CN110642852B - 一种具有线粒体靶向的有机aie光敏探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有线粒体靶向的有机aie光敏探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针及其制备方法和应用，属于抗肿瘤药物技术领域。具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针，以下式I所示的结构。所述有机AIE光敏探针通过触发线粒体ROS氧化应激，诱导产生了大量的钙网蛋白转位，有效的提高了肿瘤细胞的免疫原性，引发机体持久的抗肿瘤免疫应答。因此，有机AIE光敏探针在制备肿瘤细胞免疫应答的药物或制备触发线粒体ROS氧化应激、诱导产生钙网蛋白转位的试剂中的应用。

Description

一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤的免疫治疗在肿瘤的治疗当中具有革命性的意义，免疫检查点抑制剂也因此获得了2018年诺贝尔生理学或医学奖。PD-1/PD-L1抑制剂的使用能够在一小部分晚期癌症患者中实现长效缓解，比如在黑色素瘤治疗当中表现出色。但是对于绝大多数晚期实体肿瘤，尤其是三阴性乳腺癌肿瘤，PD-1/PD-L1抑制剂的响应率极低，效果不尽人意。并且免疫检查点抑制剂治疗可能引发患者体内强烈的细胞因子风暴，治疗后可能会留下严重后遗症甚至危及生命。
近年来，细胞免疫原性死亡这一概念的提出，给肿瘤研究带来了新的思路。肿瘤细胞在一些药物刺激下，能够诱导钙网蛋白转位到细胞膜表面，引起机体免疫系统的识别和攻击，产生自身特异性的抗肿瘤免疫应答。这一概念拓宽了肿瘤的免疫治疗领域，引起了广泛研究和关注。然而目前诱导肿瘤细胞免疫原性死亡的药物非常有限，并且机制不明，诱导效果也是参差不齐。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针及其制备和应用，所述有机AIE光敏探针能有效的提高了肿瘤细胞的免疫原性，引发了机体持久的抗肿瘤免疫应答。
本发明提供一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针，所述有机AIE光敏探针具有以下式I所示的结构；
Figure BDA0002247629000000011
其中，R＝H或1,2,2-三苯基乙烯基。
本发明提供了所述具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针的制备方法，包括以下步骤：
1)在氩气保护下，将如式II所示结构的化合物1、2-溴噻吩、三叔丁基膦四氟硼酸盐、叔丁醇钠、Pd2(dba)3混合，得到的混合物和有机溶剂混合进行取代反应，得到具有式III所示结构的化合物2；
2)在冰浴条件下，将含所述化合物2的DMF溶液和三氯氧磷混合，自然升温至23～27℃后，逐渐加热至80～100℃进行取代反应1～1.5h，得到具有式IV所示结构的化合物3；
3)在冰浴条件、氩气保护下，将溶解有所述化合物3和具有式V所示结构的化合物4的无水乙醇溶液和乙醇钠混合，在22～27℃条件下进行缩合反应20～27h，析出的固体得到具有式VI所示结构的化合物5；
4)在氩气保护下，将溶解有所述化合物5的乙腈溶液和碘甲烷混合，加热回流发生缩合反应8～20h，冷却，将反应产物和不良溶剂混合，析出的固体溶于甲醇后与饱和六氟磷酸钾溶液混合，反应1～1.5h后，去除甲醇后，得到的固体为有机AIE光敏探针；
Figure BDA0002247629000000021
其中，在式II～式VI中，R＝H或1,2,2-三苯基乙烯基。
优选的，步骤1)中所述化合物1、2-溴噻吩、三叔丁基膦四氟硼酸盐、叔丁醇钠和Pd2(dba)3的摩尔比为0.5～2：0.5～2：0.03～0.05：0.5～2：0.01～0.03。
优选的，步骤1)中所述有机溶剂包括甲苯、四氢呋喃或DMF；
所述混合物的质量和有机溶剂的体积比为0.1g：1～10mL。
优选的，步骤1)中所述取代反应的温度为60～120℃，所述取代反应的时间为12～20h。
优选的，步骤2)中三氯氧磷的摩尔添加量为所述化合物1的摩尔添加量的2.5倍。
优选的，步骤3)中所述化合物3、化合物4和乙醇钠的摩尔比为0.5～2:0.5～2:0.5～2。
优选的，步骤4)中所述化合物5和碘甲烷的摩尔比为0.5～2：7～20；
