CN110642849B - 蛋白降解靶向嵌合体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白降解靶向嵌合体及制备方法和应用，该蛋白降解靶向嵌合体结构如下所示：
L为至少含有N和O其中一种杂原子的连接基团，将能与靶标CD147蛋白质特异性结合土荆皮乙酸部分和能与E3泛素连接酶结合的沙利度胺部分连接，通过同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，将活化的泛素转移至靶标蛋白上，实现了对其选择性泛素化，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。本发明的化合物制备方法简单，易于实现，能显著降低CD147蛋白的水平，在用于制备治疗或预防癌症的药物中，尤其在用于制备以CD147为靶点的抗肿瘤药物中有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，特别涉及一种蛋白降解靶向嵌合体及其制备方法和应用。
背景技术
CD147蛋白是一个相对分子量50-60kDa的单次跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员之一；其高表达于各种肿瘤细胞上，参与肿瘤细胞的增殖，侵袭，转移，代谢，分化，抵抗凋亡等重要生物学功能，是有效的药物靶标。
泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。泛素-蛋白酶体系统是一个多步骤反应过程，有多种不同蛋白质参与。首先泛素(多肽)被泛素激活酶E1活化，传递给泛素结合酶E2，进一步在泛素连接酶E3的作用下，泛素分子被转移到靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解为长度一定的肽段。通过这样一个需要消耗能量的过程，细胞以高度特异方式对不需要的蛋白进行降解。
蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)技术就是利用泛素-蛋白酶体系统特异性对不需要的蛋白进行降解，从而达到治疗各种疾病的作用。蛋白降解靶向嵌合体主要包括三部分：配体1部分与靶标蛋白质结合，配体2部分与E3泛素连接酶结合，两部分中间由linker连接。嵌合体通过同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，将活化的泛素转移至靶标蛋白上，实现了对其选择性泛素化，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。
利用蛋白降解靶向嵌合体可以治疗疾病的方式与传统小分子化合物完全不同，不需直接抑制目标蛋白的功能活性，药物不需要与目标蛋白长时间和高强度的结合，蛋白降解靶向嵌合体通过识别并泛素化靶标蛋白，随后通过蛋白酶体降解，从而能够选择性的降低患者细胞中靶标蛋白的水平，以治疗一些疾病，降解靶标致病蛋白比用药物来抑制蛋白具有更强的效果。
目前，还没有以CD147蛋白为靶标蛋白小分子蛋白降解靶向嵌合体问世。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够靶向降解CD147蛋白的蛋白降解靶向嵌合体及其制备方法和应用。
蛋白降解靶向嵌合体的结构式如式(I)，
式(I)，L为连接基团；
上述连接基团L含有N和O中的至少一种杂原子。
其中，上述连接基团L为不含环状结构的连接基团，并含有N和O中的至少一种杂原子。
进一步地，上连接基团优选为(a)-(e)中的一种：
其中，1≤n1≤20，0≤n2≤10，2≤n3≤20，2≤n4≤20，n1、n2、n3、n4取整数。
上述蛋白降解靶向嵌合体通过中间的连接基团将能与靶标CD147蛋白质结合的土荆皮乙酸部分和能与E3泛素连接酶结合的沙利度胺部分连接起来，如此该蛋白降解靶向嵌合体能够同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，共同作用，从而将活化的泛素转移至靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。
上述蛋白降解靶向嵌合体的制备方法如下：
(1)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(a)，且n1＝1时，制备方法包括以下步骤：
将土荆皮乙酸(PAB)与氯甲基氯磺酸酯进行取代反应，得到化合物1。
将化合物1与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行亲核取代反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
(2)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(a)，且2≤n1≤20时，制备方法包括以下步骤。
在保护性气体中，将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮和化合物2进行亲核取代反应，得到化合物3。
将化合物3与土荆皮乙酸(PAB)进行酯化反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
(3)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(b)时，制备方法包括以下步骤：
在冰浴条件下，将化合物4与4-甲苯磺酰氯混合进行取代反应，得到化合物5。
将化合物5与土荆皮乙酸(PAB)进行酯化反应，得到化合物6。
将化合物6与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行取代反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
(4)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(c)时，制备方法包括以下步骤：
将土荆皮乙酸(PAB)与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行酯化反应，得到蛋白降解靶向嵌合体。
(5)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(d)时，制备方法包括以下步骤：
将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与化合物7混合进行亲核取代反应，得到化合物8。
将化合物8脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基后与土荆皮乙酸(PAB)进行脱水缩合反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
(6)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(e)时，包括以下步骤：
在保护性气体中，将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮与化合物9进行取代反应，得到化合物10。
将所述化合物10脱去保护基叔丁基氧羰基后与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
其中，上述化合物1～10的结构式如下：
其中，化合物5中Ts为对甲苯磺酰基，化合物7、8、9、10中Boc为叔丁氧羰基。
进一步地，上述(1)中，土荆皮乙酸与氯甲基氯磺酸酯在相转移催化剂与碱的作用下进行取代反应；化合物1与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮在极性溶剂中、催化剂的作用下进行亲核取代反应。
进一步地，上述(2)中，亲核取代反应在催化剂与碱的作用下、在极性溶剂中进行；酯化反应在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂或活性剂的作用下进行。
进一步地，上述(3)中，化合物4与4-甲苯磺酰氯混合在强碱作用下进行取代反应；酯化反应在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂或活性剂的作用下进行；酯交换反应在无机碱的作用下进行。
进一步地，上述(4)中，上述酯化反应在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂或活性剂的作用下进行。
进一步地，上述(5)中，亲核取代反应N,N-二异丙基乙胺(DIEA)作用下、在极性溶剂中进行；脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基是在三氟乙酸的作用下进行；脱水缩合反应是在碳鎓盐类缩合剂与催化剂的作用下进行。
进一步地，上述(6)中，取代反应在催化剂与碱作用下、在极性溶剂中进行；将化合物10脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基是在三氟乙酸的作用下进行；脱水缩合反应是在碳鎓盐类缩合剂与催化剂的作用下进行。
上述蛋白降解靶向嵌合体能应用在制备抗肿瘤药物中。
尤其是能应用于能够靶向降解CD147蛋白的抗肿瘤药物中。
