免疫細胞のそれぞれは、少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドにそれぞれ特異的に結合する１つ以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現し、ここで標的リガンドへの１つ以上のＣＬＲの特異的結合は免疫細胞を活性化し、活性化された免疫細胞は、標的細胞の死を誘発すること；（ｂ）複数の免疫細胞を除去すること；及び（ｃ）複数の治療用造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む組成物の有効量を被験体に投与すること、を含む。

本明細書で使用される「治療用ＨＳＣ」という用語は、本開示の標的細胞の選択的除去後に被験体に投与される複数の又は集団のＨＳＣを記述することを意味する。治療用ＨＳＣは、除去された標的ＨＳＣに代わる健康な若しくは無病の自己若しくは同種異系ＨＳＣを含み得る。あるいは治療用ＨＳＣは、ＨＳＣ機能を改善するために、ニッチ又は微小環境を調整するために、別の細胞又は細胞型を調整するために、又は治療用ＨＳＣと同じ供給源からの細胞、組織、若しくは臓器を用いる以後の移植用に被験体の免疫系を寛容にするために、臨床的に適切な方法で標的ＨＳＣとは異なるＨＳＣが含まれてもよい。治療用ＨＳＣは、任意のヒト起源、特に限定されるものではないが、本開示の方法の被験体、双子（例えば、被験体の１つ以上の散発性突然変異を持たないヒト）、遺伝的に関連する個人、又は遺伝的に関連する個人の組み合わせ、及び互換性のあるＭＨＣＩ／ＭＨＣＩＩプロフィールを持つ個人、又は互換性のあるＭＨＣＩ／ＭＨＣＩＩプロフィールを持つ個人の組み合わせ、から単離されるか又は誘導され得る。治療用ＨＳＣは、疾患又は障害の１つ以上の遺伝子マーカー又はエピジェネティックマーカーを含まない自己又は同種異系ＨＳＣを含むことができる。特定の実施態様において、治療用ＨＳＣは遺伝子改変されていない。特定の実施態様において、治療用ＨＳＣは遺伝子改変されている。治療用ＨＳＣを遺伝子改変して、疾患又は障害の１つ以上の遺伝子マーカー又はエピジェネティックマーカーを除去することができる。あるいは又はそれに加えて、治療用ＨＳＣは遺伝子改変して、細胞表面で発現させるか、又は１つ以上のイオン、小分子、ペプチド、又はタンパク質を分泌して別の細胞又は細胞型（例えば癌細胞、幹細胞、又は前駆細胞（骨芽細胞、間葉系幹細胞、神経前駆細胞、又はグリア細胞）、又は免疫細胞）の活性に影響を与えるか、又は特定の生物学的ニッチ又は微小環境（細胞外マトリックス、損傷部位、幹細胞のニッチ）を調整して、治療用ＨＳＣの生着のためのより好ましい条件を作成することができる。さらに、例えば治療用ＨＳＣの１つ以上が被験体の免疫系と適合しないか又は悪性変換を受けている場合、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド（すなわち安全スイッチ）を含むように、治療用ＨＳＣを遺伝子改変してもよい。特定の実施態様において、治療用ＨＳＣは、治療用ＨＳＣと同じドナーに由来する細胞、組織、移植片、又は臓器の以後の移植に対して、被験体の免疫系を寛容にするために被験体に投与される。治療用ＨＳＣが被験体の免疫系を寛容にすると、免疫系は以後の移植に対して低反応性になり、以後の移植を拒否しないはずである。

本開示の方法の特定の実施態様において、標的細胞の死を誘発することは標的細胞の細胞溶解を誘発することを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞は複数の標的細胞である。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞は複数の標的細胞である。特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞は複数の標的細胞である。特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は免疫細胞を含む。特定の実施態様において、免疫細胞はＴリンパ球（Ｔ細胞）である。特定の実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４又はＣＤ８を発現する。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞は複数の標的細胞である。特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は免疫細胞を含む。特定の実施態様において、免疫細胞はＴリンパ球（Ｔ細胞）である。特定の実施態様において、Ｔ細胞はヘルパーＴ（Ｔ_H）細胞である。特定の実施態様において、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）はＩ型ヘルパーＴ（Ｔ_H１）細胞である。特定の実施態様において、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）は２型ヘルパーＴ（Ｔ_H２）細胞である。特定の実施態様において、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）はＴヘルパー１７（Ｔ_H１７）細胞である。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞は複数の標的細胞である。特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は免疫細胞を含む。特定の実施態様において、免疫細胞はＴリンパ球（Ｔ細胞）である。特定の実施態様において、Ｔ細胞は調節性Ｔ（Ｔ_REG）細胞である。特定の実施態様において、Ｔ細胞は誘導性調節性Ｔ（ｉＴ_REG）細胞又は天然型調節性Ｔ（ｎＴ_REG）細胞である。特定の実施態様において、Ｔ細胞は誘導性調節性Ｔ（ｉＴ_REG）細胞である。特定の実施態様において、Ｔ細胞は天然型調節性Ｔ（ｎＴ_REG）細胞である。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞は複数の標的細胞である。特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は免疫細胞を含む。特定の実施態様において、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞は複数の標的細胞である。特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は、ＨＳＣ及び免疫細胞を含む。少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞がＨＳＣ及び免疫細胞を含む特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞はＨＳＣ細胞及びＴ細胞又はＮＫ細胞を含む。少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞がＨＳＣ及び免疫細胞を含む特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞はＨＳＣ細胞及びＴ細胞及びＮＫ細胞を含む。少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞がＨＳＣを含む特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は免疫細胞をさらに含み、被験体は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物を拒絶するリスクがある。少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞がＨＳＣを含む特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は免疫細胞をさらに含み、被験体は、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物を拒絶するリスクがある。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物は同種異系である。特定の実施態様において、同種異系組成物は健康なドナーに由来する。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物は自己由来である。複数の免疫細胞を含む組成物が自己由来である実施態様を含む特定の実施態様において、被験体は疾患又は障害を有し、自己組成物は、疾患又は障害の発症前に、疾患又は障害の寛解期間中に、疾患又は障害の治療後に、被験体から得られた生体試料に由来する。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の免疫細胞は遺伝子改変を含み、遺伝子改変はＴ細胞受容体又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する。特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの一部の免疫細胞は遺伝子改変を含み、遺伝子改変はＴ細胞受容体又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する。特定の実施態様において、この部分は、複数の免疫細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意の割合を含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞は遺伝子改変を含み、遺伝子改変はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する。特定の実施態様において、ＭＨＣは、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、又はこれらの組み合わせからなるか、又はこれを含む。特定の実施態様において、ＭＨＣはＭＨＣＩからなるか又はこれを含む。特定の実施態様において、ＭＨＣはＭＨＣＩＩからなるか又はこれを含む。特定の実施態様において、遺伝子改変は、１本鎖切断、２本鎖切断、配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの任意の組み合わせである。特定の実施態様において、配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの組み合わせは、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、転写抑制因子、ＣｐＧ部位、又はこれらの任意の組み合わせをコードする配列を含む。特定の実施態様において、遺伝子改変は、β－２ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする配列を含み、遺伝子改変はＭＨＣＩの発現を低減又は阻害する。特定の実施態様において、遺伝子改変は、ＨＬＡ－ＤＲα、ＣＩＩＴＡ、又はこれらの組み合わせをコードする配列を含み、遺伝子改変はＭＨＣＩＩの発現を低減又は阻害する。特定の実施態様において、遺伝子改変は、α鎖（ＴＣＲα）、β鎖（ＴＣＲβ）、又はこれらの組み合わせをコードする配列を含み、遺伝子改変はＴＣＲの発現を低減又は阻害する。

複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の免疫細胞が遺伝子改変を含み、この遺伝子改変がＴ細胞受容体又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、遺伝子改変は、ＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む組成物によって導入される。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインはガイドＲＮＡを含む。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、セントロメア、及びプロモーター因子１（Ｃｐｆ１）、又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から単離又は誘導された配列を含む。特定の実施態様において、Ｃａｓ９は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、又は短く触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄｓＣａｓ９）である。

特定の実施態様において、本開示のｄＣａｓ９は、化膿性ブドウ球菌（Staphyloccocus pyogenes）から単離又は誘導されたｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活性化するｄＣａｓ９のアミノ酸配列の１０位及び８４０位に置換を有するｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、これらの置換はＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａである。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９配列の１位の「Ｘ」残基はメチオニン（Ｍ）である。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の配列を含む：
1 XDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE
61 ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG
121 NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD
181 VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN
241 LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI
301 LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA
361 GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH
421 AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE
481 VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL
541 SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI
601 IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG
661 RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL
721 HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER
781 MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVDA
841 IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL
901 TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS
961 KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK
1021 MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF
1081 ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA
1141 YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK
1201 YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE
1261 QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA
1321 PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGD (配列番号３)。

特定の実施態様において、本開示のｄＣａｓ９は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離又は誘導されたｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活性化するｄＣａｓ９のアミノ酸配列の１０位及び５８０位に置換を有するｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、これらの置換はＤ１０Ａ及びＮ５８０Ａである。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９は小さく不活性なＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である。特定の実施態様において、ｄＳａＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の配列を含む：
1 mkrnyilglA igitsvgygi idyetrdvid agvrlfkean vennegrrsk rgarrlkrrr
61 rhriqrvkkl lfdynlltdh selsginpye arvkglsqkl seeefsaall hlakrrgvhn
121 vneveedtgn elstkeqisr nskaleekyv aelqlerlkk dgevrgsinr fktsdyvkea
181 kqllkvqkay hqldqsfidt yidlletrrt yyegpgegsp fgwkdikewy emlmghctyf
241 peelrsvkya ynadlynaln dlnnlvitrd enekleyyek fqiienvfkq kkkptlkqia
301 keilvneedi kgyrvtstgk peftnlkvyh dikditarke iienaelldq iakiltiyqs
361 sediqeeltn lnseltqeei eqisnlkgyt gthnlslkai nlildelwht ndnqiaifnr
421 lklvpkkvdl sqqkeipttl vddfilspvv krsfiqsikv inaiikkygl pndiiielar
481 eknskdaqkm inemqkrnrq tnerieeiir ttgkenakyl iekiklhdmq egkclyslea
541 ipledllnnp fnyevdhiip rsvsfdnsfn nkvlvkqeeA skkgnrtpfq ylsssdskis
601 yetfkkhiln lakgkgrisk tkkeylleer dinrfsvqkd finrnlvdtr yatrglmnll
661 rsyfrvnnld vkvksinggf tsflrrkwkf kkernkgykh haedaliian adfifkewkk
721 ldkakkvmen qmfeekqaes mpeieteqey keifitphqi khikdfkdyk yshrvdkkpn
781 relindtlys trkddkgntl ivnnlnglyd kdndklkkli nkspekllmy hhdpqtyqkl
841 klimeqygde knplykyyee tgnyltkysk kdngpvikki kyygnklnah lditddypns
901 rnkvvklslk pyrfdvyldn gvykfvtvkn ldvikkenyy evnskcyeea kklkkisnqa
961 efiasfynnd likingelyr vigvnndlln rievnmidit yreylenmnd krppriikti
1021 asktqsikky stdilgnlye vkskkhpqii kkg （配列番号４）。

特定の実施態様において、エンドヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離又は誘導された配列を含む。特定の実施態様において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、又はＣｌｏ０５１である。特定の実施態様において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼはＣｌｏ０５１である。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインは、共有結合又は非共有結合している。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインは、融合タンパク質として共有結合している。

複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の免疫細胞が遺伝子改変を含み、この遺伝子改変がＴ細胞受容体又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞は、休止細胞、活性化細胞、又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞は活性化細胞を含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞は休止細胞を含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞は、休止ＣＡＲ－Ｔ細胞、活性化ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞は、活性化ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞は休止ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の免疫細胞は、それぞれが少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドに特異的に結合する２種以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現する。特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの一部の免疫細胞は、それぞれが少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドに特異的に結合する２種以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現する。特定の実施態様において、この部分は、複数の免疫細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意の割合を含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞は、それぞれが少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドに特異的に結合する２種以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現する。特定の実施態様において、例えば第１のＣＡＲは第１の標的リガンドに特異的に結合し、第２のＣＡＲは第２の標的リガンドに特異的に結合し、第１の標的リガンドと第２の標的リガンドは同一ではない。特定の実施態様において、第１の標的リガンドと第２の標的リガンドは相同的ではない。特定の実施態様において、第３以降のＣＡＲは第３以降の標的リガンドに特異的に結合する。特定の実施態様において、第１の標的リガンド、第２の標的リガンド、及び第３以降の標的リガンドは同一ではない。特定の実施態様において、第１の標的リガンド、第２の標的リガンド、及び第３以降の標的リガンドは相同的ではない。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞はＨＳＣを含み、標的ＨＳＣ上の標的リガンドは、ｃ－ＫＩＴ／ＣＤ１１７、ＣＤ４５、ＣＤ３４、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０、ｃ－ｍｐｌ／ＣＤ１１０、ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＡＢＣＧ２／ＣＤ３３８、炭酸脱水酵素ＩＸ／ＣＡ９、ＣＤ１２３、及びＣＤ１５０の１つ以上を含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、以下の malpvtalllplalllhaarpegicrnrvtnnvkdvtklvanlpkdymitlkyvpgmdvlpshcwisemvvqlsdsltdlldkfsniseglsnysiidklvnivddlvecvkensskdlkksfkspeprlftpeeffrifnrsidafkdfvvasetsdcvvsstlspekdsrvsvtkpfmlppvaasslrndssssnrkaknppgdsslhtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号５）のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpegicrnrvtnnvkdvtklvanlpkdymitlkyvpgmdvlpshcwisemvvqlsdsltdlldkfsniseglsnysiidklvnivddlvecvkensskdlkksfkspeprlftpeeffrifnrsidafkdfvvasetsdcvvsstlspekgkaknppgdsslhtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号６）のアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpmaqvqlveswggvaqpgrslrlscaasgftfssfamhwvrqapgkglewvavtsydgsneyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakamvrgvtfgdldywgqgtlvtvssggggsggggsggggsseltqdpavsvalgqtvritcqgdslrsyyaswyqqkpeqapvlviygensrpsgipdrfsgsssgntasltitgaqaedeadyycnsrdssgthlrvfgggtkltvlgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号７）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpmaqvqlveswggvaqpgrslrlscaasgftfssfamhwvrqapgkglewvavtsydgsneyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakamvrgvtfgdldywgqgtlvtvssggggsggggsggggsseltqdpavsvalgqtvrktcqgdslksyyaswyqqkpgqapvlviygensrpsgipdrfsgsssgntasltitgaqaedeadyyccsratggyhrifgggtkltvlgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号８）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、Malpvtalllplalllhaarpmaqvklqesggglvqpggslrlscaasgftfdsyamswvrqapgkglewvsyitsssstiyyvdsvkgrftisrdnaknslylqmnslrdedtavyycarlrnsegywyfdlwgrgtlvtvssggggsggggsggggsqsaltqdpavsvalgqtvritcqgdslrsyfaswyqqkpgqapllvmygqnirpsgipdrfsgsssgnsasltitgaqaedeadyycnsrdssynhwvfgggtkltvlgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号９）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpmaqvklqesggglvqpggslrlscaasgftfdsyamswvrqapgkglewvsyitsssstiyyvdsvkgrftisrdnaknslylqmnslrdedtavyycarlrnsegywyfdlwgrgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqdpavsvalgqtvritcqgdslrsyyaswyqqkpgqapllvmygenirpsgipdrfsgstsgnsasltitgaqaedeadyycnsrdssgnhlnwvfgggtkltvlgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１０）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpqvqlkqsgaelvrpgasvklsckasgytftdyyinwvkqrpgqglewiariypgsgntyynekfkgkatltaekssstaymqlssltsedsavyfcargvyyfdywgqgttltvsaggggsggggsggggsdivmtqsqkfmstsvgdrvsvtckasqnvrtnvawyqqkpgqspkaliysasyrysgvpdrftgsgsgtdftltisnvqsedladyfcqqynsyprtfgggtkleikrtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１１）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdivmtqsqkfmstsvgdrvsvtckasqnvrtnvawyqqkpgqspkaliysasyrysgvpdrftgsgsgtdftltisnvqsedladyfcqqynsyprtfgggtkleikrggggsggggsggggsqvqlkqsgaelvrpgasvklsckasgytftdyyinwvkqrpgqglewiariypgsgntyynekfkgkatltaekssstaymqlssltsedsavyfcargvyyfdywgqgttltvsatttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１２）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpqvqlkqsgaelvrpgasvklsckasgytftdyyinwvkqrpgqglewiariypgsgntyynekfkgkatltaekssstaymqlssltsedsavyfcargvyyfdywgqgttltvssggggsggggsggggsdivmtqsqkfmstsvgdrvsvtckasqnvrtnvawyqqkpgqspkaliysasyrysgvpdrftgsgsgtdftltisnvqsedladyfcqqynsyprtfgggtkleikrtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１３）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdivmtqsqkfmstsvgdrvsvtckasqnvrtnvawyqqkpgqspkaliysasyrysgvpdrftgsgsgtdftltisnvqsedladyfcqqynsyprtfgggtkleikrggggsggggsggggsqvqlkqsgaelvrpgasvklsckasgytftdyyinwvkqrpgqglewiariypgsgntyynekfkgkatltaekssstaymqlssltsedsavyfcargvyyfdywgqgttltvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１４）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnylmswvrqapgkglewvssivpsggfthyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarlqtgswrvhafdiwgqgtmvtvssggggsggggsggggsdiqmtqsptslsafvgdrvtitcqasqdignylnwyqqksgeppkllvydasflkkgvpsrfsgsgsgtqyfltiyslqpedfatyfcqhsdnlsvtfgggtkvevktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１５）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdiqmtqsptslsafvgdrvtitcqasqdignylnwyqqksgeppkllvydasflkkgvpsrfsgsgsgtqyfltiyslqpedfatyfcqhsdnlsvtfgggtkvevkggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnylmswvrqapgkglewvssivpsggfthyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarlqtgswrvhafdiwgqgtmvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１６）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnylmswvrqapgkglewvssivpsggfthyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarlqtgswrvhafdiwgqgtmvtvssggggsggggsggggsdiqmtqsptslsafvgdrvtitcqasqdignylnwyqqksgeppkllvydasflkkgvpsrfsgsgsgtqyfltiyslqpedfatyfcqhsdslsvtfgggtkvevktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１７）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdiqmtqsptslsafvgdrvtitcqasqdignylnwyqqksgeppkllvydasflkkgvpsrfsgsgsgtqyfltiyslqpedfatyfcqhsdslsvtfgggtkvevkggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnylmswvrqapgkglewvssivpsggfthyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarlqtgswrvhafdiwgqgtmvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqgls
tatkdtydalhmqalppr（配列番号１８）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ｃ－ＫＩＴに特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpgpggrarhcslpvssnhvcisrgeghhilqcqlkcklyvlvpaepgsspkpwiyrtsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqyhsypptfgagtklelkssggggsggggggssrsslevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvssakttppsvtsgqagqhhhhhhgaypydvpdyastttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１９）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvssggggsggggsggggsdivlsqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgsspkpwiyrtsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqyhsypptfgagtklelktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２０）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvssssggggsggggggssrssldivlsqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgsspkpwiyrtsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqyhsypptfgagtklelktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２１）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdivlsqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgsspkpwiyrtsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqyhsypptfgagtklelkggggsggggsggggsevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２２）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdivlsqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgsspkpwiyrtsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqyhsypptfgagtklelkssggggsggggggssrsslevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２３）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvssggggsggggsggggsdivltqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqqyhsypptfgagtkleiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２４）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvssssggggsggggggssrssldivltqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqqyhsypptfgagtkleiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２５）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdivltqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqqyhsypptfgagtkleikggggsggggsggggsevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２６）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。特定の実施態様において、標的ＨＳＣを除去する複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種は、ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＡＲを含み、任意選択的にこのＣＡＲは、malpvtalllplalllhaarpdivltqspaimsaspgekvtiscsasssvsymywyqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqqyhsypptfgagtkleikssggggsggggggssrsslevklvesgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvnqapgkglkwmgwintetgepsyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcatdygdyfdywgqgttltvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号２７）のアミノ酸配列を含み、この配列は、ＣＤ１３３に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞は免疫細胞を含み、この標的免疫細胞上の標的リガンドは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγλ、ＣＤ５２、ＮＫ１．１、ＣＤ１６、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ９、ＣＤ１０３、及びＫＩＲの１つ以上を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞はＨＳＣ及び免疫細胞を含み、この標的ＨＳＣ上の標的リガンドは、ｃ－ＫＩＴ／ＣＤ１１７、ＣＤ４５、ＣＤ３４、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０、ｃ－ｍｐｌ／ＣＤ１１０、ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＡＢＣＧ２／ＣＤ３３８、炭酸脱水酵素ＩＸ／ＣＡ９、ＣＤ１２３、及びＣＤ１５０の１つ以上を含み、この標的免疫細胞上の標的リガンドは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγλ、ＣＤ５２、ＮＫ１．１、ＣＤ１６、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ９、ＣＤ１０３、及びＫＩＲの１つ以上を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲの各々は、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、リガンド認識領域は、タンパク質足場、センチリン（Centyrin）、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ、免疫グロブリン、及び抗体模倣物の１つ以上を含む。特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭアイソタイプの抗体又はその断片である。特定の実施態様において、抗体断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む）、軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む）、抗原結合断片（Ｆａｂ）、可変ドメイン（Ｆｖ）、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、完全な重鎖、完全な軽鎖、１つ以上の定常ドメイン、Ｆｃ（結晶化可能断片）、又はこれらの任意の組み合わせである。特定の実施態様において、抗体模倣物は、アフィボディ、アフリリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、及びアビマー、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー（Fynomer）、クニッツドメインペプチド、及びモノボディの１つ以上を含む。特定の実施態様において、ＣＬＲの少なくとも１つは２重特異性である。特定の実施態様において、各ＣＬＲは２重特異性である。特定の実施態様において、ＣＬＲの少なくとも１つは３重特異性である。特定の実施態様において、各ＣＬＲは３特異性である。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲの各々は、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。を含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲの各々は、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、及び／又はＣＤ４配列に由来する配列を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲの各々は、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲの各々は、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲの各々は、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。特定の実施態様において、少なくとも１つの同時刺激ドメインは、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、ヒトＯＸ－４０細胞内セグメント、又はこれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施態様において、少なくとも１つの同時刺激ドメインは、ヒトＣＤ２８及び／又はヒト４－１ＢＢ同時刺激ドメインを含む。特定の実施態様において、４－１ＢＢ同時刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８同時刺激ドメインとの間に位置する。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の少なくとも１種の免疫細胞は、スプリットＣＬＲを含む。特定の実施態様において、スプリットＣＬＲは、少なくとも１種の免疫細胞で同時に発現される場合、スプリットＣＬＲを発現しない免疫細胞又はＣＬＲを発現しない免疫細胞と比較して、免疫細胞の活性を上昇又は減少させる別個の細胞内ドメインを有する２種以上のＣＬＲを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の少なくとも１種の免疫細胞は、スプリットＣＬＲを含む。同時発現が免疫細胞の活性を上昇させるものを含む特定の実施態様において、スプリットＣＬＲは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１次細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメインを含む第１のＣＬＲ、及び（ｂ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２次細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメインを含む第２のＣＬＲを含む。特定の実施態様において、１次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。特定の実施態様において、２次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、又はヒトＯＸ－４０細胞内セグメントを含む。特定の実施態様において、２次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＣＤ２８を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の少なくとも１種の免疫細胞は、スプリットＣＬＲを含む。同時発現が免疫細胞の活性を低下させるものを含む特定の実施態様において、スプリットＣＬＲは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１次細胞内シグナル伝達ドメイン及び２次細胞内シグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む第１のＣＬＲ、及び（ｂ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び阻害性細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメインを含む第２のＣＬＲを含む。特定の実施態様において、１次細胞内シグナル伝達ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含み、及び２次細胞内シグナル伝達ドメインはヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、又はヒトＯＸ－４０細胞内セグメントを含む。特定の実施態様において、１次細胞内シグナル伝達ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含み、２次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＣＤ２８を含む。特定の実施態様において、阻害性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、２Ｂ４、及びＴＩＧＩＴに由来するシグナル伝達ドメインを含む。これらの阻害性細胞内シグナル伝達ドメインからの追加の細胞内シグナル伝達成分及び全体的又は部分的に使用できる他の分子には、特に限定されるものではないが、ＩＴＩＭ、ＩＴＳＭ、ＹＶＫＭ、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ２、ＫＩＥＥＬＥ、及びＹ２６５が含まれる。特定の実施態様において、第２のＣＬＲは非標的細胞上の標的に選択的に結合し、それにより第２のＣＬＲが第１のＣＬＲの活性を阻害するように誘導する。特定の実施態様において、第２のＣＬＲは、第１のＣＬＲが標的細胞又は非標的細胞の死を誘発する能力を阻害する。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲは、１０^-9Ｍ以下、１０^-10Ｍ以下、１０^-11Ｍ以下、１０^-12Ｍ以下、１０^-13Ｍ以下、１０^-14Ｍ以下、１０^-15Ｍ以下のＫ_Dから選択される親和性でリガンドに結合する。特定の実施態様において、Ｋ_Dは表面プラズモン共鳴により決定される。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物は、少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体をさらに含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、この方法は、被験体に動員組成物を投与することをさらに含む。特定の実施態様において、それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む組成物及び動員組成物が連続的に投与される。特定の実施態様において、動員組成物は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む組成物が投与される前に投与される。特定の実施態様において、動員組成物は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む組成物が投与される前の期間に投与され、その期間は、例えば、骨髄から循環血液へのＨＳＣの移動を可能にして、標的ＨＳＣへの複数の免疫細胞を含む組成物のアクセスを増加させるのに十分である。特定の実施態様において、動員組成物は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む組成物が投与される前に、１～７日間（両端を含む）投与される。特定の実施態様において、動員組成物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、プレリキサフォア（plerixafor）、又はこれらの組み合わせを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、この方法は、被験体に事前調整組成物の有効量を投与して、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物の生着を促進するか、又はそれぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物による少なくとも１種の標的細胞の除去効率を促進することをさらに含む。特定の実施態様において、事前調整組成物は免疫系を抑制する。特定の実施態様において、事前調整組成物は、化学療法、放射線療法（特に限定されるものではないが、局所放射線及び全身放射線を含む）、自己免疫療法、又は抗拒絶反応薬を含む。特定の実施態様において、事前調整組成物は、放射線療法、局所放射線照射線、又は全身放射線照射を含まない。特定の実施態様において、事前調整組成物は、リンパ除去剤、骨髄除去剤、化学療法剤、又はこれらの組み合わせの１つ以上を含む。特定の実施態様において、事前調整組成物は、リンパ除去剤を含む。例示的なリンパ除去剤には、特に限定されるものではないが、シクロホスファミド及びフルダラビンが含まれる。特定の実施態様において、事前調整組成物は骨髄除去剤を含む。例示的な骨髄除去剤には、特に限定されるものではないが、低線量及び／又は局所放射線療法が含まれる。特定の実施態様において、事前調整組成物は、ブスルファン、トレオスルファン、メルファラン、及びチオテパからなる群から選択される化学療法剤を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、この方法は、被験体に事前調整組成物の有効量を投与して、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物の生着を促進するか、又はそれぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物による少なくとも１種の標的細胞の除去効率を促進することをさらに含む。特定の実施態様において、事前調整組成物は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物が被験体に投与される前に、被験体に投与される。特定の実施態様において、事前調整組成物は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物が被験体に投与される前１分、２分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分に、又はその間の任意の時間に被験体に投与される。特定の実施態様において、事前調整組成物は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物が被験体に投与される前１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２４時間に、又はその間の任意の時間に被験体に投与される。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の免疫細胞は、被験体への投与の前に事前照射される。本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの一部の免疫細胞は、被験体への投与の前に事前照射される。特定の実施態様において、この部分は、複数の免疫細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意の割合を含む。特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞は、被験体への投与の前に事前照射される。

複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の又は各免疫細胞が、被験体への投与の前に事前照射されるものを含む本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を除去する工程は、複数の事前照射した免疫細胞の有効量を被験体に投与することを含み、それにより、複数の事前照射した免疫細胞の増殖を防止及び／又は生存期間を短縮する。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞は、誘導性カスパーゼポリペプチド又は誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列を含む。特定の実施態様において、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む。特定の実施態様において、誘導性カスパーゼポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。

複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞が誘導性カスパーゼポリペプチド又は誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列を含む方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を除去する工程は、誘導剤の有効量を被験体に投与してカスパーゼポリペプチドを誘導し、それにより免疫細胞の死を開始することを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣは、誘導性カスパーゼポリペプチド又は誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列を含む。特定の実施態様において、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む。特定の実施態様において、誘導性カスパーゼポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、この方法は、誘導剤を含む組成物を被験体に投与し、それにより複数の治療用ＨＳＣの死を開始することをさらに含む。

複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞が誘導性カスパーゼポリペプチド又は誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列を含む方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む組成物は、さらに誘導剤を含む。複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞が誘導性カスパーゼポリペプチド又は誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列を含む方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物は、さらに誘導剤を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣは遺伝子改変を含む。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの一部のＨＳＣは、遺伝子改変を含む。特定の実施態様において、この部分は、複数の治療用ＨＳＣ間の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意の割合を含む。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣは遺伝子改変を含む。

複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣが遺伝子改変を含む方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、遺伝子改変は、１本鎖切断、２本鎖切断、配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの任意の組み合わせである。特定の実施態様において、配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの組み合わせは、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、転写抑制因子、ＣｐＧ部位、又はこれらの任意の組み合わせをコードする配列を含む。
複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣが遺伝子改変含む方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、遺伝子改変は、ＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む組成物によって導入される。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインはガイドＲＮＡを含む。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、セントロメア及びプロモーター因子１（Ｃｐｆ１）、又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から単離又は誘導された配列を含む。

