CN110621343A - 选择对针对降钙素基因相关肽的抗体有反应的头痛患者 - Google Patents

选择对针对降钙素基因相关肽的抗体有反应的头痛患者 Download PDF

Info

Publication number
CN110621343A
CN110621343A CN201880029375.7A CN201880029375A CN110621343A CN 110621343 A CN110621343 A CN 110621343A CN 201880029375 A CN201880029375 A CN 201880029375A CN 110621343 A CN110621343 A CN 110621343A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
set forth
cdr
monoclonal antibody
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880029375.7A
Other languages
English (en)
Inventor
R.伯斯坦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Original Assignee
Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beth Israel Deaconess Medical Center Inc filed Critical Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Publication of CN110621343A publication Critical patent/CN110621343A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及选择对抗CGRP抗体治疗有反应的头痛患者的方法以及降低所选患者的头痛频率的方法，所述方法包括施用抗CGRP抗体。

Description

选择对针对降钙素基因相关肽的抗体有反应的头痛患者
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年3月2日提交的美国申请号62/466,158；2017年4月27日提交的美国申请号62/490,953；2017年6月2日提交的美国申请号62/514,346；以及2017年6月7日提交的美国申请号62/516,406的优先权益。前述申请中的每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
已发现人源化抗降钙素基因相关肽(CGRP)单克隆抗体有效降低慢性偏头痛的频率(Dodick DW等(2014)Lancet Neurol.13:1100-1107；Dodick DW等(2014)LancetNeurol.13:885-892；Bigal ME等(2015)Lancet Neurol.14:1081-1090；Bigal ME等(2015)Lancet Neurol.14:1091-1100；以及Sun H等(2016)Lancet Neurol.15:382-390)。然而，虽然已发现抗CGRP抗体在治疗某些头痛时为有效的，但患者可以不同方式作出反应。举例来说，抗CGRP抗体可在治疗头痛或预防头痛发生时完全有效、部分有效或根本无效。如果在用抗CGRP抗体治疗之前可确定使用所述抗体是否将有效治疗头痛和/或防止发展头痛，那么可有益于患者护理，节省医师时间并且防止不必要地使用特定疗程。
因此，需要用于确定包含抗CGRP抗体的治疗是否将有效治疗患有头痛或易患头痛的患者的方法。
发明内容
本发明涉及选择对抗CGRP抗体治疗有反应的头痛患者的方法以及用抗CGRP抗体降低所选患者的头痛频率的方法。
在一个方面中，本文提供一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：a)选择患者，所述患者的头痛由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导；以及b)向患者施用足以降低患者的头痛频率的量的调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体。
在另一方面中，本文提供一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：a)选择患者，所述患者表现出能够通过施用调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的第一单克隆抗体而减轻的痛觉过敏；以及b)向患者施用足以降低患者的头痛频率的量的调节CGRP路径的第二单克隆抗体。
在另一方面中，本文提供一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：a)选择患者，所述患者主要在头部的一部分(例如单侧眶周、单侧颞部或一只眼睛)中经历头痛；以及b)向患者施用足以降低患者的头痛频率的量的调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体。
在另一方面中，本文提供一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：a)选择患者，所述患者通过施用阻断、抑制、阻抑或减少CGRP路径的第一单克隆抗体而表现出痛觉过敏和异常性疼痛的消除；以及b)向患者施用足以降低患者的头痛频率的量的阻断、抑制、阻抑或减少CGRP路径的第二单克隆抗体。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，患者为偏头痛患者。
在本文所提供的方法中的任一者的另一实施方案中，患者为慢性或阵发性偏头痛患者。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，患者患有脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，头痛来源于颅内。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，头痛为偏头痛。在本文所提供的方法中的任一者的另一实施方案中，头痛为有预兆偏头痛。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，头痛是归因于脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
在本文所提供的方法中的任一者的另一实施方案中，将单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用给患者。
在另一实施方案中，本文所提供的方法还包括向患者施用一个或多个额外剂量的单克隆抗体。
在本文所提供的方法中的任一者的另一实施方案中，单克隆抗体为抗CGRP拮抗剂抗体。在本文所提供的方法中的任一者的另一实施方案中，单克隆抗体为抗CGRP受体抗体。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，单克隆抗体为人抗体或人源化抗体。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，单克隆抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在本文所提供的方法中的任一者的一个实施方案中，患者为人。
在另一实施方案中，在患者没有偏头痛时施用单克隆抗体。在另一实施方案中，在患者具有头痛(例如偏头痛)时施用单克隆抗体。
在另一实施方案中，由或使用预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器向患者施用本文所提供的方法的单克隆抗体。
在本文所提供的方法的实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ ID NO:3中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDR L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。在一个特定实施方案中，单克隆抗体为夫瑞奈组单抗(fremanezumab)(本文中也称为“G1”)。
在一个实施方案中，以约225至约900mg的剂量，例如以约225mg的剂量、以约675mg的剂量、以约900mg的剂量施用单克隆抗体。可每月或每季向患者施用这些剂量。另外，可以静脉内或皮下方式施用这些剂量中的任一者(例如约225、约675或约900mg)。在一个特定实施方案中，给药方案包含初始剂量(例如675mg)，并且还包括在向患者施用初始剂量的月份之后两个月(或三个月、四个月、五个月、六个月或十二个月)中的每个月内每月一次向患者施用另一剂量的约225mg的单克隆抗体。
在一个实施方案中，以包含浓度为至少约150mg/mL的抗体的制剂的形式施用单克隆抗体。在另一实施方案中，以小于2mL(例如约1.8mL、约1.7mL、约1.6mL、约1.5mL、约1.4mL、约1.3mL、约1.2mL、约1.1mL、约1.0ml、约0.9mL、约0.8mL、约0.7mL、约0.6mL、约0.5mL或更小)的体积施用单克隆抗体。在一些实施方案中，优选以约1.5mL的体积施用单克隆抗体。
在一个实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ ID NO:87中所示的CDR H1；如SEQ IDNO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:84中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
在另一实施方案中，单克隆抗体为艾普汀单抗(eptinezumab)。可以约100mg、约300mg或约1000mg的剂量施用艾普汀单抗。可以静脉内或皮下方式施用这些剂量中的任一者(例如约100mg、约300mg或约1000mg)。
在另一实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ ID NO:93中所示的CDR H1；如SEQ IDNO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:91中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
在另一实施方案中，单克隆抗体为加卡珠单抗(galcanezumab)。可以约120mg或约240mg的剂量施用加卡珠单抗。另外，可以约1.5mL的体积施用120mg剂量并且可以约3mL的体积施用240mg剂量。可以静脉内或皮下方式施用这些剂量中的任一者(例如约120mg或240mg)。
在另一实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ ID NO:103中所示的CDR H1；如SEQ IDNO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:100中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
在另一实施方案中，单克隆抗体为厄瑞奴单抗(erenumab)。可以约70mg或约140mg的剂量施用厄瑞奴单抗。另外，可以约1mL的体积施用70mg剂量。可以约2mL的体积施用140mg剂量。可以静脉内或皮下方式施用这些剂量中的任一者(例如约70或140mg)。
在一个方面中，本文提供一种调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体的用途，所述单克隆抗体用于制造用于降低患者的头痛频率的药剂，所述患者的头痛是由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导。
在一个方面中，本文提供一种调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体的用途，所述单克隆抗体用于制造用于降低患者的头痛频率的药剂，所述患者表现出能够通过施用调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏。
在一个方面中，本文提供一种调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体的用途，所述单克隆抗体用于制造用于降低患者的头痛频率的药剂，所述患者主要在头部的一部分(例如单侧眶周、单侧颞部或一只眼睛)中经历头痛。
在本文所提供的用途中的任一者的一个实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ IDNO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDR L3。在本文所提供的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQID NO:1中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在本文所提供的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
在本文所提供的用途中的任一者的另一实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ IDNO:87中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDRH3；如SEQ ID NO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。在本文所描述的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ IDNO:80中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在本文所描述的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
在本文所提供的用途中的任一者的另一实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ IDNO:93中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDRH3；如SEQ ID NO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。在本文所描述的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ IDNO:96中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在本文所描述的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