上述制备蛋白降解靶向嵌合体方法中，沙利度胺类似物与土荆皮乙酸(PAB)通过中间的连接基团连接起来，土荆皮乙酸部分能与CD147蛋白质特异性结合，沙利度胺部分能与E3泛素连接酶结合，使得蛋白降解靶向嵌合体能同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，将活化的泛素转移至靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。
CD147蛋白高表达于各种肿瘤细胞上，参与肿瘤细胞的增殖，侵袭，转移，代谢，分化，抵抗凋亡等重要生物学功能，上述制备蛋白降解靶向嵌合体应用在制备抗肿瘤药物中时，能特异性降解靶标CD147蛋白，从而有效地抑制肿瘤细胞生长，达到治疗目的。
附图说明
图1为不同浓度蛋白降解靶向嵌合体1对CD147蛋白的降解活性的电泳图；
图2为不同浓度蛋白降解靶向嵌合体6对CD147蛋白的降解活性的电泳图；
图3为不同浓度蛋白降解靶向嵌合体9对CD147蛋白的降解活性的电泳图；
图4为不同浓度土荆皮乙酸对CD147蛋白的降解活性的电泳图；
图5为蛋白降解靶向嵌合体9对下游信号分子的影响的电泳图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施方式中的蛋白降解靶向嵌合体的结构式如式(I)，
式(I)，L为连接基团；
上述连接基团L含有N和O中的至少一种杂原子。
其中，上述连接基团L为不含环状结构的连接基团，并含有N和O中的至少一种杂原子。
进一步地，上述连接基团优选为(a)-(e)中的一种：
其中，1≤n1≤20，0≤n2≤10，2≤n3≤20，2≤n4≤20，n1、n2、n3、n4取整数。
上述蛋白降解靶向嵌合体通过中间的连接基团将能与靶标CD147蛋白质结合的土荆皮乙酸部分和能与E3泛素连接酶结合的沙利度胺部分连接起来，如此该蛋白降解靶向嵌合体能够同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，共同作用，从而将活化的泛素转移至靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。
在其中一实施例中，1≤n1≤10。
在其中一实施例中，0≤n2≤5，优选n2＝3。
在其中一实施例中，2≤n3≤10。
在其中一实施例中，2≤n4≤10。
上述蛋白降解靶向嵌合体的制备方法如下几种情况。
第一种情况：(1)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(a)，且n1＝1时，上述蛋白降解靶向嵌合体的制备方法包括以下步骤S11-S12。
S11、将土荆皮乙酸(PAB)与氯甲基氯磺酸酯进行取代反应，得到化合物1。
其中，化合物1的结构如下：
进一步地，步骤S11中，取代反应在相转移催化剂与碱的作用下进行。
其中，相转移催化剂优选为季铵盐类相转移催化剂，碱为无机碱。
其中一个实施例中，步骤S11中，相转移催化剂为Bu4N+HSO4 -，无机碱为K2CO3。
该反应为非均相反应，相转移催化剂包括亲水性部分与亲油性部分，可以把水相中的反应物转移到有机相中，促使反应发生，提高收率。
S12、将化合物1与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行亲核取代反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
步骤S12中，亲核取代反应在极性溶剂中、催化剂的作用下进行。
具体地，催化剂为无机碱，能促进亲核反应。
第二种情况：(2)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(a)，且2≤n1≤20时，上述蛋白降解靶向嵌合体的制备方法包括以下步骤S21-S22。
S21、在保护性气体中，将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮和化合物2进行亲核取代反应，得到化合物3。
其中，化合物2的结构如下：
其中，化合物3的结构如下：
进一步地，步骤S21中，亲核取代反应在催化剂与碱的作用下、在极性溶剂中进行。
其中一实施例中，步骤S21中，催化剂为含碘离子的盐。
碘离子是很好的亲核试剂，同时也是很好的离去基团，使化合物2中的溴容易被碘离子进攻而失去形成碘代物，而碘代物中的碘又容易被2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮中的羟基进攻而失去，故可加快反应速率。
S22、将化合物3与土荆皮乙酸(PAB)进行酯化反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
进一步地、步骤S22中，酯化反应在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂或活性剂的作用下进行。
其中一实施例中，步骤S22中，碳二亚胺类缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)，酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
DCC能活化羧酸，促进酯的生成，4-二甲氨基吡啶能催化活化反应，加快反应速率，避免酯化反应停留在中间过程产生副产物，提高产率。
第三种情况：(3)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(b)时，制备方法包括以下步骤S31-S33。
S31、在冰浴条件下，将化合物4与4-甲苯磺酰氯混合进行取代反应，得到化合物5。
其中，化合物4的结构如下。
其中，化合物5的结构如下。
其中，化合物5中Ts为对甲苯磺酰基。
进一步地，步骤S31中化合物4与4-甲苯磺酰氯在强碱作用下进行取代反应。
S32、将化合物5与土荆皮乙酸(PAB)进行酯化反应，得到化合物6。
其中，化合物6的结构如下。
进一步地，步骤S32中，酯化反应在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂或活性剂的作用下进行。
其中一实施例中，步骤S32中，碳二亚胺类缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)，酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
DCC能活化羧酸，促进酯的生成，4-二甲氨基吡啶能催化活化反应，加快反应速率，避免酯化反应停留在中间过程产生副产物。
S33、将化合物6与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行取代反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
进一步地，步骤S33中，取代反应在无机碱的作用下进行。
第四种情况：(4)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(c)时，制备方法包括以下步骤S41。
S41、将土荆皮乙酸(PAB)与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行酯化反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
进一步地，步骤S41中，酯化反应在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂或活性剂的作用下进行。
其中一实施例中，步骤S41中，碳二亚胺类缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)，酰化催化剂优选为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
DCC能活化羧酸，促进酯的生成，4-二甲氨基吡啶能催化活化反应，加快反应速率，避免酯化反应停留在中间过程产生副产物。
第五种情况：(5)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(d)时，制备方法包括以下步骤S51-S52。
S51、将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与化合物7混合进行亲核取代反应，得到化合物8。
进一步地，步骤S51中，亲核取代反应在N,N-二异丙基乙胺(DIEA)作用下、在极性溶剂中进行。
其中，化合物7的结构如下：
其中，化合物8的结构如下：
其中，化合物7与8中Boc为叔丁氧羰基，将一边的胺基保护起来。
S52、将化合物8脱去胺基的保护基后与土荆皮乙酸(PAB)进行脱水缩合反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
进一步地，步骤S52中，脱水缩合反应是在缩合剂与催化剂的作用下进行。
缩合剂优选为碳鎓盐类缩合剂，催化剂优选为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。
其中一实施例中，步骤S52中，脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基是在三氟乙酸的作用下进行，碳鎓盐类缩合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，催化剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。