特定の実施態様において、本開示のｄＣａｓ９は、化膿性ブドウ球菌（Staphylococcus pyogenes）から単離又は誘導されたｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活性化するｄＣａｓ９のアミノ酸配列の１０位及び８４０位に置換を有するｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、これらの置換はＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａである。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９配列の１位の「Ｘ」残基はメチオニン（Ｍ）である。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の配列を含む：
1 XDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE
61 ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG
121 NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD
181 VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN
241 LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI
301 LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA
361 GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH
421 AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE
481 VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL
541 SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI
601 IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG
661 RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL
721 HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER
781 MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVDA
841 IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL
901 TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS
961 KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK
1021 MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF
1081 ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA
1141 YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK
1201 YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE
1261 QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA
1321 PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGD （配列番号２８）。

特定の実施態様において、本開示のｄＣａｓ９は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離又は誘導されたｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活性化するｄＣａｓ９のアミノ酸配列の１０位及び５８０位に置換を有するｄＣａｓ９を含む。特定の実施態様において、これらの置換はＤ１０Ａ及びＮ５８０Ａである。特定の実施態様において、ｄＣａｓ９は小さく不活性なＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である。特定の実施態様において、ｄＳａＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の配列を含む：
1 mkrnyilglA igitsvgygi idyetrdvid agvrlfkean vennegrrsk rgarrlkrrr
61 rhriqrvkkl lfdynlltdh selsginpye arvkglsqkl seeefsaall hlakrrgvhn
121 vneveedtgn elstkeqisr nskaleekyv aelqlerlkk dgevrgsinr fktsdyvkea
181 kqllkvqkay hqldqsfidt yidlletrrt yyegpgegsp fgwkdikewy emlmghctyf
241 peelrsvkya ynadlynaln dlnnlvitrd enekleyyek fqiienvfkq kkkptlkqia
301 keilvneedi kgyrvtstgk peftnlkvyh dikditarke iienaelldq iakiltiyqs
361 sediqeeltn lnseltqeei eqisnlkgyt gthnlslkai nlildelwht ndnqiaifnr
421 lklvpkkvdl sqqkeipttl vddfilspvv krsfiqsikv inaiikkygl pndiiielar
481 eknskdaqkm inemqkrnrq tnerieeiir ttgkenakyl iekiklhdmq egkclyslea
541 ipledllnnp fnyevdhiip rsvsfdnsfn nkvlvkqeeA skkgnrtpfq ylsssdskis
601 yetfkkhiln lakgkgrisk tkkeylleer dinrfsvqkd finrnlvdtr yatrglmnll
661 rsyfrvnnld vkvksinggf tsflrrkwkf kkernkgykh haedaliian adfifkewkk
721 ldkakkvmen qmfeekqaes mpeieteqey keifitphqi khikdfkdyk yshrvdkkpn
781 relindtlys trkddkgntl ivnnlnglyd kdndklkkli nkspekllmy hhdpqtyqkl
841 klimeqygde knplykyyee tgnyltkysk kdngpvikki kyygnklnah lditddypns
901 rnkvvklslk pyrfdvyldn gvykfvtvkn ldvikkenyy evnskcyeea kklkkisnqa
961 efiasfynnd likingelyr vigvnndlln rievnmidit yreylenmnd krppriikti
1021 asktqsikky stdilgnlye vkskkhpqii kkg （配列番号２９）。

特定の実施態様において、エンドヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離又は誘導された配列を含む。特定の実施態様において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、又はＣｌｏ０５１である。特定の実施態様において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼはＣｌｏ０５１である。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインは共有結合又は非共有結合している。特定の実施態様において、ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインは、融合タンパク質として共有結合している。本開示の特定の実施態様において、ヌクレアーゼドメインは、ｄＳａＣａｓ９及びＣｌｏ０５１を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。例示的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKY（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。

例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、以下のアミノ酸配列（下線付きのＣｌｏ０５１配列（配列番号３４）、太字イタリック体のリンカー、イタリック体のｄＣａｓ９配列）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり得る：
MAPKKKRKVEGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKYGGGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSPKKKRKVSS（配列番号３０）。

複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣが遺伝子改変含む方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、遺伝子改変は、相同的組換えの誘導、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の挿入、又は転移（transposition）事象によって導入される。特定の実施態様において、遺伝子改変は配列の挿入をもたらす。特定の実施態様において、転移事象は機能的トランス遺伝子（transgene）の挿入をもたらす。特定の実施態様において、トランスポゾンは機能的トランス遺伝子を含み、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。特定の実施態様において、トランスポゾンを含むＨＳＣは、super piggyBacトランスポザーゼをさらに含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、少なくとも１種の標的ＨＳＣは遺伝子改変を含み、遺伝子改変は、相同的組換えの誘導、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の挿入、又は転移事象によって導入される。特定の実施態様において、遺伝子改変は、配列の挿入をもたらす。特定の実施態様において、転移事象は機能的及び／又は治療的トランス遺伝子の挿入をもたらす。特定の実施態様において、トランスポゾンは機能的及び／又は治療的トランス遺伝子を含み、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。特定の実施態様において、トランスポゾンを含む少なくとも１種の標的ＨＳＣは、super piggyBacトランスポサーゼをさらに含む。特定の実施態様において、少なくとも１種の標的ＨＳＣは、被験体の内因性ＨＳＣである。

本開示は、本開示のトランスポゾンを含む組成物を提供する。特定の実施態様において、この組成物は、トランスポサーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドをさらに含み得る。トランスポサーゼ酵素をコードする配列はｍＲＮＡ配列であり得る。

本開示のトランスポゾンは、piggyBacトランスポゾンを含み得る。本開示のトランスポサーゼ酵素は、piggyBacトランスポサーゼ又は適合する酵素を含み得る。トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである特定の実施態様において、及び特に、トランスポサーゼはpiggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである。特定の実施態様において、及び特に、トランスポサーゼがSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである実施態様において、トランスポサーゼをコードする配列はｍＲＮＡ配列である。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素はpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。piggyBac（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、以下：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF （配列番号１）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意の割合で同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、以下の配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号１）の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の１つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む又はこれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。

特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位のうちの２つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の３つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の以下の３０位、１６５位、２８２位、及び５３８位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の３０位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の１６５位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の２８２位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の５３８位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のリジン（Ｋ）置換である。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、Super piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、本開示のSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位のアミノ酸置換がイソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）置換であり、１６５位のアミノ酸配列を含むか又はそれからなってよく、ここで、１６５位のアミノ酸置換がグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）置換であり、２８２位のアミノ酸置換がメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換であり、５３８位のアミノ酸置換がアスパラギン（Ｎ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、Super piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、以下の配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF
（配列番号２）と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意の割合で同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなってもよい。

トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１又は配列番号２の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位、及び５９１位の１つ以上にアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む特定の実施態様において、piggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位、及び５７０位の１つ以上にアミノ酸置換をさらに含み得る。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４６位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４６位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の８２位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１０３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１１９位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１２５位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１２５位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１７７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１７７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のヒスチジン（Ｈ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８５位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８７位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２００位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２０７位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２０９位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２２６位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２３５位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のアルギニン（Ｒ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号１の２４０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４１位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４３位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２５８位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のチロシン（Ｙ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１５位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１９位のアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３２７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のアルギニン（Ｒ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３２８位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３４０位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３４０位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４２１位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）のヒスチジン（Ｈ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４３６位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４５６位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のチロシン（Ｙ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４７０位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４８５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０３位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０３位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５５２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５７０位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５９１位のアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５９１位のアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）置換である。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位の１つ以上にアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位の２、３、４、５、６、又はそれ以上にアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位にアミノ酸置換をさらに含み得る。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１０３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１９４位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３７２位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３７５位のアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換である。
特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４５０位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）置換である。定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０９位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５７０位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）をバリン（Ｖ）置換を含み得る。piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素が、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を有する特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１又は配列番号２の配列の３７２位、３７５位、及び４５０位にアミノ酸置換をさらに含み得る。特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を、配列番号１の３７２位にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換を、配列番号１の３７５位にリジン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換を含み得る、特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位のメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を、配列番号１の３７２位にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換を、配列番号１の３７５位にリジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換を、及び配列番号１の４５０位にアスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）置換を含み得る。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体はヒトである。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は免疫系疾患又は障害を有するか、又は被験体は免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は自己免疫疾患又は障害を有する。特定の実施態様において、自己免疫疾患又は障害は、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蓴麻疹、軸索及び神経性神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コガンズ症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円盤状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック症候群）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型自己免疫性多発性腺症候群、ＩＩ型自己免疫性多発性腺症候群、ＩＩＩ型自己免疫性多発性腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心嚢切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、純粋な赤血球形成不全、レイノーズ現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、脈管炎、水疱性皮膚炎、又は白斑である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は免疫無防備状態である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は炎症性障害を有する。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は免疫系疾患又は障害を有するか、又は被験体は免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある。特定の実施態様において、被験体は、免疫系疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、免疫系疾患又は障害は、医学的介入を誘発する。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、免疫系疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。特定の実施態様において、疾患又は障害は癌である。特定の実施態様において、癌は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、又は悪性免疫増殖性疾患である。特定の実施態様において、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＬＴ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、細網内皮症、網状赤血球症、細網症、ミクログリオーマ、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、又は結節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。特定の実施態様において、疾患又は障害は癌である。特定の実施態様において、癌は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、又は悪性免疫増殖性疾患である。特定の実施態様において、白血病は、形質細胞白血病（ＰＣＬ）、急性赤血病及び赤白血病、急性赤血病性骨髄症、急性赤血球性白血病、ハイルマイヤー・シェーナー病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、肥満細胞白血病、汎骨髄症、骨髄線維症を伴う汎骨髄症（ＡＰＭＦ）、リンパ肉腫細胞白血病、急性期慢性骨髄性白血病、幹細胞白血病、加速期慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、真性赤血球増加症、急性前骨髄球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、攻撃性ＮＫ細胞白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性好中球性白血病、慢性リンパ性球白血病、ヘアリーセル白血病、又は慢性特発性骨髄線維症である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。特定の実施態様において、疾患又は障害は癌である。特定の実施態様において、癌は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、又は悪性免疫増殖性疾患である。特定の実施態様において、骨髄腫は、多発性骨髄腫、カーラー病、骨髄腫症、孤立性骨髄腫、形質細胞白血病、髄外形質細胞腫、悪性形質細胞腫瘍、又は形質細胞腫である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。特定の実施態様において、疾患又は障害は癌である。特定の実施態様において、癌は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、又は悪性免疫増殖性疾患である。特定の実施態様において、悪性免疫増殖性疾患は、アルファ重鎖疾患又はガンマ重鎖疾患である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。特定の実施態様において、疾患又は障害は貧血である。特定の実施態様において、貧血は、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、先天性溶血性貧血、再生不良性貧血、β－サラセミア、先天性赤血球形成不全、先天性赤血球異形成貧血、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、ファンコニー貧血、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性熱変形赤血球症、胎児ヘモグロビンの遺伝性持続、遺伝性口唇状赤血球症、ヘキソキナーゼ欠損症、高貧血、低色素性貧血、無効赤血球生成、大球性貧血、巨赤芽球性貧血、骨髄障害性貧血、神経有棘赤血球症、舞踏病有棘赤血球症、発作性夜間血色素尿症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、Ｒｈ欠損症候群、鎌状赤血球症、鉄芽球性貧血、口細胞性楕円赤血球症、サラセミア、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）欠損症、又は温式自己免疫性溶血性貧血である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。特定の実施態様において、疾患又は障害は凝固障害又は出血状態である。特定の実施態様において、疾患又は障害は凝固障害である。特定の実施態様において、凝固障害は、脱線維素症候群、プロテインＣ欠損症、プロテインＳ欠損症、第Ｖ因子ライデン、血小板増加症、血栓症、再発性血栓症、抗リン脂質抗体症候群、原発性抗リン脂質抗体症候群、又は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。特定の実施態様において、疾患又は障害は、凝固障害又は出血状態である。特定の実施態様において、疾患又は障害は出血状態である。特定の実施態様において、出血状態は、血小板減少症、血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォンビルブラント病（ｖＷＤ）、遺伝性フォンビルブラント病（ｖＷＤ）、ｖＷＤ１型、ｖＷＤ２型、ｖＷＤ３型、グランツマン血小板無力症、又はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物により接触され得る２次標的細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、２次標的細胞は、幹細胞又は前駆細胞である。特定の実施態様において、幹細胞は体細胞性幹細胞である。特定の実施態様において、幹細胞は、標的ＨＳＣ、間葉系幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞である。特定の実施態様において、２次標的細胞は分化細胞である。特定の実施態様において、分化細胞は、赤血球、白血球、単球、顆粒球、血小板、又は樹状細胞である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物により接触され得る２次標的細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、２次標的細胞は、幹細胞又は前駆細胞である。特定の実施態様において、前駆細胞は骨芽細胞である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１種のＨＳＣは、骨芽細胞の活性を増強するリガンド、ペプチド、又はタンパク質を分泌するように改変される。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物は、異常な骨芽細胞機能に関連する疾患又は障害を治療又は予防する。特定の実施態様において、被験体は、異常な骨芽細胞機能に関連する疾患又は障害に対する１つ以上の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、異常な骨芽細胞機能に関連する疾患又は障害は、ページェット病、低ホスファターゼ症、又は大理石骨病である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物により接触され得る２次標的細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、２次標的細胞は分化細胞である。特定の実施態様において、分化細胞は、赤血球、白血球、単球、顆粒球、血小板、又は樹状細胞である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１種のＨＳＣは、顆粒球の活性を増強するリガンド、ペプチド、又はタンパク質を分泌するように改変される。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物は、異常な顆粒球機能に関連する疾患又は障害を治療又は予防する。特定の実施態様において、被験体は、異常な顆粒球機能に関連する疾患又は障害に対する１つ以上の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する。特定の実施態様において、異常な顆粒球機能に関連する疾患又は障害は慢性肉芽腫性疾患である。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は免疫系疾患又は障害を有するか、又は被験体は免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある。特定の実施態様において、免疫系疾患又は障害は、医学的介入により誘発される。特定の実施態様において、被験体は、過去、現在、又は将来の医学的介入により、免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は免疫系疾患又は障害を有するか、又は被験体は免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある。特定の実施態様において、免疫系疾患又は障害は感染症により誘発された。特定の実施態様において、被験体は、過去、現在、又は潜在的な感染により、免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある。特定の実施態様において、感染症は、ウイルス性、細菌性、及び／又は微生物性である。特定の実施態様において、感染症はウイルス性である。特定の実施態様において、感染症はウイルス性であり、被験体は感染の結果として免疫無防備状態になる。特定の実施態様において、被験体はＨＩＶに曝露されたかＨＩＶに感染した。特定の実施態様において、被験体はエイズを発症している。特定の実施態様において、感染症はウイルス性である。特定の実施態様において、感染症はウイルス性であり、被験体は癌を発症する。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の投与は全身性である。特定の実施態様において、組成物は静脈内経路を介して投与される。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の投与は局所的である。特定の実施態様において、組成物は、骨内、脊髄内、又は脳内注入を介して投与される。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の投与は全身性である。特定の実施態様において、組成物は静脈内経路を介して投与される。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の投与は局所的である。特定の実施態様において、組成物は、骨内注入を介して投与される。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物は、少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体をさらに含む。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物は誘導剤をさらに含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣは遺伝子改変されている。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣは遺伝子改変されている。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣは遺伝子改変されている。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣは遺伝子改変されている。本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は免疫疾患又は障害を有し、複数の治療用ＨＳＣは免疫疾患又は障害の徴候又は症状を改善する。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣは、被験体の免疫疾患又は障害の徴候又は症状を改善するために遺伝子改変されている。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣは、被験体の免疫疾患又は障害の徴候又は症状を改善するために遺伝子改変されている。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有し、複数の治療用ＨＳＣは、疾患又は障害の徴候又は症状を改善する。特定の実施態様において、疾患又は障害は凝固障害である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣは、凝固障害の徴候又は症状を改善するタンパク質を分泌するように改変されている。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの大部分のＨＳＣは、凝固障害の徴候又は症状を改善するタンパク質を分泌するように改変されている。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣは、凝固障害の徴候又は症状を改善するタンパク質を分泌するように改変されている。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣ、大部分のＨＳＣ、又は各ＨＳＣは、凝固障害の徴候又は症状を改善するタンパク質を分泌するように改変されている。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣ、大部分のＨＳＣ、又は各ＨＳＣは、１つ以上の凝固因子を分泌するように改変されている。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、グリコーゲン貯蔵疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有し、複数の治療用ＨＳＣは、グリコーゲン貯蔵疾患又は障害の徴候又は症状を改善する。特定の実施態様において、グリコーゲン貯蔵疾患又は障害は、グリコーゲン貯蔵疾患（ＧＳＤ）０型、ＧＳＤＩ型、ＧＳＤＩＩ型、ＧＳＤＩＩＩ型、ＧＳＤＩＶ型、ＧＳＤＶ型、ＧＳＤＶＩ型、ＧＳＤＶＩＩ型、ＧＳＤＩＸ型、ＧＳＤＸ型、ＧＳＤＸＩ型、ＧＳＤＸＩＩ型、又はＧＳＤＸＩＩＩ型である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣ、大部分のＨＳＣ、又は各ＨＳＣは、グリコーゲンシンターゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性アルファ－グルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、グリコーゲン分岐酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋肉ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ２、アルドラーゼＡ、又はβ－エノラーゼの１つ以上を分泌するように改変されており、複数の治療用ＨＳＣは、それぞれＧＳＤ０型、ＧＳＤＩ型、ＧＳＤＩＩ型、ＧＳＤＩＩＩ型、ＧＳＤＩＶ型、ＧＳＤＶ型、ＧＳＤＶＩ型、ＧＳＤＶＩＩ型、ＧＳＤＩＸ型、ＧＳＤＸ型、ＧＳＤＸＩ型、ＧＳＤＸＩＩ型、又はＧＳＤＸＩＩＩ型の１つ以上を分泌するように改変される。

本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は、免疫系疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有し、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣ、一部のＨＳＣ、又は各ＨＳＣは遺伝子改変を含み、複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣ、一部のＨＳＣ、又は各ＨＳＣは、遺伝的マーカー又はエピジェネティックマーカーを含まない。特定の実施態様において、遺伝的改変は遺伝的又はエピジェネティックマーカーを除去した。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１種のＨＳＣは自己由来である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の各ＨＳＣは自己由来である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１種の遺伝子改変ＨＳＣは自己由来である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の各遺伝子改変ＨＳＣは自己由来である。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１種のＨＳＣは同種異系である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の各ＨＳＣは同種異系である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１つの遺伝子改変ＨＳＣは同種異系である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の各遺伝子改変ＨＳＣは同種異系である。

本開示の方法の特定の実施態様において、この方法は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発症又は進行を治療又は予防する。特定の実施態様において、ＧｖＨＤの治療は、ＧｖＨＤの徴候又は症状の軽減を含む。特定の実施態様において、ＧｖＨＤは急性ＧｖＨＤである。特定の実施態様において、ＧｖＨＤは慢性ＧｖＨＤである。特定の実施態様において、ＧｖＨＤの徴候又は症状は、皮膚発疹、皮膚の水ぶくれ、吐き気、嘔吐、腹部痙攣、下痢、食欲不振、黄疸、口渇、のどの乾燥、過度の口の乾燥、過度の喉の乾燥、口又は喉の潰瘍、気管支組織の乾燥、内皮組織の乾燥、表面組織の乾燥、皮膚の斑点の消失、皮膚の変色、皮膚の瘢痕、皮膚の瘢痕と同時の関節可動性の低下、皮膚の損傷と同時の脱毛、ドライアイに至る涙の生成の喪失、又はその任意の組み合わせを含む。

移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発症又は進行を治療又は予防する方法を含む本開示の方法の特定の実施態様において、被験体は移植受容者である。特定の実施態様において、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物は、移植の実施前に被験体に投与され、複数の治療用ＨＳＣ及び移植物は、同じドナーから単離又は誘導される。特定の実施態様において、この方法は、移植物に対する被験体の免疫系の寛容化に十分な、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の投与後の期間をさらに含む。特定の実施態様において、移植物は、細胞、組織、組織移植片、臓器、臓器移植片、又はこれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施態様において、臓器は固形臓器である。

本開示の例示的な誘導性切断型カスパーゼ９ポリペプチドを示す概略図である。Ａ～Ｂは、例示的な誘導剤ＡＰ１９０３を使用した本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド（ｉＣ９安全スイッチ）のインビトロ効力の評価結果を示す一連のグラフである。本開示のカルチリン（CARTyrin）を発現する細胞は、Ａ）解凍して一晩休止させるか、又はＢ）ImmunoCult（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化試薬を用いて５日間活性化し、示された時間及び濃度でＡＰ１９０３で処理した。すべてのデータポイントは３重で採取し、採取した１，５００個のビーズ事象ごとに、治療群の生細胞の数を無治療群の生細胞の平均数で割ることにより、相対的生存活性を決定した。８０％を超える非活性化カルチリン発現細胞が、試験したすべての用量レベルで２４時間で培養物から除去された（図１）。非活性化細胞では、２４時間と４８時間の間に観察可能な差はなかった。しかし、活性化されたカルチリン発現細胞では、用量応答と経時的応答の両方が観察された。ＡＰ１９０３投与後１２時間に、１ｎＭの低濃度で細胞の６５％超が死滅した。データは、カルチリン発現細胞では、ｉＣ９安全スイッチが機能的に発現され、効果的であったことを示している。ＡＰ１９０３／ｉＣ９システムは、非活性化細胞と比較して、活性化細胞に対して使用するとより効果的であった。カルチリンの発現は、細胞の活性化により増加し、ベクターデザインを提供し、ｉＣ９の発現も増加する可能性がある。従って、活性化された細胞はより高レベルのｉＣ９を発現し、ＡＰ１９０３に対する感受性を高める。多くの実施態様において、安全スイッチを使用するなら及び使用する場合、活性化された細胞が標的となる。これらのデータは、活性化された細胞が実際にＡＰ１９０３に対してより感受性が高く、４８時間で９５％超の細胞が死滅したことを裏付けている。全身照射又はブスルファンなどの遺伝毒性物質を使用する移植前のＨＳＣの従来のアブレーションの従来の方法（上のシーケンス）と本開示の方法（下のシーケンス）を対比する概略図である。この図に示されるように、本開示の組成物及び方法は、移植時にＨＳＣの優れた生着を達成する遺伝子毒性の無い方法を生み出し、これらは機能的であり、健常レベルの血球産生を維持する。造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む非ＨＳＣの枯渇を最小化するために自己又は同種異系ＣＡＲタンデムターゲティングのための、可能な表面ＨＳＣマーカーの組み合わせを示す概略図である。ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３発現細胞に向けられたＳｃＦｖ配列を有するＣＡＲ構築物を示す概略図である。ＣＡＲ構築物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するために使用されるｍＲＮＡによりコードされる例示的なシグナル伝達ドメインに結合した例示的なＣＡＲ配列を示す。例示的なｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（１）（配列番号６９）、ｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（２）（配列番号７０）、ｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（３）（配列番号７１）、ｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（４）（配列番号７２）、ｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（５）（配列番号７３）、ｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（６）（配列番号７４）、及びｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（７）（配列番号７５）の一連の配列であり、これらは、図５Ａに示されている例示的なＣＡＲで使用することができる。例示的なｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ（８）（配列番号７６）、例示的なｃ－ｋｉｔリガンド（１）（配列番号７７）、ｃ－ｋｉｔリガンド（２）（配列番号７８）、及びマウスｃ－ｋｉｔリガンド（配列番号７９）、及び例示的なＣＤ１３３ｓｃＦｖ（１）（配列番号８０）、ＣＤ１３３ｓｃＦｖ（２）（配列番号８１）、及びＣＤ１３３ｓｃＦｖ（３）（配列番号８２）の一連の配列であり、これらは、図５Ａに示されている例示的なＣＡＲで使用することができる。例示的なＣＤ１３３ｓｃＦｖ（４）（配列番号８３）、ＣＤ１３３ｓｃＦｖ（５）（配列番号８４）、ＣＤ１３３ｓｃＦｖ（６）（配列番号８５）、ＣＤ１３３ｓｃＦｖ（７）（配列番号８６）、及びＣＤ１３３ｓｃＦｖ（８）（配列番号８７）の一連の配列であり、これらは、図５Ａに示されている例示的なＣＡＲで使用することができる。図５Ａに示される例示的なＣＡＲＣＡＲの配列も提供される（配列番号８８）。Ａ～Ｅは、ｃ－ｋｉｔ（ＣＤ１１７）又はプロミニン－１（prominin-1）（ＣＤ１３３）のいずれかを発現するヒト造血細胞を特異的に標的化するＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ効力を評価した結果を示す一連のグラフである。ヒト末梢血から単離されたＣＤ３／ＣＤ２８刺激ｐａｎＴ細胞を、ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３に対するＣＡＲ候補のそれぞれをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した（図５）。ｍＲＮＡ導入の翌日に、抗体指向性ＳｃＦｖ配列からのＣＡＲ発現を、抗マウスＩｇＧ染色及びフローサイトメトリーから決定した（図６Ａ）。標的細胞の存在下でのエフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化（エフェクター細胞と標的細胞の比は３：１）は、５時間でのＣＤ１０７ａ発現に従って脱顆粒を通して証明された。ｃ－ｋｉｔを内因性にかつ均一に発現するＴＦ－１細胞は、非ｃ－ｋｉｔ発現Ｒａｊｉ細胞と５％の割合で混合した場合、より小さい活性化でｃ－ｋｉｔに対するＣＡＲ－Ｔ細胞の最大の活性化を誘発した（図６Ｂ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は、ヒト骨髄細胞との同時培養でも同様に見られたが、ＥＭＬ－Ｃ１細胞株を発現するマウスｃ－ｋｉｔとの同時培養後は、モックＣＡＲ－Ｔ対照細胞を超える有意な活性化は観察されなかった（図６Ｂ）。抗ＣＤ１３３抗体染色及びフローサイトメトリーにより測定すると、ＣＤ１３３をコードするｍＲＮＡの電気穿孔後に、ＴＦ－１細胞はＣＤ１３３発現性になった（データは示していない）。これらのトランスフェクトされた細胞は、８つの抗ＣＤ１３３ＳｃＦｖ配列のうち４つを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を可能にした。５％の割合で非ＣＤ１３３発現Ｒａｊｉ細胞と混合したＣＤ１３３ＴＦ－１細胞について、又はヒト骨髄細胞について、より少ない抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ刺激が示された（図６Ｃ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞をヒト骨髄と２日間同時培養すると（エフェクター細胞と標的細胞の比は３：１）、細胞を抗ヒトＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＣＤ１３３抗体のいずれかで染色し、フローサイトメトリーで分析したか、又は造血コロニー（ＣＦＵ）の生成のためのヒト増殖因子（MethoCult（商標）、Ｈ４４３４）を補足したメチルセルロース培養液に、１２日間にわたって播種した。ＣＤ３４陽性集団内のフローサイトメトリー分析では、６つの抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞候補のうち３つについてｃ－ｋｉｔ陽性細胞の割合が減少し、７つの抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ候補のうち３つについてＣＤ１３３陽性細胞の割合が減少した（図６Ｄ）。ＣＦＵ生存活性アッセイは、８つの抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞候補のうち７つについて、機能的造血前駆細胞の最大８５％の枯渇を示した（図６Ｅ）。ＨＳＣを標的化するためのpiggyBac（ＰＢ）トランスポゾンベクターを示す概略図である。伸長因子１α（ＥＦ１α）は、誘導性切断型カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子からなる３シストロン性カセットを駆動するための構成的プロモーターとして使用される。ＣＡＲ領域は、抗ヒトｃ－ｋｉｔ由来の可変領域（ＶＬ及びＶＨＳｃＦｖ配列）と、ＣＤ８ａリーダーペプチド、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通（ＴＭ）ドメイン、４１ＢＢ同時刺激ドメイン、及びＣＤ３ゼータ鎖からなるシグナル伝達ドメインに結合したＣＤ１３３ＩｇＧとから構成される。ＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナルと２５０ｂｐｃＨＳ４クロマチンインスレーターが示されている。転移中、同時送達されたＰＢトランスポサーゼは、トランスポゾンベクターの両端に位置するトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、送達されたＤＮＡプラスミドの元の部位から内容物を効率的に移動し、ＴＴＡＡ染色体部位に効率的に組み込む。 piggyBac（ＰＢ）転移（transpose）された抗ＣＤ１１７又は抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す一連のプロットである。ヒト末梢血Ｔ細胞は、あらかじめsuper piggyBac（ＳＰＢ）トランスポサーゼをコードするｍＲＮＡとともにＰＢトランスポゾンｐＤＮＡで電気穿孔された（図７）。表現型分析は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ２８に対する抗体を使用して実施された。図８Ａに示される各条件下で存在するＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を示す一連のグラフである。 piggyBac（ＰＢ）転移された抗ＣＤ１１７又は抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す一連のプロットである。ヒト末梢血Ｔ細胞は、あらかじめSuper piggyBac（ＳＰＢ）トランスポサーゼをコードするｍＲＮＡとともにＰＢトランスポゾンｐＤＮＡで電気穿孔された（図７）。表現型分析は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ２８に対する抗体を使用して実施された。図８Ｃに示される各条件下で存在するＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を示す一連のグラフである。Ａ～Ｂは、piggyBac（ＰＢ）転移されたＣＡＲ－Ｔ細胞による標的化後の骨髄造血前駆細胞の生存活性（％）を示す一対のグラフである。ＣＡＲ－Ｔ細胞とヒト又はサル（アカゲザル）骨髄細胞との２日間の同時培養（エフェクター細胞と標的細胞の比は３：１）後、造血コロニー（ＣＦＵ）の生成のためのヒト増殖因子（MethoCult（商標）、Ｈ４４３４）を補足したメチルセルロース培養物中に、１２日間にわたって播種した。ＣＦＵ生存活性アッセイは、８つの抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞候補のうち３つについて、ヒト機能的造血前駆細胞の７０％超の枯渇を示した（図９Ａ）。これらの同じ抗ｃ－ｋｉｔＳｃＦｖ配列をコードするＣＡＲ－Ｔ細胞は、サルの骨髄から造血前駆細胞を枯渇させ、この種との交差反応性を示した。Ａ～Ｄは、抗ｃ－ｋｉｔ及び抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞による敷石状領域形成細胞（cobblestone area forming cells；ＣＡＦＣ）の枯渇を示す一対のグラフである。ヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞を、ｃ－ｋｉｔＳｃＦｖをコードする抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞（エフェクター細胞と標的細胞との比は３：１）（２）、又はＣＤ１３３ＳｃＦｖをコードする抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞（３）のいずれかと２４時間同時培養した（図５）。その後、９６ウェルプレート中のpiggyBacトランスポゾン（図１）中のｉＣ９と事前に確立して放射線照射した（３０Ｇｙ）ＭＳ－５骨髄間質細胞層上に播種した細胞との同時発現に起因するＣＡＲ－Ｔ細胞の除去のために、同時培養物を１０^-6Ｍヒドロコルチゾンを補足したMyeloCult培地（Stem Cell Technologies）で連続希釈して、１０ｎＭＡＰ１９０３でさらに２４時間処理した。ＣＡＦＣの形成が陽性又は陰性のウェルをＬＴＣで２週目と５週目に数え、ＣＡＦＣの頻度と数をＬ－Ｃａｌｃソフトウェア（Stem Cell Technologies）を使用した限界希釈分析により決定した。Ａ～Ｂは、例示的なＰＢベクター構築物及び製造プロセスを示す一連の図である：（Ａ）構成的プロモーターを使用して、安全スイッチ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び隣接するクロマチンインスレーターを有する選択遺伝子からなる３シストロン性カセットを駆動する；（Ｂ）アフェレーシス生成物からｐａｎＴ細胞を分離し、抗ＣＤ１１７又は抗ＣＤ１３３ＣＡＲ piggyBac（商標）トランスポゾンプラスミドＤＮＡとインビトロ転写されたpiggyBac（商標）トランスポサーゼｍＲＮＡを用いて電気穿孔する。電気穿孔された細胞は、次に活性化、拡張、選択した後に、凍結する。このプロセスでは、ＣＡＲ発現が９５％超の１×１０⁹個を超える細胞が得られる。Ａ～Ｂは、例示的なＰＢＣＡＲ－Ｔ表現型を示す一連のグラフである：ＣＤ１１７及びＣＤ１３３抗原に対するＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞を、製造プロセス後に、典型的なＴ細胞マーカーについてフローサイトメトリーにより評価した。（Ａ）ＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞の幹細胞記憶表現型を示すＣＤ４、ＣＤ８、及び記憶マーカーの発現；（Ｂ）ＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞は、一般的に骨髄ホーミングに関連するマーカーであるＣＸＣＲ４を発現する。Ａ～Ｂは、ＣＤ３４⁺ＣＤ３８^-前駆細胞集団に対する抗ＣＤ１１７又は抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞の例示的活性、及び動員末梢血ＣＤ３４⁺細胞からのＣＦＵを示す一連のグラフである：動員されたヒト末梢血から単離されたＣＤ３４⁺細胞を抗ｃ－ｋｉｔ及びＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞とともに４８時間インキュベートした後、残存細胞のＦＡＣＳ表現型解析（Ａ）及びＣＦＵ生存活性アッセイ（Ｂ）を行った。抗ＣＤ１１７ＣＡＲ－Ｔは、原始ＣＤ３４⁺ＣＤ３８^-集団から９５％超のｃｋｉｔ⁺及びＣＤ１３３⁺細胞を枯渇させ、抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔはこの集団から９０％超のＣＤ１３３⁺細胞を枯渇させた（Ａ）。抗ＣＤ１１７及び抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞はいずれも、試験したすべてのＥ：Ｔ比でコロニー形成を減少させた。長期の敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）に対する抗ＣＤ１１７又は抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞の例示的な活性を示す一対のグラフ及び対応する写真である：ＣＡＲ－Ｔ細胞を動員されたヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞と２日間同時培養後（エフェクター細胞と標的細胞の比は３：１）、細胞を、ＣＡＦＣの生成のために連続希釈でＭＳ－５間質細胞に２か月間播種した。播種の５週間後、両方のＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＡＦＣの頻度を大幅に削減し、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞が非常に原始的な細胞をうまく標的化することを示唆している。Ａ～Ｃは、ＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞の骨髄ホーミングを示す一連のグラフである：ＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＸＣＲ４発現を増加させるための因子有り（＋）又は無し（－）で培養した。各処置群の細胞を別々に標識し、混合し、４週齢の放射線照射を受けたＮＳＧマウスに静脈内注射した。（Ａ）因子を加えて２４時間培養後にＣＸＣＲ４発現が増加する；（Ｂ）投入した細胞比；（Ｃ）細胞注射の１６時間後、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、処置に関係なく、血液と骨髄で同じ比率で見つかった。