在本文所提供的用途中的任一者的另一实施方案中，单克隆抗体包含如SEQ IDNO:103中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDRH3；如SEQ ID NO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ IDNO:102中所示的CDR L3。在本文所提供的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQID NO:106中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在本文所提供的用途中的任一者的一些实施方案中，单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。在一个方面中，本文提供一种药盒，所述药盒包括：预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器，所述预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器包含一定剂量的调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体；以及说明书，所述说明书用于确定患者的头痛是否由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导。
在一个方面中，本文提供一种阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径以用于降低患者的头痛频率的单克隆抗体，其中患者为头痛由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导的患者。在一些实施方案中，患者已被确定为患有由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导的头痛。
在另一方面中，本文提供一种阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径以用于降低患者的头痛频率的单克隆抗体，其中患者为表现出能够通过施用阻断、抑制、阻抑或减少CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏的患者。在一些实施方案中，患者已被确定为表现出痛觉过敏。在一些实施方案中，患者已被确定为患有痛觉过敏，所述痛觉过敏能够通过施用阻断、抑制、阻抑或减少CGRP路径的单克隆抗体而减轻。
在另一方面中，本文提供一种阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径以用于降低患者的头痛频率的单克隆抗体，其中患者为主要在头部的一部分中经历头痛的患者。在一些实施方案中，患者已被确定为主要在头部的一部分中经历头痛。
在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDR L1；如SEQ IDNO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDR L3。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:87中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:93中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗体包含如SEQ ID NO:103中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:100中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的轻链。
在一个方面中，本文提供一种药盒，所述药盒包括：预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器，所述预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器包含一定剂量的调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体；以及说明书，所述说明书用于确定患者是否表现出能够通过施用调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏。
在另一方面中，本文提供一种药盒，所述药盒包括：预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器，所述预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器包含一定剂量的阻断、抑制、阻抑或减少CGRP路径的单克隆抗体；以及说明书，所述说明书用于确定患者是否主要在头部的一部分(例如单侧眶周、单侧颞部或一只眼睛)中经历头痛。
附图说明
图1为示出12种鼠抗体对不同的丙氨酸取代的人α-CGRP片段的结合亲和力的表格。在25℃下使用Biacore通过使Fab流过芯片上的CGRP来测量结合亲和力。框起的值表示除衍生自19-37母体的K35A外，丙氨酸突变体相对于亲本片段25-37(斜体字)的亲和力损失。“a”指示19-37和25-37片段的亲和力为不同传感器芯片上的两次独立测量的平均值±标准偏差。“b”指示这些相互作用归因于双相解离速率而偏离简单双分子相互作用模型，因此其亲和力使用构象变化模型来测定。灰色量表图例：白色(1.0)指示亲本亲和力；淡灰色(小于0.5)指示亲和力比母体高；深灰色(超过2)指示亲和力比母体低；并且黑色表明未检测到结合。
图2A和图2B示出了施用CGRP 8-37(400nmol/kg)、抗体4901(25mg/kg)以及抗体7D11(25mg/kg)对电脉冲刺激30秒之后以血细胞通量形式测量的皮肤血流的影响。在电脉冲刺激之前以静脉内方式(iv)施用CGRP 8-37 3-5min。在电脉冲刺激之前腹膜内(IP)施用抗体72小时。图中的每个点表示在如所示条件下处理的一只大鼠的AUC。图中的每条线表示在如所示条件下处理的大鼠的平均AUC。AUC(曲线下面积)等于Δ通量xΔ时间。“Δ通量”表示电脉冲刺激之后通量单位的变化；并且“Δ时间”表示血细胞通量水平回到电脉冲刺激之前的水平所用的时间段。
图3示出了施用不同剂量的抗体4901(25mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg或1mg/kg)对电脉冲刺激30秒之后以血细胞通量形式测量的皮肤血流的影响。在电脉冲刺激之前静脉内(IV)施用抗体24小时。图中的每个点表示在如所示条件下处理的一只大鼠的AUC。图中的线表示在如所示条件下处理的大鼠的平均AUC。
图4A和图4B示出了施用抗体4901(1mg/kg或10mg/kg，静脉内)、抗体7E9(10mg/kg，静脉内)以及抗体8B6(10mg/kg，静脉内)对在电脉冲刺激30秒之后以血细胞通量形式测量的皮肤血流的影响。以静脉内方式(i.v.)施用抗体，随后在抗体施用之后30min、60min、90min以及120min时进行电脉冲刺激。Y轴表示与未施用抗体时(时间0)的AUC水平相比的AUC百分比。X轴表示抗体施用与电脉冲刺激之间的时间(分钟)段。“*”指示与时间0相比P<0.05，并且“**”指示P<0.01，。使用单因素ANOVA以及杜纳氏多次比较检验(Dunnett'sMultiple comparisontest)对数据进行分析。
图5示出了抗体G1的重链可变区(SEQ ID NO:1)和轻链可变区(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。Kabat CDR为粗体文本，并且Chothia CDR加下划线。对重链和轻链可变区的氨基酸残基依序进行编号。
图6示出了使用Biacore通过肽竞争对抗体G1的表位定位。将N-生物素化人α-CGRP捕获于SA传感器芯片上。使不存在竞争肽情况下的G1 Fab(50nM)或与10μM的竞争肽一起预孵育1小时的G1 Fab(50nM)流至芯片上。测量G1 Fab在芯片上与人α-CGRP的结合。Y轴表示与不存在竞争肽情况下的结合相比因存在竞争肽而阻断的结合百分比。
图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F、图7G、图7H、图7I以及图7J示出了针对CGRP-mAb(图7A、图7B、图7C、图7F、图7G以及图7H，n＝36)或同型-对照Ab(图7D、图7E、图7I以及图7J，n＝27)在雄性和雌性大鼠中的影响所测试的63个三叉神经血管神经元中的每一者的记录位点(图7A和图7F)、面部感受野(图7B、图7D、图7G以及图7I)以及硬脑膜感受野(图7C、图7E、图7H以及图7J)。图7A和图7F示出了在穿过第一颈段的代表性横截面上所绘的记录位点。如所示，圆圈表示HT和WDR神经元。图7B、图7D、图7G以及图7I示出了皮肤的最敏感区域(即，施加刷拭、压力以及夹捏的地方)以及角膜感受野。图7C、图7E、图7H以及图7J示出了硬脑膜上的机械敏感性感受野，所述机械敏感性感受野全部位于横窦上或周围。在图7H中的插图中用虚线勾勒了感受野图式中所示的硬脑膜部分。所有硬脑膜和面部感受野与所记录的神经元为同侧的。缩写：HT，高阈值；WDR，广动力范围。
图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图8F以及图8G示出了CGRP-mAb(图8A、图8B、图8C以及图8D)和同型-对照Ab(图8E、图8F以及图8G)对雄性和雌性大鼠中三叉神经血管神经元的自发性活动的影响。图8A、图8D以及图8F为在基线处(BL)以及在向HT神经元施用CGRP-mAb(图8A)或同型-对照Ab(图8E)之后1-4小时时所记录的自发放电率的曲线。括号中的数字示出了每个时间点15-分钟采样期的平均放电率。Bin宽＝1sec。图8B和图8C为示出在基线处以及在雄性(图8B)和雌性(图8C)大鼠中在CGRP-mAb施用之后1-4小时时所记录的HT和WDR神经元的平均(±S.E.)自发放电的柱状图。图8F和8G为示出在基线处以及在雄性(图8F)和雌性(图8G)大鼠中在同型-对照Ab施用之后1-4小时所记录的HT和WDR神经元的平均(±S.E.)自发放电的柱状图。*，与基线相比p<0.05。图8B、图8C、图8F以及图8G中的括号中的数字展示每一组中的神经元数目。
图9A、图9B、图9C、图9D、图9E以及图9F为示出CGRP-mAb(图9A、图9B以及图9C)和同型-对照Ab(图9D、图9E以及图9F)对在雄性和雌性大鼠中三叉神经血管神经元对硬脑膜凹陷的反应的影响的图。图9A和图9D为示出在基线处(BL)以及在向HT神经元施用CGRP-mAb(图9A)或同型对照抗体(同型-对照Ab)(图9D)之后1-4小时时对使用弗莱毛(von Freyhair)(VFH，4.19g)的硬脑膜凹陷的反应的图。括号中的数字示出了刺激期间的平均放电率。Bin宽＝1sec。图9B和图9C为示出在雄性(图9B)和雌性(图9C)大鼠中接受CGRP-mAb的神经元的整个样品在基线处以及在药物施用之后1-4小时时响应于硬脑膜刺激的平均(±S.E.)放电率的图。图9E和图9F为示出在雄性(图9E)和雌性(图9F)大鼠中接受同型-对照Ab的神经元的整个样品在基线处以及药物施用之后1-4小时时响应于硬脑膜刺激的平均(±S.E.)放电率的图。*，与基线相比p<0.05。图9B、图9C、图9E以及图9F中的括号中的数字展示每一组中的神经元数目。
图10A、图10B、图10C、图10D、图10E、图10F、图10G以及图10H为示出CGRP-mAb(图10A、图10B、图10C、图10D)和同型-对照Ab(图10E、图10F、图10G以及图10H)对雄性和雌性大鼠的中枢三叉神经血管神经元对皮肤感受野无害和有害机械刺激的反应的影响的图。图10A、图10B、图10E以及图10F为示出在基线处(BL)以及CGRP-mAb或同型-对照Ab施用之后1-4小时时，在刷拭、压力以及夹捏情况下HT(图10A和图10E)和WDR(图10B和图10F)对皮肤感受野机械刺激的反应的图。括号中的数字示出了每次刺激期间的平均放电率。Bin宽＝1sec。图10C和图10D为示出了雄性(图10C)和雌性(图10D)大鼠中接受CGRP-mAb的神经元的整个样品在基线处以及药物施用之后1-4小时时响应于皮肤刺激的平均(±S.E.)放电率的图。图10G和图10H为示出雄性(图10G)和雌性(图10H)大鼠中接受同型-对照Ab的神经元的整个样品在基线处以及药物施用之后1-4小时时响应于皮肤刺激的平均(±S.E.)放电率的图。图10C、图10D、图10G以及图10H中的括号中的数字展示每个组中的神经元数目。
图11A、图11B、图11C、图11D、图11E以及图11F为示出CGRP-mAb(图11A、11B以及11C)和同型-对照Ab(图11D、11E以及11F)对雄性和雌性大鼠中中枢三叉神经血管神经元对角膜机械刺激的反应的影响的图。图11A和图11D为示出了在基线处(BL)以及向HT神经元施用CGRP-mAb(图11A)或同型-对照Ab(图11D)之后1-4小时时，对通过温和刷拭对角膜的机械刺激的反应的图。括号中的数字示出了每次刺激期间的平均放电率。Bin宽＝1sec。图11B和图11C为示出雄性(图11B)和雌性(图11C)大鼠中接受CGRP-mAb的神经元的整个样品在基线处以及施用药物之后1-4小时时响应于角膜刺激的平均(±S.E.)放电率的图。图11E和11F为示出雄性(图11E)和雌性(图11F)大鼠中接受同型-对照Ab的神经元的整个样品在基线处以及药物施用之后1-4小时时响应于角膜刺激的平均(±S.E.)放电率的图。图11B、图11C、图11E以及图11F中的括号中的数字展示每一组中的神经元数目。
图12A、图12B、图12C、图12D、图12E以及图12F为示出CGRP-mAb(图12A、图12B以及12C)和同型-对照Ab(图12D、图12E以及图12F)对药物处理后4小时时所诱导的皮层扩散抑制(CSD)对三叉神经血管神经元的活化的影响的图。图12A和图12D为示出在CSD诱导之前4小时时接受CGRP-mAb(图12A)或同型-对照Ab(图12D)的两个HT神经元中，在CSD诱导之前(顶部)、CSD诱导期间(中间)以及CSD后2小时时(底部)的三叉神经血管神经元放电的图。Bin宽＝1sec。图12B和图12C为示出在雄性(图12B)和雌性(图12C)大鼠中针对在同型-对照Ab施用之后的CSD反应所测试的HT和WDR三叉神经血管神经元的整个样品的平均(±S.E.)放电率的图。图12E和图12F为示出雄性(图12E)和雌性(图12F)大鼠中针对在CGRP-mAb施用之后的CSD反应所测试的HT和WDR三叉神经血管神经元的整个样品的平均(±S.E.)放电率的图。示出在基线处(药物处理后4小时，CSD诱导之前)以及CSD后2小时时的放电。*，与基线相比p<0.05。图12B、图12C、图12E以及图12F中的括号中的数字展示每一组中的神经元数目。
图13A和图13B展示雄性和雌性大鼠中硬脑膜和皮肤感受野在发生CSD之后扩大。蓝色(左上至右下对角线)和粉色(右上至左下对角线)分别说明在同型-对照Ab(图13A)和CGRP-mAb(图13B)处理的大鼠中CSD诱导之前和CSD诱导之后2小时时的硬脑膜和皮肤感受野。
图14A、图14B、图14C、图14D、图14E以及图14F为表明CSD之后对硬脑膜机械刺激的增强反应因CGRP-mAb而受阻的图。图14A和图14D为示出在CSD诱导之前4小时时接受CGRP-mAb(图14A)或同型-对照Ab(图14D)处理的两个HT神经元中，在CSD诱导之前(BL)以及CSD后2小时时对硬脑膜凹陷的反应的图。括号中的数字示出了每次刺激期间的平均放电率。Bin宽＝1sec。图14B、图14C、图14E以及图14F为示出在接受同型-对照Ab(图14B和图14C)或CGRP-mAb(图14E和图14F)处理的神经元中，在CSD诱导之前(基线)以及CSD后2小时时响应于硬脑膜凹陷的平均(±S.E.)放电的图。图14B和图14E中示出了在雄性中所记录的神经元；图14C和图14F中示出了在雌性中所记录的神经元。*，与基线相比p<0.05。图14B、图14C、图14E以及图14F中的括号中的数字展示每一组中的神经元数目。