所述析出的固体的质量与甲醇和饱和六氟磷酸钾溶液的体积比为0.1g：10～20mL：15～30mL。
本发明提供了所述有机AIE光敏探针或所述的制备方法制备得到的有机AIE光敏探针在制备肿瘤细胞免疫应答的药物中的应用。
本发明提供了所述有机AIE光敏探针或所述的制备方法制备得到的有机AIE光敏探针在制备触发线粒体ROS氧化应激、诱导产生钙网蛋白转位的试剂中的应用。
本发明提供的具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针，通过探针的ROS体外检测和线粒体共定位验证实验表明，所述有机AIE光敏探针具有线粒体靶向和在聚集状态下产生ROS的特点，在聚集状态下通过触发线粒体ROS氧化应激，诱导产生了大量的钙网蛋白转位，有效的提高了肿瘤细胞的免疫原性，引发了机体持久的抗肿瘤免疫应答。本发明采用4T1小鼠三阴性乳腺癌细胞进行了体内和体外的验证，取得了良好抗肿瘤免疫应答效果，为开发新型高效诱导肿瘤细胞免疫原性死亡的功能材料提供了新的探索方向。
本发明提供了所述有机AIE光敏探针或所述的制备方法制备得到的有机AIE光敏探针在制备肿瘤细胞免疫应答的药物中的应用。所述有机AIE光敏探针具有线粒体靶向和在聚集状态下产生ROS的特点，能够通过线粒体氧化应激，诱导产生钙网蛋白转位，进而诱导肿瘤细胞免疫原性死亡。本发明采用4T1小鼠三阴性乳腺癌细胞进行了体内和体外的验证，结果表明采用本发明提供的有机AIE光敏探针能有效抑制肿瘤体积的增加，延长模型小鼠的存活时间。
附图说明
图1为本发明提供的有机AIE光敏探针的合成路线图；
图2为TPE-DPA-T-CyP和DPA-T-CyP体外产生ROS结果图；
图3为在激光扫描共聚焦显微镜下观察的TPE-DPA-T-CyP分子的成像图，其中图3-a1为TPE-DPA-T-CyP分子的纳米形式(TPE-DPA-T-CyP-NPs)与线粒体市售染料共定位结果图，图3-a2为TPE-DPA-T-CyP分子的纳米形式荧光成像图，图3-a3为线粒体市售染料荧光成像，图3-b1为TPE-DPA-T-CyP分子本身与线粒体市售染料共定位结果图，图3-b2为TPE-DPA-T-CyP分子本身的荧光成像图，图3-b3为线粒体市售染料(mito-trcker)荧光成像图；
图4为采用TPE-DPA-T-CyP和TPE-DPA-T-CyP-NPs处理下得到的重叠系数结果图；
图5为TPE-DPA-T-CyP光敏探针处理4T1细胞后的肿瘤预防性实验结果，其中图5-a为不同处理组处理小鼠后肿瘤大小关系图，图5-b为不同处理组处理小鼠后存活时间关系图。
具体实施方式
本发明提供一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针，所述有机AIE光敏探针具有以下式I所示的结构；
Figure BDA0002247629000000041
其中，R＝H或1,2,2-三苯基乙烯基。
在本发明中，所述有机AIE光敏探针中R基为H时，所述有机AIE光敏探针为DPA-T-CyP；所述有机AIE光敏探针中R基为1,2,2-三苯基乙烯基时，所述有机AIE光敏探针为TPE-DPA-T-CyP。
本发明提供了所述具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针的制备方法，包括以下步骤：
1)在氩气保护下，将如式II所示结构的化合物1、2-溴噻吩、三叔丁基膦四氟硼酸盐、叔丁醇钠、Pd2(dba)3混合，得到的混合物和有机溶剂混合进行取代反应，得到具有式III所示结构的化合物2；
2)在冰浴条件下，将含所述化合物2的DMF溶液和三氯氧磷混合，自然升温至23～27℃后，逐渐加热至80～100℃进行取代反应1～1.5h，得到具有式IV所示结构的化合物3；
3)在冰浴条件、氩气保护下，将溶解有所述化合物3和具有式V所示结构的化合物4的无水乙醇溶液和乙醇钠混合，在22～27℃条件下进行缩合反应20～27h，析出的固体得到具有式VI所示结构的化合物5；
4)在氩气保护下，将溶解有所述化合物5的乙腈溶液和碘甲烷混合，加热回流发生缩合反应8～20h，冷却，将反应产物和不良溶剂混合，析出的固体溶于甲醇后与饱和六氟磷酸钾溶液混合，反应1～1.5h后，去除甲醇后，得到的固体为有机AIE光敏探针；
Figure BDA0002247629000000051
其中，在式II～式VI中，R＝H或1,2,2-三苯基乙烯基。
本发明提供的有机AIE光敏探针的制备方法见图1。