（詳細な説明）
本開示の組成物及び方法は、キメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変された免疫細胞を利用して、被験体中の標的細胞を選択的に除去する。さらに、本開示の組成物及び方法は、これらがいったん標的細胞を選択的に除去すると、これらのＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞の選択的除去を可能にする。特に興味深いのは、本開示の組成物及び方法が、選択的に破壊された被験体の本来の細胞に存在する遺伝的欠陥を修正するために、選択的に破壊された細胞集団を置き換えるために、又は被験体の本来の細胞集団を補足して、癌を含む遺伝、免疫、及び血液ベースの障害を治療するために、遺伝子改変された可能性のある治療細胞のその後の移植を可能にすることである。

本開示の組成物及び方法は、幹細胞移植のための選択的調整方策として、「薬物可逆的」ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は受容者の造血細胞に対する複数の細胞を提供する。自家又は同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植は、さまざまな悪性及び非悪性の血液疾患を治療する能力が証明されている。しかし、その調製法は、全身の放射線照射及び／又は化学療法による攻撃的かつ遺伝子毒性のある処置を定期的に必要とし、これは重症で生命にかかわる合併症をもたらすため、その広範な適用が制限される。以前の実験的研究は、複合ドナーＨＳＣの生着を成功させる上で、受容者ＨＳＣの枯渇がこれらの調整方法の必須要件であることを確立している。動物試験でも臨床試験でも、同種抗原反応性の抗ＨＳＣドナーＴ細胞が、幹細胞の生着をさらに促進することが示されているが、これにはしばしばＧｖＨＤのリスクが伴う。これにより、より小さい毒性副作用でＨＳＣを枯渇させるために、抗ｃ－ｋｉｔ抗体及び抗ＣＤ４５抗体指向治療法などの代替調整方法の検討が促進された。このように、幹細胞移植の調整のために、短命で遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を適用することにより、より正確なＨＳＣターゲティングを実現することも可能であろう。

本発明者らは、非ウイルス性piggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポゾンシステムを使用して、遺伝子改変を介する受容者ＨＳＣターゲティングのための新規かつ制御可能なＣＡＲ－Ｔアプローチを開発した。ウイルスベクター送達システムとは反対に、ＰＢの比較的大きな運搬能力は、同じ３シストロン性トランス遺伝子カセット内にコードされた少なくとも３つの別個の遺伝子の安定した導入を可能にする。これには、ＨＳＣの表面に抗原が発現されていることが知られているマーカーであるヒトｃ－ｋｉｔ（ＣＤ１１７）又はプロミニン－１（ＣＤ１３３）のいずれかを標的とする第２世代ＣＡＲが含まれる。さらに、薬剤耐性要素は、遺伝子毒性のない薬剤と組み合わせて、製造中の有効なＣＡＲ－Ｔ細胞精製方法を提供する選択遺伝子として機能する。重要なことに、受容者ＨＳＣの枯渇後でドナーＨＳＣ移植の前に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の急速なインビボクリアランスを促進するための、小分子薬物誘導性安全スイッチ遺伝子も含まれている。最後に、製造プロセスの結果として、ＣＡＲ－Ｔ細胞の大部分は、ＣＸＣＲ４などのケモカイン受容体を発現し、これが、常在性ＨＳＣの根絶のために骨髄（ＢＭ）へのより選択的な輸送を可能にする。

抗ＨＳＣＣＡＲ構築物のパネルからリード候補を選択するために、ヒト末梢血からのＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞を、まずｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３に向けられた各ＣＡＲ候補をコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。フローサイトメトリーにより、ＣＡＲ表面発現をトランスフェクトされたＴ細胞で確認した。ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＣＡＲ－Ｔ細胞をマウス又はヒト細胞株（ＥＭＬ－Ｃ１、ＴＦ－１、及びＫ５６２）と同時培養し、ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３のいずれか、ならびにマウス及びヒトの初代ＢＭ細胞を発現させることにより、インビトロ機能アッセイを実施した。リードＣＡＲ候補は、ＣＤ１０７ａの発現とＩＦＮγの分泌に従って脱顆粒によるＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的活性化から同定された。さらに、これらのＣＡＲは、ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３陽性細胞を選択的に枯渇させることもできた。興味深いことに、ｍＲＮＡでトランスフェクトした一部のＣＡＲ－Ｔ細胞は、その可溶性リガンドである幹細胞因子の存在下でも、標的ｃ－ｋｉｔ＋ＴＦ－１細胞に対するエフェクター活性を保持していた。次に、リードＣＡＲ候補は、同じ３シストロン性トランス遺伝子中の選択及び薬物誘導性安全スイッチ遺伝子と同時発現し、ＰＢを使用してＴ細胞に安定的に送達された。製造プロセスでは、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡの陽性発現によって決定される主にＴ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）表現型であり、高レベルのＣＸＣＲ４ケモカイン受容体も発現したＣＡＲ－Ｔ細胞が得られた。ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に、これらの安定に転移された細胞は、ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３発現標的細胞の特異的枯渇を含む広範なエフェクター能力を発揮することができた。

将来の研究は、標準のブスルファン又は放射線照射調整対照とともに、予め確立された異種ヒト造血キメラを有する免疫不全ＮＳＧマウスにおけるＰＢ産生されたリード抗ＨＳＣＣＡＲ－Ｔ細胞を評価するであろう。このアプローチは、ＢＭ中の内因性ＨＳＣの枯渇のための毒性が最小の移植処方への道を先導し、移植された同種異系又は遺伝子修正された幹細胞による交換を獲得することを想定した、新規標的化生物学的治療法を構成する。

ＨＳＣ移植前の代替調整療法の必要性：米国では年間５，０００人を超える患者が、ＨＳＣ移植前に骨髄破壊的調整法で治療されている。これらの調整法のほとんどは、主にＨＳＣ枯渇剤として適用されるが生命を脅かす重大な合併症により制限されている高線量の遺伝子毒性のある放射線又はブスルファンからなる。ｃ－ｋｉｔやＣＤ４５などのＨＳＣ上に発現された抗原に対するモノクローナル抗体は、代替物と見なされている。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、骨髄に常在するＨＳＣをより効果的、選択的、及びより安全に枯渇させる可能性がある。piggyBac（商標）により生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、大きな貨物積載容量を有する非ウイルスシステムであり、選択のための遺伝子を含む複数の遺伝子やドナーＨＳＣ移植前にＣＡＲ－Ｔ細胞を除去できる安全スイッチの導入を可能にする。ＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞はまた、インビボでの効力を高めるための幹細胞記憶（ＳＣＭ）表現型も示しており、骨髄への帰巣性が高い場合がある。

ＣＤ１１７又はＣＤ１３３を標的とするＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞は、ヒト及びサルの骨髄由来の造血前駆細胞、及びヒトＣＤ３４⁺細胞由来の原始ＣＡＦＣを枯渇させる。ＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞は幹細胞の記憶表現型を示し、ＣＸＣＲ４を自然に発現するが、因子を添加して２４時間培養することで発現を増加させることができる。ＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞は、注射後１６時間以内に骨髄に正常に戻る。このデータは、非遺伝子毒性が最小であるＨＳＣ移植処方としての、ＢＭ中の内因性ＨＳＣを標的とするＰＢＣＡＲ－Ｔ細胞の使用を支持している。

造血系は、自己再生という大きな特徴と、最終的には血液及び免疫系の機能細胞を生み出す多系統前駆細胞集団を生成する能力とによって定義される、原始造血幹細胞（ＨＳＣ）のまれな集団によって維持される。正常な哺乳類の造血系は、主に成人の体の骨髄内に分布しており、休止状態の幹細胞と分化系列決定前駆細胞で構成されている。次に前駆細胞は、定義された機能を持つ分化細胞、例えば赤血球、単球、顆粒球、血小板、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞などを生じさせる。ＨＳＣは自己複製によって永続化する独自の能力を備えているため、ＨＳＣの増殖の可能性は非常に大きい。幹細胞の系統と生成能力を区別する方法では、表現型と機能的特性とを使用している。有用であることがわかっている造血幹細胞（ＨＳＣ）の決定的な特徴は、移植後、特に全身放射線照射後に、ＨＳＣが受容者の造血系に再増殖される能力である。従って、癌、免疫障害、移植拒絶などのＨＳＣが関与する疾患の治療において、宿主ＨＳＣを効果的に枯渇又は不活性化することが重要である。しかし、これは、特にＨＳＣの頻度が非常に低いために困難であることが証明されている（競合的再増殖実験で１０万個の骨髄細胞あたりわずかに１～２と推定され、これらの細胞の標的化及び根絶がより困難になる）。現在の治療法は、典型的には、ＨＳＣだけでなく造血系の多くの細胞を除去する高用量の細胞毒性薬の使用を含む。これらの治療法には明らかな欠点と重度の毒性副作用がある。従って、（例えば、完全又は混合造血細胞キメラを確立するためのドナーＨＳＣの移植前に）ＨＳＣを枯渇させるための改善された治療法が有益であろう。

通常、高用量化学療法又は放射線によって患者の内因性幹細胞が枯渇した場合に、骨髄及び造血幹細胞移植は、臨床的に患者に血球を生成する能力を提供する手段として広く使用されている。骨髄及び末梢血は現在、自己及び同種幹細胞の供給源として使用されている。将来、胚性幹細胞や誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するものを含む培養幹細胞は、移植用のＨＳＣの代替物になる可能性がある。

移植片不全又は移植片機能不全は、骨髄抑制薬の投与、移植片対宿主病、及び移植後初期の感染症によって引き起こされる可能性がある。不十分な生着はまた、患者の基礎疾患又は以前の治療に関連した微小環境又は骨髄間質機能不全から生じることもある。

受容者がドナー移植片を受け取るように適切に調整されている場合、１つ又は複数のリガンドとの相互作用の結果としてのＭＨＣマーカー又はリガンドのパターンなどの特定のリガンドに対するリンパ系細胞の応答に関して、無反応の活性状態が見られる。特定の寛容性が達成される。完全な同種ドナーの骨髄移植を受ける宿主は、免疫抑制なしで同じドナーからの腎同種移植を受け入れる。しかし、広範な骨髄破壊的調整を利用して現在実践されている完全な同種骨髄移植は、特定の年齢範囲及び病歴の患者への適用可能性が制限されている。高線量の全身放射線照射を含む骨髄破壊的調整法は、免疫学的拒絶反応を防ぐように設計された治療法（シクロホスファミドなど）と組み合わせてＨＳＣ移植でよく使用される。そのような調整は、受容者中の移植された同種ドナーＨＳＣの生着を確保するために使用される。ただし、これらの治療法は、毒性（腸炎、肺炎、腎毒性、高脂血症、骨髄抑制など）や、悪化したＧＶＨＤの合併症や免疫不全（感染や悪性腫瘍など）など、受容者に対して望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。これらの副作用は、サイトカイン誘発性の副作用に一部起因すると考えられており、受容者の臓器系に損傷を与える可能性がある。従って、より毒性の低い移植前及び移植後の調整法が非常に望ましい。本開示は、既存の治療選択肢に起因するいかなる負の副作用も誘発しない、ＨＳＣの選択的除去及び置換のための組成物及び方法を提供する。

特定のＣＡＲ－Ｔエフェクター細胞を養子移入することにより内因性幹細胞が選択的に除去され、それによりドナー幹細胞の生着のニッチを開く、ＨＳＣの生着のための組成物及び方法が提供される。選択的アブレーション（selective ablation）は、組織内の細胞の一般的なアブレーションなしに、標的組織内の内因性幹細胞を実質的に除去する。前処理なしで得られた生着と比較して、選択的アブレーションによって生着の効率は著しく向上する。そのような選択的アブレーションは、非選択的アブレーションを含む方法と比較して、生着期間中の標的組織の機能の改善を可能にする。従って、本開示の方法は、既存の非選択的アブレーション法（例えば、放射線又は化学療法）を使用せずに、効果的なＨＳＣ生着を提供する。放射線及び化学療法は、標的組織の機能に関与する分化細胞（例えば末梢血細胞数を維持する前駆細胞集団上の）を除去し、他の組織（例えば消化管上皮、肺、肝臓、腎臓の細胞）に望ましくない副作用を誘発し、続発性悪性腫瘍のリスクを高める。

本開示の方法の特定の実施態様において、ドナー幹細胞の移植の前に、患者に、内因性ＨＳＣを特異的に枯渇させることができるＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することにより、選択的アブレーションが達成される。アブレーションに続いて、患者からＨＳＣ除去ＣＡＲ－Ｔ細胞を実質的に除去するのに十分な時間の後、ドナー幹細胞の有効量が患者に導入される。

本開示の組成物及び方法は、以下の非限定例的使用［（ａ）悪性疾患及び非悪性疾患、特に血液の疾患の治療；（ｂ）細胞移植、組織移植、及び／又は固形臓器移植の免疫学的受容の促進；（ｃ）移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の予防又は軽減；（ｄ）ドナー白血球注入（ＤＬＩ）を管理するためのプラットフォームの提供；（ｅ）酵素欠損症の治療；（ｆ）自己免疫疾患の治療；（ｇ）ＨＳＣ誘導体に影響を及ぼす先天性疾患、における使用］のための混合造血細胞キメラ形成を確立するための確立された非選択的アブレーション法（例えば、放射線及び化学療法）と比較した場合、非毒性又は比較的低毒性の調整法を提供する。

幹細胞微小環境
幹細胞とその微小環境との相互作用は、維持、増殖、及び分化のための重要な手がかりを提供する。幹細胞が存在するこの物理的環境は、幹細胞微小環境又はニッチと呼ばれる場合がある。このニッチに関与する間質細胞及びその他の細胞は、可溶性因子及び結合因子を提供し、これらの因子はＨＳＣ制御に多くの効果をもたらす。

幹細胞とニッチとの間の相互作用のための様々なモデルが提案されてきた。最も単純な形式では、幹細胞が分裂するときに、ニッチに残っているのは１つの娘細胞だけで、他の娘細胞はニッチを離れて分化するモデルが、提案されている。

本開示の組成物及び方法の具体的な利点は、ＣＬＲ／ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、その近接領域又は特定の微小環境内のみで活性化する能力である。この物理的選択性は、所定の治療の標的ではない細胞、ニッチ、及び微小環境に対する本開示の組成物の影響を最小限に抑える。

さらに、微小環境は１つ以上の標的細胞のセクレトーム（secretome）によって定義され得るため、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞は、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞が分泌タンパク質に接触するか又は所定の濃度で分泌タンパク質に接触すると、ＣＬＲ／ＣＡＲのみが活性化されるように改変することができる。さらに、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞は、本開示のアポトーシス誘導剤又は非標的細胞の内因性セクレトームの成分と接触したときに、ＣＬＲ／ＣＡＲが不活性化又は除去されるように改変することができる。

本開示の微小環境は、１つ以上の標的細胞の表面上のタンパク質の発現により定義され得る。従って、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞は、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞が標的細胞上の１つ以上の細胞表面結合タンパク質に接触すると、ＣＬＲ／ＣＡＲのみが活性化されるように改変することができる。さらに、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞は、ＣＬＲ／ＣＡＲが本開示のアポトーシス誘導剤又は非標的細胞の細胞表面結合タンパク質と接触したときに、ＣＬＲ／ＣＡＲが不活性化又は除去されるように改変することができる。

例えば、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞は、標的癌細胞上の１つ以上のリガンドに特異的に結合するが、活性化される標的癌細胞微小環境に存在する１つ以上の分泌タンパク質（例えば、１つ以上のサイトカイン、血管新生を誘導する１つ以上の因子、細胞外マトリックスを分解する１つ以上の因子）の結合も必要とし得るＣＬＲ／ＣＡＲを発現するように改変され得る。デジタルの世界と同様に、この２要素認証システムは、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞が標的細胞のみを除去し、非標的細胞又は非標的環境に悪影響を与えないことを保証する。上記のように、必要なシグナルの１つ以上が標的細胞及び標的微小環境に一致しない場合、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞は、非標的細胞のリスク除去よりもアポトーシスを誘導するように変更できる。デジタル世界よりも優れている本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ発現免疫細胞は、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の異なるリガンド（細胞表面に結合したリガンド、分泌されたリガンド、又はこれらの組み合わせを含み得る）からの多要素認証を必要とするように変更できる。本明細書で使用されるリガンドという用語は、本開示のＣＡＲが特異的に結合する任意の配列、核酸、又はアミノ酸を説明するために使用することができる。

キメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）
「キメラリガンド受容体（ＣＬＲ）」及び「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、本開示を通して同義で使用される。本開示のキメラ受容体は、本開示の標的抗原及び／又は標的リガンドに特異的に結合し得る。

本開示の例示的なＣＬＲ／ＣＡＲは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、リガンド認識領域は、タンパク質足場、センチリン、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ、免疫グロブリン、及び抗体模倣物の１つ以上を含む。特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭアイソタイプの抗体又はその断片である。特定の実施態様において、抗体断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む）、軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む）、抗原結合断片（Ｆａｂ）、可変ドメイン（Ｆｖ）、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、完全な重鎖、完全な軽鎖、１つ以上の定常ドメイン、Ｆｃ（結晶化可能断片）、又はこれらの任意の組み合わせである。特定の実施態様において、抗体模倣物は、アフィボディ、アフリリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、及びアビマー、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー、クニッツドメインペプチド、及びモノボディの１つ以上を含む。特定の実施態様において、ＣＬＲの少なくとも１つは２重特異性である。特定の実施態様において、各ＣＬＲは２重特異性である。特定の実施態様において、ＣＬＲの少なくとも１つは３重特異的である。特定の実施態様において、各ＣＬＲは３特異的である。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲのそれぞれは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲのそれぞれは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、及び／又はＣＤ４配列に由来する配列を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲのそれぞれは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲのそれぞれは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲのそれぞれは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、（ａ）の外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む。特定の実施態様において、内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。特定の実施態様において、少なくとも１つの同時刺激ドメインは、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、ヒトＯＸ－４０細胞内セグメント、又はこれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施態様において、少なくとも１つの同時刺激ドメインは、ヒトＣＤ２８及び／又はヒト４－１ＢＢ同時刺激ドメインを含む。特定の実施態様において、４－１ＢＢ同時刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８同時刺激ドメインとの間に位置する。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の少なくとも１種の免疫細胞は、スプリットＣＬＲ／ＣＡＲを含む。特定の実施態様において、スプリットＣＬＲ／ＣＡＲは、少なくとも１種の免疫細胞中で同時に発現される場合、スプリットＣＬＲ／ＣＡＲを発現しない免疫細胞又はＣＬＲ／ＣＡＲを発現しない免疫細胞と比較して、免疫細胞の活性を上昇又は低下させる別個の細胞内ドメインを有する２つ以上のＣＬＲ／ＣＡＲを含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の少なくとも１種の免疫細胞は、スプリットＣＬＲ／ＣＡＲを含む。同時発現が免疫細胞の活性を上昇させるものを含む特定の実施態様において、スプリットＣＬＲ／ＣＡＲは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１次細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメインを含む第１のＣＬＲ／ＣＡＲ、（ｂ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２次細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメインを含む第２のＣＬＲ／ＣＡＲを含む。特定の実施態様において、１次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。特定の実施態様において、２次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、又はヒトＯＸ－４０細胞内セグメントを含む。特定の実施態様において、２次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＣＤ２８を含む。

本開示の方法の特定の実施態様において、複数の免疫細胞を含む組成物の少なくとも１種の免疫細胞は、スプリットＣＬＲ／ＣＡＲを含む。同時発現が免疫細胞の活性を低下させるものを含む特定の実施態様において、スプリットＣＬＲ／ＣＡＲは、（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１次細胞内シグナル伝達ドメイン２次細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメインを含む第１のＣＬＲ／ＣＡＲ、（ｂ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び阻害性細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメインを含む第２のＣＬＲ／ＣＡＲを含む。特定の実施態様において、１次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含み、２次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、又はヒトＯＸ－４０細胞内セグメントを含む。特定の実施態様において、１次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含み、２次細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＣＤ２８を含む。特定の実施態様において、阻害性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、２Ｂ４、及びＴＩＧＩＴに由来するシグナル伝達ドメインを含む。これらの阻害性細胞内シグナル伝達ドメイン由来の追加の細胞内シグナル伝達成分、及び全体的又は部分的に使用できる他の分子には、特に限定されるものではないが、ＩＴＩＭ、ＩＴＳＭ、ＹＶＫＭ、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ２、ＫＩＥＥＬＥ、及びＹ２６５が含まれる。特定の実施態様において、第２のＣＬＲ／ＣＡＲは、非標的細胞上の標的に選択的に結合し、それにより、第２のＣＬＲ／ＣＡＲを誘導して、第１のＣＬＲ／ＣＡＲの活性を阻害する。特定の実施態様において、第２のＣＬＲ／ＣＡＲは、第１のＣＬＲ／ＣＡＲが標的細胞又は非標的細胞中の死滅を誘発する能力を阻害する。

本開示の方法の特定の実施態様において、１つ以上のＣＬＲ／ＣＡＲは、１０^-9Ｍ以下、１０^-10Ｍ以下、１０^-11Ｍ以下、１０^-12Ｍ以下、１０^-13Ｍ以下、１０^-14Ｍ以下、１０^-15Ｍ以下のＫ_Dから選択される親和性でリガンドに結合する。特定の実施態様において、Ｋ_Dは表面プラズモン共鳴により決定される。

足場タンパク質
本開示のタンパク質足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質、コード化又は相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、組み合わせ、配合物、デバイス、及びこれらを作製及び使用する方法に由来し得る。好適な実施態様において、タンパク質足場は、ヒトのテナシン－Ｃ（以下「テナシン」）由来の複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から構成される。さらに好適な実施態様において、本発明のタンパク質足場は、１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列である。本開示のタンパク質足場は、例えば細胞標的タンパク質などの様々な分子に結合するように設計することができる。好適な実施態様において、本開示のタンパク質足場は、リガンドの野生型及び／又は変異型のエピトープに結合するように設計することができる。

本開示のタンパク質足場は、追加の分子又は部分、例えば、抗体のＦｃ領域、アルブミン結合ドメイン、又は半減期に影響する他の部分を含み得る。さらなる実施態様において、本開示のタンパク質足場は、タンパク質足場をコードし得る核酸分子に結合され得る。

本開示は、少なくとも１つのタンパク質足場が検出可能及び／又は回収可能な量で発現される条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞において複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいて少なくとも１つのタンパク質足場を発現するための、少なくとも１つの方法を提供する。

本開示は、（ａ）複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列及び／又は本明細書に記載のコード核酸に基づくタンパク質足場、及び（ｂ）適切な及び／又は医薬的に許容し得る担体又は希釈剤を含む、少なくとも１つの組成物を提供する。

本開示は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質、好ましくは複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列、より好ましくはヒトテナシン由来の複数のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列、に基づくタンパク質足場のライブラリーを生成する方法を提供する。ライブラリーは、足場の一部、例えばループ領域の特定の位置にある分子内のアミノ酸又はアミノ酸の数を変更して、足場の連続した世代を作ることにより形成される。ライブラリーは、単一ループのアミノ酸組成を変更するか、複数のループを同時に変更するか、足場分子の追加の位置を変更することで生成することができる。変更されたループは、それに応じて延長又は短縮することができる。そのようなライブラリーは、各位置にすべての可能なアミノ酸、又はアミノ酸の設計されたサブセットを含むように生成することができる。ライブラリーメンバーは、インビトロ又はＣＩＳディスプレイ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソームディスプレイなど）、酵母、細菌、及びファージディスプレイなどのディスプレイによるスクリーニングに使用することができる。

本開示のタンパク質足場は、還元条件下での安定性及び高濃度での溶解性などの増強された生物物理学的特性を提供する。これらは、大腸菌などの原核生物系、酵母などの真核生物系、及びウサギ網状赤血球溶解物系などのインビトロ転写／翻訳系で発現及び折り畳みをすることができる。

本開示は、本発明の足場ライブラリーを標的でパニングし、結合剤を検出することにより、特定の標的に結合する足場分子を生成する方法を提供する。他の関連する態様において、本開示は、例えば特定の親和性で標的タンパク質に結合することができる、所望の活性を有するタンパク質足場を生成又は親和性成熟させるために使用できるスクリーニング方法を含む。親和性成熟は、ファージディスプレイ又はインビトロディスプレイなどのシステムを使用して、突然変異誘発及び選択の反復ラウンドによって達成することができる。このプロセス中の突然変異誘発は、特定の足場残基への部位特異的突然変異誘発、エラーが発生しやすいＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリング、及び／又はこれらの技術の組み合わせの結果であり得る。

本開示は、特に限定されるものではないが、哺乳動物由来の足場を含むフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質のコンセンサス配列に基づく、単離された、組換え及び／又は合成タンパク質足場、ならびにコンセンサスＦＮ３配列に基づくタンパク質足場をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物及びコードする核酸分子を提供する。本開示はさらに、特に限定されるものではないが、診断及び治療用組成物、方法、及びデバイスを含む、そのような核酸及びタンパク質足場を作成及び使用する方法を含む。

本開示のタンパク質足場は、従来の治療法に勝る利点、例えば局所的、経口的に投与する能力、又は血液脳関門を通過する能力、複数の標的又は同じ標的の複数のエピトープに結合する２重特異性又はタンデム分子に作成され得る哺乳動物細胞発現能力に対して、大腸菌で発現して資源の関数としてタンパク質の発現の増加を可能にする能力、薬物、ポリマー、及びプローブに結合する能力、高濃度で配合される能力、及びそのような分子が疾患組織や腫瘍に効果的に浸透する能力、を提供する。

さらにタンパク質足場は、抗体の可変領域を模倣する折り畳みに関して、抗体の多くの特性を有する。この配向は、ＦＮ３ループが抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と同様に露出されることを可能にする。これらは、細胞標的に結合することができなければならず、ループは、特定の結合又は関連する特性を改善するために、改変、例えば親和性成熟させることができる。