图15A、图15B、图15C、图15D、图15E以及图15F为示出CSD之后对皮肤刺激的增强反应因CGRP-mAb而受阻的图。图15A和15D为示出CSD诱导之前4小时时接受CGRP-mAb(图15A)或同型-对照Ab(图15D)的两个HT神经元在CSD诱导之前(BL)和CSD后2小时对刷拭、压力以及夹捏情况下的皮肤感受野机械刺激的反应的图。括号中的数字示出了每次刺激期间的平均放电率。Bin宽＝1sec。图15B、图15C、图15E以及图15F为示出在CSD诱导之前4小时时接受同型-对照Ab或CGRP-mAb处理的HT神经元中，在CSD诱导之前(基线)和CSD诱导后2小时时响应于皮肤刺激的平均(±S.E.)放电的图。图15B和图15E中示出了雄性中所记录的神经元；图15C和图15F中示出了雌性中所记录的神经元。*，与基线相比p<0.05。
图16A、图16B、图16C、图16D、图16E以及图16F为示出CSD之后对角膜机械刺激的增强反应因CGRP-mAb而受阻(仅雌性)的图。图16A和图16D为示出在CSD诱导之前4小时时接受同型-对照Ab(图16A)或CGRP-mAb(图16D)处理的两个HT神经元中，在CSD诱导之前(BL)和CSD后2小时时对角膜刺激(温和刷拭)的反应的图。Bin宽＝1sec。图16B、图16C、图16E以及图16F为示出在CSD诱导之前4小时时接受同型-对照Ab(图16B和图16C)或CGRP-mAb(图16E和16F)处理的神经元中，在CSD诱导之前(基线)和CSD后2小时时响应于角膜刺激的平均(±S.E.)放电的图。图16B和图16E中示出了雄性中所记录的神经元；图16C和图16F中示出了雌性中所记录的神经元。*，与基线相比p<0.05。
图17为示出在施加所指示的刺激后雄性和雌性大鼠中原初状态和CSD后状态下HT和WDR神经元的自发性活动的研究结果(如实施例5中所描述)的表格。
图18A、图18B以及图18C为示出CSD对a-δ脑膜伤害感受器的活化的图。图18A为示出示例性个别a-δ纤维对CSD的反应的图。0至60min示出了神经元的基线自发性活动，而60至120min示出了CSD之后神经元的放电率。图18B为示出由CSD活化的六个a-δ纤维的平均(±SE)反应量值的柱状图(p<0.05)。图18C为示出所有六个a-δ神经元的反应频率变化的图。
图19A、图19B以及图19C为示出CSD对C型脑膜伤害感受器的活化的图。图19A为示出示例性个别C型纤维对CSD的反应的图。0至60min示出了神经元的基线自发性活动，而60至120min示出了CSD之后神经元的放电率。图19B示出了由CSD活化的六个C型纤维的平均(±SE)反应量值(p<0.05)。图19C示出了所有六个C型神经元的反应频率变化。
图20A和图20B表明夫瑞奈组单抗阻止大多数a-δ和一些C型脑膜伤害感受器的活化。图20A示出了CSD之后自发性活动未显示变化的夫瑞奈组单抗处理的a-δ纤维的个别实例。图20B示出了用夫瑞奈组单抗处理之后两个C型脑膜伤害感受器对CSD的反应的实例。注意，上部神经元未被CSD活化，而下部神经元被CSD活化。
图21A和图21B为示出A-δ或C型脑膜伤害感受器被CSD活化的发生率的表格。
图22A示出了如何自三叉神经节中的硬脑膜主要传入神经伤害感受器获得单细胞记录，同时记录尾部皮层的皮层脑电图活动。三角形示出了木防己苦毒素施用的位点。
图22B示出了根据对覆盖横窦的硬脑膜施加的单一冲击刺激的反应鉴定硬脑膜传入神经，并且根据其对硬脑膜弗莱(VFH)刺激的反应进一步表征为机械敏感性的。
图22C为示出硬脑膜感受野的位置的柱状图。
图22D为用木防己苦毒素诱导癫痫之前和之后的皮层脑电图(上部迹线)和硬脑膜传入神经的放电率(下部迹线)。三角形示出了木防己苦毒素施用的时间。
图23A示出了一种实验设置，所述设置示出了顶叶皮层中的ECG记录、上颈部背角板层I中的神经元记录以及神经元的硬脑膜和面部感受野的位置。
图23B为示出对硬脑膜的电刺激的图。
图23C为示出了对硬脑膜的机械刺激的柱状图。
图23D示出了根据对分级面部皮肤机械刺激的反应表征为广动力范围(WDR)的神经元的ECG记录。
图23E表明将木防己苦毒素局部施加至顶叶皮层诱导皮层癫痫(上部迹线)和神经元放电的暂时抑制，随后为持续增加至超过基线，这在癫痫活动停止之后持续。
图24表明抗CGRP拮抗剂抗体阻止癫痫对中枢三叉神经血管神经元的活化。当诱导癫痫之前四小时时以静脉内方式给予(30mg/kg)时，TEV-48125阻止中枢三叉神经血管神经元的活化，但不阻止癫痫发生。上部图示出了皮层中的癫痫活动。下部图示出了中枢神经元中缺乏活动。
具体实施方式
本文提供一种降低头痛频率的方法，所述方法包括a)选择患者，所述患者的头痛由高阈值神经元的活化和敏化介导；以及b)向患者施用足以降低患者的头痛频率的量的调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体。在一个实施方案中，高阈值神经元的敏化取决于来自脑膜的疼痛信号的到来。
大量证据支持CGRP在偏头痛的病理生理学中的重要作用。此证据使得全球努力研发降低偏头痛患者中CGRP的可获得性的新一代治疗剂。最近，人源化单克隆抗CGRP抗体中的夫瑞奈组单抗(TEV-48125)被发现有效降低慢性或阵发性偏头痛的频率。
使用单细胞细胞外记录技术来测定TEV-48125(30mg/kg，静脉内)和其同型(对照)对麻醉雄性和雌性大鼠中延髓和上部颈背角中的原初和CSD敏化中枢三叉神经血管神经元中的自发和诱发活动的影响(参见例如实施例5)。
本文所描述的研究证实，抗CGRP抗体夫瑞奈组单抗(TEV-48125)抑制原初高阈值(HT)三叉神经血管神经元，但不抑制广动力范围(WDR)三叉神经血管神经元，抑制作用限于其来自颅内硬脑膜而非面部皮肤或角膜的活化，并且当给予充足时间时，此药物阻止HT但不阻止WDR神经元因皮层扩散抑制而活化和敏化。雄性与雌性大鼠中此抑制为类似的。
对于慢性和阵发性偏头痛因抗CGRP抗体(诸如夫瑞奈组单抗)而缓解的患者，所述发现增加以下情况的可能性：HT神经元在头痛感知的起始和慢性化中发挥关键的先前未识别的作用，而WDR神经元促成相关异常性疼痛和中枢敏化(参见实施例5)。临床上，所述发现可帮助解释抗CGRP抗体在减轻颅内来源的头痛(诸如偏头痛)以及归因于脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血以及某些脑肿瘤的头痛中的治疗作用。此发现还解释了为什么此治疗方法可能并非对每个头痛患者均有效。
定义
如本文所用，“约”当用于提及数值范围、截止值或特定值时用于表明所叙述的值可相较于所列的值变化最多多达10％。因此，术语“约”用于涵盖相较于所规定的值±10％或更小的变化、±5％或更小的变化、±1％或更小的变化、±0.5％或更小的变化或±0.1％或更小的变化。
“抗体”为能够通过至少一个抗原识别位点特异性结合于诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等靶标的免疫球蛋白分子，所述至少一个抗原识别位点定位于免疫球蛋白分子的可变区。如本文所用，所述术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分(诸如结构域抗体)的融合蛋白以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其子类)，并且抗体不需要属于任何特定类别。根据抗体重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配到不同类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且其中若干可进一步划分成诸多个子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的次单元结构和三维构型为熟知的。
如本文所用，“单克隆抗体”或“mAb”是指获自基本上均质的抗体群体的抗体，即构成所述群体的个别抗体为相同的，除了可以微小量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体具高度特异性，从而针对单一抗原位点。此外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比之下，每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。修饰词“单克隆”指示抗体的特征为获自基本上均质的抗体群体，并且不应被视为要求通过任何特定方法来产生抗体。举例来说，要根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler和Milstein,1975,Nature,256:495首次描述的杂交瘤法来制备，或可通过诸如美国专利号4,816,567中所描述的重组DNA法来制备。还可从使用例如McCafferty等,1990,Nature,348:552-554中所描述的技术产生的噬菌体文库分离单克隆抗体。
如本文所用，“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体形式，它们是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者的互补决定区(CDR)的残基由具有所需特异性、亲和力以及生物活性的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由对应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含接受者抗体与输入的CDR或构架序列中均不存在的残基，但也可包括所述残基以进一步改善和优化抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含至少一个并且典型地两个可变域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有的FR区为人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳还将包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，典型地为人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区或结构域。抗体可具有如WO 99/58572中所描述进行修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体有所改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，所述一个或多个CDR也称为“衍生自”原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
如本文所用，“人抗体”意指抗体具有对应于由人产生和/或已使用本领域中已知或本文所公开的任何用于制备人抗体的技术制备的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列。人抗体的此定义包括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个此类实例为包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。在一个实施方案中，人抗体是选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等,1996,Nat.Biotechnol.,14:309-314；Sheets等,1998,PNAS,(USA)95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。还可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全去活化的小鼠)中来制备人抗体。美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；以及5,661,016中描述了此方法。或者，可通过使产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(此类B淋巴细胞可从个体回收或可已在体外进行免疫)永生化来制备人抗体。参见例如Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；以及美国专利号5,750,373。
如本文所用，术语“降钙素基因相关肽”和“CGRP”是指任何形式的降钙素基因相关肽和其保留至少部分CGRP活性的变体。举例来说，CGRP可为α-CGRP或β-CGRP。如本文所用，CGRP包括所有哺乳动物物种(例如人、犬、猫、马以及牛)的天然序列CGRP。
如本文所用，“抗CGRP抗体”是指调节CGRP生物活性或CGRP路径，包括由CGRP信号传导介导的下游路径(诸如受体结合和/或引出细胞对CGRP的反应)的抗体。举例来说，抗CGRP抗体可阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径。术语抗CGRP抗体涵盖“抗CGRP拮抗剂抗体”与“抗CGRP受体抗体”两者。在一些实施方案中，抗CGRP抗体为单克隆抗体(即，抗CGRP单克隆抗体)。
“抗CGRP拮抗剂抗体”是指能够结合于CGRP并且由此抑制CGRP生物活性和/或由CGRP信号传导介导的一个或多个下游路径的抗体。抗CGRP拮抗剂抗体涵盖调节、阻断、拮抗、阻抑或降低CGRP生物活性或以其他方式拮抗CGRP路径，包括由CGRP信号传导介导的下游路径(诸如受体结合和/或引出细胞对CGRP的反应)的抗体。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体结合CGRP并且阻止CGRP结合于CGRP受体。在其他实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体结合CGRP并且阻止CGRP受体活化。本文提供了抗CGRP拮抗剂抗体的实例。
“抗CGRP受体抗体”是指能够结合于CGRP受体并且由此调节CGRP路径的抗体。本文提供了抗CGRP受体抗体的实例(例如厄瑞奴单抗)。
如本文所用，术语“G1”、“抗体G1”、“TEV-48125”以及“夫瑞奈组单抗”可互换地用于指由保藏号为ATCC PTA-6867和ATCC PTA-6866的表达载体产生的抗CGRP拮抗剂抗体。图5中示出了重链和轻链可变区的氨基酸序列。图5中图解展示了抗体G1的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)。SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中示出了编码重链和轻链可变区的多核苷酸。SEQ ID NO:11中示出了G1重链全长氨基酸序列。SEQ ID NO:12中示出了G1轻链全长氨基酸序列。下文的实施例1-4以及PCT公布号WO 2007/054809和WHO DrugInformation30(2):280-1(2016)中描述了抗体G1(和其变体)的表征和制备方法，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