采用碳鎓盐类缩合剂与催化剂进行脱水缩合的效率高，催化剂能加快反应速率避免反应停留在中间过程产生副产物。
具体地，脱水缩合反应步骤中，先加化合物8脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基的产物，然后依次加入土荆皮乙酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，避免产生副产物，提高产率。
(6)当蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(e)时，包括以下步骤S61-S62。
S61、将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮与化合物9混合进行取代反应，得到化合物10。
进一步地，步骤S61中，取代反应在催化剂与碱的作用下、在极性溶剂中进行。
其中，化合物9的结构如下：
其中，化合物10的结构如下：
化合物9与10中Boc为叔丁氧羰基，将一边的胺基保护起来。
其中一实施例中，步骤S61中，催化剂为含碘离子的盐。
碘离子是很好的亲核试剂，同时也是很好的离去基团，使化合物9中的溴容易被碘离子进攻而失去形成碘代物，而碘代物中的碘又容易被2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮中的羟基进攻而失去，故可加快反应速率。
S62、将化合物10脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基后与土荆皮乙酸(PAB)进行脱水缩合反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。
进一步地，步骤S62中，脱水缩合反应是在缩合剂与催化剂的作用下进行。缩合剂优选为碳鎓盐类缩合剂，催化剂优选为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。
其中一实施例中，步骤S62中，将化合物10脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基是在三氟乙酸的作用下进行，碳鎓盐类缩合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，催化剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。
采用碳鎓盐类缩合剂与催化剂进行脱水缩合的效率高，催化剂能加快反应速率避免反应停留在中间过程产生副产物。
具体地，脱水缩合反应步骤中，先加入化合物10脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基的产物，然后依次加入土荆皮乙酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，避免产生副产物，提高产率。
本发明还涉及到上述蛋白降解靶向嵌合体在制备抗肿瘤药物中的应用；尤其是能应用于能够靶向降解CD147蛋白的抗肿瘤药物中。
为此，本发明对上述蛋白降解靶向嵌合体对CD147蛋白的降解活性、上述蛋白降解靶向嵌合体对下游信号分子的影响以及上述蛋白降解靶向嵌合体细胞水平活性进行了测定，详细过程参考具体实施例。
结果表明，上述制备蛋白降解靶向嵌合体方法中，沙利度胺类似物与土荆皮乙酸(PAB)通过中间的连接基团连接起来，土荆皮乙酸部分能与CD147蛋白质特异性结合，沙利度胺部分能与E3泛素连接酶结合，使得蛋白降解靶向嵌合体能同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，将活化的泛素转移至靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。
CD147蛋白高表达于各种肿瘤细胞上，参与肿瘤细胞的增殖，侵袭，转移，代谢，分化，抵抗凋亡等重要生物学功能，上述制备蛋白降解靶向嵌合体应用在制备抗肿瘤药物中时，能特异性降解靶标CD147蛋白，从而有效地抑制肿瘤细胞生长，达到治疗目的。
下面将结合具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于下述实施例，应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。
以下为具体实施例.
这里按照本发明的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法举例，但本发明并不局限于下述实施例。
实施例1
蛋白降解靶向嵌合体1的结构式如下所示：
合成步骤如下:
(1)称取22mg Bu4N+HSO4 -(0.06mmol)、468mg K2CO3(3.38mmol)加入到50mL三颈瓶中，加10mL水溶解；称取212mg土荆皮乙酸(0.49mmol)、135mg氯甲基氯磺酸酯(0.82mmol)溶于10mL DCM中，将DCM溶液在10分钟内缓慢加入反应瓶中，室温反应10h。TLC监测PAB反应完全，停止反应后加入15mL水，再用二氯甲烷(DCM)萃取，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，抽滤、旋蒸得288mg淡黄色中间体粗品。
(2)称取76mg步骤(1)中所得中间体粗品(0.16mmol)，121mg 2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮(0.44mmol)，26mg碳酸钾(0.19mmol)于25mL茄形瓶中，加入4mL DMF溶解，室温反应5天，停止反应后，加入15mL水，抽滤，用二氯甲烷(DCM)萃取母液，合并有机层后用饱和食盐水洗至溶液为中性，再用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸，得92mg白色固体，最后经柱层析纯化得84mg蛋白降解靶向嵌合体1，洗脱体系先用石油醚：乙酸乙酯＝1：1，后用二氯甲烷：甲醇＝50:1。蛋白降解靶向嵌合体1的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.06(s,1H),7.75(t,J＝7.9Hz,1H),7.62(d,J＝7.2Hz,1H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.23(d,J＝11.4Hz,2H),6.55(dd,J＝15.0,11.4Hz,1H),6.10-6.04(m,2H),5.93(d,J＝15.0Hz,1H),4.99(dd,J＝12.3,5.3Hz,1H),3.74(s,3H),3.32(d,J＝3.8Hz,1H),3.09(dd,J＝14.3,6.4Hz,1H),2.98-2.71(m,5H),2.62(dd,J＝15.2,4.2Hz,1H),2.15(s,5H),1.98(s,3H),1.87-1.72(m,5H),1.60(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ:172.8,170.7,169.4,168.0,167.9,166.6,166.5,165.2,154.0,144.9,141.6,138.8,136.6,134.5,133.9,127.1,121.9,121.5,118.6,118.2,90.1,86.2,83.7,55.2,52.1,49.3,49.2,33.3,31.4,30.7,28.4,27.7,24.4,22.6,21.8,20.1,12.8.
HRMS(ESI)m/z:741.2275(M+Na)+.
实施例2
蛋白降解靶向嵌合体2的结构式如下所示：
(1)称取110mg 2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮(0.4mmol)，167mg 3-溴丙醇(1.2mmol)，60mg NaI(0.4mmol)，168mg碳酸氢钠(0.8mmol)，放入10mL茄形瓶中，加入1mL DMF溶解，70℃氩气条件下反应24h，旋蒸除去大部分DMF，加入5mL水，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层为浅绿色，合并乙酸乙酯层后用碳酸钠水溶液萃取至溶液无色，再用饱和食盐水洗至溶液为中性，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸，重结晶得到中间体109mg。
中间体结构如下所示：
中间体的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ11.12(s,1H),7.81(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.45(d,J＝7.2Hz,1H),5.09(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),4.57(t,J＝5.2Hz,1H),4.28(t,J＝6.2Hz,2H),3.64-3.59(m,2H),2.89(ddd,J＝17.0,13.9,5.4Hz,1H),2.63-2.52(m,2H),2.07-2.00(m,1H),1.91(p,J＝6.2Hz,2H).