本開示のタンパク質足場の６つのループのうちの３つは、トポロジー的に抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ１～３）、すなわちリガンド結合領域に対応し、残りの３つのループは抗体のＣＤＲと同様の方法で表面に露出している。これらのループは、配列番号１の残基１３～１６、２２～２８、３８～４３、５１～５４、６０～６４、及び７５～８１に又はその付近に及ぶ。好ましくは、残基２２～２８、５１～５４、及び７５～８１又はその付近のループ領域は、結合特異性と親和性が変更されている。これらのループ領域の１つ以上は、主鎖部分として、これらの配列を維持する他のループ領域及び／又は他の鎖でランダム化されてライブラリに定着し、特定のタンパク質標的に対して高い親和性を有するライブラリから強力なバインダーを選択することができる。１つ以上のループ領域は、タンパク質との抗体のＣＤＲ相互作用と同様に、標的タンパク質と相互作用できる。

本開示の足場は、抗体模倣物を含んでもよい。

「抗体模倣物」という用語は、標的配列に特異的に結合し、天然に存在する抗体とは異なる構造を有する有機化合物を記述することを意図している。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、又は小分子を含んでもよい。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、リガンドであり得る。抗体模倣物は、抗体より優れた特性、特に限定されるものではないが、優れた溶解性、組織浸透性、熱及び酵素に対する安定性（例えば、酵素分解に対する耐性）、及びより低い生産コストを提供する。例示的な抗体模倣物には、特に限定されるものではないが、アフィボディ、アフリリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、及びアビマー（アビディティーマルチマーとしても知られる）、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、フィノマー、クニッツドメインペプチド、及びモノボディが含まれる。

本開示のアフィボディ（Affibody）分子は、ジスルフィド架橋のない１つ以上のアルファらせんを含むか又はそれからなるタンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファらせんを含むか又はそれからなる。例えば、本開示のアフィボディ分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含み得る。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含み得る。

本開示のアフィリン（Affilin）分子は、例えばガンマ－Ｂクリスタリン又はユビキチンのいずれかの露出したアミノ酸の改変により生成されるタンパク質足場を含む。アフィリン分子は、機能的にリガンドに対する抗体の親和性を模倣するが、構造的に抗体を模倣することはない。アフィリンの作成に使用される任意のタンパク質足場において、溶媒にアクセスできるかアミノ酸又は適切に折りたたまれたタンパク質分子中の可能な結合パートナーにアクセスできるかアミノ酸は、露出したアミノ酸と見なされる。これらの露出したアミノ酸のいずれか１つ以上を改変して、標的リガンド配列又はリガンドに特異的に結合することができる。

本開示のアフィマー（Affimer）分子は、特定の標的配列に対する高親和性結合部位を提供するペプチドループを表示するように設計された高度に安定なタンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質又はその３次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、逆平行ベータシートの上にあるアルファらせんを含む共通の３次構造を共有し得る。

本開示のアフィチン（Affitin）分子は、人工的タンパク質足場を含み、その構造は例えばＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来し得る。本開示のアフィチンは、リガンドの全体又は一部であり得る標的配列に選択的に結合することができる。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合タンパク質の結合表面上の１つ以上のアミノ酸配列をランダム化し、得られたタンパク質をリボソームディスプレイ及び選択に供することにより製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えばゲノム内、又はペプチド、タンパク質、ウイルス、又は細菌の表面上に見られ得る。本開示の特定の実施態様において、アフィチン分子は、酵素の特異的阻害剤として使用され得る。本開示のアフィチン分子は、耐熱性タンパク質又はその誘導体を含み得る。

本開示のアルファボディ（Alphabody）分子は、細胞浸透性アルファボディ（ＣＰＡＢ）とも呼ばれ得る。本開示のアルファボディ分子は、様々な標的配列（リガンドを含む）に結合する小さなタンパク質（典型的には１０ｋＤａ未満）を含む。アルファボディ分子は、細胞内標的配列に到達して結合することができる。本開示のアルファボディ分子は、構造的に１本鎖アルファらせんを形成する人工配列を含む（天然に存在するコイルドコイル構造に類似）。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように改変された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質足場を含んでもよい。分子の結合特異性に関係なく、本開示のアルファボディ分子は正しい折りたたみと熱安定性を維持する。

本開示のアンチカリン（Anticalin）分子は、タンパク質又は小分子のいずれかの標的配列又は標的部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリンに由来する人工タンパク質を含み得る。本開示のアンチカリン分子は、例えばモノクローナル抗体又はその断片の代わりに使用され得る。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体又はその断片よりも優れた組織透過性と熱安定性を示す場合がある。本開示の例示的なアンチカリン分子は、約１８０のアミノ酸を含み、約２０ｋＤａの質量を有し得る。本開示のアンチカリン分子は、構造的に、ループ及び付着したアルファらせんによって対で接続された逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。好適な実施態様において、本開示のアンチカリン分子は、ループ及び結合したアルファらせんによって対で接続された８つの逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。

本開示のアビマー（Avimer）分子は、標的配列（リガンドでもあり得る）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内又は別個の標的内の複数の結合部位を認識してもよい。本開示のアビマーが複数の標的を認識する場合、アビマーは２重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、それぞれ約３０～３５アミノ酸の２つ以上のペプチド配列を含んでもよい。これらのペプチドは、１つ以上のリンカーペプチドを介して接続できる。アビマーのペプチドの１つ以上のアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメインに由来してもよい。アビマーは、任意選択的にジスルフィド結合及び／又はカルシウムを含んでもよい剛性構造を持っている。本開示のアビマーは、抗体と比較してより大きな熱安定性を示し得る。

本開示のＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質（Designed Ankyrin Repeat Proteins））は、標的配列に対して高い特異性及び高い親和性を有する遺伝子操作された、組換え、又はキメラタンパク質を含む。特定の実施態様において、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質に由来し、任意選択的にアンキリンタンパク質の少なくとも３つの反復モチーフ（反復構造単位とも呼ばれる）を含む。アンキリンタンパク質は、高親和性タンパク質－タンパク質相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きな標的相互作用表面を含む。

本開示のフィノマー（Fynomer）は、ヒトＦｙｎＳＨ３ドメインに由来し、抗体と同等の親和性及び同等の特異性で標的配列及び分子に結合するように工学作成された小さな結合タンパク質（約７ｋＤａ）を含む。

本開示のクニッツ（Kunitz）ドメインペプチドは、クニッツドメインを含むタンパク質足場を含む。クニッツドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。本開示のクニッツドメインは、構造的にジスルフィドが豊富なアルファ＋ベータ折り畳みを含む。この構造は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤によって例示される。クニッツドメインペプチドは、特定のタンパク質構造を認識し、競合的なプロテアーゼ阻害剤として機能する。本開示のクニッツドメインは、エカランチド（Ecallantide）（ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）に由来する）を含み得る。

本開示のモノボディは、１本鎖抗体に匹敵するサイズの小さなタンパク質（約９４個のアミノ酸を含み、約１０ｋＤａの質量を有する）である。これらの遺伝子組み換えタンパク質は、リガンドを含む標的配列に特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つ以上の別個のタンパク質又は標的配列を特異的に標的とし得る。好適な実施態様において、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣するタンパク質足場を含み、より好ましくは、フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣する。フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインとそのモノボディ模倣物は、バレルを形成する７つのベータシートと、抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応して各側に３つの露出したループを含む。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディには金属イオンと中央のジスルフィド結合の結合部位がない。ループＢＣ及びＦＧを改変することにより、多重特異性モノボディを最適化できる。本開示のモノボディはアドネクチン（adnectin）を含んでもよい。

このような方法は、少なくとも１つの足場タンパク質を含む組成物又は医薬組成物の有効量のを、症状、効果、又はメカニズムのそのような調節、治療、緩和、予防、又は低下を必要とする細胞、組織、臓器、動物、又は患者に投与することを含むことができる。有効量は、本明細書に記載又は関連技術分野で既知の方法を使用して行われ測定された場合、一回（例えばボーラス）、複数回、又は連続投与あたり約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇの量を含むことができ、又は一回、複数回、又は連続投与あたり０．０１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその中の任意の有効範囲若しくは値を達成することができる。

足場タンパク質の産生と生成
本開示の少なくとも１つの足場タンパク質は、当該分野で公知のように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって任意選択的に産生することができる。例えば、Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001) を参照されたい。

足場タンパク質からのアミノ酸は、免疫原性を低下させるか、結合、親和性、オンレート、オフレート、結合力、特異性、半減期、安定性、溶解性、又は当該分野で知られている他の適切な特性を低減、増強、又は改変するために、変更、追加、及び／又は欠失することができる。

任意選択的に足場タンパク質は、リガンド及び他の好ましい生物学的特性に対する高い親和性を保持するように設計することができる。この目的を達成するために、足場タンパク質は、親配列及び工学作成配列の３次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的工学作成生成物の分析プロセスによって、任意選択的に調製することができる。３次元モデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補配列の推定３次元立体構造を示し、表示し、免疫原性の可能性を測定できるコンピュータープログラムが利用できる（例えば、Monrovia, Calif.のXencor、Inc.のImmunofilterプログラム）。これらの表示の検査により、候補配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわちリガンドを結合する候補足場タンパク質の能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、親配列及び参照配列から残基を選択及び組み合わせて、標的リガンドに対する親和性などの所望の特性を達成することができる。上記の操作の代わりに、又はそれに加えて、工学作成の他の適切な方法を使用することができる。

足場タンパク質のスクリーニング
類似したタンパク質又は断片への特異的結合のためのタンパク質足場のスクリーニングは、ヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ表示）又はペプチド表示ライブラリー、例えばインビトロ表示を使用して便利に達成することができる。この方法では、目的の機能又は構造を持つ個々のメンバーについて、ペプチドの大規模なコレクションをスクリーニングする。表示されるヌクレオチド又はペプチド配列は、長さが３～５０００以上のヌクレオチド又はアミノ酸、しばしば５～１００アミノ酸長で、しばしば約８～２５アミノ酸長であり得る。ペプチドライブラリーを生成するための直接的な化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法が記載されている。１つのタイプは、バクテリオファージ又は細胞の表面にペプチド配列を表示することである。各バクテリオファージ又は細胞には、特定の表示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が含まれている。そのような方法は、ＰＣＴ特許公開第９１／１７２７１号、第９１／１８９８０号、第９１／１９８１８号、及び第９３／０８２７８号に記載されている。

ペプチドのライブラリーを生成するための他のシステムは、インビトロ化学合成及び組換え法の両方の態様を有する。ＰＣＴ特許公開第９２／０５２５８号、第９２／１４８４３号、及び第９６／１９２５６号を参照されたい。また米国特許第５，６５８，７５４号；及び５，６４３，７６８号も参照されたい。ペプチド表示ライブラリー、ベクター、及びスクリーニングキットは、Invitrogen (Carlsbad, Calif.) 及び Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK) などの業者から市販されている。例えば、Enzonの米国特許第４，７０４，６９２号、第４，９３９，６６６号、第４，９４６，７７８号、第５，２６０，２０３号、第５，４５５，０３０号、第５，５１８，８８９号、第５，５３４，６２１号、第５，６５６，７３０号、第５，７６３，７３３号、第５，７６７，２６０号、第５，８５６，４５６号；Dyaxの第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１，６９８号、第５，８３７，５００号；Affymaxの第５，４２７，９０８号、第５，５８０，７１７号；Cambridge Antibody Technologiesの第５，８８５，７９３号；Genentechの第５，７５０，３７３号；Xoma、Colligan（前掲）の第５，６１８，９２０号、第５，５９５，８９８号、第５，５７６，１９５号、第５，６９８，４３５号、第５，６９３，４９３号、第５，６９８，４１７号；前述のAusubel；又は前述のSambrookを参照されたい。

本開示のタンパク質足場は、広範囲の親和性（ＫＤ）でヒト又は他の哺乳類タンパク質に結合することができる。好適な実施態様において、本発明の少なくとも１つのタンパク質足場は、当業者により実施されるように表面プラズモン共鳴又はキネクサ（Kinexa）法により決定すると、高親和性、例えば約１０^-7Ｍ以下、例えば、特に限定されるものではないが、０．１～９．９（又はその中の任意の範囲又は値）×１０^-8、１０^-9、１０^-10、１０^-11、１０^-12、１０^-13、１０^-14、１０^-15、又はその中の任意の範囲又は値のＫ_Dで、標的リガンドに任意選択的に結合することができる。

リガンドに対するタンパク質足場の親和性又は結合力は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる（例えば、Berzofsky, et al., “Antibody-Ligand Interactions,” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)；及び本明細書に記載の方法を参照されたい）。特定のタンパク質足場－リガンド相互作用の測定される親和性は、異なる条件下（塩濃度、ｐＨなど）で測定された場合、異なる場合がある。従って、親和性及び他のリガンド結合パラメーター（例えば、Ｋ_D、Ｋ_on、Ｋ_off）の測定は、タンパク質足場及びリガンドの標準化された溶液、及び本明細書に記載の緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行うことが好ましい。

本発明のタンパク質足場を用いて競合アッセイを実施して、どのタンパク質、抗体、及び他のアンタゴニストが、標的タンパク質への結合について本発明のタンパク質足場と競合し、及び／又はエピトープ領域を共有するかを決定することができる。当業者に容易に理解されるこれらのアッセイは、タンパク質上の限られた数の結合部位に対するアンタゴニスト又はリガンド間の競合を評価する。タンパク質及び／又は抗体は、競合の前又は後に固定化又は不溶化され、標的タンパク質に結合した試料は、例えばデカンテーション（タンパク質／抗体が事前に不溶化された場合）又は遠心分離（タンパク質／抗体が競合反応後に沈殿した場合）によって、非結合試料から分離される。また競合的結合は、標的タンパク質へのタンパク質足場の結合又は結合の欠如によって機能が変化するかどうかによって、例えば、タンパク質足場分子が、例えば標識物の酵素活性を阻害又は増強するかどうかによって決定され得る。当該分野で公知のように、ＥＬＩＳＡ及び他の機能アッセイを使用してもよい。

センチリン（Centyrin）とカルチリン（CARTyrin）
本開示は、以下を含むキメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）を提供する：（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、ここで、リガンド認識領域は少なくとも１つのセンチリンを含む；（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメイン。本開示を通して使用されるように、センチリンを含むＣＬＲ／ＣＡＲはカルチリンと呼ばれる。特定の実施態様において、リガンド認識領域は、２重特異性又はタンデムＣＬＲ／ＣＡＲを生成するために２つのセンチリンを含んでもよい。特定の実施態様において、リガンド認識領域は、３重特異性ＣＬＲ／ＣＡＲを生成するために３つのセンチリンを含んでもよい。特定の実施態様において、外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含んでもよい。あるいは又はさらに、特定の実施態様において、外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含んでもよい。

本開示は、以下を含むキメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）を提供する：（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、ここで、リガンド認識領域は少なくとも１つのタンパク質足場又は抗体模倣物を含む；（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）少なくとも１つの同時刺激ドメインを含む内部ドメイン。特定の実施態様において、リガンド認識領域は、２重特異性又はタンデムＣＬＲ／ＣＡＲを生成するために２つの足場タンパク質又は抗体模倣物を含んでもよい。特定の実施態様において、リガンド認識領域は、３重特異性ＣＬＲ／ＣＡＲを生成するために３つのタンパク質足場又は抗体模倣物を含んでもよい。特定の実施態様において、外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含んでもよい。あるいは又はさらに、特定の実施態様において、外部ドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含んでもよい。

本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、シグナルペプチドはヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号３１）を含むアミノ酸配列を含んでもよい。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号３１）を含むアミノ酸配列、又はMALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号３１）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドは、atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca（配列番号３２）を含む核酸配列によりコードされ得る。

本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、膜貫通ドメインはヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号３３）を含むアミノ酸配列、又はIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号３３）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＣＤ８α膜貫通ドメインは、attcatatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc（配列番号３５）を含む核酸配列によりコードされ得る。

本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含み得る。

本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、少なくとも１つの同時刺激ドメインは、ヒト４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ－４０細胞内セグメント、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、少なくとも１つの同時刺激ドメインは、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢ同時刺激ドメインを含み得る。ＣＤ２８同時刺激ドメインは、RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （配列番号３６）を含むアミノ酸配列を、又はRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号３６）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＣＤ２８同時刺激ドメインは、cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg （配列番号３７）を含む核酸配列によりコードされ得る。４－１ＢＢ同時刺激ドメインは、KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号３８）を含むアミノ酸配列を、又はKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号３８）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。４－１ＢＢ同時刺激ドメインは、aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg（配列番号３９）を含む核酸配列によりコードされ得る。４－１ＢＢ同時刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８同時刺激ドメインとの間に位置する場合がある。

本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、ヒンジはヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、及び／又はＣＤ４配列に由来する配列を含み得る。本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの特定の実施態様において、ヒンジはヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含み得る。ヒンジは、TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号４０）を含むヒトＣＤ８αアミノ酸配列を、又はTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号４０）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ヒトＣＤ８αヒンジアミノ酸配列は、actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac（配列番号４１）を含む核酸配列によりコードされ得る。

本開示のセンチリンは、タンパク質足場を含むことができ、ここで、足場はリガンドに特異的に結合することができる。本開示のセンチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むタンパク質足場を含むことができ、足場はリガンドに特異的に結合することができる。少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインは、ヒトタンパク質に由来してもよい。ヒトタンパク質はテナシン－Ｃであってもよい。コンセンサス配列は、LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT （配列番号４２）、又はMLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号４３）を含み得る。コンセンサス配列は、atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca（配列番号４４）を含む核酸配列によりコードされ得る。コンセンサス配列は、（ａ）コンセンサス配列の１３～１６位でアミノ酸残基ＴＥＤＳ（配列番号６３）を含むか又はそれからなるＡ－Ｂループ；（ｂ）コンセンサス配列の２２～２８位でアミノ酸残基ＴＰＤＡＡＦ（配列番号６４）を含むか又はそれからなるＢ－Ｃループ；（ｃ）コンセンサス配列の３８～４３位でアミノ酸残基ＳＥＫＶＧＥ（配列番号６５）を含むか又はそれからなるＣ－Ｄループ；（ｄ）コンセンサス配列の５１～５４位でアミノ酸残基ＧＳＥＲ（配列番号６６）を含むか又はそれからなるＤ－Ｅループ；（ｅ）コンセンサス配列の６０～６４位でアミノ酸残基ＧＬＫＰＧ（配列番号６７）を含むか又はそれからなるＥ－Ｆループ；（ｆ）コンセンサス配列の７５～８１位でアミノ酸残基ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号６８）を含むか又はそれからなるＦ－Ｇループ；又は（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の組み合わせ、内の１つ以上の位置で改変され得る。本開示のセンチリンは、少なくとも５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、少なくとも１０個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は少なくとも１５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含み得る。足場は、１０^-9Ｍ以下、１０^-10Ｍ以下、１０^-11Ｍ以下、１０^-12Ｍ以下、１０^-13Ｍ以下、１０^-14Ｍ以下、１０^-15Ｍ以下のＫ_Dから選択される少なくとも１つの親和性でリガンドに結合してもよい。Ｋ_Dは、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。

本開示は、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲと少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を提供する。

本開示は、本開示のＣＬＲ／ＣＡＲを含むトランスポゾンを提供する。

本開示のトランスポゾンは、トランスポゾンを発現する細胞の同定、濃縮、及び／又は単離のための選択遺伝子を含み得る。例示的な選択遺伝子は、細胞の生存活性と生存に不可欠な任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、選択遺伝子によりコードされる遺伝子産物の非存在下で、細胞が感受性である（又は細胞に致命的であり得る）薬物刺激に対する耐性を付与するために不可欠な、任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子は、選択遺伝子の非存在下で、細胞の生存活性及び／又は生存に不可欠な１つ以上の栄養物質を欠く細胞培地での生存活性及び／又は生存に不可欠な任意の遺伝子産物（例えば、転写物、タンパク質、及び酵素）をコードする。例示的な選択遺伝子には、特に限定されるものではないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を与える）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素をコードし、メトトレキサートに対する耐性を与える）、ＴＹＭＳ（チミジル酸合成酵素をコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）－メチルグアニン－ＤＮＡメチル転移酵素をコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、及びＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）が挙げられる。

本開示のトランスポゾンは、エピソーム的に維持されるか、又は組換え／改変細胞のゲノムに組み込まれる。トランスポゾンは、非ウイルス性遺伝子導入を増強するためにトランスポゾンとトランスポサーゼを利用する２成分piggyBacシステムの一部であり得る。この方法の特定の実施態様において、トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーター要素が隣接するキメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。特定の実施態様において、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。特定の実施態様、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様において、トランスポサーゼはpiggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーター要素が隣接するリガンド受容体／抗原受容体をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。特定の実施態様において、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。特定の実施態様において、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様において、トランスポサーゼはpiggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである。特定の実施態様において、特にトランスポサーゼがSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである実施態様において、トランスポサーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素である。piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF （配列番号１）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の割合で同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF （配列番号１）の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の１つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。

特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の２つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の３つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の３０位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の１６５位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の２８２位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の５３８位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のリジン（Ｋ）置換である。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、Super piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、本開示のSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の存在のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなってよく、ここで３０位のアミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）置換であり、１６５位のアミノ酸置換はグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）置換であり、２８２位のアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換であり、５３８位のアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、Super piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF （配列番号２）と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意の割合で同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり得る。

トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１又は配列番号２の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位、及び５９１位の１つ以上にアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記変異を含む実施態様を含む特定の実施態様において、piggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位、及び５７０位の１つ以上にアミノ酸置換をさらに含み得る。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４６位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４６位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の８２位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１０３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１１９位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１２５位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１２５位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１７７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１７７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のヒスチジン（Ｈ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８５位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８７位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２００位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２０７位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２０９位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２２６位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２３５位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のアルギニン（Ｒ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４１位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４３位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２５８位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のチロシン（Ｙ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１５位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１９位のアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３２７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のアルギニン（Ｒ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３２８位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３４０位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３４０位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４２１位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）のヒスチジン（Ｈ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４３６位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４５６位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のチロシン（Ｙ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４７０位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４８５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０３位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０３位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５５２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５７０位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５９１位のアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５９１位のアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）置換である。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位の１つ以上にアミノ酸置換を含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位の２、３、４、５、６、又はそれ以上にアミノ酸置換を含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記突然変異を含む実施態様を含む特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位にアミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１０３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１９４位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３７２位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３７５位のアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４５０位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０９位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）への置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５７０位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位のメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を含み得る。piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素が、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を含む特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１又は配列番号２の配列の３７２位、３７５位、及び４５０位にアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を、配列番号１の３７２位にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換を、及び配列番号１の３７５位にリジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換を含み得る。特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を、配列番号１の３７２位にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換を、配列番号１の３７５位にリジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換を、及び配列番号１の４５０位にアスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）置換を含み得る。

誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、既存の誘導性ポリペプチドよりも免疫原性がはるかに低いため優れている。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは組換えポリペプチドであり、従って天然に存在しないが、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを産生するように組換えられる配列は、宿主ヒト免疫系が「非自己」として認識できる非ヒト配列を含まず、従って本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞、又は誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む組成物、又は誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞を受け取る被験体において、免疫応答を誘導する。

本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）アポトーシス促進性ポリペプチドを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むことができ、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、非ヒト配列は制限部位を含む。特定の実施態様において、リガンド結合領域は多量体リガンド結合領域であってもよい。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」とも呼ぶことができる。特定の実施態様において、本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチドを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチドを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、リガンド結合領域はＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含み得る。特定の実施態様において、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の３６位に改変を含み得る。改変は、３６位のフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換（Ｆ３６Ｖ）であってもよい。特定の実施態様において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号４５）を含むアミノ酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号４６）を含む核酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、リガンド結合領域に特異的な誘導剤は、３６位のフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含み、ＡＰ２０１８７及び／又はＡＰ１９０３（両方とも合成薬である）を含む。

本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、リンカー領域は、GGGGS（配列番号４７）を含むアミノ酸、又はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号４８）を含む核酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含まない。

本開示の切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされる。あるいは又はさらに、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされる。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号４９）を含むアミノ酸によりコードされるか、又はTTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC （配列番号５０）を含む核酸配列によりコードされる。

ポリペプチドが切断型カスパーゼ－９ポリペプチドを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの特定の実施態様において、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号５１）を含むアミノ酸配列によりコードされるか、又はGGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC （配列番号５２）を含む核酸配列によりコードされる。

トランスポゾン及びトランスポサーゼ
本開示のトランスポゾンは、例えば本開示のタンパク質足場、センチリン、又はカルチリンの１つ以上と本開示の選択遺伝子との間に位置する少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み得る。本開示のトランスポゾンは、例えば、本開示のタンパク質足場、センチリン、又はカルチリンの１つ以上と本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの間に位置する少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み得る。本開示のトランスポゾンは、少なくとも２つの自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流又はすぐ上流に位置し、及び第２の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの下流又はすぐ上流に位置する。

少なくとも１つの自己切断ペプチドは、例えばＴ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列を、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５４）を含むアミノ酸配列を、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP （配列番号５４）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号５５）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列を、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列を、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列を、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列を、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列を、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列を、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。

本開示のトランスポゾンは、第１及び第２の自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドは、例えば本開示のタンパク質足場、センチリン、又はカルチリンの１つ以上の上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、例えば本開示のタンパク質足場、センチリン、又はカルチリンの１つ以上の下流に位置する。第１及び／又は第２の自己切断ペプチドは、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列を、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５４）を含むアミノ酸配列を、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５４）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号５５）を含むアミノ酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列を、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列を、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列を、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列を、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列を、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列を、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。

本開示は、本開示のトランスポゾンを含む組成物を提供する。特定の実施態様において、組成物は、トランスポサーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドをさらに含み得る。トランスポサーゼ酵素をコードする配列はｍＲＮＡ配列であり得る。

本開示のトランスポゾンは、piggyBacトランスポゾンを含み得る。本開示のトランスポサーゼ酵素は、piggyBacトランスポサーゼ又は適合する酵素を含み得る。本方法の特定の実施態様において、トランスポゾンは、２つのシス調節性インスレーター要素が隣接するキメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体をコードする配列を有するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。特定の実施態様において、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。本開示のトランスポサーゼ酵素は、piggyBacトランスポサーゼ又は適合する酵素を含み得る。特定の実施態様、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様において、トランスポサーゼはpiggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである。特定の実施態様、及び特にトランスポサーゼがSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼである実施態様において、トランスポサーゼをコードする配列はｍＲＮＡ配列である。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素はpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。piggyBac（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF （配列番号１）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意の割合の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなってよい。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGYKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF （配列番号１）の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の１つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。

特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の２つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の３つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の配列の３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の３０位のアミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の１６５位のアミノ酸置換はグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の２８２位のアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１の配列の５３８位のアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）のリジン（Ｋ）置換である。

本開示の方法の特定の実施態様において、トランスポサーゼ酵素は、Super piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素である。特定の実施態様において、本開示のSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、３０位のアミノ酸置換がイソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）置換であり、１６５位のアミノ酸置換がグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）置換であり、２８２位のアミノ酸置換がメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）の置換であり、及び５３８位のアミノ酸置換がアスパラギン（Ｎ）のリジン（Ｋ）置換である、配列番号１の配列のアミノ酸配列を含むか又はそれからなってよい。特定の実施態様において、Super piggyBac（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF （配列番号２）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意の割合の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなってもよい。

トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位、及び５９１位の１つ以上にアミノ酸置換を含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む特定の実施態様において、piggyBac（商標）又はSuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位、及び５７０位の１つ以上にアミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のアスパラギン（Ｎ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４６位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４６位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の８２位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１０３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１１９位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１２５位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１２５位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１７７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１７７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のヒスチジン（Ｈ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２のの１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８０位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８５位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１８７位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２００位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２０７位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２０９位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２２６位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２３５位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のアルギニン（Ｒ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４０位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４１位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２４３位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２５８位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のトリプトファン（Ｗ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のチロシン（Ｙ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９６位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の２９８位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１１位のアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１５位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３１９位のアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３２７位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のアルギニン（Ｒ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３２８位のアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３４０位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３４０位のアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４２１位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）のヒスチジン（Ｈ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４３６位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４５６位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のチロシン（Ｙ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４７０位のアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４８５位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０３位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０３位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のイソロイシン（Ｉ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５５２位のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のリジン（Ｋ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５７０位のアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５９１位のアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５９１位のアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）置換である。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSUper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位の１つ以上にアミノ酸置換を含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の突然変異を含む実施態様を含む本開示の方法の特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はSUper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位の２、３、４、５、６、又はそれ以上にアミノ酸置換を含み得る。トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の変異を含む実施態様を含む特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、又はsuper piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素はさらに、配列番号１又は配列番号２の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、及び５７０位にアミノ酸置換を含み得る。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１０３位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のプロリン（Ｐ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の１９４位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３７２位のアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の３７５位のアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の４５０位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５０９位のアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）置換である。特定の実施態様において、配列番号１又は配列番号２の５７０位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）のセリン（Ｓ）置換である。特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を含み得る。piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素が配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を含む実施態様を含む特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の又は配列番号２の配列の３７２位、３７５位、及び４５０位にアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を、配列番号１の３７２位にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換を、及び配列番号１の３７５位にリジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換を含み得る。特定の実施態様において、piggyBac（商標）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１の１９４位にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換を、配列番号１の３７２位にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）置換を、配列番号１の３７５位にリジン（Ｋ）のアラニン（Ａ）置換を、及び配列番号１の４５０位にアスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）置換を含み得る。

ベクター
本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。特定の実施態様において、ベクターはウイルスベクターである。ベクターは組換えベクターであってもよい。

本開示のウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はこれらの任意の組み合わせから単離又は誘導された配列を含み得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離又は誘導された配列を含んでもよい。ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含んでもよい。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスは、本開示のタンパク質足場、センチリン、又はカルチリンをコードする配列の隣にシスで位置する２つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、すべての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９）が含まれる。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、及び１つの血清型のゲノムと別の血清型のキャプシドを含むＡＡＶハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８）を含む。本開示の例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３が含まれる。