本发明在氩气保护下，将如式II所示结构的化合物1、2-溴噻吩、三叔丁基膦四氟硼酸盐、叔丁醇钠、Pd2(dba)3混合，得到的混合物和有机溶剂混合进行取代反应，得到具有式III所示结构的化合物2。
在本发明中，所述化合物1、2-溴噻吩、三叔丁基膦四氟硼酸盐、叔丁醇钠和Pd2(dba)3的摩尔比优选为0.5～2：0.5～2：0.03～0.05：0.5～2：0.01～0.03，更优选为1:1:0.04:1:0.02。当化合物1中R为H，记为化合物1a，得到的产物为化合物2a；当化合物1中R为1,2,2-三苯基乙烯基，记为化合物1b，得到的产物为化合物2b。
在本发明中，所述有机溶剂优选包括甲苯、四氢呋喃或DMF。所述混合物的质量和有机溶剂的体积比为0.1g：1～10mL，更优选为0.1g：1mL。所述取代反应的温度优选为60～120℃，更优选为110℃。所述取代反应的时间优选为12～20h，更优选为16h。
在本发明中，在所述取代反应后，优选对取代反应产物进行去杂。所述去杂的方法优选包括将所述取代反应产物冷却至室温后，反应混合物经硅藻土过滤后，向滤液中加入水(30mL)和氯仿(200mL)，分液，收集的有机相用饱和食盐水洗，然后无水硫酸钠干燥，浓缩除去溶剂，得到化合物2。
得到化合物2后，本发明在冰浴条件下，将含所述化合物2的DMF溶液和三氯氧磷混合，自然升温至23～27℃后，逐渐加热至80～100℃进行取代反应1～1.5h，得到具有式IV所示结构的化合物3。
在本发明中，三氯氧磷的摩尔添加量优选为所述化合物1的摩尔添加量的2.5倍。所述取代反应的温度优选为90℃。所述取代反应的时间优选为1～1.2h。在所述取代反应后，还包括将所述取代反应产物进行去杂。所述去杂的方法优选如下：将所述取代反应产物冷却至室温，在1～-1MPa减压除去溶剂，得到的粗品溶于乙酸乙酯，分别依次用饱和醋酸钠和饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥后在室温，1～-1MPa的条件下减压浓缩，得到的第二粗品室温条件下经硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝20:1，V/V)，得到黄色固体为化合物3。步骤1)和步骤2)两步的总产率为47％～48.4％。化合物2a的取代产物为化合物3a，化合物2b的取代产物为化合物3b。
得到化合物3后，本发明在冰浴条件、氩气保护下，将溶解有所述化合物3和具有式V所示结构的化合物4的无水乙醇溶液和乙醇钠混合，在22～27℃条件下进行缩合反应20～27h，析出的固体得到具有式VI所示结构的化合物5。
在本发明中，所述化合物3、化合物4和乙醇钠的摩尔比优选为0.5～2:0.5～2:0.5～2，更优选为1：1：1。所述缩合反应的温度优选为23～26℃，更优选为25℃。所述缩合反应的时间优选为22～25h，更优选为24h。
在本发明中，在所述缩合反应后，优选还包括将所述缩合反应的产物进行去杂。所述去杂的方法优选将析出的固体产物过滤，乙醇洗涤，真空干燥。
在本发明中，化合物3a制备得到的化合物5为化合物5a，表征数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝4Hz,2H),7.69(s,4H),7.57-7.54(m,3H),7.39-7.33(m,5H),7.26-7.23(m,4H),7.19-7.15(m,2H),6.50(d,J＝4Hz,1H)ppm；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ159.03,150.50,147.31,146.75,137.55,135.53,135.41,134.61,129.76,127.72,127.62,125.91,125.29,124.70,121.41,118.86,115.56,102.07ppm；HRMS(ESI+):calcd.for[C30H21N3S+H+]456.1529,found 465.1532。采用化合物3a制备的化合物5a的得率为83％。