13C NMR(125MHz,DMSO)δ173.3,170.4,167.3,165.8,156.5,137.5,133.7,120.2,116.7,115.6,66.4,57.5,49.2,32.3,31.4,22.5.
(2)称取67mg步骤(1)中所得中间体(0.20mmol)，86mg土荆皮乙酸(PAB，0.2mmol)，50mg二环己基碳二亚胺(DCC，0.24mmol)，9.8mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.08mmol)，放入10mL茄形瓶中，加入3mL二氯甲烷溶解，室温搅拌反应10h。TLC监测原料土荆皮乙酸反应完全后停止反应。此时反应液中析出白色固体，抽滤、旋蒸得188mg白色固体，最后用柱层析纯化得130mg蛋白降解靶向嵌合体2，洗脱体系为石油醚：乙酸乙酯＝1：1。蛋白降解靶向嵌合体2的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.71(t,J＝7.8Hz,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.23(d,J＝11.7Hz,1H),7.17(d,J＝11.7Hz,1H),6.55(dd,J＝14.8,11.6Hz,1H),5.89(d,J＝15.0Hz,1H),4.97(dd,J＝12.3,5.4Hz,1H),4.44(t,J＝6.3Hz,2H),4.31(t,J＝6.3Hz,2H),3.74(s,3H),3.32(d,J＝5.3Hz,1H),3.13-3.05(m,1H),2.92(dd,J＝16.0,7.2Hz,2H),2.83(d,J＝14.0Hz,1H),2.77(dd,J＝16.2,7.7Hz,2H),2.63(d,J＝15.1Hz,1H),2.30(t,J＝6.3Hz,2H),2.15(s,4H),1.97(s,3H),1.90-1.71(m,5H),1.61(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ:172.9,170.9,169.4,168.1,168.05,168.01,166.9,165.5,156.3,143.7,141.6,136.9,136.5,134.5,133.9,128.4,121.7,119.0,117.4,116.1,90.1,83.7,66.1,61.2,55.2,52.0,49.3,49.1,33.3,31.4,30.7,29.7,29.6,28.6,28.5,27.7,24.3,22.6,21.8,20.1,13.0.
HRMS(ESI)m/z:764.3028(M+NH4)+.
实施例3
蛋白降解靶向嵌合体3的结构式如下所示：
合成步骤同实施例2；蛋白降解靶向嵌合体3的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.12(d,J＝7.0Hz,1H),7.70(t,J＝7.9Hz,1H),7.48(d,J＝7.3Hz,1H),7.23(dd,J＝9.0,4.7Hz,2H),7.17(d,J＝11.4Hz,1H),6.55(dd,J＝15.0,11.5Hz,1H),5.89(d,J＝15.0Hz,1H),4.97(dd,J＝12.2,5.4Hz,1H),4.22(t,J＝6.4Hz,4H),3.74(s,3H),3.32(d,J＝5.6Hz,1H),3.09(dd,J＝14.3,6.4Hz,1H),2.96-2.72(m,5H),2.63(dd,J＝13.9,3.3Hz,1H),2.15(s,5H),1.99-1.92(m,5H),1.88-1.73(m,7H),1.65(dd,J＝11.2,5.1Hz,2H),1.61(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ:172.9,171.0,169.4,168.3,168.1,168.0,167.0,165.6,156.6,143.4,141.7,136.6,136.5,134.5,133.8,128.7,121.8,118.9,117.2,115.8,90.2,83.8,69.1,64.5,55.2,52.0,49.3,49.1,33.3,31.4,30.7,28.6,28.5,28.3,27.7,24.3,22.6,22.5,21.8,20.1,13.0.
HRMS(ESI)m/z:797.2904(M+Na)+.
实施例4
蛋白降解靶向嵌合体4的结构式如下所示：
合成步骤同实施例2；蛋白降解靶向嵌合体4的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(t,J＝7.9Hz,1H),7.47(d,J＝7.3Hz,1H),7.23(d,J＝8.3Hz,2H),7.17(d,J＝11.4Hz,1H),6.55(dd,J＝15.1,11.4Hz,1H),5.90(d,J＝15.1Hz,1H),4.98(dd,J＝12.2,5.4Hz,1H),4.19(dt,J＝11.0,6.2Hz,4H),3.74(s,3H),3.32(d,J＝5.6Hz,1H),3.10(dd,J＝14.3,6.4Hz,1H),2.96–2.71(m,5H),2.63(d,J＝14.3Hz,1H),2.15(s,4H),1.97(s,4H),1.93-1.67(m,15H),1.61(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.9,171.0,169.5,168.3,168.0,167.1,165.7,156.7,143.4,141.7,136.5,134.5,133.8,128.8,121.8,118.9,117.1,115.7,90.2,83.8,69.4,64.8,55.2,52.1,49.3,49.1,33.3,31.4,30.7,29.0,28.8,28.6,28.5,27.7,25.9,25.8,25.6,24.9,24.3,22.6,21.8,20.1,13.0.
HRMS(ESI)m/z:825.3211(M+Na)+.
实施例5
蛋白降解靶向嵌合体5的结构式如下所示：
合成步骤如下:
称取80mg土荆皮乙酸(0.18mmol)、48mg二环己基碳二亚胺(DCC，0.24mmol)、3mg4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.02mmol)加入到25mL茄形瓶2mL DCM中溶解，称取61mg 2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮(0.22mmol)中溶于1mL DMF中，滴入茄形瓶，70℃反应3d。TLC监测PAB反应完全，停止反应后加入15mL水，抽滤、二氯甲烷(DCM)萃取滤液，合并有机层后无水硫酸镁干燥20min，抽滤，旋干得136mg白色固体，柱层析纯化得121mg蛋白降解靶向嵌合体5，洗脱体系为DCM：EA＝3：1，收率97％。蛋白降解靶向嵌合体5的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.96(d,J＝14.6Hz,1H),7.81(d,J＝6.8Hz,2H),7.51(t,J＝10.5Hz,2H),7.24(d,J＝8.6Hz,1H),6.66(dd,J＝15.1,11.5Hz,1H),6.02(d,J＝15.1Hz,1H),4.96(dd,J＝12.6,5.3Hz,1H),3.75(s,3H),3.35(d,J＝5.3Hz,1H),3.11(dd,J＝14.3,6.4Hz,1H),2.93(dd,J＝16.2,7.7Hz,2H),2.88–2.69(m,3H),2.65(dd,J＝14.1,3.6Hz,1H),2.16(s,4H),2.14(s,3H),1.90–1.74(m,6H),1.64(s,3H)；
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.8,170.8,169.5,168.0,167.8,166.4,165.6,164.9,147.5,145.4,141.7,140.0,136.1,134.5,133.2,129.1,126.7,122.5,121.6,1213,90.1,83.7,55.3,52.1,49.3,49.2,33.4,31.4,30.7,28.5,27.7,24.4,22.5,21.8,20.1,13.1.