术语“ALD403”和“艾普汀单抗”是指为来自兔前体的人源化IgG1单克隆抗体的抗CGRP拮抗剂抗体。在美国公布号US 2012/0294797和WHO Drug Information 30(2):274-5(2016)中可找到艾普汀单抗的表征和制备方法，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
术语“LY2951742”和“加卡珠单抗”是指为来自鼠前体的人源化IgG4单克隆抗体的抗CGRP拮抗剂抗体。在美国公布号US 2011/0305711和WHO Drug Information 29(4):526-7(2015)中可找到加卡珠单抗的表征和制备方法，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。在PCT公布号WO 2016/205037中可找到与加卡珠单抗相关的给药和配方，所述参考文献也以全文引用的方式并入本文中。
术语“AMG334”和“厄瑞奴单抗”是指为完全人源化IgG2抗体的抗CGRP受体抗体。在美国公布号US 2010/0172895、美国专利号9,102,731以及WHO DrugInformation 30(2):275-6(2016)中可找到厄瑞奴单抗的表征和制备方法，所述参考文献中的每一者以全文引用的方式并入本文中。在PCT公布号WO 2016/171742中可找到与厄瑞奴单抗相关的给药和配方，所述参考文献也以全文引用的方式并入本文中。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为直链或分枝链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可夹杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已天然地或通过例如以下干预修饰的氨基酸聚合物：二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域中已知的其他修饰。应了解，因为本发明的多肽是基于抗体的，所以多肽可以单链或缔合链的形式存在。
如本文中可互换使用，“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物或可由DNA或RNA聚合酶合并至聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和其类似物。如果存在，那么可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可夹杂有非核苷酸组分。可在聚合之后诸如通过与标记组分缀合进一步对多核苷酸进行修饰。其他类型的修饰包括例如“帽”、天然存在的核苷酸中的一者或多者用类似物取代、核苷酸间修饰，诸如具有不带电荷的键联(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键联(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、含有侧接部分(诸如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等))的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷基化剂的修饰、具有经修饰的键联(例如α端基异构核酸等)的修饰，以及未修饰形式的一种或多种多核苷酸。另外，通常存在于糖中的羟基中的任一者可例如由膦酸酯基、磷酸酯基置换，由标准保护基保护，或发生活化以为额外核苷酸准备额外键联，或可缀合至固体支撑物。5'和3'端OH可为磷酸化的或用胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。还可将其他羟基衍生为标准保护基。多核苷酸还可含有类似形式的核糖或脱氧核糖，这些形式通常为本领域中已知的，包括例如，2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基核糖、2'-氟-核糖或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖(lyxose))、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非环类似物以及无碱基核苷类似物，诸如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键联可由替代键联基团置换。这些替代键联基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯由P(O)S(“硫代酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代酯(dithioate)”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲酰乙缩醛”)置换，其中每个R或R'独立地为H或任选含有醚(-O-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的取代或未取代的烷基(1-20C)。并非多核苷酸中所有键联均需要相同。前述描述适用于本文中提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
头痛的诊断或评估为本领域中充分确定的。熟练从业者可使用诸如International Classification of Headache Disorders,第3版(ICHD-IIIβ版；Cephalalgia(2013)33(9):629-808)等参考文献来评估患者经历的头痛类型。本发明范围内的头痛包括颅内来源的头痛。颅内来源的头痛的非限制性实例包括偏头痛(例如慢性和阵发性)以及归因于脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血以及某些脑肿瘤的头痛(其中头痛是由颅内压力增加引起)。
举例来说，“慢性偏头痛”是指头痛每月发生15天或更多天持续超过三个月，所述头痛每月至少8天具有偏头痛特征。根据ICHD-IIIβ版,2013慢性偏头痛的诊断准则如下：
A.每月头痛(紧张型样和/或偏头痛样)≥15天持续>3个月并且满足准则B和C(以下)。
B.发生在有过至少五次发作满足无预兆偏头痛的某些准则和/或有预兆偏头痛的某些准则的患者中
C.每月≥8天持续>3个月，满足以下中的任一者：
1.无预兆偏头痛的某些准则
2.有预兆偏头痛的某些准则
3.在发作时患者认为是偏头痛并且因曲普坦(triptan)或麦角衍生物而缓解
D.通过其他头痛诊断不能更好地解释。
熟练从业者将能够容易地识别具有本文所描述类型偏头痛中的任一者的受试者。可基于主观测量(诸如患者症状表征)进行评估。举例来说，可基于以下准则来诊断偏头痛：1)阵发性头痛发作持续4至72小时；2)具有以下症状中的两者：单侧疼痛、搏动性、运动后加重以及中度或重度强度的疼痛；以及3)以下症状中的一者：恶心或呕吐以及畏光或畏声(Goadsby等,N.Engl.J.Med.346:257-270,2002)。在一些实施方案中，可如本文别处所描述经由头痛小时数来评估头痛(例如偏头痛)。举例来说，可根据每天头痛小时数、每周头痛小时数，每月头痛小时数和/或每年头痛小时数来评估头痛(例如偏头痛)。在一些情况下，头痛小时数可如受试者所报道。
如本文所用，“治疗”为用于获得有益或所需临床结果的途径。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于以下中的一者或多者：头痛的任何方面的改良(包括严重程度减轻、疼痛强度以及其他相关症状的缓解)、复发频率降低、罹患头痛的患者的生活质量提高以及治疗头痛所需的其他药物的剂量降低。使用偏头痛作为实例，其他相关症状包括但不限于恶心、呕吐以及对光、声音和/或运动敏感。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，患者为人类。
如本文所用，“预防”为防止易于发展头痛的受试者中发生或存在头痛的途径。举例来说，患者可先前被诊断为具有慢性或阵发性偏头痛。在其他实例中，患者可已被诊断为具有脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
“降低头痛发生率”或“降低头痛频率”意指降低严重程度(其可包括降低对(例如暴露于)通常用于此头痛疾患的其他药物和/或疗法的需要和/或量)、减少持续时间和/或降低频率(包括例如延迟或增加到个体中下一次头痛发作的时间)中的任一者。如本领域技术人员所理解，个体对治疗的反应可变化，并且因而，举例来说，“降低个体的头痛频率的方法”是基于此类施用有可能在所述特定个体中引起此类头痛发生率减少的合理预期来考虑施用抗CGRP拮抗剂抗体。
“改善”头痛或头痛的一种或多种症状意指与不施用抗CGRP拮抗剂抗体相比头痛的一种或多种症状的减轻或改良。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。
如本文所用，“控制头痛”是指维持或降低个体中头痛的一种或多种症状的严重程度或持续时间或者头痛(例如偏头痛)发作的频率(与治疗之前的水平相比)。举例来说，与治疗之前头痛的持续时间或严重程度或者发作频率相比，个体中头痛的持续时间或严重程度或者发作频率降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。
如本文所用，“头痛小时”是指期间受试者经历头痛的一小时。头痛小时数可根据整个小时数(例如头痛一小时、头痛两小时、头痛三小时等)或根据整个和部分小时数(例如头痛0.5小时、头痛1.2小时、头痛2.67小时等)来表述。头痛一小时或多个小时可相对于特定时间间隔来描述。举例来说，“每天头痛小时数”可指受试者在一天间隔(例如24-小时时间)内经历的头痛小时数。在另一实例中，“每周头痛小时数”可指受试者在一周间隔(例如7-天时间)内经历的头痛小时数。如可理解，一周间隔可能对应于或可能不对应于日历周。在另一实例中，“每月头痛小时数”可指受试者在一个月间隔内经历的头痛小时数。如可理解，一个月间隔(例如28、29、30或31天的时间)的天数可变化，这取决于特定月份并且可能对应于或可能不对应于日历月。在另一实例中，“每年头痛小时数”可指受试者在一个年间隔内经历的头痛小时数。如可理解，一个年间隔(例如365或366天的时间)的天数可变化，这取决于特定年份并且可能对应于或可能不对应于日历年。
如本文所用，“头痛天”是指期间受试者经历头痛的一天。头痛天数可根据整个一天(例如头痛一天、头痛两天、头痛三天等)或根据整个和部分天(例如头痛0.5天、头痛1.2天、头痛2.67天等)来表述。头痛一天或多天可相对于特定时间间隔来描述。举例来说，“每周头痛天数”可指受试者在一周间隔(例如7-天时间)内经历的头痛天数。如可理解，一周间隔可能对应于或可能不对应于日历周。在另一实例中，“每月头痛天数”可指受试者在一个月间隔内经历的头痛天数。如可理解，一个月间隔(例如28、29、30或31天的时间)的天数可变化，这取决于特定月份并且可能对应于或可能不对应于日历月。在另一实例中，“每年头痛天数”可指受试者在一个年间隔内经历的头痛天数。如可理解，一个年间隔(例如365或366天的时间)的天数可变化，这取决于特定年份并且可能对应于或可能不对应于日历年。
如其中所用，“延迟”头痛发展意指推迟、阻碍、减慢、阻滞、稳定和/或推后疾病的进展。此延迟可根据病史和/或所治疗的个体具有变化的时间长度。如对本领域技术人员显而易见的，充足或显著延迟可事实上涵盖预防，因为个体不发展头痛。“延迟”症状发展的方法为如下方法，所述方法当与不使用所述方法相比时降低给定时间框内发展症状的可能性和/或降低给定时间框内症状的程度。典型地基于临床研究使用统计显著性数目的受试者来进行此类比较。
头痛的“发展”或“进展”意指病症的初始表现和/或随后的进展。头痛的发展可为可检测的并且使用如本领域中熟知的标准临床技术进行评价。然而，发展也指可能不可检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物过程。“发展”包括发生、复发以及发作。如本文所用头痛的“发作”或“发生”包括初次发作和/或复发。
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”为足以实现有益或所需结果的量。对于预防性用途，有益或所需结果包括诸如以下结果：消除或降低疾病(包括疾病的生物化学、组织和/或行为症状；其在疾病发展期间存在的并发症和中间病理表型)的危险、减轻其严重程度或延迟其发作。对于治疗性用途，有益或所需结果包括诸如以下临床结果：降低头痛发作的疼痛强度、持续时间或频率，以及减轻由头痛引起的一种或多种症状(生物化学、组织和/或行为)，包括其在疾病发展期间存在的并发症和中间病理表型；提高罹患疾病的患者的生活质量；降低治疗疾病所需的其他药物的剂量；增强另一药物的效果；和/或延迟患者疾病的进展。可以一次或多次施用的形式施用有效剂量。出于本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量为足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景下所了解，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能结合或可能不结合另一药物、化合物或药物组合物来实现。因此，“有效剂量”可以是在施用一种或多种治疗剂的情形下考虑，并且如果结合一种或多种其他剂可实现或实现了所需结果，那么可将单一剂视为以有效剂量给予。
如本文所用，“异常性疼痛”是指由患者经历的并且由一般不引发疼痛的刺激所引起的疼痛(International Association for the Study of Pain,2014-2015,“Allodyniaand Hyperalgesia in Neuropathic Pain”)。
如本文所用，“痛觉过敏”是指由患者经历的由一般会引起疼痛的刺激引起的疼痛增加(International Association for the Study of Pain,2014-2015,“Allodynia andHyperalgesia in Neuropathic Pain”)。
本领域技术人员可通过诸如定量感觉测试(QST)(Rolke(2006)等Pain 123:231-243)等方法来区分和定量异常性疼痛与痛觉过敏。Rolke等教示用于获得患者的相对与绝对完全体感表型的QST参考数据。举例来说，Rolke等描述了一种针对机械疼痛敏感度(MPS)的测试作为用于检测针刺痛觉过敏的手段。在此类测试中，可使用一组针刺刺激获得关于针刺诱发的疼痛的刺激-反应函数(其中最强针刺力为平均机械疼痛阈值的约八倍)来评价MPS。可要求受试者按‘0-100’尺度针对每次刺激为疼痛给出评分，其中‘0’指示没有疼痛并且‘100’指示最高疼痛。以特定时间间隔为受试者递送某一数目的针刺以避免上扬(wind-up)。在每次针刺之后，受试者提供数值疼痛评分。然后以针刺刺激的所有数值评分的几何平均数(复合度量)的形式计算MPS(Rolke等在第233页)。
如本文所用，“敏化”为随时间推移产生反应所需的刺激强度降低，而反应振幅增加的过程。
短语“主要在头部的一部分中经历头痛”是指患者描述在头部的确定部分中具有头痛(经历如同例如疼痛)。“头部部分”的实例包括单侧眶周、单侧颞部、一只眼睛、头部后部的一小区域(例如仅中线外侧)、头部顶部的一小区域、前额中间的一小区域、眶上神经离开颅骨的‘点’(例如10x10mm)(即，在眉毛内端中)以及前额上的一小区域。本领域技术人员将能够基于患者的描述评估患者是否在头部的一部分中经历头痛(Noseda,R.等(2016)Brain.139(7):1971-1986)。