在本发明中，化合物3b制备得到的化合物5为化合物5b，表征数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(d,J＝8Hz,2H),7.70(s,4H),7.57-7.54(m,3H),7.36-7.31(m,3H),7.20-7.12(m,9H),7.11-7.02(m,9H),6.99-6.94(m,4H),6.45(d,J＝4Hz,1H)ppm；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.81,150.54,146.58,144.87,143.78,143.42,141.47,140.73,140.27,137.59,135.38,134.57,132.64,131.49,131.44,129.70,127.88,127.78,127.64,126.78,126.70,126.61,125.95,125.27,124.67,123.58,121.43,118.87,115.70,102.11ppm；HRMS(ESI+):calcd.for[C50H35N3S+H+]710.2624,found 710.2627。由化合物3b制得红色固体化合物5b得率为92％。
得到化合物5后，本发明在氩气保护下，将溶解有所述化合物5的乙腈溶液和碘甲烷混合，加热回流发生缩合反应8～20h，冷却，将反应产物和不良溶剂混合，析出的固体溶于甲醇后与饱和六氟磷酸钾溶液混合，反应1～1.5h后，去除甲醇后，得到的固体为有机AIE光敏探针。
在本发明中，所述化合物5和碘甲烷的摩尔比优选为0.5～2：7～20，更优选为1:14。所述析出的固体的质量与甲醇和饱和六氟磷酸钾溶液的体积比为0.1g：10～20mL：15～30mL，更优选为0.1g：120mL：15mL。所述加热回流的温度优选为60～100℃，更优选为65℃。所述缩合反应的时间优选为16h。所述不良溶剂包括乙醚。所述去除甲醇的方优选为减压蒸除甲醇，参数没有特殊限制，采用本领域所熟知的去除甲醇的减压蒸馏方法即可。去除甲醇后，优选包括将得到的固体抽滤、水洗及真空干燥，具体参数没有特殊限制，采用本领域所熟知的抽滤、真空干燥和水洗的方案即可。
在本发明中，由化合物5a制备的有机AIE光敏探针为DPA-T-CyP，表征数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.99(d,J＝8Hz,2H),8.52(d,J＝8Hz,2H),8.35(s,1H),8.16(d,J＝8Hz,2H),7.84(d,J＝8Hz,2H),7.60(d,J＝4Hz,1H),7.44(t,J＝8Hz,4H),7.32-7.24(m,6H),6.47(d,J＝4Hz,1H)4.30(s,3H)ppm；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.77,153.08,145.92,145.54,138.34,137.85,137.79,132.10,130.05,128.80,125.98,125.56,125.04,123.64,118.54,113.57,98.51,47.01ppm；HRMS(ESI+):calcd.for[C31H24N3S+]470.1685，found470.1690。由化合物5a(140mg，0.31mmol)制得深紫色固体化合物DPA-T-CyP(160mg，84％得率)。
在本发明中，由化合物5b制备的有机AIE光敏探针为TPE-DPA-T-CyP，表征数据如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.98(d,J＝8Hz,2H),8.51(d,J＝8Hz,2H),8.32(s,1H),8.15(d,J＝12Hz,2H),7.85(d,J＝12Hz,2H),7.57(d,J＝4Hz,1H),7.41(t,J＝12Hz,2H),7.27-7.18(m,4H),7.17-7.14(m,2H),7.13-7.06(m,6H),7.05-6.95(m,10H),6.41(d,J＝4Hz,1H),4.31(s,3H)ppm；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.45,153.07,145.68,145.52,144.09,142.96,142.74,141.05,140.78,139.79,138.21,137.79,132.17,132.09,130.73,130.66,129.96,128.78,127.93,127.82,126.72,126.66,126.28,125.84,125.58,124.72,124.25,123.63,118.50,113.75,98.67,47.00ppm；HRMS(ESI+):calcd.for[C51H38N3S+]724.2781,found 724.2779。由化合物5b(126mg,0.178mmol)制得深紫色固体化合物TPE-DPA-T-CyP(150mg，97％得率)。