本開示のウイルスベクターは、選択遺伝子を含んでもよい。選択遺伝子は、細胞の生存活性と生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的な細胞培養条件によって刺激されたとき、細胞の生存活性と生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的な細胞培養条件は、細胞の生存活性又は生存に有害な化合物を含む場合があり、遺伝子産物は化合物に対する耐性を付与する。本開示の例示的な選択遺伝子には、特に限定されるものではないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を与える）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素をコードし、メトトレキサートに対する耐性を与える）、ＴＹＭＳ（チミジル酸合成酵素をコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）－メチルグアニン－ＤＮＡメチル転移酵素をコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリーをコードする、メンバーＡ１）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）、又はこれらの組み合わせが含まれる。

本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）アポトーシス促進性ポリペプチドを含むことができ、ここで誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、非ヒト配列は制限部位を含む。特定の実施態様において、リガンド結合領域は多量体リガンド結合領域であってもよい。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」とも呼ぶことができる。特定の実施態様において、本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチド、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒトを含まない。特定の実施態様において、本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチド、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、本開示のウイルスベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチド、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、ここで誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、リガンド結合領域はＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含み得る。特定の実施態様において、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の３６位に改変を含み得る。改変は、３６位のフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換（Ｆ３６Ｖ）であってもよい。特定の実施態様において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号４５）を含むアミノ酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号４６）を含む核酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域に特異的な誘導剤は、ＡＰ２０１８７及び／又はＡＰ１９０３（両方とも合成薬である）を含む。

本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、リンカー領域は、GGGGS（配列番号４７）を含むアミノ酸配列によりコードされるか、又はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号４８）を含む核酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含まない。

本開示の切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされる。あるいは又はさらに、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の２８２位にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされる。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号４９）を含むアミノ酸配列によりコードされるか、又はTTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号５０）を含む核酸配列によりコードされる。

ポリペプチドが、切断型カスパーゼ－９ポリペプチドを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの特定の実施態様において、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号５１）を含むアミノ酸配列によりコードされるか、又はGGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAGGGAGGAGGAGGATCCGAATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC （配列番号５２）含む核酸配列によりコードされる。

本開示のウイルスベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み得る。いくつかの実施態様において、ベクターは少なくとも１つの自己切断ペプチドを含むことができ、自己切断ペプチドはＣＡＲと選択遺伝子との間に位置する。いくつかの実施態様において、ベクターは少なくとも１つの自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドはＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドはＣＡＲの下流に位置する。本開示のウイルスベクターは、例えば本開示のタンパク質足場、センチリン、又はカルチリンの１つ以上と、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの間に位置する少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み得る。本開示のウイルスベクターは、少なくとも２つの自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流又はすぐ上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの下流又はすぐ上流に位置する。自己切断ペプチドは、例えばＴ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドを含んでもよい。Ｔ２Ａペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列を、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５４）を含むアミノ酸配列を、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５４）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号５５）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列を、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列を、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列を、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列を、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列を、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列を、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。

本開示は、本開示のＣＡＲを含むベクターを提供する。特定の実施態様において、ベクターはナノ粒子である。本開示の例示的なナノ粒子ベクターには、特に限定されるものではないが、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、合成ヌクレオチド、改変ヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせ）、アミノ酸（Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、合成アミノ酸、改変アミノ酸、又はこれらの任意の組み合わせ）、ポリマー（例えばポリマーソーム）、ミセル、脂質（例えばリポソーム）、有機分子（例えば炭素原子、シート、繊維、チューブ）、無機分子（例えばリン酸カルシウム又は金）、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。ナノ粒子ベクターは、細胞膜を介して受動的又は能動的に輸送され得る。

本開示のナノ粒子ベクターは、選択遺伝子を含み得る。選択遺伝子は、細胞の生存活性と生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的な細胞培養条件によって刺激されたときに、細胞の生存活性と生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的な細胞培養条件は、細胞の生存活性又は生存に有害な化合物を含む場合があり、遺伝子産物は化合物に対する耐性を付与する。本開示の例示的な選択遺伝子には、特に限定されるものではないが、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を与える）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素をコードし、メトトレキサートに対する耐性を与える）、ＴＹＭＳ（チミジル酸合成酵素をコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）－メチルグアニン－ＤＮＡメチル転移酵素をコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリーをコードする、メンバーＡ１）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）、又はこれらの組み合わせが含まれる。

本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）アポトーシス促進性ポリペプチドを含む、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むことができ、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、非ヒト配列は制限部位を含む。特定の実施態様において、リガンド結合領域は多量体リガンド結合領域であってもよい。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」とも呼ぶことができる。特定の実施態様において、本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチド、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒトを含まない。特定の実施態様において、本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチド、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施態様において、本開示のナノ粒子ベクターは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチド、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができ、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、リガンド結合領域はＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含み得る。特定の実施態様において、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の３６位に改変を含み得る。改変は、３６位のフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換（Ｆ３６Ｖ）であってもよい。特定の実施態様において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号４５）を含むアミノ酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号４６）を含む核酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域に特異的な誘導剤は、ＡＰ２０１８７及び／又はＡＰ１９０３（両方とも合成薬である）を含む。

本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドの特定の実施態様において、リンカー領域は、GGGGS（配列番号４７）を含むアミノ酸により、又はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号４８）を含む核酸配列によりコードされる。特定の実施態様において、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含まない。

本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み得る。いくつかの実施態様において、ナノ粒子ベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドを含むことができ、自己切断ペプチドはＣＡＲとナノ粒子との間に位置する。いくつかの実施態様において、ナノ粒子ベクターは少なくとも１つの自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドはＣＡＲの上流に位置し、第２の自己切断ペプチドはＣＡＲの下流に位置する。いくつかの実施態様において、ナノ粒子ベクターは少なくとも１つの自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドはＣＡＲとナノ粒子との間に位置し、第２の自己切断ペプチドはＣＡＲの下流に位置する。いくつかの実施態様において、ナノ粒子ベクターは少なくとも１つの自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドはＣＡＲとナノ粒子との間に位置し、第２の自己切断ペプチドはＣＡＲの下流、例えばＣＡＲと選択遺伝子との間に位置する。本開示のナノ粒子ベクターは、例えば、本開示のタンパク質足場、センチリン、又はカルチリンの１つ以上と本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの間に位置する少なくとも１つの自己切断ペプチドを含み得る。本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも２つの自己切断ペプチドを含むことができ、第１の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの上流又はすぐ上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの下流又はすぐ上流に位置する。自己切断ペプチドは、例えばＴ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドを含み得る。Ｔ２Ａペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列を、又はEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５３）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５４）を含むアミノ酸配列を、又はGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号５４）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号５５）を含む核酸配列を含み得る。Ｅ２Ａペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列を、又はQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５６）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列を、又はGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号５７）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｆ２Ａペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列を、又はVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５８）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列を、又はGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号５９）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。Ｐ２Ａペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列を、又はATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６０）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列を、又はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号６１）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。

本開示は、本開示のベクターを含む組成物を提供する。

ＣＡＲ発現細胞
本開示は、本開示のＣＡＲを含む細胞を提供する。本開示は、本開示のトランスポゾンを含む細胞を提供する。特定の実施態様において、本開示のＣＡＲ、トランスポゾン、又はベクターを含む細胞は、細胞表面でＣＡＲを発現し得る。細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。

本開示の特定の実施態様において、細胞は免疫細胞である。免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞（例えば、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞）、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞、又は臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞であり得る。

本開示の特定の実施態様において、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、ヘルパー１型Ｔ細胞、ヘルパー２型Ｔ細胞、ヘルパー１７Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、天然型調節性Ｔ細胞、又は誘導性調節性Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞はＣＤ４⁺であり得る。

本開示の特定の実施態様において、細胞は人工リガンド提示細胞であり、任意選択的に、本開示の改変免疫細胞又はＴ細胞を刺激及び拡張するために使用することができる。

本開示の特定の実施態様において、細胞は腫瘍細胞であり、これは、任意選択的に人工又は改変リガンド提示細胞として使用することができる。

養子療法に使用され得る本開示の改変細胞は、自家又は同種異系であり得る。

ＣＡＲ発現細胞の作成方法
本開示は、細胞の表面上にキメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）を発現させる方法を提供し、この方法は、（ａ）細胞集団を得ること；（ｂ）細胞集団中の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲを移動させるのに十分な条件下で、細胞集団に本開示のＣＡＲ又はＣＡＲをコードする配列を含む組成物を接触させ、それにより改変細胞集団を生成すること；（ｃ）改変細胞集団をトランスポゾンの組み込みに適した条件下で培養すること；（ｄ）細胞表面でＣＡＲを発現する改変細胞集団から少なくとも１つの細胞を拡張及び／又は選択することを含む。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、細胞集団は、白血球、及び／又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋白血球を含み得る。細胞集団は、最適化された比率でＣＤ４＋及びＣＤ８＋白血球を含み得る。ＣＤ４＋とＣＤ８＋白血球との最適化された比率は、インビボで自然には発生しない。細胞集団は腫瘍細胞を含み得る。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、トランスポゾン又はベクターは、ＣＡＲ又はＣＡＲをコードする配列を含む。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、細胞集団中の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切って、ＣＡＲをコードする配列を移すのに十分な条件は、ヌクレオフェクション（nucleofection）を含む。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、細胞集団中の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲをコードする配列を移すのに十分な条件は、指定された電圧で１つ以上の電気パルス、緩衝液、及び１つ以上の補助因子の適用の少なくとも１つを含む。特定の実施態様において、緩衝液は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、アマクサヌクレオフェクター（Amaxa Nucleofector）、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の実施態様において、１種以上の補助因子は、（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はこれらの任意の組み合わせ；（ｂ）塩、無機物、代謝産物、又はこれらの任意の組み合わせ；（ｃ）細胞培地；（ｄ）細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つ以上のアポトーシス経路、又はこれらの組み合わせの阻害剤；及び（ｅ）１つ以上の核酸を改変又は安定化する試薬を含み得る。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はこれらの任意の組み合わせは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロダイマー、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。塩、無機物、代謝産物、又はこれらの任意の組み合わせは、ヘペス、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、ヌクレオフェクタープラスサプリメント（Nucleofector PLUS Supplement）、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、トリス／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８１、ポロキサマー４０７、ポリビニルピロリドン、ポップ３１３、クラウン－５、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。細胞培地は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地、ＣＴＳＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞拡張ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶＴ細胞拡張培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞拡張培地、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つ以上のアポトーシス経路、又はこれらの組み合わせの阻害剤は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）（例えばＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫの阻害剤、又はこれらの任意の組み合わせを含む。１つ以上の核酸を改変又は安定化する試薬は、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を含む又は含まない正味中性電荷のＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、又はこれらの任意の組み合わせを含む。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、本開示のＣＡＲ又はＣＡＲをコードする配列の組み込みに適した条件は、緩衝液及び１種以上の補助因子のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施態様において、本開示のトランスポゾン又はベクターは、本開示のＣＡＲ又はＣＡＲをコードする配列を含む。特定の実施態様において、緩衝液は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、アマクサヌクレオフェクター（Amaxa Nucleofector）、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の実施態様において、１種以上の補助因子は、（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はこれらの任意の組み合わせ；（ｂ）塩、無機物、代謝産物、又はこれらの任意の組み合わせ；（ｃ）細胞培地；（ｄ）細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つ以上のアポトーシス経路の阻害剤、又はこれらの組み合わせ；及び（ｅ）１つ以上の核酸を改変又は安定化する試薬を含み得る。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はこれらの任意の組み合わせは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロダイマー、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。塩、無機物、代謝産物、又はこれらの任意の組み合わせは、ヘペス、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、ヌクレオフェクタープラスサプリメント（Nucleofector PLUS Supplement）、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、トリス／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８１、ポロキサマー４０７、ポリビニルピロリドン、ポップ３１３、クラウン－５、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。細胞培地は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地、ＣＴＳＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞拡張ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶＴ細胞拡張培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞拡張培地、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つ以上のアポトーシス経路、又はこれらの組み合わせの阻害剤は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）（例えばＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫの阻害剤、又はこれらの任意の組み合わせを含む。１つ以上の核酸を改変又は安定化する試薬は、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を含む又は含まない正味中性電荷のＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、又はこれらの任意の組み合わせを含む。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、拡張及び選択工程は連続して行われる。拡張は、選択前に行われる場合がある。拡張は選択後に行われる場合があり任意選択的に、拡張後にさらに（つまり２回目の）選択が行われる場合がある。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、拡張及び選択工程は同時に行い得る。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、拡張は、改変細胞集団の少なくとも１つの細胞にリガンドを接触させて、ＣＡＲを介して少なくとも１つの細胞を刺激し、それによって拡張細胞集団を生成することを含み得る。リガンドは、基質の表面に提示されてもよい。基質は、特に限定されるものではないが、表面、ウェル、ビーズ、又はこれらの複数、及びマトリックスを含む任意の形態を有してもよい。基質は、常磁性又は磁性成分をさらに含んでもよい。ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、リガンドは基質の表面に提示されてもよく、ここで、基質は磁気ビーズであり、磁石を使用して、改変及び拡張された細胞集団から磁気ビーズを除去又は分離することができる。リガンドは、細胞又は人工リガンド提示細胞の表面に提示されてもよい。本開示の人工リガンド提示細胞には、特に限定されるものではないが、腫瘍細胞及び幹細胞が含まれ得る。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、トランスポゾン又はベクターは選択遺伝子を含み、選択工程は、改変細胞集団の少なくとも１つの細胞に、選択遺伝子が耐性を付与する化合物と接触させることを含み、それにより、選択遺伝子を発現している細胞を選択を生き延びていると特定し、選択遺伝子を発現していない細胞を、選択工程を生き延びていないと特定する。

ＣＡＲを発現するこの方法の特定の実施態様において、拡張及び／又は選択工程は、１０～１４日間（両端を含む）にわたって進行し得る。

本開示は、本開示の方法の改変、拡張、及び選択された細胞集団を含む組成物を提供する。

造血幹細胞
本開示の組成物は、被験体からの天然ＨＳＣの選択的除去後の移植のための複数の造血幹細胞（ＨＳＣ）を含み得る。

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性の自己再生前駆細胞である。リンパ系及び骨髄系から分化した血球はすべて、ＨＳＣに由来する。ＨＳＣは、成人の骨髄、末梢血、及び臍帯血に見出すことができる。

骨髄移植の形でのＨＳＣ移植は、被験体の免疫系の残留物が、移植された細胞を攻撃するか又は移植された細胞の生存を促進しない状態を作り出すために、しばしば失敗する。本開示の組成物及び方法の開発以前は、骨髄移植前のＨＳＣの除去は無効であるか、又は目的のＨＳＣ以外の細胞集団に害を引き起こした。本開示の組成物及び方法は、ＨＳＣ表面リガンドを特異的に標的とするキメラリガンド受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を用いてこれらのＨＳＣを標的とすることにより、損傷された、機能不全の、又は疾患を引き起こす遺伝的欠陥を有するＨＳＣを、選択的に除去する方法を提供する。ＣＡＲ発現免疫細胞を含む組成物は、免疫細胞に事前照射するか、又は誘導剤の投与時に、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド（「安全スイッチ」とも呼ばれる）を含む外因性ＣＡＲ発現免疫細胞のみのアポトーシスを開始する誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むように、これらの細胞をさらに改変することにより、いったんその機能を実行すると、除去され得る。

本開示の組成物及び方法は、複数のＨＳＣの移植をさらに提供する。好ましくは、本開示の移植されたＨＳＣは遺伝子改変されている。

本開示のＨＳＣは、ＤＮＡ局在化ドメイン及びエフェクタードメインを含む組成物によって改変され得る。特定の実施態様において、ＤＮＡ局在化ドメインは、Ｃａｓ９のＤＮＡ結合ドメイン、不活性化されたＣａｓ９、短いＣａｓ９、短い不活性化されたＣａｓ９、ＴＡＬＥＮ、又は亜鉛フィンガータンパク質を含み得る。特定の実施態様において、エフェクターはエンドヌクレアーゼを含む。好ましくは、エンドヌクレアーゼはＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。特定の実施態様において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ又はＣｌｏ０５１の１つ以上である。ゲノム編集ツールの詳細については、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３７９２２を参照されたい（この内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。ＤＮＡ局在化ドメイン及びエフェクタードメインを含む組成物は、トランスポゾンに含まれていてもよい。ベクターに含まれるものを含むＤＮＡ局在化ドメイン及びエフェクタードメインを含む組成物は、発現及び／又は細胞への送達のためのベクターにさらに含まれてもよい。

本開示のＨＳＣは、疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを除去するために改変され得る。

本開示のＨＳＣは、本開示の疾患又は障害を治療するために、核酸又はタンパク質を発現又は過剰発現するか、分子、ペプチド、タンパク質、又は化合物を分泌するように改変され得る。

本開示のＨＳＣは、本開示の免疫応答を改変するために、核酸又はタンパク質を発現若しくは過剰発現するように、又は分子、ペプチド、タンパク質、又は化合物を分泌するように改変され得る。

本開示のＨＳＣは、本開示のＣＡＲ発現免疫細胞の活性を改変するために、細胞表面リガンドを発現又は過剰発現するように改変され得る。例えば、移植されたＨＳＣは、本開示のＣＡＲ発現免疫細胞に結合すると免疫細胞を不活性化するリガンドを発現して、残存するＣＡＲ発現免疫細胞が、移植されたＨＳＣ細胞を選択的に除去するのを防ぐことができる。

核酸分子
タンパク質足場をコードする本開示の核酸分子は、例えばｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は任意の他の形態のＲＮＡの形態、又は特に限定されるものではないが、クローニングによって得られるか合成的に生成されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡは、３本鎖、２本鎖、若しくは１本鎖、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であり得るか、又はアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。

本開示の単離された核酸分子は、例えば、特に限定されるものではないが、少なくとも１つのタンパク質足場の少なくとも１つの特定の部分などの１つ以上のイントロンを任意選択的に有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子；標的タンパク質に結合するタンパク質足場又はループ領域のコード配列を含む核酸分子；及び、上記のものと実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝暗号の縮重により、本明細書に記載の及び／又は当該分野で公知のタンパク質足場を依然としてコードする核酸分子を含み得る。もちろん、遺伝暗号は当該分野で公知である。従って、本発明の特定のタンパク質足場をコードするそのような縮重核酸変種を生成することは、当業者にとって日常的であろう。例えば、前述のAusubel、et al.を参照すれば、そのような核酸変種は本発明に含まれる。

本明細書に示されるように、タンパク質足場をコードする核酸を含む本開示の核酸分子には、特に限定されるものではないが、タンパク質足場断片のアミノ酸配列を単独でコードするもの；タンパク質足場全体又はその一部のコード配列；タンパク質足場、断片、又は部分のコード配列、並びに、追加の配列、例えば上記追加のコード配列有り又は無しの少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列、例えば、特に限定されるものではないが、非コーディング５’及び３’配列を含む追加の非コード配列と一緒の少なくとも１つのイントロン、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡプロセシング（例えばリボソーム結合とｍＲＮＡの安定性）で役割を果たす転写された非翻訳配列；追加の機能を提供するものなどの、追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列、を含み得る。従って、タンパク質足場をコードする配列は、タンパク質足場断片又は部分を含む融合タンパク質足場の精製を促進するペプチドをコードする配列などの融合マーカー配列であり得る。

本明細書に記載のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本開示は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。すなわちこのポリヌクレオチド実施態様は、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量化するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリー内の部分的又は完全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。いくつかの実施態様においてポリヌクレオチドは、ヒト又は哺乳動物の核酸ライブラリーからから単離されたゲノム若しくはｃＤＮＡ配列、又はｃＤＮＡに相補的な配列である。

好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％の全長配列、好ましくは少なくとも８５％又は９０％の全長配列、より好ましくは少なくとも９５％の全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーを標準化して、まれな配列の表現を増やすことができる。低又は中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的には、特に限定されるものではないが、相補的配列と比較して配列同一性が低下した配列で使用される。中程度及び高ストリンジェンシー条件は、任意選択的に、より大きな同一性の配列に使用できる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソロガス配列又はパラロガス配列を決定するために使用することができる。

任意選択的に本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質足場の少なくとも一部をコードするであろう。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに使用できる核酸配列を包含する。例えば、前述のAusubel、前述のColliganを参照されたい（それぞれ参照により本明細書に完全に組み込まれる）。

核酸の構築
本開示の単離された核酸は、当該分野で公知のように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、及び／又は（ｄ）これらの組み合わせを使用して作製され得る。

核酸は、本発明のポリヌクレオチド意外に配列を都合よく含むことができる。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を補助することができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を補助することができる。例えば、６ヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。コード配列を除く本開示の核酸は、任意選択的に、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーである。

追加の配列をそのようなクローニング及び／又は発現配列に追加して、クローニング及び／又は発現におけるこれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離を補助し、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該分野で公知である（例えば、前述のAusubel；又は前述のSambrookを参照）。

核酸を構築するための組換え方法
本開示の単離された核酸組成物、例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせは、当業者に公知の任意の数のクローニング方法を使用して生物源から得ることができる。いくつかの実施態様において、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー内の所望の配列が同定される。ＲＮＡの単離、及びｃＤＮＡ、及びゲノムライブラリーの構築は、当業者に公知である。（例えば、前述のAusubel；又は前述のSambrookを参照）。

核酸のスクリーニングと分離方法
本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。同じ又は異なる生物中の相同遺伝子を分離するために、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズするプローブを使用することができる。当業者はアッセイにおいて、様々な程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを使用でき、ハイブリダイゼーション又は洗浄培地のいずれかが厳密であり得ることを理解するであろう。ハイブリダイゼーション条件がより厳しくなるにつれて、２本鎖形成が起きるためには、プローブと標的との間にはより高度の相補性がなければならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドなどの部分変性溶媒の存在の１つ以上によって制御できる。例えば、例えば０％から５０％の範囲内でホルムアミドの濃度を操作することにより、反応物溶液の極性を変えることにより、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは便利に変化する。検出可能な結合に必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション培地及び／又は洗浄培地のストリンジェンシーに応じて異なる。相補性の程度は、最適には１００％、７０～１００％、又はその中の任意の範囲又は値である。しかし、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄媒体のストリンジェンシーを低下させることにより、プローブ及びプライマーのわずかな配列変化を補償できることを理解されたい。

ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は当該分野で公知であり、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、過度の実験なしに本開示に従って使用することができる。

ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法には、特に限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、Mullis, et al.の米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号；Tabor, et alの第４，７９５，６９９及び第４，９２１，７９４号；Innisの第５，１４２，０３３号；Wilson et al.の第５，１２２，４６４号；Innisの第５，０９１，３１０号；Gyllensten，et al.の第５，０６６，５８４号；Gelfand, et al.の第４，８８９，８１８号；Silver, et al.の第４，９９４，３７０号；Biswasの第４，７６６，０６７号；Ringoldの第４，６５６，１３４号を参照）、及び２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介増幅（Malek, et al.の米国特許第５，１３０，２３８号、商品名ＮＡＳＢＡ）が挙げられ、その参照の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる（例えば、前述のAusubel；又は前述のSambrookを参照）。

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから、本開示のポリヌクレオチド及び関連遺伝子の配列を直接増幅することができる。ＰＣＲや他のインビトロ増幅法も、例えば発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するために、試料中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用される核酸を作成するために、核酸配列決定のために、又はその他の目的のために、有用であり得る。インビトロ増幅法に当業者を導くのに十分な技術の例は、前述のBerger、前述のSambrook、及び前述のAusubel、ならびにMullis, et al.、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）；及びInnis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)中に見いだされる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販のキットは、当該分野で公知である。例えば、Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)を参照されたい。さらに、例えばＴ４遺伝子３２タンパク質（Boehringer Mannheim）を使用して、長いＰＣＲ産物の収量を改善することができる。

核酸を構築するための合成方法
本開示の単離された核酸は、既知の方法による直接的な化学合成によっても調製され得る（例えば、前述の Ausubel, et al.を参照）。化学合成は一般に１本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これは相補配列とのハイブリダイゼーションによって、又は１本鎖を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼによる重合を用いて、２本鎖ＤＮＡに変換することができる。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００以上の塩基の配列に制限され得るが、短い配列の連結によって、より長い配列が得られ得ることを認識するであろう。

組換え発現カセット
本開示はさらに、本開示の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本開示の核酸配列、例えば本開示のタンパク質足場をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列は、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入できる組換え発現カセットを構築するために使用できる。組換え発現カセットは、典型的には目的の宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写を指示する転写開始調節配列に作動可能に連結された本開示のポリヌクレオチドを含む。異種及び非異種（すなわち内因性）プロモーターの両方を使用して、本開示の核酸の直接の発現を指示することができる。

いくつかの実施態様において、プロモーター、エンハンサー、又は他の要素として機能する単離された核酸は、本開示のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入して、本開示のポリヌクレオチドの発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることができる。例えば内因性プロモーターは、突然変異、欠失、及び／又は置換によりインビボ又はインビトロで改変することができる。

ベクターと宿主細胞
本開示はまた、当該技術分野で公知のように、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術による少なくとも１つのタンパク質足場の産生に関する。例えば、前述のSambrook、et al.、前述のAusubel, et al.（それぞれ参照により本明細書に完全に組み込まれる）を参照されたい。

例えば、ＰＢ－ＥＦ１ａベクターを使用することができる。ベクターは以下のヌクレオチド配列を含む：
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ポリヌクレオチドは、宿主での増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに任意選択的に結合され得る。一般的にプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物で、又は荷電脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、これは適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングしてから、宿主細胞に形質導入することができる。

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。発現構築物は、転写開始、停止のための部位をさらに含み、転写領域では、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは翻訳すべきｍＲＮＡの先端に翻訳開始コドンを、そして末端に適切に配置された終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）を含み、哺乳類又は真核細胞の発現用にはＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。

発現ベクターは、好ましくはしかし任意選択的に、少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。このようなマーカーには、特に限定されるものではないが、例えば真核細胞培養用のアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ミコフェノール酸、又はグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；第５，７７０，３５９号；第５，８２７，７３９号）、ブラストサイジン（ｂｓｄ遺伝子）、耐性遺伝子を含み、並びに大腸菌及び他の細菌又は原核生物中で培養するためのアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、又はテトラサイクリン耐性遺伝子（上記特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。上記の宿主細胞に適切な培養培地及び条件は、当該分野で公知である。適切なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、又は他の既知の方法により達成され得る。そのような方法は、当該分野において前述のSambrook、第１章～第４章及び第１６章～第１８章、及び前述のAusubel、第１、９、１３、１５、１６章に記載されている。

発現ベクターは、好ましくはしかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法により改変された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含む。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞又は細胞のサブセットを別の定義された細胞のサブセットから区別する表面タンパク質、糖タンパク質、又はタンパク質のグループを含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物又は方法によって改変された細胞を、本開示の組成物又は方法によって改変されていない細胞から区別する。そのような細胞表面マーカーには、例えば、特に限定されるものではないが、ＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２の切断型又は全長型など、又はこれらの任意の組み合わせの「指定クラスター」又は「分類決定因子」タンパク質（しばしば「ＣＤ」と略される）が含まれる。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８をさらに含む（Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87）。

発現ベクターは、好ましくはしかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法により改変された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な薬剤耐性マーカーを含む。本開示の選択可能な薬剤耐性マーカーは、野生型又は突然変異体Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。

本開示の少なくとも１つのタンパク質足場は、融合タンパク質などの改変された形態で発現することができ、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能性領域も含むことができる。例えば、追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域をタンパク質足場のＮ末端に付加して、精製中、又はその後の取り扱いと保管中に、宿主細胞内での安定性と持続性を向上させることができる。また、ペプチド部分を本開示のタンパク質足場に付加して、精製を促進することができる。そのような領域は、タンパク質足場又はその少なくとも１つの断片の最終調製の前に除去することができる。そのような方法は、前述のSambrook、第１７．２９～１７．４２章、及び第１８．１～１８．７４章、及び前述のAusubel、第１６、１７、１８章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。

当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系に精通している。あるいは本開示の核酸は、本開示のタンパク質足場をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞中で刺激することにより（操作により）宿主細胞で発現させることができる。そのような方法は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、第５，６４１，６７０号、第５，７３３，７４６号、及び第５，７３３，７６１号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

タンパク質足場、その特定の部分又は変種の産生に有用な細胞培養物の例は、当該分野で公知の細菌、酵母、及び哺乳動物細胞である。哺乳類の細胞系は、しばしば細胞の単層の形態になるが、哺乳類の細胞懸濁液又はバイオリアクターも使用できる。未変性のグリコシル化タンパク質を発現することができる多くの適切な宿主細胞株が当該分野で開発されており、ＣＯＳ－１（例、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ－７（例えばＡＴＣＣＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣＣＲＬ１６１０）、及びＢＳＣ－１（例えばＡＴＣＣＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐＧ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられ、これらは、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、Manassas, Va. (www.atcc.org) から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ－１８５１）である。特に好適な実施態様において、組換え細胞はＰ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。

これらの細胞の発現ベクターは、以下の発現制御配列の１つ以上、例えば、特に限定されるものではないが、複製起点；プロモーター（例えば、後期又は早期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター；エンハンサー、及び／又は処理情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０大ＴＡｇポリＡ付加部位）、及び転写ターミネーター配列を含み得る。前述のAusubel, et al.、前述のSambrook、et al.を参照されたい。本発明の核酸又はタンパク質の産生に有用な他の細胞は、例えばAmerican Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) 又はその他の既知又は商業ソースから知られており、及び／又は入手可能である。

真核生物宿主細胞が使用される場合、ポリアデニル化又は転写ターミネーター配列は典型的にはベクターに組み込まれる。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)）。さらに、当該分野で知られているように、宿主細胞の複製を制御する遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。

タンパク質足場の精製
タンパク質足場は、特に限定されるものではないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム沈殿若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法により、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた精製に使用することができる。例えば、Colligan, Current Protocols in Immunology、又は Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)、例えば第１、４、６、８、９、１０章を参照されたい（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

本開示のタンパク質足場には、自然界から精製された生成物、化学合成操作の生成物、及び例えば大腸菌、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳動物細胞を含む原核生物又は真核生物宿主から組換え技術により産生された生成物が含まれる。組換え産生操作で使用される宿主に応じて、本開示のタンパク質足場は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。そのような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル、例えば前述のSambrook、セクション１７．３７～１７．４２；前出のAusubel、第１０章、第１２章、第１３章、第１６章、第１８章、及び第２０章、前述のColligan, Protein Science、第１２章～第１４章に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