HRMS(ESI)m/z:706.2613(M+H)+.
实施例6
蛋白降解靶向嵌合体6的结构如下：
合成步骤如下:
(1)称取0.447g氢氧化钠(11mmol)置于50mL三颈瓶中，用2mL水溶解，再加入10g三乙二醇(66mmol)，混合均匀，然后称取1.278g 4-甲苯磺酰氯(TsCl、6mmol)，放入50mL烧杯中，加入17mL THF溶解，放入恒压滴液漏斗中，在冰浴下缓慢滴加，2.5小时后滴加完毕，继续反应10分钟，TLC监测反应完全，停止反应后向反应液中加入20mL水，然后用二氯甲烷萃取，合并有机层后用饱和食盐水洗有机层，再用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸得1.773g中间产物粗品。
(2)在25mL圆底烧瓶中，依次加入89.4mg步骤(1)所得中间体粗品，87mg土荆皮乙酸(0.2mmol)，53mg二环己基碳二亚胺(DCC，0.26mmol)，15mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.12mmol)溶于2mL DCM中，室温反应24h，停止反应，溶液浑浊，抽滤后得265mg淡黄色固体。柱层析纯化得120mg中间体产物，洗脱体系为石油醚：乙醇＝3:2，中间体结构如下所示：
中间体的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.2Hz,2H),7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.24-7.16(m,2H),6.54(dd,J＝15.1,11.5Hz,1H),5.90(d,J＝15.1Hz,1H),4.30(t,J＝4.8Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.79-3.67(m,7H),3.61(s,3H),3.31(d,J＝5.2Hz,1H),3.09(dd,J＝14.1,6.1Hz,1H),2.90(dd,J＝15.6,6.2Hz,1H),2.76(dd,J＝15.1,8.8Hz,1H),2.62(dd,J＝15.0,2.1Hz,1H),2.46(s,3H),2.19-2.10(m,4H),1.96(s,3H),1.88-1.68(m,7H),1.40-1.28(m,1H),1.18-1.04(m,1H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.9,169.4,168.12,168.05,144.9,143.7,141.7,137.0,134.5,133.0,129.8,128.3,128.0,121.7,90.1,83.7,70.8,70.5,69.3,69.2,68.7,63.8,55.2,52.0,49.3,33.3,30.7,28.5,27.8,24.3,21.8,21.7,20.1,12.9.
HRMS(ESI)m/z:736.3013(M+NH4)+.
(3)称取38mg步骤(2)所得中间体产物6(0.14mmol)，28mg碳酸钾(0.2mmol)，放入10mL茄形瓶中，加入4mL DMF溶解，后加入80mg 2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮(0.11mmol)40℃反应20h。TLC监测反应完全，停止反应，溶液为黄绿色液体，有少量白色固体沉淀。加入15mL水，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层为浅绿色，合并乙酸乙酯层后用饱和碳酸钠溶液萃取至溶液无色，饱和食盐水洗至溶液为中性，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸，得77mg固体。柱层析纯化得25mg蛋白降解靶向嵌合体6，洗脱体系为石油醚：乙醇＝1:1，二氯甲烷：甲醇＝50:1。蛋白降解靶向嵌合体6的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(t,J＝7.9Hz,1H),7.49(d,J＝7.0Hz,1H),7.21(t,J＝12.1Hz,2H),6.54(dd,J＝15.0,11.4Hz,1H),5.90(d,J＝15.1Hz,1H),4.97(dd,J＝12.0,5.2Hz,1H),4.35(dt,J＝18.3,4.6Hz,4H),3.97(t,J＝4.6Hz,2H),3.80(dd,J＝17.7,4.6Hz,4H),3.74(s,3H),3.71(d,J＝5.1Hz,2H),3.32(d,J＝5.3Hz,1H),3.09(dd,J＝14.3,6.4Hz,1H),3.01-2.88(m,3H),2.86-2.71(m,3H),2.67-2.57(m,1H),2.15(s,4H),1.97(s,3H),1.91-1.70(m,6H),1.60(s,3H).
HRMS(ESI)m/z:843.2949(M+H)+.
实施例7
蛋白降解靶向嵌合体7的结构如下：
合成步骤同实施例6，蛋白降解靶向嵌合体7的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.70(t,J＝7.9Hz,1H),7.49(d,J＝7.0Hz,1H),7.21(t,J＝12.1Hz,2H),6.54(dd,J＝15.0,11.4Hz,1H),5.90(d,J＝15.1Hz,1H),4.97(dd,J＝12.0,5.2Hz,1H),4.35(dt,J＝18.3,4.6Hz,4H),3.97(t,J＝4.6Hz,2H),3.80(dd,J＝17.7,4.6Hz,4H),3.74(s,3H),3.71(d,J＝5.1Hz,2H),3.32(d,J＝5.3Hz,1H),3.09(dd,J＝14.3,6.4Hz,1H),3.01-2.88(m,3H),2.86-2.71(m,3H),2.67-2.57(m,1H),2.15(s,4H),1.97(s,3H),1.91-1.70(m,6H),1.60(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.9,171.2,169.5,168.24,168.17,168.1,167.0,165.6,156.4,143.6,141.7,137.0,136.5,134.5,133.8,128.4,121.7,119.5,117.3,116.1,90.1,83.8,71.1,70.7,70.6,70.5,69.4,69.3,69.2,63.9,55.2,52.0,49.3,49.1,33.3,31.4,30.7,29.7,28.5,27.7,24.3,22.6,21.8,20.1,12.9.
HRMS(ESI)m/z:882.3678(M+H)+.