基于所述有机AIE光敏探针具有具有线粒体靶向，触发线粒体ROS氧化应激，诱导产生了大量的钙网蛋白转位，有效的提高了肿瘤细胞的免疫原性，引发了机体持久的抗肿瘤免疫应答，本发明提供了所述有机AIE光敏探针或所述的制备方法制备得到的有机AIE光敏探针在制备肿瘤细胞免疫应答的药物中的应用。
所述药物包括光敏探针。优选的，所述光敏探针的使用剂量终浓度为0.2μmol/L，孵育90min，光照1min，光照功率10mW/cm2。光照会使得药物在线粒体产生ROS，诱导ICD。
本发明提供了所述有机AIE光敏探针或所述的制备方法制备得到的有机AIE光敏探针在制备触发线粒体ROS氧化应激、诱导产生钙网蛋白转位的试剂中的应用。试剂的使用方法和剂量同所述药物，在此不做赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将化合物1a(1g，5.92mmol，1.0eq.)、2-溴噻吩(1.45g，8.88mmol,1.5eq.)，三叔丁基膦四氟硼酸盐(70mg，0.24mmol，0.04eq.)，叔丁醇钠(853mg，8.88mmol，1.5eq.)以及Pd2(dba)3(108mg，0.12mmol，0.02eq)在氩气保护下混合，加入无水甲苯(甲苯、四氢呋喃、DMF等溶剂)(30mL)，110℃取代反应16小时。冷却至室温后，反应混合物经硅藻土过滤后，向滤液中加入30mL水和200mL氯仿，分液，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩除去溶剂。粗产物化合物2a无需纯化，直接用于下一步反应。
在冰浴条件下，向化合物2a(1.5g，crude)的DMF(25mL)溶液中，滴加三氯氧磷(2.3g，14.8mmol，2.5eq.)。滴加完毕，自然升至室温，随后逐渐加热至90℃取代反应1h。冷却至室温，在室温，1～-1MPa的压力下减压除去溶剂，得到的粗品溶于乙酸乙酯，分别依次用饱和醋酸钠和饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥后，在室温，1～-1MPa的压力下减压浓缩，得到第二粗品室温经硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝20:1，V/V)，得到黄色固化合物3a(800mg,两步产率48.4％)。
在冰浴条件下，氩气保护下，向溶有化合物3a(1eq.)和化合物4(1eq.)的无水乙醇溶液中，加入乙醇钠(乙醇钠的添加量相对与化合物3的摩尔比为1:1)，室温条件下缩合反应24h。将析出的固体过滤，乙醇洗涤，真空干燥，得到化合物5a。
由化合物3a(400mg,1.43mmol)制得红色固体化合物5a(540mg,83％yield)。表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝4Hz,2H),7.69(s,4H),7.57-7.54(m,3H),7.39-7.33(m,5H),7.26-7.23(m,4H),7.19-7.15(m,2H),6.50(d,J＝4Hz,1H)ppm；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ159.03,150.50,147.31,146.75,137.55,135.53,135.41,134.61,129.76,127.72,127.62,125.91,125.29,124.70,121.41,118.86,115.56,102.07ppm；HRMS(ESI+):calcd.for
[C30H21N3S+H+]456.1529,found465.1532。
在氩气保护下，向化合物5a(1eq.)的乙腈溶液中，加入碘甲烷(14eq.)，并加热回流缩合反应16h。冷却至室温后，将混合物倒入乙醚中。过滤析出的固体，并再次溶于20mL甲醇中，加入15mL饱和六氟磷酸钾溶液。室温反应1h后，减压蒸除甲醇并再次将固体抽滤、水洗及真空干燥，得到目标化合物DPA-T-CyP。