A.抗CGRP抗体用于降低头痛频率的方法和用途
本文提供一种降低患者的头痛(例如偏头痛)频率的方法。所述方法包括选择患者，所述患者经历由高阈值(HT)神经元的活化和敏化(例如通过皮层扩散抑制(CSD)、响应于脑膜中的任何脉管舒张或从脑膜进来疼痛信号)介导的头痛。然后用抗CGRP抗体对患者进行治疗。
选择患者包括确定患者的头痛是否由HT神经元介导。熟练从业者将了解，此类确定可以本文所描述的多种方式进行，诸如通过观测HT神经元活动和/或向患者施用调节CGRP路径的单克隆抗体并且确定抗体是否减轻痛觉过敏(如例如通过QST所测量)，和/或确定患者的头痛定位于头部的一部分中(例如在其中的经历最强烈或最主要)。
实施例5描述可用来鉴定和选择大鼠中的神经元(HT与WDR神经元)的手段。此实施例还描述了结合CSD诱导之后这些类型的神经元中的每一者的活化和敏化进行的观测。
经历痛觉过敏的患者可能对包含调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体的疗程(例如较长的抗CGRP抗体疗程和/或较高剂量的抗CGRP抗体疗程)作出反应，其中所述痛觉过敏在施用调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体后减轻(例如逆转或消除)。如果抗CGRP抗体减轻痛觉过敏患者的头痛，那么证实头痛由HT神经元介导，因为如实施例5中所示抗CGRP抗体不抑制另一类别的伤害感受性神经元WDR。实施例6描述了QST的实验设计，QST适用于确定患者是否经历痛觉过敏，以及在用抗CGRP抗体治疗后它是否减轻。
同样地，经历异常性疼痛的患者可能对包含调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体的疗程(例如较长的抗CGRP抗体疗程和/或较高剂量的抗CGRP抗体疗程)作出反应，其中所述异常性疼痛在施用调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体后减轻(例如逆转或消除)。
因此，对抗CGRP抗体治疗作出反应的患者在第一疗程之后可经历痛觉过敏与异常性疼痛两者的减少、逆转或消除。
另外，已知高阈值神经元表现出小感受野，而广动力范围神经元表现出大感受野。因此，定位于头部的一部分中(或主要在其中经历)的头痛可鉴定将有利地对用调节CGRP路径的单克隆抗体治疗作出反应的患者。
因此，一种治疗策略包括：a)选择患者，所述患者表现出能够通过施用调节CGRP路径的第一单克隆抗体而减轻的痛觉过敏；以及b)向患者施用足以降低患者的头痛频率的量的阻断、抑制、阻抑或减少CGRP路径的第二单克隆抗体。在此类治疗中，向患者施用的第一和第二单克隆抗体可为相同类型的抗CGRP抗体或不同类型的抗CGRP抗体，并且每一者均可以静脉内或皮下方式或两者施用给患者。举例来说，第一和第二单克隆抗体可各自独立地选自抗CGRP拮抗剂抗体和抗CGRP受体抗体。在一些治疗方案中，第一和第二单克隆抗体可为抗CGRP拮抗剂抗体。在其他治疗方案中，第一单克隆抗体可为抗CGRP拮抗剂抗体，而第二单克隆抗体可为抗CGRP受体抗体。第一和第二单克隆抗体可为人抗体或人源化抗体。第一和/或第二单克隆抗体可各自独立地选自IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4抗体。
在一些情况下，在患者没有头痛(例如没有偏头痛)时施用第一和/或第二单克隆抗体。在其他实施方案中，在患者经历头痛(例如偏头痛)时施用第一和/或第二单克隆抗体。
在患者经历偏头痛时的情况下，优选在偏头痛发作之后不久进行施用。举例来说，可在患者经历前驱症状(即，头痛之前的症状，诸如预兆)时，但在头痛阶段之前进行施用。
在另一实施方案中，患者被诊断为或先前被诊断为患有阵发性或慢性偏头痛。在此类患者中，可在患者没有偏头痛或经历偏头痛或轻度偏头痛早期阶段时施用第一和/或第二单克隆抗体。
在另一实施方案中，患者被诊断为或先前诊断为患有脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。在这些情况下，头痛可归因于脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
熟练从业者将了解，可使用本领域中已知的任何方法向患者施用一种或多种抗体。举例来说，可使用预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔、自动注射器或其任何组合向患者施用一种或多种抗体。
特别适合作为第一和/或第二单克隆抗体的是抗CGRP抗体，所述抗CGRP抗体包括a)如SEQ ID NO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ IDNO:8中所示的CDR L3或b)如表5中所示的根据(a)的抗体的变体。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。示例性单克隆抗体为夫瑞奈组单抗(本文中也称为“G1”)。
在选择患者之后，可以约225mg至约900mg的剂量(例如约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约500mg、约525mg、约550mg、约550mg、约575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg或约900mg的剂量)施用第一和/或第二单克隆抗体。可每月或每季向患者施用这些剂量。在一种示例性治疗中，给药方案可包括初始剂量(例如675mg)，并且还包括在患者接受初始剂量的月份之后两个月(或三个月、四个月、五个月、六个月或十二个月)中的每个月内每月一次向患者施用另一约225mg剂量的单克隆抗体。
第一和/或第二单克隆抗体可作为任何适用制剂的一部分并且以任何制剂体积施用。特别适用的是如下制剂，所述制剂包含浓度为至少约150mg/mL(例如约175mg/mL、约200mg/mL、约225mg/mL、约250mg/mL、约275mg/mL、约300mg/mL、约325mg/mL、约350mg/mL、约375mg/mL、约400mg/mL、约425mg/mL、约450mg/mL或更大)的抗体。如下制剂也是适用的，其中单克隆抗体可以小于2mL(例如约1.8mL、约1.7mL、约1.6mL、约1.5mL、约1.4ml、约1.3mL、约1.2mL、约1.1mL、约1.0ml、约0.9mL、约0.8mL、约0.7mL、约0.6mL、约0.5mL或更小)的体积施用。在一些实施方案中，优选以约1.5mL的体积施用单克隆抗体。可以静脉内或皮下方式施用本文所提供的剂量中的任一者(例如约225mg、约675mg或约900mg)。举例来说，可以每月或每季约225mg的剂量施用夫瑞奈组单抗并且以皮下方式施用。
以下第一和/或第二单克隆抗体也适合用于本文所描述的治疗方法中，所述第一和/或第二单克隆抗体包括如SEQ ID NO:87中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:88中所示的CDRH2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。此类抗体的示例性抗体将为艾普汀单抗。可以约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg或约1000mg的剂量施用此抗体。可以静脉内或皮下方式施用本文所提供的剂量中的任一者(例如约100mg、约300mg或约1000mg)。
以下第一和/或第二单克隆抗体也是适用的，所述第一和/或第二单克隆抗体包括如SEQ ID NO:93中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ IDNO:98中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。此类抗体的示例性抗体将为加卡珠单抗。可以约100mg、约120mg、约150mg、约200mg、约240mg、约250mg、约300mg、约350mg、约360mg、约400mg、约450mg、约480mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg或约1000mg的剂量施用此抗体。另外，可以约1.5mL的体积施用120mg剂量并且可以约3mL的体积施用240mg剂量。可以静脉内或皮下方式施用本文所提供的剂量中的任一者(例如约120mg或240mg)。
以下第一和/或第二单克隆抗体也是适用的，所述第一和/或第二单克隆抗体包括如SEQ ID NO:103中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ IDNO:106中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，第一和/或第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。此类抗体的示例性抗体将为厄瑞奴单抗。可以约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg的剂量施用厄瑞奴单抗。另外，可以约1mL的体积施用70mg剂量。可以约2mL的体积施用140mg剂量。可以静脉内或皮下方式施用本文所提供的剂量中的任一者(例如约70mg或140mg)。
因此，在本文所描述的某些方法中，要用于本文所描述的方法中的单克隆抗体可选自由以下组成的组：夫瑞奈组单抗、艾普汀单抗、加卡珠单抗、厄瑞奴单抗以及其生物等效物。
抗CGRP抗体的施用可通过本领域中已知的任何手段来进行，包括：经口、静脉内、皮下、动脉内、肌肉内、鼻内(例如在进行或不进行吸入的情况下)、心内、脊柱内、胸内、腹膜内、心室内、舌下、经皮和/或经由吸入。施用可为全身性的(例如静脉内)或局部的。在一些实施方案中，经由相同途径(即，以皮下或静脉内方式)施用初始剂量和一个或多个额外剂量。在一些实施方案中，经由与初始剂量不同的途径施用一个或多个额外剂量，即，可以静脉内方式施用初始剂量并且可以皮下方式施用一个或多个额外剂量。
在一些情况下，本文所描述的方法可还包括与单克隆抗体同时或依序向患者施用第二剂。第二剂可为非类固醇消炎药(NSAID)和/或曲普坦和/或5羟色胺1F受体激动剂(即，血清素受体激动剂)。在一些情况下，第二剂为预防性地施用给患者的剂。
可与抗CGRP抗体组合使用的NSAID的非限制性实例包括阿司匹林(aspirin)、双氯芬酸、二氟新诺(diflusinal)、依托度酸(etodolac)、芬布芬(fenbufen)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟苯柳(flufenisal)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯灭酸、甲灭酸、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、苯基保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)或佐美酸(zomepirac)、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、美洛昔康(meloxicam)、JTE-522、L-745,337、NS398或其药学上可接受的盐。
可与抗CGRP抗体组合使用的曲普坦的非限制性实例包括舒马曲坦(sumatriptan)、佐米曲坦(zolmitriptan)、那拉曲坦(naratriptan)、利扎曲坦(rizatriptan)、依利曲坦(eletriptan)、阿莫曲坦(almotriptan)以及夫罗曲坦(afrovatriptan)。
5羟色胺1F受体激动剂的非限制性实例为拉司米地坦(lasmiditan)。
本文所提供的方法的预防、治疗或减轻可包括减少任何严重程度的头痛小时数、减少任何严重程度的偏头痛小时数、减少任何严重程度的每月头痛天数、减少任何严重程度的每月偏头痛天数、减少任何急性头痛药物的使用、降低6-项头痛击打测试(HIT-6)功能障碍得分、提高12-项简易形式健康调查(SF-12)得分(Ware等,Med.Care 4:220-233,1996)、降低患者总体变化印象(PGIC)得分(Hurst等,J.Manipulative Physiol.Ther.27:26-35,2004)、提高运动震荡评估工具3(SCAT-3)得分(McCrory等BritishJ.Sport.Med.47:263-266,2013)或其任何组合。在一些实施方案中，在单一施用之后每月头痛或偏头痛天数可减少持续至少七天。
在一些实施方案中，在所述施用之后相较于受试者中的施用前水平，受试者经历的每月头痛或偏头痛小时数减少40或更多小时(例如45、50、55、60、65、70、75、80或更多小时)。每月头痛或偏头痛小时数可减少超过60小时。在一些实施方案中，在所述施用之后相对于受试者中的施用前水平，受试者经历的每月头痛或偏头痛小时数减少25％或更多(例如30％、35％、40％、45％、50％或更多)。每月头痛或偏头痛小时数可减少40％或更多。在一些实施方案中，在所述施用之后相较于受试者中的施用前水平，受试者经历的每月头痛或偏头痛天数减少三天或更多天(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天)。在一些实施方案中，相较于受试者中的施用前水平，每月头痛或偏头痛天数可减少至少约50％。因此，在一些方面中，每月头痛或偏头痛天数可减少至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％或至少约90％。
B.用于治疗方法中的抗CGRP抗体
在一些实施方案中，本文所提供的方法使用抗体，所述抗体可为抗CGRP拮抗剂抗体。抗CGRP拮抗剂抗体可指调节(例如阻断、阻抑或减少，包括显著阻断、阻抑或降低)CGRP生物活性，包括由CGRP信号传导介导的下游路径(诸如受体结合和/或引出细胞对CGRP的反应)的任何抗体分子。
抗CGRP拮抗剂抗体可表现出以下特征中的任何一者或多者：(a)结合于CGRP；(b)阻断CGRP结合于其一个或多个受体；(c)阻断或减少CGRP受体活化(包括但不限于cAMP活化)；(d)抑制CGRP生物活性或由CGRP信号传导功能介导的下游路径；(e)预防、改善或治疗偏头痛的任何方面；(f)增加CGRP的清除率；以及(g)抑制(减少)CGRP合成、产生或释放。抗CGRP拮抗剂抗体为本领域中已知的。参见例如Tan等,Clin.Sci.(Lond).89:565-73,1995；Sigma(Missouri,US),产品编号C7113(克隆#4901)；Plourde等,Peptides 14:1225-1229,1993。
在一些实施方案中，抗体以抑制CGRP和/或CGRP路径，包括由CGRP信号传导功能介导的下游路径的方式与CGRP反应。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体识别人CGRP。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体结合于人α-CGRP与β-CGRP两者。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体结合人CGRP和大鼠CGRP。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体结合CGRP的具有氨基酸25-37的C端片段。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体结合CGRP的氨基酸25-37内的C端表位。