实施例8
蛋白降解靶向嵌合体8的结构如下：
合成步骤如下：
(1)称取82mg 2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮(0.3mmol),167mg 2-溴叔丁氧羰基乙胺(0.36mmol)，5mg KI(0.3mmol),50mg碳酸氢钠(2mmol)，加入1mL DMF溶解，80℃氩气条件下反应3天后，停止反应，加入15mL水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层为浅绿色，多次萃取后合并乙酸乙酯层，然后用饱和碳酸钠溶液洗至溶液无色，饱和食盐水洗至溶液为中性，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸，最后经柱层析纯化得中间体。
(2)将步骤(1)所得中间体(17mg，0.04mmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入60uL三氟乙酸，室温下搅拌1小时，旋干溶剂，加入甲苯将残留的三氟乙酸除去，将得到的脱去胺基保护基的粗产品悬浮于1.5mL DCM中，依次加入17mg土荆皮乙酸，21mg苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，20uL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，反应7小时，旋干，经柱层析纯化得到上述蛋白降解靶向嵌合体8，蛋白降解靶向嵌合体8的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):8.78-8.69(m,0.5H),8.64-8.53(m,0.5H),7.76-7.68(m,1H),7.54-7.46(m,1H),7.26(dd,J＝8.4,2.6Hz,1H),7.20(dd,J＝6.5,2.1Hz,1H),6.94(dd,J＝15.4,11.5Hz,1H),6.86(s,1H),6.48(ddd,J＝15.1,11.2,8.8Hz,1H),5.83(t,J＝14.5Hz,1H),4.97(dd,J＝12.4,5.3Hz,1H),4.33-4.23(m,2H),3.90-3.76(m,2H),3.72(s,3H),3.30(d,J＝5.9Hz,1H),3.07(dd,J＝14.3,6.4Hz,1H),2.95-2.85(m,3H),2.81(s,3H),2.76-2.70(m,1H),2.66-2.56(m,1H),2.19-2.11(m,5H),1.99(s,3H),1.89-1.70(m,6H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ：173.2,173.1,171.1,171.0,169.7,169.6,169.1,169.0,168.23,168.22,168.05,168.03,166.87,166.86,166.09,166.06,156.2,156.1,142.6,142.5,141.7,136.83,136.80,134.51,134.48,133.65,133.64,132.9,132.6,131.2,130.9,121.9,121.6,119.7,119.6,117.7,116.6,90.22,90.19,84.0,83.9,68.4,68.3,55.25,55.24,52.0,49.6,49.4,49.3,38.9,38.8,38.6,33.30,33.28,31.49,31.47,30.8,30.7,29.7,28.52,28.45,27.75,27.72,24.2,22.57,22.56,21.81,21.79,20.1,13.04,13.03.
HRMS(ESI)m/z:732.2780(M+H)+.
实施例9
蛋白降解靶向嵌合体9的结构如下：
合成步骤如下：
(1)称取2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮(50mg,0.18mmol)，N-Boc-1，2-乙二胺(32mg,0.20mmol)，溶于1.8mL NMP中，加入63uL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，氮气保护下加热至100℃，反应7小时，旋干溶剂，柱层析得到氟原子被N-Boc-1，2-乙二胺取代的中间体(61mg，81％)。中间体结构如下所示：
中间体的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.37(s,1H),7.52(t,J＝7.8Hz,1H),7.13(d,J＝7.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.3Hz,1H),6.42(t,J＝5.4Hz,1H),4.99-4.91(m,2H),3.50-3.42(m,2H),3.41-3.33(m,2H),2.93-2.86(m,1H),2.83-2.70(m,2H),2.19-2.10(m,1H),1.46(s,9H).HRMS(ESI)m/z:439.1587(M+Na)+.
(2)将步骤(1)所得中间体(27mg，0.065mmol)溶于0.4mL二氯甲烷中，加入90uL三氟乙酸，室温下搅拌1小时，旋干溶剂，加入甲苯将残留的三氟乙酸除去，将得到的脱去胺基保护基的粗产品悬浮于2mL DCM中，依次加入土荆皮乙酸(28mg，0.065mmol)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(35mg，0.091mmol)，N,N-二异丙基乙胺(32uL，0.195mmol)，反应2小时，旋干，柱层析得到蛋白降解靶向嵌合体9，蛋白降解靶向嵌合体8的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.94-8.70(m,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),7.23-7.15(m,1H),7.10-7.04(d,J＝4.9Hz,1H),7.01(d,J＝8.5Hz,1H),6.89(d,J＝11.2Hz,1H),6.60(s,1H),6.54-6.37(m,2H),5.89-5.76(m,1H),4.93(dd,J＝11.2,4.9Hz,1H),3.71(s,3H),3.61-3.44(m,4H),3.28(d,J＝3.5Hz,1H),3.06(dd,J＝14.1,5.9Hz,1H),2.93-2.69(m,12H),2.66-2.56(m,1H),2.13(m,5H),1.91(s,3H),1.86-1.66(m,5H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:173.2,173.1,171.8,169.51,169.49,169.46,169.1,168.1,167.57,167.55,146.9,146.8,142.5,141.7,136.3,134.5,133.0,132.9,132.4,130.7,130.6,121.43,121.35,116.9,111.8,110.1,90.1,83.90,83.88,55.2,52.1,49.35,49.31,48.9,41.8,39.6,39.5,33.3,31.4,30.7,29.7,29.6,28.5,27.7,24.3,22.7,21.8,20.1,13.1.
HRMS(ESI)m/z:731.2931(M+H)+.
实施例10
蛋白降解靶向嵌合体10的结构如下：
合成步骤同实施例9，蛋白降解靶向嵌合体10的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.88(d,J＝6.2Hz,1H),7.50-7.42(m,1H),7.18(d,J＝8.4Hz,1H),7.05(d,J＝7.1Hz,1H),6.95(d,J＝11.2Hz,1H),6.87(d,J＝8.6Hz,1H),6.52-6.38(m,3H),5.80(d,J＝15.0Hz,1H),4.92(dd,J＝11.9,5.4Hz,1H),3.70(s,3H),3.47-3.40(m,2H),3.35-3.30(m,2H),3.27(d,J＝5.6Hz,1H),3.09-3.03(m,1H),2.89-2.82(m,3H),2.79(s,3H),2.76-2.69(m,2H),2.64-2.55(m,1H),2.14-2.08(m,5H),1.92(s,3H),1.90-1.86(m,2H),1.83-1.69(m,5H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ:175.1,173.1,171.5,169.4,169.0,168.7,168.0,167.6,146.7,142.2,141.7,136.1,134.5,132.7,132.5,130.7,121.5,116.6,111.5,110.1,90.1,83.8,55.2,52.0,49.4,49.3,48.9,40.1,38.6,37.4,33.3,31.5,30.7,29.6,29.3,28.5,27.7,24.3,22.7,21.8,20.1,17.6,13.1.