由化合物5a(140mg,0.31mmol)制得深紫色固体化合物DPATNP(160mg,84％yield)。表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.99(d,J＝8Hz,2H),8.52(d,J＝8Hz,2H),8.35(s,1H),8.16(d,J＝8Hz,2H),7.84(d,J＝8Hz,2H),7.60(d,J＝4Hz,1H),7.44(t,J＝8Hz,4H),7.32-7.24(m,6H),6.47(d,J＝4Hz,1H)4.30(s,3H)ppm；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.77,153.08,145.92,145.54,138.34,137.85,137.79,132.10,130.05,128.80,125.98,125.56,125.04,123.64,118.54,113.57,98.51,47.01ppm；HRMS(ESI+):calcd.for[C31H24N3S+]470.1685,found 470.1690。
实施例2
将化合物1b(1g，2.36mmol，1.0eq.)、2-溴噻吩(577mg，3.54mmol，1.5eq.)，三叔丁基膦四氟硼酸盐(30mg，0.097mmol，0.04eq.)，叔丁醇钠(340mg，3.54mmol，1.5eq.)以及Pd2(dba)3(45mg，0.049mmol，0.02eq)在氩气保护下混合，加入20mL无水甲苯，110℃反应16h。冷却至室温后，反应混合物经硅藻土过滤后，向滤液中加入30mL水和200mL氯仿，分液，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩除去溶剂。粗产物无需纯化，直接用于下一步反应。
冰浴，向溶解有化合物2b的DMF(25mL)溶液中，滴加三氯氧磷(757mg，4.95mmol，2.5eq.)。滴加完毕，自然升至室温，随后逐渐加热至90℃反应1h。冷却至室温，减压除去溶剂，粗品溶于乙酸乙酯，分别用饱和醋酸钠和饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，粗品经硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝30:1，V/V)，得到黄色固化合物3b(600mg，两步产率47％)。
在冰浴条件下，氩气保护下，向溶有化合物3b(1eq.)和化合物4(1eq.)的无水乙醇溶液中，加入乙醇钠(乙醇钠的添加量相对于化合物3b的摩尔比为1:1)，室温条件下缩合反应24h。将析出的固体过滤，乙醇洗涤，真空干燥，得到化合物5b。
由化合物3b(360mg,0.675mmol)制得红色固体化合物5b(440mg，92％产率)。表征数据：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(d,J＝8Hz,2H),7.70(s,4H),7.57-7.54(m,3H),7.36-7.31(m,3H),7.20-7.12(m,9H),7.11-7.02(m,9H),6.99-6.94(m,4H),6.45(d,J＝4Hz,1H)ppm；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.81,150.54,146.58,144.87,143.78,143.42,141.47,140.73,140.27,137.59,135.38,134.57,132.64,131.49,131.44,129.70,127.88,127.78,127.64,126.78,126.70,126.61,125.95,125.27,124.67,123.58,121.43,118.87,115.70,102.11ppm；HRMS(ESI+):calcd.for[C50H35N3S+H+]710.2624,found 710.2627。
在氩气保护下，向化合物5b(1eq.)的乙腈溶液中，加入碘甲烷(14eq.)，并加热回流缩合反应16h。冷却至室温后，将混合物倒入乙醚中。过滤析出的固体，并再次溶于20mL甲醇中，加入15mL饱和六氟磷酸钾溶液。室温反应1h后，减压蒸除甲醇并再次将固体抽滤、水洗及真空干燥，得到目标化合物TPE-DPA-T-CyP。