适用于本发明的抗CGRP抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、杂缀合抗体、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分(例如结构域抗体)的融合蛋白、人源化抗体以及免疫球蛋白分子的包含具有所需特异性的抗原识别位点的任何其他经修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体以及共价修饰抗体。抗体可来源于鼠、大鼠、人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。
在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，抗体为人抗体。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体为抗体G1(如本文所描述)。在一些实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体包含抗体G1的一个或多个CDR(诸如一个、两个、三个、四个、五个或在一些实施方案中为所有六个CDR)或表5中所示的G1变体。在其他实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体包含图5中所示的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和图5中所示的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。在其他实施方案中，抗CGRP拮抗剂抗体包含SEQ ID NO:11中所示的重链全长氨基酸序列和SEQID NO:12中所示的轻链全长氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)：(a)LCVR17(SEQ ID NO:58)和HCVR22(SEQ ID NO:59)；(b)LCVR18(SEQ ID NO:60)和HCVR23(SEQ ID NO:61)；(c)LCVR19(SEQ ID NO:62)和HCVR24(SEQ ID NO:63)；(d)LCVR20(SEQ ID NO:64)和HCVR25(SEQ ID NO:65)；(e)LCVR21(SEQ ID NO:66)和HCVR26(SEQ ID NO:67)；(f)LCVR27(SEQ ID NO:68)和HCVR28(SEQ ID NO:69)；(g)LCVR29(SEQ IDNO:70)和HCVR30(SEQ ID NO:71)；(h)LCVR31(SEQ ID NO:72)和HCVR32(SEQ ID NO:73)；(i)LCVR33(SEQ ID NO:74)和HCVR34(SEQ ID NO:75)；(j)LCVR35(SEQ ID NO:76)和HCVR36(SEQ ID NO:77)；以及(k)LCVR37(SEQ ID NO:78)和HCVR38(SEQ ID NO:79)。本文提供了这些区的序列。美国专利公布号US 2011/0305711(SEQ ID NO:5、6、7、12、16、19、24、29、34以及39)、US 2012/0294802、US 2012/0294797(SEQ ID NO:51-60)中描述了抗CGRP抗体的其他实例，这些专利以全文引用的方式并入本文中。举例来说，可使用具有以下序列中的任一者的抗体。
Ab6可变区轻链(人源化)蛋白质序列(US20120294797)
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:80)
Ab6轻链(人源化)全长蛋白序列(US20120294797)
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:81)
Ab6可变区重链(人源化)蛋白质序列(US20120294797)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:82)
Ab6重链(人源化)全长蛋白序列-酵母产生的(US20120294797)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:83)
Ab6可变区轻链(人源化)蛋白质序列CDR1(US20120294797)
QASQSVYHNTYLA(SEQ ID NO:84)
Ab6可变区轻链(人源化)蛋白质序列CDR2(US20120294797)
DASTLAS(SEQ ID NO:85)
Ab6可变区轻链(人源化)蛋白质序列CDR3(US20120294797)
LGSYDCTNGDCFV(SEQ ID NO:86)
Ab6可变区重链(人源化)蛋白质序列CDR1(US20120294797)
GYYMN(SEQ ID NO:87)
Ab6可变区重链(人源化)蛋白质序列CDR2(US20120294797)
IGINGATYYASWAKG(SEQ ID NO:88)
Ab6可变区重链(人源化)蛋白质序列CDR3(US20120294797)
GDI(SEQ ID NO:89)
轻链可变区蛋白质序列CDR3(US20110305711)
QQGDALPPT(SEQ ID NO:90)
轻链可变区蛋白质序列CDR1(US20110305711)
RASKDISKYL(SEQ ID NO:91)
轻链可变区蛋白质序列CDR2(US20110305711)
YTSGYHS(SEQ ID NO:92)
重链可变区蛋白质序列CDR1(US20110305711)
GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO:93)
重链可变区蛋白质序列CDR2(US20110305711)
AIYEGTGKTVYIQKFAD(SEQ ID NO:94)
重链可变区蛋白质序列CDR3(US20110305711)
LSDYVSGFGY(SEQ ID NO:95)
轻链可变区蛋白质序列(US20110305711)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:96)
重链可变区蛋白质序列(US20110305711)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:97)
轻链蛋白质序列(US20110305711)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:98)
重链蛋白质序列(US20110305711)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:99)
在一些实施方案中，抗体包含经修饰的恒定区，诸如本文所描述的免疫惰性的恒定区。
抗CGRP拮抗剂抗体对CGRP(诸如人α-CGRP)的结合亲和力(KD)可为约0.02至约200nM。在一些实施方案中，结合亲和力为以下中的任一者：约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约60pM、约50pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约2pM。在一些实施方案中，结合亲和力小于以下中的任一者：约250nM、约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM。
在一些实施方案中，可将抗CGRP受体抗体用于本文所描述的方法中的任一者中。举例来说，可使用如美国专利公布号US 2010/0172895和美国专利号9,102,731中所描述的抗CGRP受体抗体，所述专利以全文引用的方式并入本文中。因此，可使用具有以下序列中的任一者的抗体。
轻链可变区蛋白质序列CDR1(美国专利号9,102,731)
SGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO:100)
轻链可变区蛋白质序列CDR2(美国专利号9,102,731)
DNNKRPS(SEQ ID NO:101)
轻链可变区蛋白质序列CDR3(美国专利号9,102,731)
GTWDSRLSAVV(SEQ ID NO:102)
重链可变区蛋白质序列CDR1(美国专利号9,102,731)
SFGMH(SEQ ID NO:103)
重链可变区蛋白质序列CDR2(美国专利号9,102,731)
VISFDGSIKYSVDSVKG(SEQ ID NO:104)
重链可变区蛋白质序列CDR3(美国专利号9,102,731)
DRLNYYDSSGYYHYKYYGMAV(SEQ ID NO:105)
轻链可变区蛋白质序列(美国专利号9,102,731)
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGTWDSRLSAVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:106)
重链可变区蛋白质序列(美国专利号9,102,731)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGMAVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:107)
轻链蛋白质序列(美国专利号9,102,731)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGTWDSRLSAVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:108)
重链蛋白质序列(美国专利号9,102,731)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGMAVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:109)
C.抗体G1和相关抗体、多肽、多核苷酸、载体以及宿主细胞
本文提供降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括使用组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含抗体G1和其表5中所示的变体或衍生自抗体G1和其表5中所示的变体的多肽；以及包含编码G1和其变体或所述多肽的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，本文所提供的方法中所用的组合物包含结合于CGRP的一种或多种抗体或多肽(其可能为或可能不为抗体)，和/或包含编码结合于CGRP的一种或多种抗体或多肽的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可还包含本领域中熟知的适合的赋形剂，诸如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
适合用于本文所描述的方法中的抗CGRP拮抗剂抗体和多肽的特征可为以下特征中的任何(一种或多种)：(a)结合于CGRP的能力；(b)阻断CGRP结合于其一个或多个受体的能力；(c)阻断或减少CGRP受体活化(包括cAMP活化)的能力；(d)抑制CGRP生物活性或由CGRP信号传导功能介导的下游路径的能力；(e)预防、改善或治疗头痛(例如偏头痛)的任何方面的能力；(f)增加CGRP清除率的能力；以及(g)抑制(减少)CGRP合成、产生或释放的能力。
以下中的任一者或包含以下中的任一者的组合物(包括药物组合物)适合用于本文所描述的方法中：(a)抗体G1或其表5中所示的变体；(b)抗体G1或其表5中所示的变体的片段或区域；(c)抗体G1或其表5中所示的变体的轻链；(d)抗体G1或其表5中所示的变体的重链；(e)抗体G1或其表5中所示的变体的轻链和/或重链的一个或多个可变区；(f)抗体G1或其表5中所示的变体的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；(g)抗体G1的重链的CDR H3；(h)抗体G1或其表5中所示的变体的轻链的CDR L3；(i)抗体G1或其表5中所示的变体的轻链的三个CDR；(j)抗体G1或其表5中所示的变体的重链的三个CDR；(k)抗体G1或其表5中所示的变体的轻链的三个CDR和重链的三个CDR；以及(l)包含(b)至(k)中的任一者的抗体。在一些情况下，所述方法包括使用包含以上中的任何一者或多者的多肽。
图5中图解展示了抗体G1的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)。CDR区的确定完全在本领域技术范围内。熟练从业者将了解，CDR可为Kabat与Chothia CDR的组合(也称为“组合的CDR”或“延长的CDR”)。在一些情况下，CDR为Kabat CDR，并且在其他情况下，CDR为Chothia CDR。换言之，在其中超过一个CDR为适用的一些情况下，CDR可为Kabat、Chothia、组合CDR或其组合中的任一者。
本文所描述的方法可采用多肽(其可能为或可能不为抗体)，所述多肽包含与G1或其表5中所示的变体的至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或所有六个CDR基本上相同的至少一个CDR、至少两个、至少三个或至少四个、至少五个或所有六个CDR。所述方法可包括使用具有与G1的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR基本上相同或衍生自G1的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR的抗体。在一些情况下，至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR与G1或其表5中所示的变体的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
本文所提供的方法可利用多肽(其可能为或可能不为抗体)，所述多肽包含G1或其表5中所示的变体的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有以下中的任一者：G1或其表5中所示的变体的序列的至少5个连续氨基酸、至少8个连续氨基酸、至少约10个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约25个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸，其中所述氨基酸中至少3者来自G1(图5)或其表5中所示的变体的可变区。举例来说，可变区可来自G1的轻链或G1的重链。示例性多肽具有来自G1的重链和轻链可变区的连续氨基酸(上文所描述的长度)。在另一实施方案中，5个(或更多个)连续氨基酸来自图5中所示的G1的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，连续氨基酸来自G1的可变区。