アミノ酸コード
本開示のタンパク質足場を構成するアミノ酸はしばしば略記される。アミノ酸の指定は、当該分野でよく理解されているように、１文字コード、３文字コード、名前、又は３つのヌクレオチドコドンでアミノ酸を指定することにより示すことができる（Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994）。本開示のタンパク質足場は、本明細書で特定されるように、自然突然変異又はヒトによる操作のいずれかからの１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を含むことができる。機能に不可欠な本開示のタンパク質足場中のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発などの当該分野で知られている方法によって特定することができる（例えば、前述のAusubel、第８章、１５章；Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)）。後者の操作では、分子内のすべての残基に単一のアラニン変異が導入される。次に、得られた変異体分子は、生物活性、例えば少なくとも１つの中和活性について試験される。タンパク質足場の結合に非常に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、光親和性標識などの構造解析によっても同定することができる（Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)）。

当業者により理解されるように、本発明は、本開示の少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質足場を含む。生物学的に活性なタンパク質足場は、未変性（非合成）の、内因性、又は関連する、及び公知のタンパク質足場の比活性の、少なくとも２０％、３０％、又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、又は９５％～９９％、又はそれ以上の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性の測定値をアッセイし定量化する方法は、当業者に公知である。

別の態様において、本開示は、有機部分の共有結合により改変される本明細書に記載のタンパク質足場及び断片に関する。そのような改変により、薬物動態特性が改善された（例えば、インビボ血清半減期の延長）タンパク質足場断片を生成することができる。有機部分は、直鎖の又は分岐鎖の親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。特定の実施態様において、親水性ポリマー基は、約８００～約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、又はポリビニルピロリドンであり得、そして脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約８～約４０個の炭素原子を含むことができる。

本開示の改変タンパク質足場及び断片は、抗体に直接又は間接的に共有結合した１つ以上の有機部分を含むことができる。本開示のタンパク質足場又は断片に結合される各有機部分は、独立して親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用される用語「脂肪酸」は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。本明細書で使用される用語「親水性ポリマー基」は、オクタンよりも水に溶けやすい有機ポリマーを指す。例えば、ポリリジンはオクタンよりも水に溶けやすい。従って、ポリリジンの共有結合により改変されたタンパク質足場は、本開示に含まれる。本開示のタンパク質足場を改変するのに適した親水性ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であり得、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ－ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパルテートなど）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。好ましくは、本開示のタンパク質足場を改変する親水性ポリマーは、別個の分子実体として約８００～約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００（下付き文字はダルトン単位のポリマーの平均分子量である）を使用することができる。親水性ポリマー基は、１～約６個のアルキル基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸基又は脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適切な方法を使用することにより調製できる。例えば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートに結合することができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾールで活性化）は、ポリマー上のヒドロキシル基に結合し得る。

本開示のタンパク質足場を改変するのに適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは飽和していてもよく、又は１つ以上の不飽和単位を含み得る。本開示のタンパク質足場を改変するのに適した脂肪酸には、例えば、ｎ－ドデカン酸塩（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ－テトラデカン酸塩（Ｃ１４、ミリスチン酸塩）、ｎ－オクタデカン酸塩（Ｃ１８、ステアリン酸塩）、ｎ－エイコサン酸塩（Ｃ２０、アラキン酸塩）、ｎ－ドコサン酸塩（Ｃ２２、ベヘン酸塩）、ｎ－トリアコンタン酸塩（Ｃ３０）、ｎ－テトラコンタン酸塩（Ｃ４０）、ｃｉｓ－Δ９－オクタデカン酸塩（Ｃ１８、オレイン酸塩）、すべてｃｉｓ－Δ５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸塩（Ｃ２０、アラキドン酸塩）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが挙げられる。適切な脂肪酸エステルには、直鎖又は分岐鎖の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが含まれる。低級アルキル基は、１～約１２個、好ましくは１～約６個の炭素原子を含むことができる。

改変されたタンパク質足場及び断片は、１つ以上の改変剤との反応などによる適切な方法を使用して調製することができる。本明細書で使用される用語「改変剤」は、活性化基を含む適切な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で第２の化学基と反応し、それによって改変剤と第２の化学基の間に共有結合を形成できる化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基には、トシル酸塩、メシル酸塩、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などの求電子基が含まれる。チオールと反応し得る活性化基には、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ－チオール）などが含まれる。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子に結合でき、アジド基は三価リン基と反応して、ホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成できる。活性化基を分子に導入する適切な方法は、当該分野で公知である（例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996) を参照）。活性化基は、有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接結合するか、リンカー部分、例えば２価Ｃ１～Ｃ１２基（１つ以上の炭素原子を酸素、窒素、硫黄などのヘテロ原子で置換することができる）を介して結合することができる。適切なリンカー部分には、例えばテトラエチレングリコール、－（ＣＨ２）３－、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、及び－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－が含まれる。リンカー部分を含む改変剤は、例えばモノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えば、モノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノヘキサン）を脂肪酸と、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートの間にアミド結合を形成することにより生成され得る。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することにより生成物から除去され、前述のように別のカルボキシレートに結合できる一級アミンを露出させるか、又は無水マレイン酸と反応させ、生じる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる（例えば、Thompson, et al.、ＷＯ９２／１６２２１を参照、これらの教示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

本開示の改変タンパク質足場は、タンパク質足場又は断片を改変剤と反応させることにより生成することができる。例えば有機部分は、アミン反応性改変剤、例えばＰＥＧのＮＨＳエステルを使用することにより、非部位特異的な方法でタンパク質足場に結合させることができる。本開示のタンパク質足場の特定の部位に結合される有機部分を含む改変タンパク質足場及び断片は、適切な方法、例えば逆タンパク質分解（Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)）、及びHermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996) に記載された方法を使用して調製することができる。

白血球アフェレーシス産物からのＴ細胞の単離
白血球アフェレーシス産物又は血液は、閉鎖システム及び標準的な方法（例えば、COBE Spectra Apheresis System）を使用して、臨床現場の被験者から採取することができる。好ましくは産物は、標準の病院又は施設の白血球アフェレーシス手順に従って、標準の白血球アフェレーシス回収バッグに回収される。例えば、本開示の方法の好適な実施態様において、白血球アフェレーシスに通常使用されるものを超える追加の抗凝固剤又は血液添加物（ヘパリンなど）は含まれない。

あるいは、白血球（ＷＢＣ）／末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Biosafe Sepax 2（閉鎖／自動化）を使用）又はＴ細胞（CliniMACS（登録商標）Prodigy（閉鎖／自動化）を使用）を全血から直接単離してもよい。ただし特定の被験者（例えば、がんの診断及び／又は治療を受けた被験者）では、白血球アフェレーシスにより単離した場合よりも、全血から単離した場合のＷＢＣ／ＰＢＭＣの収率は大幅に低くなる可能性がある。

白血球アフェレーシス手順及び／又は直接細胞単離手順のいずれかが、本開示の任意の被験体に使用され得る。

白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は断熱容器に詰められるべきであり、臨床プロトコールでの使用が承認された標準の病院又は施設の採血手順に従って、制御された室温（＋１９℃～＋２５℃）に維持されるべきである。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は冷蔵すべきではない。

細胞濃縮白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は、輸送中に１ｍＬあたり０．２ｘ１０⁹細胞を超えてはならない。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の激しい混合は避けなければならない。

白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物を、例えば一晩保存する必要がある場合、管理された室温に保つ必要がある（上記と同じ）。保存中、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の濃度は、１ｍＬあたり０．２ｘ１０⁹細胞を超えてはならない。

好ましくは、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の細胞は、自己由来血漿に保存すべきである。特定の実施態様において、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物の細胞濃度が０．２ｘ１０⁹細胞／ｍＬよりも高い場合、産物は自己由来血漿で希釈すべきである。

好ましくは、標識及び分離操作を開始するとき、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は２４時間以上経過していてはならない。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物は、閉鎖及び／又は自動化システム（例えば、CliniMACS Prodigy）を使用して細胞標識のために処理及び／又は調製することができる。

自動化システムは、恐らくは細胞産物（例えば、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物）のフィコレーション（ficolation）及び／又は洗浄により、追加のバフィーコート分離を実施し得る。

閉鎖及び／又は自動化システムを使用して、Ｔ細胞単離のために細胞を調製及び標識することができる（例えば、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、及び／又はＴ細胞組成物から）。

ＷＢＣ／ＰＢＭＣは直接ヌクレオフェクションすることができる（これはより簡単で、追加の工程が必要ない）が、本開示の方法は、ヌクレオフェクションの前にまずＴ細胞を単離することを含む得る。ＰＢＭＣを直接ヌクレオフェクションするためのより簡単な方策は、ＣＡＲシグナル伝達を介したＣＡＲ＋細胞の選択的拡張を必要とし、これ自体は、Ｔ細胞を機能的に使い果たすことにより、産物のインビボ効率を直接低下させる劣った拡張方法であることが証明されている。この産物は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、又はこれらの任意の組み合わせを含むＣＡＲ＋細胞の不均一な組成物である可能性があり、これは、患者毎の産物のばらつきを増加させ、投薬とＣＲＳ管理をより困難にする。Ｔ細胞は腫瘍の抑制及び死滅における主要なエフェクターであると考えられているため、自己由来産物の製造のためのＴ細胞の単離は、他のより不均一な組成物よりも大きな利益をもたらす可能性がある。

Ｔ細胞は、一方向標識操作で標識細胞の濃縮又は標識細胞の枯渇によって直接に、又は二段階標識操作で間接的に、単離することができる。本開示の特定の濃縮方策によれば、Ｔ細胞は細胞回収バッグに回収され、非標識細胞（非標的細胞）は陰性画分バッグに回収される。本開示の濃縮方策とは対照的に、非標識細胞（標的細胞）は細胞回収バッグに回収され、標識細胞（非標的細胞）は陰性画分バッグ又は非標的細胞バッグにそれぞれ回収される。選択試薬には、特に限定されるものではないが、抗体被覆ビーズが含まれる。抗体被覆ビーズは、改変工程及び／又は拡張工程の前に除去され得るか、改変工程及び／又は拡張工程の前に細胞上に保持することができる。以下の細胞マーカーの非限定的な例の１つ以上を使用して、Ｔ細胞を単離することができる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、及び／又はこれらの任意の組み合わせ。Ｔ細胞を単離する方法は、Ｔ細胞を単離するために使用できる細胞マーカーの以下の非限定的な例の１つ以上を特異的に結合及び／又は検出可能に標識する１つ以上の試薬を含み得る：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、及び／又はこれらの組み合わせ。これらの試薬は、「適正製造基準」（「ＧＭＰ」）グレードであってもなくてもよい。試薬には、特に限定されるものではないが、Thermo DynaBeads 及び Miltenyi CliniMACS 製品が含まれる。本開示のＴ細胞を単離する方法は、標識工程及び／又は単離工程の複数回の繰り返しを含み得る。本開示のＴ細胞を単離する方法の任意の時点で、望ましくない細胞及び／又は望ましくない細胞型を、正又は負の選択により本開示のＴ細胞産物組成物から枯渇させることができる。本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又は別のＴ細胞マーカーを発現し得る追加の細胞型を含み得る。

Ｔ細胞のヌクレオフェクションに関する本開示の方法は、例えばヌクレオフェクション後に単離工程を含むか、又はＴＣＲシグナル伝達を介した選択的拡張工程を含むＷＢＣ／ＰＢＭＣの集団又は組成物中のＴ細胞のヌクレオフェクションプロセスにより、Ｔ細胞単離の工程を排除し得る。

特定の細胞集団は、Ｔ細胞の濃縮及び／又は選別の前又は後に、正又は負の選択により枯渇させてもよい。細胞産物組成物から枯渇される可能性のある細胞組成物の例には、骨髄細胞、ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）、樹状細胞、マクロファージ、赤血球、肥満細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞（例えば、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞）、誘導ナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離又は選択操作中に別々の回収バッグ中に単離できる。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、さらに別々に処理するか、具体的な比率で再構成（同じ組成物への組み合わせ）後に処理することができる。

ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が再構成され得る具体的な比率は、使用される拡張技術の種類及び有効性、細胞培地、及び／又はＴ細胞産物組成物の拡張に利用される増殖条件に依存し得る。可能なＣＤ４＋：ＣＤ８＋比率の例には、特に限定されるものではないが、５０％：５０％、６０％：４０％、４０％：６０％、７５％：２５％、及び２５％：７５％が含まれる。

ＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍細胞殺傷の強力な能力を示し、一方ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力及び機能を支持するのに必要なサイトカインの多くを提供する。正常なドナーから単離されたＴ細胞は主にＣＤ４＋であるため、Ｔ細胞産物組成物はＣＤ４＋：ＣＤ８＋の比率に関してインビトロで人工的に調整され、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の比率をインビボで本来存在すると思われる比率に改善する。最適化された比率はまた、自己Ｔ細胞産物組成物のエクスビボでの拡張にも使用し得る。Ｔ細胞産物組成物の人為的に調整されたＣＤ４＋：ＣＤ８＋比を考慮すると、本開示の産物組成物が、天然に存在するＴ細胞の集団とは大幅に異なる可能性があり、著しく大きな利点を提供する可能性に注目することが重要である。

Ｔ細胞単離のための好ましい方法は、手つかずのｐａｎＴ細胞を得るための負の選択方策を含むことができ、これは、生じるＴ細胞組成物が、手を入れられていなくて天然に存在する多様性／比率のＴ細胞を含むことを意味する。

正又は負の選択に使用できる試薬には、特に限定されるものではないが、磁気細胞分離ビーズが含まれる。磁気細胞分離ビーズは、本開示のＴ細胞単離方法の次の工程を実施する前に、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択された集団、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の混合集団から、除去又は枯渇させてもさせなくてもよい。

Ｔ細胞組成物及びＴ細胞産物組成物は、凍結保存、標準的なＴ細胞培養培地での保存、及び／又は遺伝子改変のために調製され得る。

Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、非刺激Ｔ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はこれらの任意の部分は、高い回収率、生存活性、表現型、及び／又は機能的能力を有するヒト細胞を保存及び回収するために最適化された標準的な凍結保存法を使用して、凍結保存することができる。市販の凍結保存培地及び／又はプロトコールを使用してもよい。本開示の凍結保存方法は、凍結に関連する毒性を低減するＤＭＳＯフリー凍結保存剤（例えばCryoSOfree（商標）ＤＭＳＯフリー凍結保存剤）を含有し、凍結に関連する毒性を低下させる。

Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、非刺激Ｔ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はこれらの任意の部分は、培地に保存してもよい。本開示のＴ細胞培養培地は、細胞保存、細胞の遺伝子改変、細胞表現型、及び／又は細胞拡張のために最適化され得る。本開示のＴ細胞培養培地は、１種以上の抗生物質を含み得る。細胞培養培地に抗生物質を含めると、ヌクレオフェクションを介する遺伝子改変後のトランスフェクション効率及び／又は細胞収量が低下する可能性があるため、特定の抗生物質（又はその組み合わせ）とそれぞれの濃度は、ヌクレオフェクションを介する遺伝子改変後の最適のトランスフェクション効率及び／又は又は細胞収量のために改変してもよい。

本開示のＴ細胞培養培地は血清を含むことができ、さらに、血清組成及び濃度は最適な細胞結果のために変更さしてもよい。本開示のＴ細胞培養培地での使用が考えられるが、ＦＢＳ／ＦＣＳは異種タンパク質を導入する可能性があるため、Ｔ細胞の培養にはＦＢＳ／ＦＣＳよりもヒトＡＢ血清が好ましい。血清は、培養したＴ細胞組成物が投与される予定の被験体の血液から単離してもよく、従って本開示のＴ細胞培養培地は自己血清を含んでもよい。無血清培地又は血清代替物も、本開示のＴ細胞培養培地で使用することができる。本開示のＴ細胞培養培地及び方法の特定の実施態様において、無血清培地又は血清代替物は、培地に異種血清を補足するよりも利点があり、特に限定されるものではないが、より大きな生存活性を有する細胞、より高い効率ヌクレオフェクションを有し、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上を示し、より望ましい細胞表現型を示し、及び／又は拡張技術の追加によるより大きな／迅速な拡張を示す。

Ｔ細胞培養培地には、市販の細胞増殖培地が含まれ得る。例示的な市販の細胞増殖培地には、特に限定されるものではないが、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地、ＣＴＳＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞拡張ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶＴ細胞拡張培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞拡張培地、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、非刺激Ｔ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はこれらの任意の部分は、遺伝子改変のために調製することができる。遺伝子改変のためのＴ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、非刺激Ｔ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はこれらの任意の部分の調製には、所望のヌクレオフェクション緩衝液中での細胞洗浄及び／又は再懸濁が含まれ得る。凍結保存されたＴ細胞組成物を解凍し、ヌクレオフェクションによる遺伝子改変のために調製することができる。凍結保存された細胞は、標準的又は既知のプロトコールに従って解凍することができる。凍結保存された細胞の解凍と調製を最適化して、高い生存活性を有し、高効率でヌクレオフェクションされ、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上を示し、より望ましい細胞表現型を示し、及び／又は拡張技術の追加によるより大きく／迅速な拡張を示す細胞を得ることができる。例えば、解凍及び／又は調製プロセスでGrifols Albutein（２５％ヒトアルブミン）を使用することができる。

遺伝子改変Ｔ細胞
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、非刺激Ｔ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はこれらの任意の部分は、例えば電気穿孔法などのヌクレオフェクション方策を使用して遺伝子改変することができる。ヌクレオフェクションされる細胞の総数、ヌクレオフェクション反応の総容量、及び試料調製の正確なタイミングを最適化して、高い生存活性を有し、高効率でヌクレオフェクションされ、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上を示し、より望ましい細胞表現型を示し、及び／又は拡張技術の追加によるより大きく／迅速な拡張を示す細胞を得ることができる。

ヌクレオフェクション及び／又は電気穿孔は、例えばLonza Amaxa、MaxCyte PulseAgile、Harvard Apparatus BTX、及び／又はInvitrogen Neonを使用して実施ことができる。ヌクレオフェクションには、特に限定されるものではないが、プラスチックポリマー電極を含む非金属電極システムが好ましい場合がある。

ヌクレオフェクションによる遺伝子改変の前に、Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、非刺激Ｔ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、又はこれらの任意の部分をヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁することができる。本開示のヌクレオフェクション緩衝液には、市販のヌクレオフェクション緩衝液が含まれる。本開示のヌクレオフェクション緩衝液を最適化して、高い生存活性を有し、高効率でヌクレオフェクションされ、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上を示し、より望ましい細胞表現型を示し、及び／又は拡張技術の追加によるより大きく／迅速な拡張を示す細胞を得ることができる。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、特に限定されるものではないが、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、アマクサヌクレオフェクター（Amaxa Nucleofector）、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、及びこれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、高い生存活性を有し、高効率でヌクレオフェクションされ、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上を示し、より望ましい細胞表現型を示し、及び／又は拡張技術の追加によるより大きく／迅速な拡張を示す細胞を得るために、１種以上の補助因子を含有することができる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的なサイトカイン、ケモカイン、及びインターロイキンには、特に限定されるものではないが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロダイマー、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、塩、無機物、代謝産物、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な塩、無機物、及び代謝産物には、特に限定されるものではないが、ヘペス、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、ヌクレオフェクタープラスサプリメント（Nucleofector PLUS Supplement）、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、トリス／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８１、ポロキサマー４０７、ポリビニルピロリドン、ポップ３１３、クラウン－５、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な補助因子には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地、ＣＴＳＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞拡張ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶＴ細胞拡張培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞拡張培地、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路の阻害剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。例示的な阻害剤には、特に限定されるものではないが、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）（例えばＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫの阻害剤、又はこれらの任意の組み合わせの阻害剤が含まれる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、細胞送達を促進する方法、核送達又は輸送を促進する方法、核への核酸の促進輸送を増強する方法、エピ染色体（epi-chromosomal）核酸の分解を促進する方法、及び／又はＤＮＡ媒介性毒性を低下させる方法で、１種以上の核酸を改変又は安定化する試薬が含まれる。１つ以上の核酸を改変又は安定化する例示的な試薬には、特に限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を含むか又は含まない正味中性電荷のＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

トランスポゾン及びトランスポサーゼを含む転移試薬は、ヌクレオフェクション緩衝液（任意選択的に、ヌクレオフェクション反応バイアル又はキュベット内に含まれる）への細胞の添加の前、同時、又は後に、本開示のヌクレオフェクション反応物に添加してもよい。本開示のトランスポゾンは、プラスミドＤＮＡ、線状化プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、DOGGYBONE（商標）ＤＮＡ、ｍＲＮＡ鋳型、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ、タンパク質－核酸の組み合わせ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のトランスポゾンは、１つ以上のＴＴＡＡ部位、１つ以上の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、１つ以上の長い末端反復配列（ＬＴＲ）、１つ以上のインスレーター、１つ以上のプロモーター、１つ以上の完全長又は切断遺伝子、１つ以上のポリＡシグナル、１つ以上の自己切断２Ａペプチド切断部位、１つ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、１つ以上のエンハンサー、１つ以上の調節因子、１つ以上の複製開始点、及びこれらの任意の組み合わせを含み得る。

本開示のトランスポゾンは、１つ以上の完全長又は切断型遺伝子をコードする１つ以上の配列を含み得る。本開示のトランスポゾンによって導入された完全長及び／又は切断型遺伝子は、シグナルペプチド、センチリン、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、同時刺激ドメイン、キメラリガンド受容体／キメラ抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ－Ｔ）、カルチリン（センチリンを含むＣＡＲ－Ｔ）、受容体、リガンド、サイトカイン、薬剤耐性遺伝子、腫瘍リガンド、同種又は自己リガンド、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、蛍光タンパク質、ムテイン、又はこれらの任意の組み合わせの１つ以上をコードし得る。

本開示のトランスポゾンは、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示の補助因子、又はこれらの任意の組み合わせ中で調製することができる。

本開示のトランスポゾンは、臨床的安全性を最適化し及び／又は製造性を改善するように設計し得る。非限定的な例として本開示のトランスポゾンは、不必要な配列又は領域を除去し、及び／又は非抗生物質選択マーカーを含めることにより、臨床的安全性を最適化し、及び／又は製造性を改善するように設計することができる。本開示のトランスポゾンは、ＧＭＰグレードであってもなくてもよい。

本開示のトランスポサーゼ酵素は、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、タンパク質－核酸の組み合わせ、又はこれらの任意の組み合わせの１つ以上の配列によりコードされ得る。

本開示のトランスポサーゼ酵素は、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示の補助因子、又はこれらの任意の組み合わせ中で調製することができる。本開示のトランスポサーゼ酵素、又はこれらをコード化若しくは送達する配列／構築物は、ＧＭＰグレードであってもなくてもよい。

本開示のトランスポゾン及びトランスポサーゼ酵素は、任意の手段により細胞に送達され得る。

本開示の組成物及び方法は、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）による細胞への本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポサーゼの送達を含むが、送達のためのプラスミドの使用により、細胞の染色体ＤＮＡにトランスポゾン及び／又はトランスポサーゼを組み込むことが可能になり、これはトランスポサーゼ発現の継続につながる可能性がある。従って本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポサーゼ酵素は、ｍＲＮＡ又はタンパク質として細胞に送達されて、染色体組み込みの可能性を除去し得る。

本開示のトランスポゾン及びトランスポサーゼは、ヌクレオフェクション反応物へのトランスポゾン及び／又はトランスポサーゼの導入の前に、単独で又は互いに組み合わせて予備インキュベートすることができる。トランスポゾン及びトランスポサーゼのそれぞれの絶対量ならびに相対量、例えばトランスポゾンとトランスポサーゼの比を最適化することができる。

ヌクレオフェクション反応物の調製後、任意選択的に、バイアル又はキュベット内で、反応物をヌクレオフェクター装置に装填し、製造業者のプロトコールに従って電気パルスの送達のために活性化することができる。本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポサーゼ（又は本開示のトランスポゾン及び／又はトランスポサーゼをコードする配列）の細胞への送達に使用される電気パルス条件を最適化して、高い生存活性、高効率のヌクレオフェクション、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上、より望ましい細胞表現型、及び／又は拡張技術の追加によるより大きく／迅速な拡張を有する細胞を得ることができる。

本開示のヌクレオフェクション反応後、細胞を細胞培地に穏やかに加えることができる。例えばＴ細胞がヌクレオフェクション反応を受ける場合、Ｔ細胞をＴ細胞培地に添加してもよい。本開示のポストヌクレオフェクション後の細胞培地は、任意の１つ以上の市販の培地を含み得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）を最適化して、高い生存活性を有し、高効率でヌクレオフェクションされ、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上を示し、より望ましい細胞表現型を示し、及び／又は拡張技術の追加によるより大きく／迅速な拡張を示す細胞を得ることができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地、ＣＴＳＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞拡張ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶＴ細胞増殖培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞増殖培地、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、高い生存活性、ヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存活性、細胞表現型、及び／又は拡張技術の追加時のより大きく／迅速な拡張を高めるために、本開示の１種以上の補助因子を含み得る。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的なサイトカイン、ケモカイン、及びインターロイキンには、特に限定されるものではないが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロダイマー、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、塩、無機物、代謝産物、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な塩、無機物、及び代謝産物には、特に限定されるものではないが、ヘペス、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、ヌクレオフェクタープラスサプリメント（Nucleofector PLUS Supplement）、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、トリス／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８１、ポロキサマー４０７、ポリビニルピロリドン、ポップ３１３、クラウン－５、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地、ＣＴＳＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞拡張ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶＴ細胞増殖培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞増殖培地、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路、及びこれらの組み合わせの阻害剤が含まれる。例示的な阻害剤には、特に限定されるものではないが、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）（例えばＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫの阻害剤、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。例示的な補助因子には、特に限定されるものではないが、細胞送達を促進する方法、核送達又は輸送を促進する方法、核への核酸の促進輸送を増強する方法、エピ染色体核酸の分解を促進する方法、及び／又はＤＮＡ媒介性毒性を低下させる方法で、１つ以上の核酸を改変又は安定化する試薬が含まれる。１つ以上の核酸を改変又は安定化する例示的な試薬には、特に限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を含む又は含まない正味中性電荷のＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、室温で使用するか、又は例えば３２℃～３７℃（両端を含む）に予め温めておくことができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、本開示のトランスポゾン又はその一部の細胞生存活性及び／又は発現を維持又は増強する任意の温度に事前に温められてもよい。

本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、組織培養フラスコ又は皿、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ、バイオリアクター、又は細胞培養バッグ、又は任意の他の標準容器に含まれ得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培養物（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物を含む）は、静置されてもよく、又はこれらは混合（例えば、揺れ、渦巻き、又は振盪）されてもよい。

ヌクレオフェクション後の細胞培養物は、遺伝子改変細胞を含み得る。ヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物は、遺伝子改変されたＴ細胞を含んでもよい。本開示の遺伝子改変細胞は、一定期間休止するか、又は、例えばＴ細胞エキスパンダー（T Cell Expander）技術の追加により拡張のために刺激することができる。特定の実施態様において、本開示の遺伝子改変細胞は、一定期間休止されるか、又は、例えばＴ細胞エキスパンダー技術の追加により拡張のために直ちに刺激し得る。本開示の遺伝子改変細胞は、順応するのに十分な時間、転移が起きる時間、及び／又は正又は負の選択の時間を与えて、高い生存活性、高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上、望ましい細胞表現型、及び／又は拡張技術の追加時による大きく／迅速な拡張を有する細胞を得ることができる。本開示の遺伝子改変細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、又はそれ以上、休止することができる。特定の実施態様において、本開示の遺伝子改変細胞は、例えば一晩休止され得る。特定の態様において、一晩は約１２時間である。本開示の遺伝子改変細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、又はそれ以上休止ませることができる。

本開示の遺伝子改変細胞は、ヌクレオフェクション反応の後でエキスパンダー技術の追加前に選択され得る。遺伝子改変細胞の最適な選択のために、細胞をヌクレオフェクション後の細胞培地に少なくとも２～１４日間静置して、改変細胞の同定（例えば改変細胞の非改変細胞からの区別）を容易にすることができる。

本開示のトランスポゾンのヌクレオフェクションが成功すると、ヌクレオフェクションの２４時間後という早い時点で、本開示のＣＡＲ／カルチリン及び選択マーカーの発現が改変Ｔ細胞で検出可能になり得る。トランスポゾンのエピ染色体発現のため、選択マーカーの発現だけでは改変Ｔ細胞（トランスポゾンが正常に組み込まれた細胞）と非改変Ｔ細胞（トランスポゾンが正常に組み込まれなかった細胞）を区別できない場合がある。トランスポゾンのエピ染色体発現が選択マーカーによる改変細胞の検出をあいまいにする場合、ヌクレオフェクションされた細胞（改変細胞及び非改変細胞の両方）を一定期間（例えば２～１４日）休止ませて、細胞が発現を停止させるか又はすべてのエピ染色体トランスポゾン発現を失うことを可能にする。この延長された休止期間の後、選択マーカーの発現のために、改変されたＴ細胞のみが陽性のままのはずである。この延長された休止期間の長さは、各ヌクレオフェクション反応及び選択プロセスに対して最適化される。トランスポゾンのエピ染色体発現が選択マーカーによる改変細胞の検出をあいまいにする場合、この延長された休止期間なしで選択が実行される場合があるが、後の時点で追加の選択工程を含めることができる（例えば、拡張ステージ中又はその後）。