按照以上一般方法，由化合物5b(126mg，0.178mmol)制得深紫色固体化合物TPE-DPA-T-CyP(150mg，97％产率)。表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.98(d,J＝8Hz,2H),8.51(d,J＝8Hz,2H),8.32(s,1H),8.15(d,J＝12Hz,2H),7.85(d,J＝12Hz,2H),7.57(d,J＝4Hz,1H),7.41(t,J＝12Hz,2H),7.27-7.18(m,4H),7.17-7.14(m,2H),7.13-7.06(m,6H),7.05-6.95(m,10H),6.41(d,J＝4Hz,1H),4.31(s,3H)ppm；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.45,153.07,145.68,145.52,144.09,142.96,142.74,141.05,140.78,139.79,138.21,137.79,132.17,132.09,130.73,130.66,129.96,128.78,127.93,127.82,126.72,126.66,126.28,125.84,125.58,124.72,124.25,123.63,118.50,113.75,98.67,47.00ppm；HRMS(ESI+):calcd.for[C51H38N3S+]724.2781,found724.2779。
实施例3
探针的ROS体外检测
将实施例1和2制备的探针(TPE-DPA-T-CyP和DPA-T-CyP)以一定浓度溶解于DMSO中，按照DMSO：水＝1：199的溶剂体积配比将探针加入此溶剂中，使用ABDA抗体进行ROS检测，在紫外分光光度计下考察ABDA的三个特征吸收峰的强度，当使用白光进行照射时，探针产生ROS能够使得ABDA的紫外吸收峰迅速下降，进行ROS产生的体外检测。
ROS产生的体外检测结果见图2。使用ABDA作为指示剂，斜率表示ABDA在400nm处吸收值的降低与光照时间的关系。斜率表示ROS产生能力，ROS产生能力与斜率成正比。由图2可知，TPE-DPA-T-CyP和DPA-T-CyP均能再体外产生ROS，且TPE-DPA-T-CyP的斜率比DPA-T-CyP大，说明TPE-DPA-T-CyP体外产生ROS的能力强于DPA-T-CyP。
实施例4
线粒体共定位验证
将4T1细胞接种到激光共聚焦专用培养皿中，待细胞贴壁后，加入用1640培养基配制的TPE-DPA-T-CyP分子或TPE-DPA-T-CyP分子的纳米形式(TPE-DPA-T-CyP-NPs，纳米形式的分子的制备方法：1mg TPE-DPA-T-CyP分子与5mg pluronic F127溶解于1mL THF中，在超声探头超声情况下逐滴加入9mL的水中，超声5min。透析除去THF，即得到纳米形式。只是为了证明TPE-DPA-TCyP的线粒体靶向性。因为制备成纳米形式分子后就不具备线粒体靶向性)在细胞培养箱中37℃孵育90分钟，探针终浓度为1μM，之后用PBS小心洗涤两次，加入mito-trcker(市售染料)，浓度为5μM，孵育20分钟。之后用PBS洗涤两次，换为新鲜的完全培养基，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察，TPE-DPA-T-CyP分子使用的成像条件为488nm下进行激发，600～750nm范围接受；mito-tracker使用633nm激发，650～800nm范围接受。
图3为在激光扫描共聚焦显微镜下观察的TPE-DPA-T-CyP分子的成像图，其中图3-a1为TPE-DPA-T-CyP分子的纳米形式与线粒体市售染料共定位结果图，图3-a2为TPE-DPA-T-CyP分子纳米形式荧光成像图，图3-a3为线粒体市售染料荧光成像，图3-b1为TPE-DPA-T-CyP分子本身与线粒体市售染料共定位结果图，图3-b2为TPE-DPA-T-CyP分子本身的荧光成像图，图3-b3为线粒体市售染料荧光成像图；图4是两种形式，即线粒体靶向的本身药物分子和非靶向的纳米制剂形式与线粒体重叠的定量情况，为图4的量化形式结果。
由图3可知，TPE-DPA-T-CyP药物分子的线粒体靶向性能，通过与市售线粒体指示剂共培养，能够完美重合。而将药物制备成纳米形式后，通过图3共聚焦能够看到与线粒体指示剂几乎不重合，该纳米形式用于后续验证线粒体靶向性产生ROS，引起线粒体氧化应激促发大量ICD的概念。
实施例5
光敏探针处理4T1细胞后的肿瘤预防性实验