抗CGRP拮抗剂抗体和多肽对如本文所提供的方法中所用的CGRP(诸如人α-CGRP)的结合亲和力(KD)可为约0.06至约200nM。举例来说，结合亲和力可为以下中的任一者：约200nM、100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、约60pM、约50pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约2pM。在其他实例中，结合亲和力小于以下中的任一者：约250nM、约200nM、约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM。
本文所提供的方法可使用本文所描述的抗体(诸如G1)的单链可变区片段(“scFv”)。通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备单链可变区片段。Bird等(1988)Science 242:423-426。
可使用本领域中已知的任何方法来制备包含抗体G1或其表5中所示的变体的一个或多个CDR或衍生自抗体G1或其表5中所示的变体的一个或多个CDR的人源化抗体。
在一些情况下，本文所描述的方法可采用使用包含修饰(诸如表5中所示的那些修饰)的抗体G1，包括不显著影响其特性的功能等效抗体和具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。举例来说，可使抗体G1或其表5中所示的变体的氨基酸序列突变以获得对CGRP具有所需结合亲和力的抗体。经修饰的多肽的实例包括具有保守氨基酸残基取代、不显著有害地改变功能活性的一个或多个氨基酸缺失或添加的多肽或使用化学类似物。
修饰还包括糖基化和非糖基化多肽，以及具有其他翻译后修饰(诸如使用不同糖的糖基化、乙酰化以及磷酸化)的多肽。用于实现此类型的修饰的技术为本领域中熟知的。
可将包含编码本文所描述的多肽的多核苷酸的组合物(诸如药物组合物)用于当前所描述的方法中。在一些情况下，组合物可包括包含编码G1抗体和/或本文所描述的抗体或多肽中的任一者的多核苷酸的表达载体。举例来说，组合物可包括SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10中所示的多核苷酸中的任一者或两者。适用表达载体和施用多核苷酸组合物的方法为本领域中已知的并且进一步描述于本文中。
D.组合物
在一些实施方案中，用于本文所提供的方法中的组合物包含有效量的本文所描述的抗CGRP抗体或抗体衍生的多肽。组合物(例如药剂或治疗制剂)可还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins,K.E.Hoover编)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者为无毒的。
本文所提供的抗体(例如抗CGRP拮抗剂或抗CGRP受体抗体)和其组合物还可与用以增强和/或补充抗体有效性的其他剂结合使用。
E.药盒
本文还提供用于本发明方法中的药盒。药盒可包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包含本文所描述的抗体(例如抗CGRP拮抗剂抗体(诸如人源化抗体))或本文所描述的多肽；以及用于根据本文所描述的方法中的任一者使用的说明书。通常，这些说明书包含施用抗体以根据本文所描述的方法中的任一者选择和治疗患者的描述。举例来说，药盒可包含如何基于确定患者是否患有由HT神经元的活化和敏化介导的头痛(例如颅内来源的头痛)来选择适合于治疗的患者的描述。在其他实施方案中，说明书包括如何向患者施用单克隆抗体(例如抗CGRP拮抗剂抗体)以降低头痛频率的描述。
因此，药盒可包括例如预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器，所述预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器包含一定剂量的调节降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体；以及说明书，所述说明书用于确定患者的头痛是否由高阈值(HT)神经元的活化介导。或者或此外，说明书可指示确定患者是否表现出能够通过施用调节(例如阻断、抑制、阻抑或减少)CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏，和/或确定患者是否主要在头部的一部分(例如单侧眶周、单侧颞部或一只眼睛)中经历头痛。
另一示例性药盒可包含调节CGRP路径的单克隆抗体以及关于如何对患者施用QST的详细说明书或关于对患者进行问卷调查和对反应进行分析以确定患者是否主要在头部的一部分(例如单侧眶周、单侧颞部或一只眼睛)中经历头痛的说明书。
除与鉴定反应者有关的说明书之外，药盒可还包含用于用单克隆抗体(例如抗CGRP拮抗剂或受体抗体)进一步治疗的说明书，所述说明书包括与预期治疗的剂量、给药时间表以及施用途径有关的信息(例如用于在根据药盒的说明书将患者鉴定为反应者后实现头痛频率降低的说明书)。
在本文所提供的药盒中，提供于药盒中的单克隆抗体可包括如SEQ ID NO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDRL3。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
或者或此外，提供于药盒中的单克隆抗体可包括如SEQ ID NO:87中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
或者或此外，提供于药盒中的单克隆抗体可包括如SEQ ID NO:93中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
或者或此外，提供于药盒中的单克隆抗体可包括如SEQ ID NO:103中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列或由其组成的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链可变区。在一些实施方案中，提供于药盒中的单克隆抗体包含含有如SEQID NO:109中所示的氨基酸序列或由其组成的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列或由其组成的轻链。
提供于药盒中的单克隆抗体可为夫瑞奈组单抗、艾普汀单抗、加卡珠单抗、厄瑞奴单抗或其任何生物等效物。熟练从业者将了解，药盒可包括任何前述抗体的组合。
本发明的药盒可提供于适合的包装中。适合的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装(例如密封密拉膜(Mylar)或塑料袋)等。还涵盖与诸如吸入器、经鼻施用装置(例如喷雾器)或输注装置(诸如微型泵)等特定装置组合使用的包装。药盒可具有无菌存取孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。容器也可具有无菌存取孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为抗CGRP拮抗剂抗体和/或调节CGRP路径的单克隆抗体。容器可还包含第二药学活性剂。
药盒可任选提供额外组分，诸如缓冲剂和解释性信息。一般地，药盒包括容器和位于容器上或与容器关联的标签或一个或多个包装插页。
提供以下实施例以说明但不限制本发明。应了解，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且将向本领域技术人员建议根据它们作出的各种修改或变化，并且所述修改或变化应包括在本申请的精神和权限范围内。本文引用的所有公布、专利以及专利申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，所达到的程度如同每个个别公布、专利或专利申请被特定地并且个别地指示为如此以引用的方式并入本文中一般。
实施例
实施例1：针对CGRP的单克隆抗体的产生和表征
抗CGRP抗体的产生.为产生对大鼠和人CGRP具有跨物种反应性的抗CGRP抗体，以各种时间间隔用含25-100μg缀合至KLH的人α-CGRP或β-CGRP的佐剂对小鼠进行免疫(每个足垫50μl，每只小鼠总计100μl)。通常如Geerligs HJ等,1989,J.Immunol.Methods 124:95-102；Kenney JS等,1989,J.Immunol.Methods 121:157-166；以及Wicher K等,1989,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89:128-135中所描述进行免疫。用含50μg缀合至KLH的人α-CGRP或β-CGRP的CFA(完全弗氏佐剂)对小鼠进行第一次免疫。在21天之后，用含25μg缀合至KLH的人β-CGRP(对于用人α-CGRP进行第一次免疫的小鼠)或α-CGRP(对于用人β-CGRP进行第一次免疫的小鼠)的IFA(不完全弗氏佐剂)对小鼠进行第二次免疫。在第二次免疫之后二十三天后，用含25μg缀合至KLH的大鼠α-CGRP的IFA进行第三次免疫。十天后，使用ELISA测试抗体效价。在第三次免疫之后34天时用含25μg肽(大鼠α-CGRP-KLH)的IFA进行第四次免疫。在第四次免疫之后32天时用100μg可溶性肽(大鼠α-CGRP)进行最终加强免疫。
从免疫过的小鼠获得脾细胞并且使用聚乙二醇1500使其以10:1的比率与NSO骨髓瘤细胞融合。将杂合物涂铺至96孔板中含有20％马血清和2-草酰乙酸盐/丙酮酸盐/胰岛素(Sigma)的DMEM中，并且开始次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶选择。在第8天，向所有孔中添加100μl含有20％马血清的DMEM。通过使用抗体捕获免疫分析筛选杂合物的上清液。使用类别特异性第二抗体进行抗体类别的确定。
基于与人和大鼠CGRP的结合选择一组产生单克隆抗体的细胞系用于进一步表征。下文在表1和表2中示出了这些抗体和特征。
纯化和Fab片段制备.使用蛋白质A亲和色谱法从杂交瘤培养物的上清液纯化被选择用于进一步表征的单克隆抗体。将上清液平衡至pH 8。然后将上清液加载至用PBS平衡至pH 8的蛋白质A柱MabSelect(Amersham Biosciences#17-5199-02)。将柱子用5倍柱体积的PBS(pH 8)洗涤。将抗体用50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 3)洗脱。将洗脱的抗体用1M磷酸盐缓冲液(pH 8)中和。将纯化的抗体用PBS(pH 7.4)渗析。通过SDS-PAGE使用鼠单克隆抗体标准曲线测定抗体浓度。
使用Immunopure Fab试剂盒(Pierce#44885)通过全抗体的木瓜蛋白酶蛋白水解来制备Fab并且通过流通蛋白质A色谱法遵循制造商说明书进行纯化。使用已知浓度的标准Fab(通过氨基酸分析测定)通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳以及通过A280使用1OD＝0.6mg/ml(或基于氨基酸序列理论上等效)来测定浓度。
Fab的亲和力测定.在25℃或37℃下使用BIACORE3000表面等离子体共振(SPR)系统(Biacore,INC,Piscataway NJ)使用制造商自己的操作缓冲液HBS-EP(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v聚山梨醇酯P20)测定抗CGRP单克隆抗体的亲和力。通过经由预固定于SA芯片上的链霉亲和素捕获N端生物素化CGRP肽(从GenScriptCorporation,New Jersey or Global Peptide Services,Colorado定购)并且测量在CGRP表面上滴定的抗体Fab的结合动力学来测定亲和力。将生物素化CGRP稀释至HBS-EP中并且以小于0.001mg/ml的浓度注射在芯片上。在个别芯片通道间使用可变流动时间，实现两种范围的抗原密度：对于详细动力学研究为<50个反应单位(RU)，并且对于浓度研究和筛选为约800RU。将纯化Fab片段的典型地浓度跨越1μM-0.1nM(目标为0.1-10倍所估计KD)的两倍或三倍连续稀释液以100μL/min注射1分钟并且允许10分钟的解离时间。在每个结合循环之后，将表面用25mM NaOH的25％v/v乙醇溶液再生，所述溶液历经数百个循环为耐受的。通过使用BIA评估程序将数据拟合至1:1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)(Karlsson等(1994).Methods Enzymology 6.99-110)同时获得动力学缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。由比率KD＝k解离/k缔合计算总体平衡解离常数(KD)或“亲和力”。表1和表2中示出了鼠Fab片段的亲和力。
鼠抗CGRP抗体的表位定位.为确定人α-CGRP上抗CGRP抗体所结合的表位，如上文所描述通过将N端生物素化CGRP片段氨基酸19-37和氨基酸25-37捕获于SA芯片上来测量Fab片段对各种CGRP片段的结合亲和力。图1示出了其在25℃下测量的结合亲和力。如图1中所示，除抗体4901外的所有抗体均以类似于其对全长人α-CGRP(1-37)的结合亲和力的亲和力结合于人α-CGRP片段19-37和25-37。抗体4901以与结合于全长人α-CGRP片段相比低六倍的亲和力结合于人α-CGRP片段25-37，这主要归因于解离速率的损失。数据表明这些抗CGRP抗体通常结合于CGRP的C末端。
进行丙氨酸扫描以进一步表征人α-CGRP中参与抗CGRP抗体的结合的氨基酸。通过肽合成产生具有单一丙氨酸取代的不同人α-CGRP变体。表3中示出了其氨基酸序列以及用于Biacore分析的所有其他肽。如上文所描述使用Biacore测定抗CGRP抗体的Fab片段对这些变体的亲和力。如图1中所示，所有12种抗体均靶向C端表位，并且氨基酸F37为最关键的残基。F37突变为丙氨酸显著降低抗CGRP抗体对肽的亲和力或甚至完全消除抗CGRP抗体与肽的结合。其次重要的氨基酸残基为G33，然而，仅高亲和力抗体(7E9、8B6、10A8以及7D11)受此位置丙氨酸置换的影响。氨基酸残基S34也在这四种高亲和力抗体的结合中发挥显著但较小的作用。
表1.抗CGRP单克隆抗体与人α-CGRP的结合的特征以及其拮抗剂活性
注：抗体4901为可商购获得的(Sigma,产品编号C7113)。
n.d.＝未测得
表2.抗CGRP单克隆抗体与大鼠α-CGRP的结合的特征以及拮抗剂活性
“n.d.”指示未对抗体进行测试。
表3.人α-CGRP片段(SEQ ID NO:15-40)和相关肽(SEQ ID NO:41-47)的氨基酸序列.除SEQ ID NO:36-40外所有肽均为C端酰胺化的。粗体的残基指示点突变。
实施例2：使用体外分析筛选抗CGRP拮抗剂抗体.
使用基于细胞的cAMP活化分析和结合分析针对体外拮抗剂活性对鼠抗CGRP抗体进行进一步筛选。
通过cAMP分析测量的拮抗剂活性.将在存在或不存在抗CGRP抗体(最终浓度1-3000nM)情况下的五微升人α-CGRP或大鼠α-CGRP(最终浓度50nM)或大鼠α-CGRP或人α-CGRP(最终浓度0.1nM-10μM；作为c-AMP活化的阳性对照)分配至384孔板(Nunc，目录号264657)中。将含十微升细胞(如果使用人α-CGRP，那么为人SK-N-MC，或如果使用大鼠α-CGRP，那么为来自ATCC的大鼠L6)的刺激缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4、146mMNaCl、5mM KCl、1mMCaCl2、1mM MgCl2以及500μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX))添加至平板的孔中。将平板在室温下孵育30分钟。