HRMS(ESI)m/z:745.3086(M+H)+.
实施例11
蛋白降解靶向嵌合体11的结构如下：
合成步骤同实施例9，蛋白降解靶向嵌合体11的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.78(s,1H),7.50-7.43(m,1H),7.22-7.13(m,1H),7.06(d,J＝7.1Hz,1H),6.93(d,J＝11.3Hz,1H),6.87(d,J＝8.6Hz,1H),6.47(dd,J＝15.0,11.4Hz,1H),6.23(t,J＝5.6Hz,1H),6.13(s,1H),5.80(d,J＝15.0Hz,1H),4.94-4.89(m,1H),3.71(s,3H),3.33-3.25(m,3H),3.06(dd,J＝14.1,6.2Hz,1H),2.90-2.82(m,2H),2.77-2.68(m,2H),2.63-2.57(m,1H),2.18-2.08(m,6H),1.94(s,3H),1.86-1.63(m,9H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ:175.2,173.1,171.4,169.6,169.4,168.8,168.7,168.1,167.6,146.8,142.2,141.7,136.2,134.5,132.6,132.4,130.9,121.5,116.7,111.5,109.9,90.1,83.8,55.2,52.0,49.4,49.3,48.9,42.2,39.3,38.6,33.3,31.4,30.7,29.6,28.5,27.7,27.1,26.5,24.3,22.8,21.8,20.1,17.6,13.2.
HRMS(ESI)m/z:759.3244(M+H)+.
实施例12
蛋白降解靶向嵌合体12的结构如下：
合成步骤同实施例9，蛋白降解靶向嵌合体12的表征结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:8.47(d,J＝5.4Hz,1H),7.54-7.44(m,1H),7.25-7.15(m,1H),7.09(d,J＝7.1Hz,1H),6.95(d,J＝11.3Hz,1H),6.88(d,J＝8.6Hz,1H),6.49(dd,J＝15.0,11.4Hz,1H),6.23(t,J＝5.4Hz,1H),5.89(t,J＝5.4Hz,1H),5.82(d,J＝15.0Hz,1H),4.95-4.88(m,1H),3.72(s,3H),3.36-3.22(m,5H),3.10-3.05(m,1H),2.92-2.86(m,2H),2.82-2.70(m,4H),2.64-2.57(m,1H),2.19-2.10(m,5H),2.07-1.98(m,4H),1.96(s,3H),1.85-1.63(m,8H),1.49-1.36(m,4H).
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ:175.1,173.0,171.2,169.5,169.4,168.6,168.5,168.1,167.6,147.0,142.1,141.7,136.1,134.5,132.5,130.9,121.5,116.6,111.4,109.9,90.1,83.8,55.2,52.0,49.45,49.35,48.9,42.5,39.8,38.6,33.3,31.4,30.7,29.7,29.60,29.56,29.1,28.6,27.8,26.63,26.62,24.3,22.8,21.8,20.1,17.7,13.27.
HRMS(ESI)m/z:787.3555(M+H)+.
上述蛋白降解靶向嵌合体的表征结果表明成功制备得到了目标蛋白降解靶向嵌合体。
实施例13
蛋白降解靶向嵌合体对CD147蛋白的降解活性。
测试方法：采用的是Western Blot方法测定蛋白降解靶向嵌合体对CD147的降解活性。将处于对数增长期的A375细胞(人黑色素瘤细胞)或SK-MEL-28细胞(人皮肤恶性黑色素瘤细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于6孔板(1×105个/孔)，每孔2mL放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药.每组设置3个复孔，阴性对照组加入2mL/孔10％血清培养基，实验组加入2mL/孔不同浓度的蛋白降解靶向嵌合体或药物(以10％血清培养基稀释药物)，放入37℃，5％CO2恒温培养箱中继续培养药物作用24h后，小心吸弃上清液，1mL/孔PBS(KH2PO 4 2mM，Na2HPO4 8mM,，NaCl 136mM，KCl 2.6mM)冲洗细胞两次后，再次加入1mLPBS，使用细胞刮将细胞刮下，置EP管中，转速为1000rmp，3min沉淀细胞，吸弃上清液.根据细胞数量加入预冷的裂解/冼涤缓冲液以及蛋白酶抑制剂，重悬细胞，将细胞裂解液冰上放置30min，超速低温离心机转速为13000rmp，4℃离心10min，轻轻吸取上清至EP管中，进行BCA蛋白定量。将定量好的蛋白加入5×样品缓冲液配置成上样样品，终体积为15Μl.按常规凝胶配制SDS聚丙烯酰胺凝胶。样品电泳：将预置的样品加入孔道进行电泳，电泳条件：恒压100伏，90min。转膜：按常规将胶块与PVDF膜置于转膜槽内，冰上环境进行转膜，转膜条件：恒流300mA，90min。封闭、抗体孵育以及发光等步骤同常规免疫印迹反应。
以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参蛋白质蛋，电泳图如附图1-4中所示，结果显示靶向嵌合体1、6、9对CD147的有很好的降解效果，而土荆皮乙酸对CD147的没有明显的降解效果。
注：1μM＝10-6mol/L
实施例14
关于蛋白降解靶向嵌合体对下游信号分子的影响的测试方法：采用的是WesternBlot方法测定蛋白降解靶向嵌合体对CD147的降解活性。将处于SK-MEL-28细胞(人皮肤恶性黑色素瘤细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于6孔板(1×105个/孔)，每孔2mL。放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药。每组设置3个复孔，阴性对照组加入2mL/孔10％血清培养基，实验组加入2mL/孔不同浓度的蛋白降解靶向嵌合体(以10％血清培养基稀释药物)，放入37℃，5％CO2恒温培养箱中继续培养。药物作用24h后，小心吸弃上清液，1mL/孔PBS(KH2PO4 2mM，Na2HPO48mM，NaCl 136mM，KCl 2.6mM)冲洗细胞两次后，再次加入1mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，使用细胞刮将细胞刮下，置EP管中，转速为1000rmp，3min沉淀细胞，吸弃上清液。根据细胞数量加入预冷的裂解/冼涤缓冲液以及蛋白酶抑制剂，重悬细胞，将细胞裂解液冰上放置30min，超速低温离心机转速为13000g，4℃离心10min，轻轻吸取上清至EP管中，进行BCA蛋白定量。将定量好的蛋白加入5×样品缓冲液配置成上样样品，终体积为15uL按常规凝胶配制SDS聚丙烯酰胺凝胶。样品电泳：将预置的样品加入孔道进行电泳，电泳条件：恒压100伏，90min。转膜：按常规将胶块与PVDF膜置于转膜槽内，冰上环境进行转膜，转膜条件：恒流300mA，90min。封闭、抗体孵育以及发光等步骤同常规免疫印迹反应。使用Bio-Rad Gel DocTMXR+System凝胶成像系统测定发光值，计算降解活性，表1为蛋白降解靶向嵌合体的浓度为10μM的结果，电泳图见附图4。
数值处理：降解率＝(给药组值-阴性对照组值)/(阴性对照组值)×100％；
表1.蛋白降解靶向嵌合体9对CD147下游信号分子的影响
| 蛋白 | CD147 | MMP9 | p-STA | GAPDH |
| 降解/抑制率(％) | 75 | 71 | 62 | - |