本開示の遺伝子改変細胞の選択は、任意の手段により実施することができる。本開示の方法の特定の実施態様において、本開示の遺伝子改変細胞の選択は、特定の選択マーカーを発現する細胞を単離することにより実施することができる。本開示の選択マーカーは、トランスポゾン内の１つ以上の配列によってコード化されていてもよい。本開示の選択マーカーは、転移の成功の結果として改変細胞によって発現され得る（すなわち、トランスポゾンの１つ以上の配列によりコードされない）。特定の実施態様において、本開示の遺伝子改変細胞は、ヌクレオフェクション後の細胞培地の標的化合物に対する耐性を付与する選択マーカーを含む。標的化合物は、例えば選択マーカーにより改変細胞に付与された耐性がなければ細胞死をもたらす抗生物質又は薬物を含んでもよい。例示的な選択マーカーには、特に限定されるものではないが、以下の遺伝子の１つ以上の野生型（ＷＴ）又は突然変異型が含まれる：ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、及びＮＫＸ２．２。例示的な選択マーカーには、特に限定されるものではないが、表面発現選択マーカー又は表面発現タグが含まれ、それぞれ抗体で被覆された磁気ビーズ技術又はカラム選択により標的化され得る。効率的なカラム選択、洗浄、及び溶出のために、タンパク質精製で使用されるような切断可能なタグを本開示の選択マーカーに追加してもよい。特定の実施態様において本開示の選択マーカーは、改変細胞（改変Ｔ細胞を含む）によって自然には発現されず、従って改変細胞の物理的単離（例えば、細胞選別技術による）に有用であり得る。改変細胞（改変Ｔ細胞を含む）によって自然には発現されない本開示の例示的な選択マーカーには、特に限定されるものではないが、ＣＤ２７１、ＣＤ１９、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＲＱＲ８、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３の完全長、変異型、又は切断型、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。

本開示の遺伝子改変細胞は、ヌクレオフェクション反応後に選択的に拡張され得る。特定の実施態様において、ＣＡＲ／カルチリンを含む改変Ｔ細胞は、ＣＡＲ／カルチリン刺激により選択的に拡張することができる。ＣＡＲ／カルチリンを含む改変Ｔ細胞は、標的で被覆された試薬（例えば、標的を発現する腫瘍株又は正常細胞株、又は標的で覆われたエキスパンダービーズ）との接触によって刺激され得る。あるいは、ＣＡＲ／カルチリンを含む改変Ｔ細胞は、放射線照射された腫瘍細胞、放射線照射された同種異系の正常細胞、放射線照射された自己ＰＢＭＣとの接触により刺激され得る。刺激に使用される標的発現細胞による本開示の細胞産物組成物の汚染を最小限に抑えるために、例えば、細胞産物組成物を被験体に直接投与できる場合、ＣＡＲ／カルチリン標的タンパク質で被覆されたエキスパンダービーズを使用して刺激を実施してもよい。ＣＡＲ／カルチリン刺激によるＣＡＲ／カルチリンを含む改変Ｔ細胞の選択的拡張は、改変Ｔ細胞が機能的に使い果たされないように最適化することができる。

本開示の選択された遺伝子改変細胞は、凍結保存されるか、一定期間休止されるか、又はセルエキスパンダー技術の追加による拡張のために刺激されてもよい。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、凍結保存されるか、一定期間休止されるか、又はセルエキスパンダー技術の追加により拡張のために直ちに刺激されてもよい。選択された遺伝子組み換え細胞がＴ細胞である場合、このＴ細胞はＴ細胞エキスパンダー技術の追加により増殖を刺激される。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、又はそれ以上、休止させることができる。特定の実施態様において、本開示の選択された遺伝子改変細胞は、例えば一晩休止させることができる。特定の態様において、一晩は約１２時間である。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間、又はそれ以上、休止させることができる。本開示の選択された遺伝子改変細胞は、任意の期間休止させて、より高い生存活性、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存活性の向上、望ましい細胞表現型、及び／又は拡張技術の追加時のより大きく／迅速な拡張を有する細胞をもたらすことができる。

選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞を含む）は、任意の標準的な凍結保存方法を使用して凍結保存することができ、これは、高い回復率、生存活性、表現型、及び/又は機能的能力を有するヒト細胞の保存及び/又は回収のために最適化することができる。本開示の凍結保存方法は、市販の凍結保存培地及び／又はプロトコールを含み得る。

選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変Ｔ細胞を含む）の転移効率は、任意の手段により評価することができる。例えば、エキスパンダー技術の適用前に、選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変Ｔ細胞を含む）によるトランスポゾンの発現を蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変Ｔ細胞を含む）の転移効率の決定は、トランスポゾンを発現する選択された細胞（例えばＣＡＲ）の割合を測定することを含み得る。あるいは又はさらに、Ｔ細胞の純度、トランスポゾン発現（ＣＡＲ発現など）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する細胞の脱顆粒及び／又は殺傷を媒介するＣＡＲの能力（トランスポゾンで送達される）、及び／又は選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変Ｔ細胞を含む）の表現型は、任意の手段によって評価することができる。

本開示の細胞産物組成物は、特定のリリース基準を満たすと、被験体への投与のためにリリースされ得る。例示的なリリース基準は、特に限定されるものではないが、細胞表面上で検出可能なレベルのＣＡＲを発現する改変、選択、及び／又は拡張Ｔ細胞の具体的な割合を含む。

ＣＡＲ発現Ｔ細胞の産生
本開示の遺伝子改変細胞（遺伝子改変Ｔ細胞を含む）は、エキスパンダー技術を使用して拡張させることができる。本開示のエキスパンダー技術は、市販のエキスパンダー技術を含んでもよい。本開示の例示的なエキスパンダー技術は、ＴＣＲを介した本開示の遺伝子改変Ｔ細胞の刺激を含む。本開示の遺伝子改変Ｔ細胞の刺激のためのすべての手段が企図されるが、ＴＣＲを介した本開示の遺伝子改変Ｔ細胞の刺激は好ましい方法であり、優れたレベルの殺傷能力を有する産物を生じる。

ＴＣＲを介して本開示の遺伝子改変Ｔ細胞を刺激するために、サーモエキスパンダーダイナビーズ（Thermo Expander DynaBeads）を、ビーズとＴ細胞の比３：１で使用することができる。エキスパンダービーズが生分解性でない場合、ビーズはエキスパンダー組成物から除去してもよい。例えばビーズは、約５日後にエキスパンダー組成物から除去してもよい。ＴＣＲを介して本開示の遺伝子改変Ｔ細胞を刺激するために、Miltenyi Ｔ細胞活性化／拡張試薬を使用してもよい。ＴＣＲを介して本開示の遺伝子改変Ｔ細胞を刺激するために、StemCell TechnologiesのImmunoCult Human CD3/CD28又はCD3/CD28/CD2 Ｔ細胞アクチベーター試薬を使用することができる。この技術は、可溶性四量体抗体複合体が一定期間後に分解し、プロセスから除去する必要がないため、好ましい場合がある。

人工リガンド提示細胞（ＡＰＣ）は、標的リガンドを同時発現するように工学作成することができ、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲを介して本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。人工ＡＰＣは、腫瘍細胞株（例えば、不死化骨髄性白血病株Ｋ５６２を含む）を含むか又はそれに由来してもよく、複数の同時刺激分子又は技術（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢＬ、ＣＤ６４、ｍｂＩＬ－２１、ｍｂＩＬ－１５、ＣＡＲ標的分子）を同時発現するように工学作成することができる。本開示の人工ＡＰＣを同時刺激分子と組み合わせる場合、条件を最適化して、望ましくない表現型及び機能的能力、すなわち最終分化エフェクターＴ細胞の生成又は出現を防ぐことができる。

放射線照射ＰＢＭＣ（自己又は同種異系）は、ＣＤ１９などのいくつかの標的リガンドを発現することができ、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲを介して本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。あるいは又はさらに、放射線照射された腫瘍細胞はいくつかの標的リガンドを発現し、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲを介して本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。

プレートに結合した及び／又は可溶性の抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、及び／又は抗ＣＤ２８刺激を使用して、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲを通して本開示の細胞又はＴ細胞を刺激することができる。

リガンド被覆ビーズは標的タンパク質を表示することができ、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲを介して本開示の細胞又はＴ細胞を刺激するために使用することができる。あるいは又はさらに、ＣＡＲ／カルチリン標的タンパク質で被覆されたエキスパンダービーズを使用して、本開示のＴＣＲ及び／又はＣＡＲを介して本開示の細胞又はＴ細胞を刺激することができる。

遺伝子改変Ｔ細胞上のＴＣＲ又はＣＡＲ／カルチリン及び表面発現ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及び／又は他のマーカーを介した本開示の細胞又はＴ細胞の刺激に向けられた拡張方法。

ヌクレオフェクションの直後からヌクレオフェクションの約２４時間後まで、拡張技術を本開示の細胞に適用することができる。拡張操作中に様々な細胞培地を使用することができるが、本開示の望ましいＴ細胞拡張培地は、例えばより高い生存活性、細胞表現型、全体の拡張、又はインビボでの持続、生着、及び／又はＣＡＲ媒介殺傷能力を有する細胞を与えることができる。本開示の細胞培地は、本開示の遺伝子改変細胞の拡張、表現型、及び機能を改善／増強するために最適化することができる。拡張したＴ細胞の好ましい表現型には、Ｔ幹細胞記憶、Ｔ中枢、及びＴエフェクター記憶細胞の混合物が含まれ得る。エキスパンダーダイナビーズは、主に中央記憶Ｔ細胞を生成する場合があり、クリニックでの優れたパフォーマンスにつながる可能性がある。

本開示の例示的なＴ細胞拡張培地は、部分的又は全体的に、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地、ＣＴＳＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞拡張ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶＴ細胞拡張培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦＴ細胞拡張培地、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のＴ細胞拡張培地は、１種以上の補助因子をさらに含み得る。本開示のＴ細胞拡張培地に含まれ得る補助因子は、生存活性、細胞表現型、全拡張を増強するか、又はインビボ持続性、生着、及び／又はＣＡＲ媒介殺傷能力を増強する。本開示のＴ細胞拡張培地に含まれ得る補助因子には、特に限定されるものではないが、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、及び／又はＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロダイマー、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。本開示のＴ細胞拡張培地に含まれ得る補助因子には、特に限定されるものではないが、塩、無機物、及び／又は代謝産物、例えばヘペス、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、ヌクレオフェクタープラスサプリメント（Nucleofector PLUS Supplement）、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、トリス／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８１、ポロキサマー４０７、ポリビニルピロリドン、ポップ３１３、クラウン－５、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。本開示のＴ細胞拡張培地に含まれ得る補助因子には、特に限定されるものではないが、細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路の阻害剤、例えばＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－ＫＢ、１型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）（例えばＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫの阻害剤、又はこれらの任意の組み合わせの阻害剤が含まれる。

本開示のＴ細胞拡張培地に含まれ得る補助因子には、特に限定されるものではないが、細胞送達を促進する方法、核送達又は輸送を促進する方法、核への核酸の促進輸送を増強する方法、エピ染色体核酸の分解を促進する方法、及び／又はＤＮＡ媒介性毒性を低下させる方法で、核酸を改変又は安定化する試薬、例えばｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を含む又は含まない正味中性電荷のＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

本開示の遺伝子改変細胞は、選択可能な薬物又は化合物の使用により、拡張プロセス中に選択することができる。例えば特定の実施態様において、本開示のトランスポゾンが、培地に添加された薬物に対する耐性を遺伝子改変細胞に付与する選択マーカーをコードし得る場合、選択は拡張工程中に行われ、選択が起きるのに約１～１４日間の培養を必要とする場合がある。本開示のトランスポゾンによりコードされる選択マーカーとして使用できる薬物耐性遺伝子の例には、特に限定されるものではないが、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＮＫＸ２．２遺伝子、又はこれらの任意の組み合わせの野生型（ＷＴ）又は変異体型が含まれる。選択マーカーが耐性を付与する可能性のある培地に添加できる対応する薬物又は化合物の例には、特に限定されるものではないが、Ｇ４１８、ピューロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、メトトレキサート、メファラン、テモゾロミド、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ベンダムスチン、フルダラビン、アレディア（パミドロネート二ナトリウム）、ベセナム（カルムスチン）、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、カームブリス（カルムスチン）、カルムスチン、クラフェン（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロザキサタム）、ダラツムマブ、ダルザレックス（ダラツムマブ）、ドキシル（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシンリポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エロツズマブ、エンプリシチ（エロツズマブ）、エバセト（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、ファリダク（パノビノスタット）、クエン酸イキサゾミブ、カイプロリス（カーフィルゾミブ）、レナリドマイド、リポドックス（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、モゾビル（プレリキサフォア）、ネオサール（シクロホスファミド）、ニンラーロ（クエン酸イキサゾミブ）、パミドロネート二ナトリウム、パノビノスタット、プレリキサフォア、ポマリドマイド、ポマリスト（ポマリドマイド）、レブリミド（レナリドマイド）、シノビル（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）、又はこれらの任意の組み合わせがある。

本開示のＴ細胞拡張プロセスは、ＷＡＶＥバイオリアクター中の細胞培養バッグ、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ、又は任意の他の適切な容器及び／又は反応器中で行うことができる。

本開示の細胞又はＴ細胞培養物は、安定した状態に維持され、揺らされ、渦巻かれ、又は振盪され得る。

本開示の細胞又はＴ細胞拡張プロセスは、特定の条件、特に限定されるものではないが、培養期間、細胞濃度、Ｔ細胞培地の添加／除去のスケジュール、細胞サイズ、総細胞数、細胞表現型、細胞集団の純度、成長する細胞集団における遺伝子改変細胞の割合、補助物質の使用と組成、エキスパンダー技術の追加／除去、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

本開示の細胞又はＴ細胞拡張プロセスは、生じる拡張された細胞集団の配合の前に、所定のエンドポイントまで継続し得る。例えば、本開示の細胞又はＴ細胞拡張プロセスは、所定の時間（少なくとも、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間；少なくとも１、２、３、４、５、６か月間、又は少なくとも１年間）継続し得る。本開示の細胞又はＴ細胞拡張プロセスは、生じる培養物が所定の全体的細胞密度：１、１０、１００、１０００、１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰細胞／容量（μｌ、ｍｌ、Ｌ）、又はその間の任意の密度）に達するまで継続し得る。本開示の細胞又はＴ細胞拡張プロセスは、生じる培養物の遺伝子改変細胞が、本開示のトランスポゾンの所定レベルの発現を示すまで継続し得る：発現の閾値レベル（生じる遺伝子改変細胞が臨床的に有効であることを示す発現の最小、最大、又は平均レベル）の１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はその間の任意の割合。本開示の細胞又はＴ細胞拡張プロセスは、生じる培養物の遺伝子改変細胞と非改変細胞との比率が所定の閾値に到達するまで継続し得る：少なくとも１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、又はその間の任意の比率。

投与前のＣＡＲ発現Ｔ細胞の品質管理分析
遺伝子改変細胞の割合は、本開示の拡張プロセス中又は後に評価され得る。本開示の遺伝子改変細胞によるトランスポゾンの細胞性発現は、蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）によって測定され得る。例えばＦＡＣＳは、本開示のＣＡＲを発現する細胞又はＴ細胞の割合を決定するために使用され得る。あるいは又はさらに、遺伝子改変細胞又はＴ細胞の純度、本開示の遺伝子改変細胞又はＴ細胞によって発現されるＣＡＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒及び／又は殺傷を媒介するＣＡＲの能力、及び／又はＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型を評価することができる。

被験体への投与を目的とする本開示の組成物は、組成物が医薬品としての配合に及び／又は被験体への投与に安全かつ有効であることを示す１つ以上の「リリース基準」を満たす必要がある場合がある。リリース基準は、本開示の組成物（例えば、本開示のＴ細胞生成物）が、その細胞表面に本開示のＣＡＲの検出可能なレベルを発現するＴ細胞の特定の割合を含むという要件を含み得る。

拡張プロセスは、特定の基準が満たされる（例えば、細胞の特定の総数に到達し、記憶細胞の特定の集団に到達し、特定のサイズの集団に到達する）まで継続すべきである。

特定の基準シグナルは、拡張プロセスが終了すべきポイントを通知する。例えば、細胞が３００ｆＬの細胞サイズに達したら（又は、細胞が死に始めるこの閾値を超えるサイズに達したら）、細胞を配合、再活性化、又は凍結保存する必要がある。細胞集団がいったん３００ｆＬ未満の平均細胞サイズに達した時にすぐに凍結保存すると、凍結保存前に細胞がまだ完全に休止状態になっていないため、解凍及び培養時に細胞回収率が向上する場合がある（完全休止サイズは約１８０ｆＬである）。拡張の前に、本開示のＴ細胞は約１８０ｆＬの細胞サイズを有し得るが、拡張後３日目にこれらの細胞サイズを約９００ｆＬまで４倍を超えて多くし得る。次の６～１２日間で、Ｔ細胞の集団はゆっくり細胞サイズを減少させて１８０ｆＬで完全に休止する。

製剤用の細胞集団を調製するためのプロセスは、特に限定されるものではないが、細胞集団の細胞の濃縮、細胞の洗浄、及び／又は薬剤耐性若しくは特定の表面発現マーカーに対する磁気ビーズ選別による細胞のさらなる選択の工程を含み得る。製剤化のために細胞集団を調製するプロセスは、最終製品の安全性と純度を確保するための選別工程をさらに含んでもよい。例えば、患者の腫瘍細胞を使用して、本開示の遺伝子改変Ｔ細胞を刺激した場合、又は製剤化のために調製されている本開示の遺伝子改変Ｔ細胞を刺激するために遺伝子改変した場合、患者の腫瘍細胞が最終製品に含まれないことが重要である。

ＣＡＲ発現細胞の投与と保存
本開示の医薬製剤は、注入、凍結保存、及び／又は保存のためにバッグに分配されてもよい。

本開示の医薬製剤は、標準的なプロトコール、及び任意選択的に注入可能な凍結保存培地を使用して凍結保存することができる。例えば、凍結に関連する毒性を減らすために、ＤＭＳＯを含まない凍結保存剤（例えばCryoSOfree（登録商標）ＤＭＳＯフリー凍結保存培地）を使用してもよい。本開示の凍結保存された医薬製剤は、後日、患者への注入のために保存されてもよい。効果的な治療は、本開示の医薬製剤の複数回の投与が必要となる場合があり、従って医薬製剤は、凍結保存できるが個別用量の解凍のために分けられた事前分注「用量」に包装できる。

本開示の医薬製剤は、室温で保存することができる。効果的な治療には、本開示の医薬製剤の複数回の投与が必要となる場合があり、従って、医薬製剤は、個別の用量の投与のために一緒に保存されるが分離された事前に分注された「用量」で包装されてもよい。

本開示の医薬製剤は、例えば、症状の寛解と再発後の将来の日に投与を必要とする可能性がある同種療法の場合、同じ患者への追加の用量の生成のための後続の再拡張及び／又は選択のために保管され得る。

養子細胞療法としての改変細胞の注入
本開示は、それを必要とする被験体への投与のための改変免疫細胞及びＨＳＣを提供する。本開示の改変された細胞は、室温及び体温を含む任意の温度での保存のために配合することができる。本開示の改変細胞は、凍結保存及びその後の解凍のために配合することができる。本開示の改変細胞は、無菌包装から、被験体に直接投与するために医薬的に許容し得る担体に配合することができる。本開示の改変細胞は、最小レベルの細胞機能及びＣＡＲ／カルチリン発現を確保するために、細胞生存活性及び／又はＣＡＲ／カルチリン発現レベルの指標を用いて、医薬的に許容し得る担体に配合することができる。本開示の改変細胞は、さらなる拡張を阻害し、及び／又は細胞死を防ぐために、１つ以上の試薬を用いて、処方された密度で医薬的に許容し得る担体に配合することができる。

実施例１
piggyBacの発現と機能はｉＣ９安全スイッチを人間のｐａｎＴ細胞に組み込んだ
ヒトｐａｎＴ細胞は、４つのpiggyBacトランスポゾンのうちの１つと共にＡｍａｘａ４Ｄヌクレオフェクターを使用してヌクレオフェクションされた。「モック」条件を受けた改変Ｔ細胞は、空のpiggyBacトランスポゾンでヌクレオフェクションされた。改変Ｔ細胞は、治療薬（カルチリンをコードする配列）のみを含むpiggyBacトランスポサーゼ、又は組み込みｉＣ９配列と治療薬（カルチリンをコードする配列）とを含むpiggyBacトランスポサーゼのいずれかを受け取った。

図１は、リガンド結合領域、リンカー、及び切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含むｉＣ９安全スイッチの概略図を提供する。詳しくは、ｉＣ９ポリペプチドは、３６位にフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）置換（Ｆ３６Ｖ）を含むＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域を含む。ｉＣ９ポリペプチドのＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号４５）を含むアミノ酸配列によりコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号４６）を含む核酸配列によりコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域は、GGGGS（配列番号４７）を含むアミノ酸によりコードされ、及びGGAGGAGGAGGATCC（配列番号４８）を含む核酸配列によりコードされる。ｉＣ９ポリペプチドのリンカー領域をコードする核酸配列は、GFGDVGALESLRGNADLAYISLMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCNFLRKKLFFKTS（配列番号４９）を含むアミノ酸によりコードされる。ＩＣ９ポリペプチドのリンカー領域をコードする核酸配列は、TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号５０）を含む核酸配列によりコードされる。

ｉＣ９安全スイッチを試験するために、４つの改変Ｔ細胞のそれぞれを、０、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１０００ｎＭのＡＰ１９０３（ＡＰ１９０３の誘導剤）を用いて２４時間インキュベートした。アポトーシスを受けている細胞のマーカーとして、蛍光インターカレーターである７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を使用したフローサイトメトリーにより、生存活性を評価した。

細胞の生存活性を１２日目に評価した（図２を参照）。データは、ｉＣ９構築物を含む細胞の誘導剤の濃度が増加すると、細胞集団が右下から左上に移動することを示している；ただし、この効果は、ｉＣ９構築物を欠く細胞（カルチリンのみを受けたもの）では観察されず、細胞は、誘導剤の濃度に関係なく、これら２つの領域に均等に分布している。さらに、細胞の生存活性を１９日目に評価した（図３を参照）。データは、図２（ヌクレオフェクション後１２日目）と同じ傾向を示している；ただし、左上の象限への集団の移動は、この後の時点（ヌクレオフェクション後１９日目）でより顕著である。

集計結果の定量化を実施して、図４に示すが、１２日目（図２と左のグラフ）又は１９日目（図３と右のグラフ）の各改変された細胞型の、ｉＣ９スイッチの誘導剤（ＡＰ１９０３）の濃度の関数として、細胞生存活性の割合に対するｉＣ９安全スイッチの顕著な影響を示している。ｉＣ９安全スイッチの存在は、１２日目までにかなりの数の細胞でアポトーシスを誘導し、１９日目までにその効果はさらに劇的になる。

この試験の結果は、ＡＰ１９０３が試験の最低濃度（０．１ｎＭ）でさえアポトーシスを誘導するため、ｉＣ９安全スイッチは誘導剤（例えばＡＰ１９０３）との接触時に、活性細胞を除去するのに非常に効果的であることを示す。さらにｉＣ９安全スイッチは、３シストロン性ベクターの一部として機能的に発現される場合がある。

実施例２
ｃ－ｋｉｔ（ＣＤ１１７）及びプロミニン－１（ＣＤ１３３）を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞による造血細胞の枯渇
ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞が特異的に活性化され、ＨＳＣの表面に抗原的に発現されることが知られているマーカーであるヒトｃ－ｋｉｔ（ＣＤ１１７）又はプロミニン－１（ＣＤ１３３）を有する造血細胞を枯渇させる能力を証明する試験を行った。ＣＡＲ構築物のパネルからリード候補を選択するために、ヒト末梢血から単離されたＣＤ３／ＣＤ２８刺激ｐａｎＴ細胞を、ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３に対するＣＡＲ候補のそれぞれをコードするｍＲＮＡを用いてまず電気穿孔した（図５）。ＣＡＲ表面発現のレベルは、フローサイトメトリーによりトランスフェクトされたＴ細胞で決定された（図６Ａ）。次に、ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＣＡＲ－Ｔ細胞を、ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３のいずれかを発現するマウス又はヒト細胞株（ＥＭＬ－Ｃ１及びＴＦ－１）、並びにヒト初代ＢＭ細胞と同時培養することにより、インビトロ機能アッセイを実施した。リード抗ｃ－ｋｉｔ及び抗ＣＤ１３３ＣＡＲ候補は、表面での発現レベルと、ＣＤ１０７ａ発現による脱顆粒を介するＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的活性化から同定された（図６Ｂ及びＣ）。さらに、ＣＡＲ－Ｔ殺傷能力を評価するためにＣＡＲ－Ｔ細胞とヒト骨髄を２日間にわたって同時培養した後、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＣＤ１３３細胞表面抗原のフローサイトメトリー分析を行い、造血コロニー（ＣＦＵ）の生成のために、ヒト増殖因子（MethoCult（商標）、Ｈ４４３４）を補足したメチルセルロース培養液に細胞を１２日間にわたって播種した。６つの抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞候補のうち３つを用いて培養後に、ＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋細胞の比率の低下が見られたが、７つの抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ候補のうち３つについてＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞の低下が観察された（図６Ｄ）。ＣＦＵ機能アッセイは、８つの抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞候補のうち７つによる骨髄中の造血前駆細胞の効果的な枯渇を示した（図６Ｅ）。従って、これらのデータは、ＢＭにおける内因性ＨＳＣの枯渇のための最小毒性移植処方に対する我々の新しいアプローチを支持し、移植された同種異系又は遺伝子修正された幹細胞による置換を可能にする。

ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３（図５）のいずれかに対して向けられた同じＣＡＲカセットが、３シストロン性piggyBacトランスポゾンベクター（図７）に、ＤＨＦＲ遺伝子（メトトレキサートでエクスビボ処理後の転移Ｔ細胞の選択に使用される）及びｉＣ９遺伝子（ＡＰ１９０３の投与後でドナーＨＳＣの移植前にインビボでＣＡＲ－Ｔ細胞のクリアランスを可能にする）とともに挿入される。

ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３（図５）のいずれかに向けられた選択されたＣＡＲ候補のそれぞれをコードするpiggyBacトランスポゾン（図７）を、super piggyBac（ＳＰＢ）トランスポサーゼをコードするｍＲＮＡコードとともに、各ｐＤＮＡの電気穿孔により、ヒト末梢血から、単離されたｐａｎＴ細胞に導入した。次にＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ２８に対する抗体を使用して、細胞表面抗原についてフローサイトメトリーにより、採取した細胞の表現型を決定した（図８）。この分析は、ＣＤ４５ＲＡとＣＤ６２Ｌの同時発現（６８．７～８８．７％）に従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分が幹細胞記憶（ＳＣＭ）表現型であることを示した。ほとんどのＣＤ８＋Ｔ細胞は、骨髄への細胞のホーミングを媒介することが知られているケモカインＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ－１の受容体であるＣＸＣＲ４（７３．１～９３．６％）も発現した。

次にＣＡＲ－Ｔ殺傷能力を評価するために、上記のpiggyBac転移ＣＡＲ－Ｔ細胞をヒト骨髄（ＨｕＢＭ）細胞又はサル（アカゲザル）骨髄（ＭｏＢＭ）細胞と２日間同時培養し、ヒト増殖因子（MethoCult（商標）、Ｈ４４３４）を補足したメチルセルロース培養物に細胞を播種し、１２日間にわたる造血コロニー（ＣＦＵ）の生成について、インビトロ機能アッセイを実施した。ＣＦＵ機能アッセイは、８つの抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞候補のうち３つにより、骨髄中のヒト造血前駆細胞の効果的な枯渇を示すが（図９Ａ）、８つの抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞候補のうち４つについて、サル骨髄前駆細胞の枯渇が観察される（図９Ｂ）ことを示した。

ｃ－ｋｉｔ又はＣＤ１３３に向けられた選択されたpiggyBac転移ＣＡＲ－Ｔ細胞に関するさらなる試験は、これらをＧ－ＣＳＦ動員末梢血（ｍＰＢ）細胞から単離されたＣＤ３４＋細胞との同時培養し、次にpiggyBacベクター（図１）中のｉＣ９に起因するＣＡＲ－Ｔ細胞の除去のためにＡＰ１９０３で処理し、次に放射線照射したＭＳ－５骨髄間質細胞を連続希釈で培養することにより、行った。これらの長期培養物（ＬＴＣ）は、培養中に経時的に原始性が上昇する造血細胞サブセットの形成を評価する敷石状領域形成細胞（ＣＡＦＣ）の有無について評価された。播種後２週間及び５週間に、Ｌ－Ｃａｌｃソフトウェア（Stem Cell Technologies）を使用した限界希釈分析により、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を有するＣＡＦＣ頻度と数を決定した。ＣＤ３４＋細胞と抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞の以前の同時培養は、ＬＴＣ（図１０Ａ）で２週間で生成されるＣＡＦＣの数を生存率１３％（図１０Ｂ）で大幅に枯渇させる効果を有し、一方、抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔとの同時培養では、ＣＡＦＣの枯渇がより穏やかで、生存率は４３％であった。５週間後の時点でのＣＡＦＣ頻度の評価では、１４％の生存率で抗ｃ－ｋｉｔＣＡＲ－Ｔ細胞から同様の枯渇レベルが示されたが、このＣＡＦＣサブセットは、２週間で早期に生成するＣＡＦＣと比較して、抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔ細胞（２２％の生存率）からのより大きな枯渇を示した（図１０Ｃ及びＤ）。抗ＣＤ１３３ＣＡＲ－Ｔによる長期増殖の可能性がある原始造血細胞のより選択的な枯渇は、原始ＨＳＣからの恒久的な生着を可能にし、一方、分化決定ＨＰＣを節約して、これが移植後のより迅速で一時的な血液学的回復を可能にすることにより、以後のＩＳＣ移植を受ける患者の臨床結果の改善の基礎となる（図３）。

参照による組み込み
相互参照された又は関連する特許又は特許出願を含む本明細書に引用されるすべての文書は、明示的に排除されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。文書の引用は、本明細書に開示又は請求された発明に関する先行技術であることを、単独で又は他の文献と組合せても、かかる発明を教示、示唆、又は開示することを認めるものではない。さらに、本文書内の用語の意味又は定義が参照により組み込まれた文書内の同じ用語の意味又は定義と矛盾する場合、この文書内でその用語に割り当てられた意味又は定義が優先するものとする。

その他の実施態様
本開示の特定の実施態様を例示し説明してきたが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、他のさまざまな変更及び修正を行うことは可能である。添付の特許請求の範囲には、本開示の範囲内にあるすべてのそのような変更及び修正が含まれる。