健康BALB/c雌性小鼠随机分为四组，每组10只。用200nM的TPE-DPA-T-CyP分子，500nM的Ce6分子分别孵育4T1肿瘤细胞90min，之后用白光照射1min，12h后用PBS洗涤两次，使用X-射线进行安全性灭活处理，接受辐照剂量为60Gray。同时接受射线辐照的还有正常不处理的4T1细胞。将三组经过不同方式处理的4T1肿瘤细胞接种于BALB/c小鼠腋下，接种剂量为120μL，其中含有约500万细胞。7天之后按照同样的处理方式和剂量分别再次于同一部位进行免疫。第四组为空白对照组，两次均只注射相同体积的无菌PBS。14天后，于对侧腋下位置，每只接种100万同种处于对数生长期的4T1肿瘤细胞。之后对四组小鼠接种出肿瘤生长进行密切观察，并记录小鼠的肿瘤大小和存活时间等。
动物实验是采用细胞预防性疫苗，也就是将钙网蛋白转位后的细胞经过射线灭活后注射进入小鼠体内，是证明肿瘤细胞免疫原性死亡的金标准。
结果如图5所示。由图5可知，与其他处理组相比，采用TPE-DPA-T-CyP分子处理的实验组，小鼠的肿瘤体积明显小于其他处理组，同时存活时间由明显延长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针，其特征在于，所述有机AIE光敏探针具有以下式I所示的结构；
Figure FDA0002247628990000011
其中，R＝H或1,2,2-三苯基乙烯基。
2.权利要求1所述具有线粒体靶向的有机AIE光敏探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在氩气保护下，将如式II所示结构的化合物1、2-溴噻吩、三叔丁基膦四氟硼酸盐、叔丁醇钠、Pd2(dba)3混合，得到的混合物和有机溶剂混合进行取代反应，得到具有式III所示结构的化合物2；
2)在冰浴条件下，将含所述化合物2的DMF溶液和三氯氧磷混合，自然升温至23～27℃后，逐渐加热至80～100℃进行取代反应1～1.5h，得到具有式IV所示结构的化合物3；
3)在冰浴条件、氩气保护下，将溶解有所述化合物3和具有式V所示结构的化合物4的无水乙醇溶液和乙醇钠混合，在22～27℃条件下进行缩合反应20～27h，析出的固体为具有式VI所示结构的化合物5；
4)在氩气保护下，将溶解有所述化合物5的乙腈溶液和碘甲烷混合，加热回流发生缩合反应8～20h，冷却，将反应产物和不良溶剂混合，析出的固体溶于甲醇后与饱和六氟磷酸钾溶液混合，反应1～1.5h后，去除甲醇，得到的固体为有机AIE光敏探针；
Figure FDA0002247628990000012
Figure FDA0002247628990000021
其中，在式II～式VI中，R＝H或1,2,2-三苯基乙烯基。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述化合物1、2-溴噻吩、三叔丁基膦四氟硼酸盐、叔丁醇钠和Pd2(dba)3的摩尔比为0.5～2：0.5～2：0.03～0.05：0.5～2：0.01～0.03。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述有机溶剂包括甲苯、四氢呋喃或DMF；
所述混合物的质量和有机溶剂的体积比为0.1g：1～10mL。
5.根据权利要求2～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述取代反应的温度为60～120℃，所述取代反应的时间为12～20h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中三氯氧磷的摩尔添加量为所述化合物1的摩尔添加量的2.5倍。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述化合物3、化合物4和乙醇钠的摩尔比为0.5～2:0.5～2:0.5～2。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述化合物5和碘甲烷的摩尔比为0.5～2：7～20；
所述析出的固体的质量与甲醇和饱和六氟磷酸钾溶液的体积比为0.1g：10～20mL：15～30mL。
9.权利要求1所述有机AIE光敏探针或权利要求2～8任意一项所述的制备方法制备得到的有机AIE光敏探针在制备肿瘤细胞免疫应答的药物中的应用。
10.权利要求1所述有机AIE光敏探针或权利要求2～8任意一项所述的制备方法制备得到的有机AIE光敏探针在制备触发线粒体ROS氧化应激、诱导产生钙网蛋白转位的试剂中的应用。
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