注：MMP9为基质金属蛋白酶，CD147蛋白分子通过诱导基质金属蛋白酶的分泌促进肿瘤的侵袭和转移；p-STAT为CD147蛋白表达的下游信号分子；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参蛋白。
实施例15
蛋白降解靶向嵌合体抗肿瘤活性的测定。
方法：蛋白降解靶向嵌合体细胞水平的活性检测采用CCK-8检测法。将处于对数增长期的SK-MEL-28细胞(人皮肤恶性黑色素瘤细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于96孔板(2×103个/孔)，每孔100μL。放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药。每组设置3个复孔，阴性对照组加入100μL/孔10％血清培养基，实验组加入100μL/孔不同浓度的蛋白降解靶向嵌合体(以10％血清培养基稀释药物)，放入37℃、5％CO2恒温培养箱中继续培养。药物作用48h后，小心吸弃上清液，向每孔加入10μL CCK和100μL10％血清培养基，37℃孵育1-3h后，用酶联免疫检测仪于450nm波长下测定各孔吸光度(OD)值，数据用GraphPad处理，计算蛋白降解靶向嵌合体的IC50(μM)值，表2为蛋白降解靶向嵌合体抗肿瘤活性测试结果。
表2.蛋白降解靶向嵌合体抗肿瘤活性测试结果
| 蛋白降解靶向嵌合体 | 1 | 2 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| IC<sub>50</sub>(μM) | 10.5 | 7.9 | 10.3 | 6.6 | 3.9 | 5.4 | 8.7 | 8.6 | 7.5 | 7.9 |
注：IC50(μM)指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度，可以用来衡量蛋白降解靶向嵌合体抑制肿瘤细胞增殖的能力，抑制能力越强，数值越低。
从表1与表2可以看出按照本发明的蛋白降解靶向嵌合体对癌症细胞具有较好的抑制活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述蛋白降解靶向嵌合体的结构式如式(I)，
所述连接基团选自(a)-(e)中的一种：
其中，1≤n1≤20，0≤n2≤10，2≤n3≤20，2≤n4≤20，n1、n2、n3、n4为整数。
2.根据权利要求1所述的蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，
1≤n1≤10；0≤n2≤5；2≤n3≤10；2≤n4≤10。
3.根据权利要求1所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，
(1)当所述蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(a)，且所述n1＝1时，所述制备方法包括以下步骤：
将土荆皮乙酸与氯甲基氯磺酸酯进行取代反应，得到化合物1；
将所述化合物1与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行亲核取代反应，得到所述蛋白降解靶向嵌合体；或
(2)当所述蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(a)，且所述2≤n1≤20时，所述制备方法包括以下步骤：
在保护性气体中，将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮和化合物2进行亲核取代反应，得到化合物3；
将所述化合物3与土荆皮乙酸进行酯化反应，得到所述蛋白降解靶向嵌合体；或
(3)当所述蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(b)时，所述制备方法包括以下步骤：
在冰浴条件下，将化合物4与4-甲苯磺酰氯混合进行取代反应，得到化合物5；
将所述化合物5与土荆皮乙酸进行酯化反应，得到化合物6；
将化合物6与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行取代反应，得到所述蛋白降解靶向嵌合体；或
(4)当所述蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(c)时，所述制备方法包括以下步骤：
将土荆皮乙酸与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮进行酯化反应，得到所述蛋白降解靶向嵌合体；或
(5)当所述蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(d)时，所述制备方法包括以下步骤：
将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与化合物7进行亲核取代反应，得到化合物8；
将所述化合物8脱去保护基叔丁基氧羰基后与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，得到所述蛋白降解靶向嵌合体；或
(6)当所述蛋白降解靶向嵌合体的连接基团为(e)时，包括以下步骤：
在保护性气体中，将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮与化合物9进行取代反应，得到化合物10；
将所述化合物10脱去保护基叔丁基氧羰基后与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，得到所述蛋白降解靶向嵌合体；
其中，所述化合物1～10的结构式如下：
其中，化合物2和化合物3中的n1相同，且2≤n1≤20，n1为整数；
化合物4、化合物5和化合物6中的n2相同，且0≤n2≤10，n2为整数；
化合物7和化合物8中的n3相同，且2≤n3≤20，n3为整数；
化合物9和化合物10中的n4相同，且2≤n4≤20，n4为整数。
4.根据权利要求3所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，在所述(1)中，所述土荆皮乙酸与所述氯甲基氯磺酸酯在相转移催化剂与无机碱的作用下进行取代反应；所述化合物1与所述2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-羟基-异吲哚-1,3-二酮在极性溶剂中、催化剂作用下进行亲核取代反应。
5.根据权利要求3所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，所述(2)中，所述亲核取代反应在催化剂与碱的作用下、在极性溶剂中进行；所述酯化反应在碳二亚胺类缩合剂的作用下进行。
6.根据权利要求3所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，所述(3)中，所述化合物4与所述4-甲苯磺酰氯在强碱作用下进行取代反应；所述酯化反应在碳二亚胺类缩合剂作用下进行。
7.根据权利要求3所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，所述(4)中，所述酯化反应在碳二亚胺类缩合剂的作用下进行。
8.根据权利要求3所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，所述(5)中，所述亲核取代反应在催化剂作用下、在极性溶剂中进行；所述脱水缩合反应是在碳鎓盐类缩合剂与催化剂的作用下进行。
9.根据权利要求3所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，所述(6)中，所述取代反应在催化剂与碱作用下、在极性溶剂中进行；所述脱水缩合反应是在碳鎓盐类缩合剂与催化剂的作用下进行。
10.根据权利要求1或2所述蛋白降解靶向嵌合体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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