Claims

複数の免疫細胞を含む組成物の有効量を被験体に投与することを含む、被験体の少なくとも１種の標的細胞を除去する方法であって、複数の免疫細胞のそれぞれは、少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドにそれぞれ特異的に結合する１つ以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現し、標的リガンドへの１つ以上のＣＬＲの特異的結合は免疫細胞を活性化し、活性化された免疫細胞は標的細胞の死を誘発する上記方法。
前記複数の免疫細胞を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
以下を含む、被験体の免疫系を移植する方法：
（ａ）複数の免疫細胞を含む組成物の有効量を被験体に投与することを含み、ここで、複数の免疫細胞のそれぞれは、少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドにそれぞれ特異的に結合する１つ以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現し、ここで標的リガンドへの１つ以上のＣＬＲの特異的結合は免疫細胞を活性化し、活性化された免疫細胞は、標的細胞の死を誘発すること；
（ｂ）複数の免疫細胞を除去すること；及び
（ｃ）複数の治療用造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む組成物の有効量を被験体に投与すること。
前記標的細胞の死を誘発することが、前記標的細胞の細胞溶解を誘発することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の標的細胞が複数の標的細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の標的細胞又は複数の標的細胞が免疫細胞を含む、請求項５又は６に記載の方法。
前記免疫細胞がＴリンパ球（Ｔ細胞）である、請求項７に記載の方法。
前記Ｔ細胞がＣＤ４又はＣＤ８を発現する、請求項８に記載の方法。
前記Ｔ細胞がヘルパーＴ（Ｔ_H）細胞である、請求項８又は９に記載の方法。
前記ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）がＩ型ヘルパーＴ（Ｔ_H１）細胞である、請求項１０に記載の方法。
前記ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）が２型ヘルパーＴ（Ｔ_H２）細胞である、請求項１０に記載の方法。
前記ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）がＴヘルパー１７（Ｔ_H１７）細胞である、請求項１０に記載の方法。
前記Ｔ細胞が調節性Ｔ（Ｔ_REG）細胞である、請求項８又は９に記載の方法。
前記Ｔ細胞が誘導性調節性Ｔ（ｉＴ_REG）細胞又は天然型調節性Ｔ（ｎＴ_REG）細胞である、請求項１４に記載の方法。
前記Ｔ細胞が誘導性調節性Ｔ（ｉＴ_REG）細胞である、請求項１４に記載の方法。
前記Ｔ細胞が天然型調節性Ｔ（ｎＴ_REG）細胞である、請求項１４に記載の方法。
前記免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項８に記載の方法。
前記少なくとも１種の標的細胞又は前記複数の標的細胞がＨＳＣを含み、前記少なくとも１種の標的細胞又は前記複数の標的細胞が免疫細胞をさらに含み、前記被験体は、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物を拒絶するリスクがある、請求項８～１８のいずれか１項に記載の方法。
複数の免疫細胞を含む前記組成物がＴ細胞又はＮＫ細胞を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
複数の免疫細胞を含む前記組成物がＴ細胞及びＮＫ細胞を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
複数の免疫細胞を含む前記組成物が同種異系である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記同種組成物が健康なドナーに由来する、請求項２２に記載の方法。
複数の免疫細胞を含む前記組成物が自己由来である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が疾患又は障害を有し、自己由来組成物が、疾患又は障害の発症前に、疾患又は障害の寛解期間中に、又は疾患又は障害の治療後に、被験体から得られた生体試料に由来する、請求項２４に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の免疫細胞が遺伝子改変を含み、前記遺伝子改変がＴ細胞受容体又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの一部の免疫細胞が遺伝子改変を含み、前記遺伝子改変がＴ細胞受容体又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記部分が、前記複数の免疫細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意の割合を含む、請求項２７に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞が遺伝子改変を含み、前記遺伝子改変がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を低減又は阻害する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記ＭＨＣが、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、又はこれらの組み合わせからなるか又はこれらを含む、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
前記ＭＨＣがＭＨＣＩからなるか又はこれを含む、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
前記ＭＨＣがＭＨＣＩＩからなるか又はこれを含む、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝子改変が、１本鎖切断、２本鎖切断、配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項２６～３２のいずれか１項に記載の方法。
前記配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの組み合わせが、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、転写抑制因子、ＣｐＧ部位、又はこれらの任意の組合せをコードする配列を含む、請求項３３に記載の方法。
前記遺伝子改変がβ－２ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする配列を含み、前記遺伝子改変がＭＨＣＩの発現を低減又は阻害する、請求項２６～３４のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝子改変が、ＨＬＡ－ＤＲα、ＣＩＩＴＡ、又はこれらの組み合わせをコードする配列を含み、前記遺伝子改変がＭＨＣＩＩの発現を低減又は阻害する、請求項２６～３４のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝子改変が、α鎖（ＴＣＲα）、β鎖（ＴＣＲβ）、又はこれらの組み合わせをコードする配列を含み、前記遺伝子改変がＴＣＲの発現を低減又は阻害する、請求項２６～３６のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝子改変が、ＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む組成物によって導入される、請求項２６～３７のいずれか１項に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメインがガイドＲＮＡを含む、請求項３８に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、セントロメア、及びプロモーター因子１（Ｃｐｆ１）、又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から単離又は誘導された配列を含む、請求項３８に記載の方法。
前記Ｃａｓ９が、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）又は短くて触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄｓＣａｓ９）である、請求項４０に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離又は誘導された配列を含む、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、又はＣｌｏ０５１である、請求項４２に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインが共有結合又は非共有結合している、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインが融合タンパク質として共有結合している、請求項４４に記載の方法。
トランスポゾンが、ＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む組成物を含む、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞が、休止細胞、活性化細胞、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２６～４６のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞が活性化細胞を含む、請求項２６～４６のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞が休止細胞を含む、請求項２６～４６のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞が、休止ＣＡＲ－Ｔ細胞、活性化ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２６～４６のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞が活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含む、請求項２６～４６のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞が休止ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む、請求項２６～４６のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの少なくとも１種の免疫細胞が、それぞれ少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドに特異的に結合する２種以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの一部の免疫細胞が、それぞれ少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドに特異的に結合する２種以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
前記部分が、前記複数の免疫細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はこれらの間の任意の割合を含む、請求項５４に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞が、それぞれが少なくとも１種の標的細胞上の標的リガンドに特異的に結合する２種以上のキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）を発現する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
第１のＣＡＲが第１の標的リガンドに特異的に結合し、第２のＣＡＲが第２の標的リガンドに特異的に結合し、第１の標的リガンドと第２の標的リガンドは同一ではない、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の方法。
第１の標的リガンド及び第２の標的リガンドが相同ではない、請求項５７に記載の方法。
前記少なくとも１種の標的細胞又は前記複数の標的細胞がＨＳＣを含み、前記少なくとも１種の標的ＨＳＣ上の前記標的リガンドが、ｃ－ＫＩＴ／ＣＤ１１７、ＣＤ４５、ＣＤ３４、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０、ｃ－ｍｐｌ／ＣＤ１１０、ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＡＢＣＧ２／ＣＤ３３８、炭酸脱水酵素ＩＸ／ＣＡ９、ＣＤ１２３、及びＣＤ１５０の１つ以上を含む、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の標的細胞又は前記複数の標的細胞がＨＳＣを含み、前記少なくとも１種の標的細胞又は前記複数の標的細胞が免疫細胞をさらに含み、前記被験体が、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物を拒絶するリスクがある、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の標的細胞又は前記複数の標的細胞がＨＳＣを含み、前記少なくとも１種の標的細胞又は前記複数の標的細胞が免疫細胞をさらに含み、前記被験体は、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物を拒絶するリスクがある、請求項１～６０のいずれか１項に記載の方法。
前記標的免疫細胞上の標的リガンドが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγλ、ＣＤ５２、ＮＫ１．１、ＣＤ１６、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ９、ＣＤ１０３、及びＫＩＲの１つ以上を含む、請求項６０～６１のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上のＣＬＲのそれぞれが、以下：
（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、
（ｂ）膜貫通ドメイン、及び
（ｃ）少なくとも１種の同時刺激ドメインを含む内部ドメイン、
を含む、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６３］
前記リガンド認識領域が、タンパク質足場、センチリン、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ、免疫グロブリン、及び抗体模倣物の１つ以上を含む、請求項６３に記載の方法。
前記免疫グロブリンが抗体又はその断片である、請求項６３に記載の方法。
前記抗体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭアイソタイプである、請求項６４に記載の方法。
前記抗体断片が、相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖ＣＤＲ、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３、抗原結合断片（Ｆａｂ）、可変ドメイン（Ｆｖ）、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、完全重鎖、完全軽鎖、１つ以上の定常ドメイン、Ｆｃ（結晶化可能断片）、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項６４に記載の方法。
前記抗体模倣物が、アフィボディ、アフリリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、及びアビマー、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー、クニッツドメインペプチド、及びモノボディの１つ以上を含む、請求項６３に記載の方法。
前記ＣＬＲの少なくとも１種が２重特異性である、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
前記ＣＬＲの少なくとも１種が３重特異性である、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）の外部ドメインがシグナルペプチドをさらに含む、請求項６３～６９のいずれか１項に記載の方法。
前記シグナルペプチドが、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項７０に記載の方法。
（ａ）の外部ドメインが、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含む、請求項６３～７１のいずれか１項に記載の方法。
前記ヒンジが、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、及び／又はＣＤ４配列に由来する配列を含む、請求項７２に記載の方法。
前述貫通ドメインが、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＧＭ－ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含む、請求項６３～７３のいずれか１項に記載の方法。
前記内部ドメインがヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む、請求項６３～７４のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つの同時刺激ドメインが、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、ヒトＯＸ－４０細胞内セグメント、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項６３～７５のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１つの同時刺激ドメインが、ヒトＣＤ２８及び／又はヒト４－１ＢＢ同時刺激ドメインを含む、請求項６３～７６のいずれか１項に記載の方法。
前記４－１ＢＢ同時刺激ドメインが、膜貫通ドメインとＣＤ２８同時刺激ドメインとの間に位置する、請求項７７に記載の方法。
前記複数の免疫細胞を含む組成物の少なくとも１種の免疫細胞が、スプリットＣＬＲを含む、請求項６３～７８のいずれか１項に記載の方法。
前記スプリットＣＬＲが、少なくとも１種の免疫細胞中で同時に発現される場合、スプリットＣＬＲを発現しない免疫細胞又はＣＬＲを発現しない免疫細胞と比較して、免疫細胞の活性を上昇又は減少させる別個の細胞内ドメインを有する２つ以上のＣＬＲを含む、請求項７９に記載の方法。
前記同時発現が免疫細胞の活性を上昇させ、前記スプリットＣＬＲが以下を含む、請求項８０に記載の方法：
（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１次細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメイン、を含む第１のＣＬＲ、及び
（ｂ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２次細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメイン、を含む第２のＣＬＲ。
前記１次細胞内シグナル伝達ドメインがヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む、請求項８０に記載の方法。
前記２次細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、又はヒトＯＸ－４０細胞内セグメントを含む、請求項８１又は８２に記載の方法。
前記２次細胞内シグナル伝達ドメインがヒト４－１ＢＢ及びヒトＣＤ２８を含む、請求項８１又は８２に記載の方法。
前記同時発現が免疫細胞の活性を低下させ、前記スプリットＣＬＲが以下を含む、請求項８０に記載の方法：
（ａ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１次細胞内シグナル伝達ドメイン及び２次細胞内シグナル伝達ドメインを含む内部ドメイン、を含む第１のＣＬＲ、及び
（ｂ）リガンド認識領域を含む外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び阻害性細胞内シグナル伝達ドメインからなる内部ドメイン、を含む第２のＣＬＲ。
前記１次細胞内シグナル伝達ドメインがヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含み、前記２次細胞内シグナル伝達ドメインがヒト４－１ＢＢ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ４０、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＭｙＤ８８、又はヒトＯＸ－４０細胞内セグメントを含む、請求項８５に記載の方法。
前記１次細胞内シグナル伝達ドメインがヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含み、前記２次細胞内シグナル伝達ドメインがヒト４－１ＢＢ及びヒトＣＤ２８を含む、請求項８６に記載の方法。
前記阻害性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＩＴＩＭ、ＩＴＳＭ、ＹＶＫＭ、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ２、ＫＩＥＥＬＥ、及びＹ２６５に由来するシグナル伝達ドメインを含む、請求項８５～８７のいずれか１項に記載の方法。
前記第２のＣＬＲが非標的細胞上の標的リガンドに選択的に結合する、請求項８０～８８のいずれか１項に記載の方法。
１つ以上のＣＬＲが、１０^-9Ｍ以下、１０^-10Ｍ以下、１０^-11Ｍ以下、１０^-12Ｍ以下、１０^-13Ｍ以下、１０^-14Ｍ以下、１０^-15Ｍ以下のＫ_Dから選択される親和性でリガンドに結合する、請求項１～８９のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｋ_Dが表面プラズモン共鳴により決定される、請求項９０に記載の方法。
複数の免疫細胞を含む前記組成物が、少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１～９１のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体に動員組成物を投与することをさらに含む、請求項１～９２のいずれか１項に記載の方法。
それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む組成物の前に、前記動員組成物が投与される、請求項９３に記載の方法。
それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む組成物の前に、前記動員組成物が１～７日間（両端を含む）投与される、請求項９４に記載の方法。
前記動員組成物が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、プレリキサフォー、（plerixafor）、又はこれらの組み合わせを含む、請求項９３～９５のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体に事前調整組成物の有効量を投与して、それぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物の生着を促進するか、又はそれぞれが１つ以上のＣＬＲを発現する複数の免疫細胞を含む組成物による少なくとも１種の標的細胞の除去効率を促進することをさらに含む、請求項１～９６のいずれか１項に記載の方法。
前記事前調整組成物が免疫系を抑制する、請求項９７に記載の方法。
前記事前調整組成物が、自己免疫療法、抗拒絶反応薬、リンパ除去剤、骨髄除去剤、化学療法剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項９７又は９８に記載の方法。
前記リンパ除去剤がシクロホスファミド又はフルダラビンを含む、請求項９９に記載の方法。
前記骨髄除去剤が低線量の放射線又は局所放射線療法を含む、請求項９９に記載の方法。
前記化学療法剤が、ブスルファン、トレオスルファン、メルファラン、チオテパ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項９９に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞が、被験体への投与の前に事前照射される、請求項１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞を除去する工程が、複数の事前照射免疫細胞の有効量を被験体に投与し、それにより複数の前照射免疫細胞の増殖を防止又は生存期間を短縮することを含む、請求項１０３に記載の方法。
前記複数の免疫細胞のうちの各免疫細胞が、誘導性カスパーゼポリペプチド又は誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列を含む、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の方法。
前記誘導性カスパーゼポリペプチドが以下を含む、請求項１０５に記載の方法：
（ａ）リガンド結合領域、
（ｂ）リンカー、及び
（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチド。
前記誘導性カスパーゼポリペプチドが非ヒト配列を含まない、請求項１０６に記載の方法。
前記複数の免疫細胞を除去する工程が、誘導剤の有効量を被験体に投与してカスパーゼポリペプチドを誘導し、それにより免疫細胞の死を開始させることを含む、請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の方法。
それぞれが１つ以上のＣＬＲを含む複数の免疫細胞を含む前記組成物が誘導剤をさらに含む、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣが、誘導性カスパーゼポリペプチド又は誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列を含む、請求項３～１０９のいずれか１項に記載の方法。
前記誘導性カスパーゼポリペプチドが以下を含む、請求項１１０に記載の方法：
（ａ）リガンド結合領域、
（ｂ）リンカー、及び
（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチド。
前記誘導性カスパーゼポリペプチドが非ヒト配列を含まない、請求項１１１に記載の方法。
誘導剤を含む組成物を前記被験体に投与し、それにより複数の治療用ＨＳＣの死を開始させることをさらに含む、請求項１１２に記載の方法。
前記被験体がヒトである、請求項１～１１３のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が免疫系疾患又は障害を有するか、又は被験体が免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある、請求項１～１１４のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が自己免疫疾患又は障害を有する、請求項１～１１４のいずれか１項に記載の方法。
請求項１１６に記載の方法であって、前記自己免疫疾患又は障害が、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蓴麻疹、軸索及び神経性神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コガンズ症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円盤状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック症候群）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型自己免疫性多発性腺症候群、ＩＩ型自己免疫性多発性腺症候群、ＩＩＩ型自己免疫性多発性腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心嚢切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、純粋な赤血球形成不全、レイノーズ現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、脈管炎、水疱性皮膚炎、又は白斑である、上記方法。
前記被験体が免疫無防備状態である、請求項１～１１７のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が炎症性障害を有する、請求項１～１１７のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する、請求項１～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はこれらの前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する、請求項１～１１４のいずれか１項に記載の方法。
前記前駆細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１２１に記載の方法。
前記疾患又は障害が癌である、請求項１２０、１２１、又は１２２に記載の方法。
前記癌が、リンパ腫、白血病、骨髄腫、又は悪性免疫増殖性疾患である、請求項１２３に記載の方法。
前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＬＴ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、細網内皮症、網状赤血球症、細網症、ミクログリオーマ、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、又は結節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫である、請求項１２４に記載の方法。
前記白血病が、形質細胞白血病（ＰＣＬ）、急性赤血病及び赤白血病、急性赤血病性骨髄症、急性赤血球性白血病、ハイルマイヤー・シェーナー病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、肥満細胞白血病、汎骨髄症、骨髄線維症を伴う汎骨髄症（ＡＰＭＦ）、リンパ肉腫細胞白血病、急性期慢性骨髄性白血病、幹細胞白血病、加速期慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、真性赤血球増加症、急性前骨髄球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、攻撃性ＮＫ細胞白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性好中球性白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、又は慢性特発性骨髄線維症である、請求項１２４に記載の方法。
前記骨髄腫が、多発性骨髄腫、カーラー病、骨髄腫症、孤立性骨髄腫、形質細胞白血病、髄外形質細胞腫、悪性形質細胞腫瘍、又は形質細胞腫である、請求項１２４に記載の方法。
前記悪性免疫増殖性疾患がアルファ重鎖疾患又はガンマ重鎖疾患である、請求項１２４に記載の方法。
前記疾患又は障害が貧血である、請求項１２０、１２１、又は１２２に記載の方法。
前記貧血が、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、先天性溶血性貧血、再生不良性貧血、β－サラセミア、先天性赤血球形成不全、先天性赤血球異形成貧血、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、ファンコニー貧血、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性熱変形赤血球症、胎児ヘモグロビンの遺伝性持続、遺伝性口唇状赤血球症、ヘキソキナーゼ欠損症、高貧血、低色素性貧血、無効赤血球生成、大球性貧血、巨赤芽球性貧血、骨髄障害性貧血、神経有棘赤血球症、舞踏病有棘赤血球症、発作性夜間血色素尿症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、Ｒｈ欠損症候群、鎌状赤血球症、鉄芽球性貧血、口細胞性楕円赤血球症、サラセミア、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）欠損症、又は温式自己免疫性溶血性貧血である、請求項１２９に記載の方法。
前記疾患又は障害が凝固障害又は出血状態である、請求項１２０、１２１、又は１２２に記載の方法。
前記疾患又は障害が凝固障害である、請求項１３１に記載の方法。
前記凝固障害が、脱線維素症候群、プロテインＣ欠損症、プロテインＳ欠損症、第Ｖ因子ライデン、血小板増加症、血栓症、再発性血栓症、抗リン脂質抗体症候群、原発性抗リン脂質抗体症候群、又は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である、請求項１３２に記載の方法。
前記疾患又は障害が出血状態である、請求項１３１に記載の方法。
前記出血状態が、血小板減少症、血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォンビルブラント病（ｖＷＤ）、遺伝性フォンビルブラント病（ｖＷＤ）、ｖＷＤ１型、ｖＷＤ２型、ｖＷＤ３型、グランツマン血小板無力症、又はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）である、請求項１３４に記載の方法。
前記被験体が、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物により接触され得る２次標的細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する、請求項１～１１４のいずれか１項に記載の方法。
前記２次標的細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項１３６に記載の方法。
前記幹細胞が体性幹細胞である、請求項１３７に記載の方法。
前記幹細胞が、標的ＨＳＣ、間葉系幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞である、請求項１３８に記載の方法。
前記前駆細胞が骨芽細胞である、請求項１３７に記載の方法。
前記２次標的細胞が分化細胞である、請求項１３６に記載の方法。
前記分化細胞が、赤血球、白血球、単球、顆粒球、血小板、又は樹状細胞である、請求項１４１に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１種のＨＳＣが、骨芽細胞の活性を増強するリガンド、ペプチド、又はタンパク質を分泌するように改変される、請求項１３６、１３７、又は１４０に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣを含む組成物が、異常な骨芽細胞機能に関連する疾患又は障害を治療又は予防する、請求項１４３に記載の方法。
前記被験体が、異常な骨芽細胞機能に関連する疾患又は障害に対する１つ以上の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する、請求項１４４に記載の方法。
前記異常な骨芽細胞機能に関連する疾患又は障害が、ページェット病、低ホスファターゼ症、又は大理石骨病である、請求項１４４又は１４５に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の少なくとも１種のＨＳＣが、顆粒球の活性を増強するリガンド、ペプチド、又はタンパク質を分泌するように改変される、請求項１３６、１３７又は１４２の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣを含む組成物が、異常な顆粒球機能に関連する疾患又は障害を治療又は予防する、請求項１４７に記載の方法。
前記被験体が、異常な顆粒球機能に関連する疾患又は障害に対する１つ以上の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有する、請求項１４８に記載の方法。
前記異常な顆粒球機能に関連する疾患又は障害が慢性肉芽腫性疾患である、請求項１４８又は１４９に記載の方法。
前記免疫系疾患又は障害が医学的介入により誘発される、請求項１～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が、過去、現在、又は将来の医学的介入により、免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある、請求項１～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫系疾患又は障害が感染症により誘発される、請求項１～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が、過去、現在、又は潜在的な感染症により、免疫系疾患又は障害を発症するリスクがある、請求項１～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の免疫細胞を含む組成物の投与が全身性である、請求項１～１５４のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物が静脈内経路を介して投与される、請求項１５５に記載の方法。
前記複数の免疫細胞を含む組成物の投与が局所的である、請求項１～１５４のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物が、骨内、脊髄内、又は脳内注入を介して投与される、請求項１５７に記載の方法。
複数の治療用ＨＳＣを含む前記組成物が、少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体をさらに含む、請求項３～１５８のいずれか１項に記載の方法。
複数の治療用ＨＳＣを含む前記組成物が誘導剤をさらに含む、請求項１１１～１５９のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣのうちの少なくとも１種のＨＳＣが遺伝子改変を含む、請求項３～１６０のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣの一部のＨＳＣが遺伝子改変を含む、請求項３～１６０のいずれか１項に記載の方法。
前記部分が、前記複数の治療用ＨＳＣの少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の割合を含む、請求項１６２に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣの各ＨＳＣが遺伝子改変を含む、請求項３～１６０のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝子改変が、１本鎖切断、２本鎖切断、配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項１６１～１６４のいずれか１項に記載の方法。
前記配列欠失、配列挿入、配列置換、又はこれらの組み合わせが、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、転写抑制因子、ＣｐＧ部位、又はこれらの組み合わせをコードする配列を含む、請求項１６７に記載の方法。
前記前記遺伝子改変が、ＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む組成物によって導入される、請求項１６１～１６６のいずれか１項に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメインがガイドＲＮＡを含む、請求項１６７に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、セントロメア、及びプロモーター因子１（Ｃｐｆ１）、又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から単離又は誘導された配列を含む、請求項１６７に記載の方法。ＺＦＮ）。
前記Ｃａｓ９が、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）又は短く触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄｓＣａｓ９）である、請求項１６９に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離又は誘導された配列を含む、請求項１６７～１７０のいずれか１項に記載の方法。
前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼが、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、又はＣｌｏ０５１である、請求項１７１に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインが共有結合又は非共有結合している、請求項１６７～１７２のいずれか１項に記載の方法。
前記ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインが融合タンパク質として共有結合している、請求項１７３に記載の方法。
前記遺伝子改変が、相同的組換えの誘導、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の挿入、又は転移事象によって導入される、請求項１６１～１７４のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝子改変が配列の挿入をもたらす、請求項１７５に記載の方法。
前記転移事象が機能的及び／又は治療的トランス遺伝子の挿入をもたらす、請求項１７５又は１７６に記載の方法。
トランスポゾンが機能的及び／又は治療的トランス遺伝子を含み、トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである、請求項１７５～１７７のいずれか１項に記載の方法。
前記トランスポゾンを含むＨＳＣがpiggyBac（ＰＢ）トランスポサーゼをさらに含む、請求項１７８に記載の方法。
前記piggyBacトランスポサーゼが、配列番号１を含むアミノ酸配列を含む、請求項１７９に記載の方法。
前記piggyBacトランスポサーゼが高活動性変種であり、前記高活動性変種が、配列番号１の３０位、１６５位、２８２位、及び５３８位の１つ以上にアミノ酸置換を含む、請求項１７９又は１８０に記載の方法。
配列番号１の３０位のアミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）置換（Ｉ３０Ｖ）である、請求項１８１に記載の方法。
配列番号１の１６５位のアミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）置換（Ｇ１６５Ｓ）である、請求項１８１に記載の方法。
配列番号１の２８２位のアミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）置換（Ｍ２８２Ｖ）である、請求項１８１に記載の方法。
配列番号１の５３８位のアミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）のリジン（Ｋ）置換（Ｎ５３８Ｋ）である、請求項１８１に記載の方法。
前記トランスポサーゼがSuper piggyBac（ＳＰＢ）トランスポサーゼである、請求項１８０～１８５のいずれか１項に記載の方法。
前記Super piggyBac（ＳＰＢ）トランスポサーゼが、配列番号２を含むアミノ酸配列を含む、請求項１８６に記載の組成物。
前記被験体が免疫疾患又は障害を有し、前記複数の治療用ＨＳＣが免疫疾患又は障害の徴候又は症状を改善する、請求項１６１～１８７のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が、血球、血液中を循環する免疫細胞、骨髄細胞、又はその前駆細胞に現れる疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有し、前記複数の治療用ＨＳＣが前記疾患又は障害の徴候又は症状を改善する、請求項１６１～１８７のいずれか１項に記載の方法。
前記疾患又は障害が凝固障害である、請求項１８９に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣが、凝固障害の徴候又は症状を改善するタンパク質を分泌するように改変されている、請求項１９０に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣが、１つ以上の凝固因子を分泌するように改変されている、請求項１９１に記載の方法。
前記被験体がグリコーゲン貯蔵疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有し、複数の治療用ＨＳＣが前記グリコーゲン貯蔵疾患又は障害の徴候又は症状を改善する、請求項１６１～１８７のいずれか１項に記載の方法。
前記グリコーゲン貯蔵疾患又は障害が、グリコーゲン貯蔵疾患（ＧＳＤ）０型、ＧＳＤＩ型、ＧＳＤＩＩ型、ＧＳＤＩＩＩ型、ＧＳＤＩＶ型、ＧＳＤＶ型、ＧＳＤＶＩ型、ＧＳＤＶＩＩ型、ＧＳＤＩＸ型、ＧＳＤＸ型、ＧＳＤＸＩ型、ＧＳＤＸＩＩ型、又はＧＳＤＸＩＩＩ型である、請求項１９３に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣが、グリコーゲンシンターゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性アルファ－グルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、グリコーゲン分岐酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋肉ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ２、アルドラーゼＡ、又はβ－エノラーゼの１つ以上を分泌するように改変されており、複数の治療用ＨＳＣが、それぞれＧＳＤ０型、ＧＳＤＩ型、ＧＳＤＩＩ型、ＧＳＤＩＩＩ型、ＧＳＤＩＶ型、ＧＳＤＶ型、ＧＳＤＶＩ型、ＧＳＤＶＩＩ型、ＧＳＤＩＸ型、ＧＳＤＸ型、ＧＳＤＸＩ型、ＧＳＤＸＩＩ型、又はＧＳＤＸＩＩＩ型の１つ以上を分泌するように改変されている、請求項１９３又は１９４に記載の方法。
前記被験体が前記免疫系疾患又は障害の遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有し、複数の治療用ＨＳＣの少なくとも１種のＨＳＣ、ＨＳＣの一部、又は各ＨＳＣが遺伝子改変を有し、複数の治療用ＨＳＣの少なくとも１種のＨＳＣ、ＨＳＣの一部、又は各ＨＳＣが遺伝的又はエピジェネティックマーカーを有さない、請求項１６１～１８７のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝的改変が遺伝的又はエピジェネティックマーカーを除去した、請求項１９６に記載の方法。
前記改変されたＨＳＣが自己由来である、請求項１９６又は１９７に記載の方法。
前記改変されたＨＳＣが同種異系である、請求項１９６又は１９７に記載の方法。
前記方法が、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発症又は進行を治療又は予防する、請求項３～１９９のいずれか１項に記載の方法。
前記治療することが、ＧｖＨＤの徴候又は症状を軽減することを含む、請求項２００に記載の方法。
前記ＧｖＨＤが急性ＧｖＨＤである、請求項２００又は２０１に記載の方法。
前記ＧｖＨＤが慢性ＧｖＨＤである、請求項２００又は２０１に記載の方法。
前記ＧｖＨＤの徴候又は症状が、皮膚発疹、皮膚の水ぶくれ、吐き気、嘔吐、腹部痙攣、下痢、食欲不振、黄疸、口渇、のどの乾燥、過度の口の乾燥、過度の喉の乾燥、口又は喉の潰瘍、気管支組織の乾燥、内皮組織の乾燥、表面組織の乾燥、皮膚の斑点の消失、皮膚の変色、皮膚の瘢痕、皮膚の瘢痕と同時の関節可動性の低下、皮膚の損傷と同時の脱毛、ドライアイに至る涙の生成の喪失、又はその任意の組み合わせを含む、請求項２００～２０３のいずれか１項に記載の方法。
前記被験体が移植受容者である、請求項２００～２０４のいずれか１項に記載の方法。
前記複数の治療用ＨＳＣを含む組成物が、移植の実施前に被験体に投与され、複数の治療用ＨＳＣ及び移植片が同じドナーから単離又は誘導される、請求項２０５に記載の方法。
移植片への前記被験体の免疫系の寛容化に十分な、複数の治療用ＨＳＣを含む組成物の投与後の期間をさらに含む、請求項２０６に記載の方法。
前記移植片が、細胞、組織、組織移植片、臓器、臓器移植片、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２００～２０７のいずれか１項に記載の方法。
前記臓器が固形臓器である、請求項２０８に記載の方法。