在孵育之后，使用HitHunterTM酶片段互补分析(Applied Biosystems)遵循制造商的说明书进行cAMP活化。基于由称为酶受体(EA)和酶供体(ED)的两个片段组成的基因工程化β半乳糖苷酶进行分析。当两个片段分离时，酶为非活性的。当片段在一起时，它们可通过称为互补的过程自发重组以形成活性酶。EFC分析平台利用ED-cAMP肽缀合物，其中cAMP由抗cAMP识别。此ED片段能够与EA重缔合以形成活性酶。在所述分析中，最佳滴定抗cAMP抗体以结合ED-cAMP缀合物并且抑制酶形成。细胞溶解产物样品中的各水平的cAMP与ED-cAMP缀合物竞争结合于抗cAMP抗体。分析中游离ED缀合物的量与cAMP的浓度成比例。因此，通过形成活性酶来测量cAMP，活性酶的形成是通过β半乳糖苷酶发光底物的周转来定量。通过添加10μl的溶解缓冲液和抗cAMP抗体(1:1比率)随后在室温下孵育60min来进行cAMP活化分析。然后将10μl的ED-cAMP试剂添加至每个孔中并且在室温下孵育60分钟。在孵育之后，将20μl的EA试剂和CL混合物(含有底物)(1:1比率)添加至每个孔中并且在室温下孵育1-3小时或过夜。将平板在PMT仪器上以1秒/孔进行读取或在成像器上以30秒/位置进行读取。以上表1和表2中鉴定了抑制α-CGRP对cAMP的活化的抗体(称为“是”)。表1和表2中的数据表明分析中展现拮抗剂活性的抗体通常具有高亲和力。举例来说，对人α-CGRP具有约80nM或更小的KD(在25℃下测定)或对大鼠α-CGRP具有约47nM或更小的KD(在37℃下测定)的抗体在此分析中显示拮抗剂活性。
放射性配体结合分析.如先前所描述进行结合分析以测量抗CGRP抗体在阻断CGRP结合于受体时的IC50。Zimmermann等,Peptides 16:421-4,1995；Mallee等,J.Biol.Chem.277:14294-8,2002。将SK-N-MC细胞的膜(25μg)在室温下在总体积为1mL的含有10pM 125I-人α-CGRP的孵育缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4、5mM MgCl2、0.1％BSA)中孵育90min。为测定抑制浓度(IC50)，将来自高约100倍的储备溶液的抗体或未标记的CGRP(作为对照)以变化的浓度溶解于孵育缓冲液中并且与膜和10pM 125I-人α-CGRP同时孵育。通过经已用0.5％聚乙烯亚胺阻断的玻璃微纤维过滤器(GF/B，1μm)过滤来终止孵育。绘制剂量反应曲线并且通过使用以下公式确定Ki值：Ki＝IC50/(1+([配体]/KD)；其中人α-CGRP对如存在于SK-N-MC细胞中的CGRP1受体的平衡解离常数KD＝8pM，并且B最大＝每毫克蛋白质0.025pmol。将所报道的IC50值(就IgG分子而言)转化为结合位点(通过将其乘以2)，使得它可与通过Biacore测定的亲和力(KD)(参见表1)相比较。
表1示出了鼠抗体7E9、8B6、6H2以及4901的IC50。数据表明抗体亲和力通常与IC50有关：在放射性配体结合分析中具有较高亲和力(较低KD值)的抗体具有较低IC50。
实施例3：抗CGRP拮抗剂抗体对由刺激大鼠隐神经诱导的皮肤血管舒张的影响
为测试抗CGRP抗体的拮抗剂活性，使用先前描述的大鼠模型测试抗体对由刺激大鼠隐神经引起的皮肤血管舒张的影响。Escott等,Br.J.Pharmacol.110:772-776,1993。在此大鼠模型中，电刺激隐神经诱导CGRP从神经末梢释放，从而使得皮肤血流增加。在隐神经刺激之后测量雄性斯普雷格多利大鼠(Sprague Dawley rat)(170-300g，来自CharlesRiver Hollister)足部皮肤中的血流。将大鼠用2％异氟烷维持在麻醉状态下。在实验开始时给予甲苯磺酸溴苄铵(30mg/kg，静脉内施用)以使因伴随的隐神经交感神经纤维的刺激产生的血管收缩程度最小。通过使用恒温连接至温度受控的加热垫的直肠探针将体温维持在37℃下。通过右侧股静脉以静脉内方式给予包括抗体、阳性对照(CGRP 8-37)以及媒介物(PBS，0.01％吐温20(Tween 20))的化合物，除了图3中所示的实验，通过尾部静脉注射来测试化合物和对照，并且在图2A和图2B中所示的实验中，以腹膜内方式(IP)注射抗体4901和7D11。阳性对照化合物CGRP 8-37(血管舒张拮抗剂)因其半衰期短故在神经刺激之前3-5min时以400nmol/kg(200μl)给予。Tan等,Clin.Sci.89:656-73,1995。以不同剂量给予抗体(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg以及25mg/kg)。
对于图2A和图2B中所示的实验，在电脉冲刺激之前72小时时以腹膜内方式(IP)施用抗体4901(25mg/kg)、抗体7D11(25mg/kg)或媒介物对照(含0.01％吐温20的PBS)。对于图3中所示的实验，在电脉冲刺激之前24小时时以静脉内方式施用抗体4901(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg或25mg/kg)或媒介物对照(含0.01％吐温20的PBS)。在施用抗体或媒介物对照之后，将右后肢的隐神经手术暴露，近端切割并且用塑料包裹物覆盖以防变干。将激光多普勒探针放置于后爪皮肤的中部背侧上，这是由隐神经支配的区域。用激光多普勒流量计监测以血细胞通量形式测量的皮肤血流。当建立稳定基线通量(变化小于5％)持续至少5分钟时，将神经放置于铂双极电极上并且使用60个脉冲(2Hz，10V，1ms，持续30秒)进行电刺激，然后在20分钟后再次进行刺激。对于对电脉冲刺激的每个通量反应，通过通量-时间曲线下面积(AUC，它等于通量变化乘以时间变化)估计累积皮肤血流变化。取得对两次刺激的血流反应的平均值。将动物保持在麻醉下持续一至三小时的时间。
如图2A和图2B中所示，与对照相比，通过对隐神经施加电脉冲所刺激的血流增加因CGRP 8-37(400nmol/kg，静脉内施用)、抗体4901(25mg/kg，腹膜内施用)或抗体7D11(25mg/kg，腹膜内施用)的存在而受到抑制。在隐神经刺激之前3-5分钟施用CGRP 8-37；并且在隐神经刺激之前72小时施用抗体。如图3中所示，通过对隐神经施加电脉冲所刺激的血流增加因在隐神经刺激之前24小时时以静脉内方式施用的不同剂量(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg以及25mg/kg)的抗体4901的存在而受到抑制。
对于图4A和图4B中所示的实验，在抗体施用之前将隐神经手术暴露。将右后肢的隐神经手术暴露，近端切割并且用塑料包裹物覆盖以防变干。将激光多普勒探针放置于后爪皮肤的中部背侧上，这是由隐神经支配的区域。用激光多普勒流量计监测以血细胞通量形式测量的皮肤血流。在甲苯磺酸溴苄铵注射之后三十至四十五分钟时，当建立稳定基线通量(变化小于5％)持续至少5分钟时，将神经放置于铂双极电极上并且进行电刺激(2Hz，10V，1ms，持续30秒)并且在20分钟后再次进行刺激。使用对这两次刺激的血流通量反应的平均值来建立对电刺激的基线反应(时间0)。然后以静脉内方式(i.v.)施用抗体4901(1mg/kg或10mg/kg)、抗体7E9(10mg/kg)、抗体8B6(10mg/kg)或媒介物(含0.01％吐温20的PBS)。随后在抗体或媒介物施用之后30分钟、60分钟、90分钟以及120分钟时对神经进行刺激(2Hz，10V，1ms，持续30sec)。将动物保持在麻醉下持续约三小时的时间。对于对电脉冲刺激的每个通量反应，通过通量-时间曲线下面积(AUC，它等于通量变化乘以时间变化)估计累积皮肤血流变化。
如图4A中所示，当在抗体施用之后60分钟、90分钟以及120分钟时施加电脉冲刺激时，通过对隐神经施加电脉冲所刺激的血流增加因静脉内施用的1mg/kg的抗体4901的存在而受到显著抑制，并且当在抗体施用之后30分钟、60分钟、90分钟以及120分钟时施加电脉冲刺激时，通过对隐神经施加电脉冲所刺激的血流增加因静脉内施用的10mg/kg的抗体4901的存在而受到显著抑制。图4B表明当在抗体施用之后30min、60min、90min以及120min时施加电脉冲刺激时，通过对隐神经施加电脉冲所刺激的血流增加因抗体7E9(10mg/kg，静脉内施用)的存在而受到显著抑制，并且当在抗体施用之后30min时施加电脉冲刺激时，因抗体8B6(10mg/kg，静脉内施用)的存在而受到显著抑制。
这些数据表明如利用通过刺激大鼠隐神经诱导的皮肤血管舒张所测量，抗体4901、7E9、7D11以及8B6有效阻断CGRP活性。
实施例4.抗CGRP抗体G1和其变体的表征
图5中示出了抗CGRP抗体G1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。使用以下方法进行抗体G1和其变体的表达和表征。
所用的表达载体.抗体的Fab片段的表达在IPTG可诱导的lacZ启动子的控制下进行，这类似于Barbas(2001)Phage display:a laboratory manual,Cold Spring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press第2.10页.Vector pComb3X中所描述，然而，修饰包括以下额外结构域的添加和表达：人κ轻链恒定结构域和IgG2人免疫球蛋白的CH1恒定结构域，Igγ-2链C区，蛋白质登录号P01859；免疫球蛋白κ轻链(智人)，蛋白质登录号CAA09181。
小规模Fab制备.从Fab文库转化的大肠杆菌(使用电穿孔感受态TG1细胞或化学感受态Top 10细胞)，使用单菌落接种主平板(琼脂LB+卡本西林(carbenicillin)(50μg/mL)+2％葡萄糖)与工作平板(2mL/孔，96孔/板)，其中每个孔含有1.5mL LB+卡本西林(50μg/mL)+2％葡萄糖。为平板施加透气粘合密封物(ABgene,Surrey,UK)。将两个平板在30℃下孵育12-16小时；将工作平板剧烈振荡。将主平板储存在4℃下直至需要为止，同时将来自工作平板的细胞集结成粒(4000rpm，4℃，20分钟)并且再悬浮于1.0mL LB+卡本西林(50μg/mL)+0.5mM IPTG中，以通过在30℃下剧烈振荡5小时来诱导Fab表达。将诱导过的细胞在4000rpm、4℃下离心20分钟并且再悬浮于0.6mL Biacore HB-SEP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v P20)中。通过冷冻(-80℃)然后在37℃下解冻来实现HB-SEP再悬浮的细胞的溶解。将细胞溶解产物在4000rpm、4℃下离心1小时以将碎屑与含Fab的上清液分离，随后使用Millipore MultiScreen分析系统96孔过滤板和真空歧管将含Fab的上清液过滤(0.2μm)。使用Biacore通过将所过滤的上清液注射在传感器芯片上的CGRP上来对其进行分析。从主平板中救出表达Fab的亲和力选择克隆，它们提供用于PCR、测序以及质粒制备的模板DNA。
大规模Fab制备.为获得动力学参数，如下使Fab以较大规模进行表达。为含有150mL LB+卡本西林(50μg/mL)+2％葡萄糖的依氏烧瓶(Erlenmeyer flask)接种来自亲和力选择的表达Fab的大肠杆菌克隆的1mL“起始”过夜培养物。将其余起始培养物(约3mL)用于制备质粒DNA(QIAprep mini-prep，Qiagen试剂盒)以便测序和进一步操纵。将大量培养物在剧烈振荡下在30℃下孵育，直至达到1.0的OD600nm(典型地12-16h)。通过在4000rpm、4℃下离心20分钟使细胞集结成粒，并且再悬浮于150mL LB+卡本西林(50μg/mL)+0.5mM IPTG中。在30℃下进行5小时表达之后，通过在4000rpm、4℃下离心20分钟使细胞集结成粒，再悬浮于10mL Biacore HBS-EP缓冲液中，并且使用单一冷冻(-80℃)/解冻(37℃)循环进行溶解。通过在4000rpm、4℃下离心一小时使细胞溶解产物集结成粒，并且收集和过滤(0.2um)上清液。将所过滤的上清液加载至用PBS(pH 8)平衡的Ni-NTA超流琼脂糖(Qiagen,Valencia,CA)柱上，然后用5倍柱体积的PBS(pH 8)洗涤。用PBS(pH 8)+300mM咪唑洗脱不同级分中的个别Fab。将含有Fab的级分汇集在一起并且在PBS中渗析，然后通过ELISA定量，然后进行亲和力表征。
全抗体制备.对于全抗体的表达，在哺乳动物表达载体中克隆重链和轻链可变区并且使用脂质体转染至HEK 293细胞中用于瞬时表达。使用蛋白质A使用标准方法纯化抗体。
载体pDb.CGRP.hFcGI为包含G1抗体的重链的表达载体，并且适合于重链的瞬时或稳定表达。载体pDb.CGRP.hFcGI具有对应于以下区域的核苷酸序列：鼠巨细胞病毒启动子区(核苷酸7-612)；合成内含子(核苷酸613-1679)；DHFR编码区(核苷酸688-1253)；人生长激素信号肽(核苷酸1899-1976)；G1的重链可变区(核苷酸1977-2621)；含有以下突变的人重链IgG2恒定区：A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2序列；参见Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624)。载体pDb.CGRP.hFcGI于2005年7月15日保藏于ATCC，并且被分配ATCC登录号PTA-6867。
载体pEb.CGRP.hKGI为包含G1抗体的轻链的表达载体，并且适合于轻链的瞬时表达。载体pEb.CGRP.hKGI具有对应于以下区域的核苷酸序列：鼠巨细胞病毒启动子区(核苷酸2-613)；人EF-1内含子(核苷酸614-1149)；人生长激素信号肽(核苷酸1160-1237)；抗体G1轻链可变区(核苷酸1238-1558)；人κ链恒定区(核苷酸1559-1882)。载体pEb.CGRP.hKGI于2005年7月15日保藏于ATCC，并且被分配ATCC登录号PTA-6866。
用于亲和力测定的Biacore分析.在25℃或37℃下使用BIACORE3000表面等离子体共振(SPR)系统(Biacore,INC,Piscataway NJ)测定G1单克隆抗体和其变体的亲和力。通过经由预固定的链霉亲和素(SA传感器芯片)捕获N端生物素化CGRP或片段并且测量在芯片上的CGRP或片段滴定的抗体G1 Fab片段或变体的结合动力学来测定亲和力。在HBS-EP操作缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v聚山梨醇酯P20)中进行所有Biacore分析。通过将N-生物素化CGRP在HBS-EP缓冲液中稀释至小于0.001mg/mL的浓度并且使用可变接触时间将其注射在SA传感器芯片上来制备CGRP表面。将对应于捕获水平<50个反应单位(RU)的低容量表面用于高分辨率动力学研究，而高容量表面(约800RU的捕获CGRP)用于浓度研究、筛选以及溶液亲和力测定。通过将抗体G1 Fab以两倍或三倍增量连续稀释至跨越1uM-0.1nM(目标为0.1-10倍所估计KD)的浓度来获得动力学数据。将样品典型地以100μL/min注射1分钟并且允许至少10分钟的解离时间。在每个结合循环之后，将表面用25mMNaOH的25％v/v乙醇溶液再生，所述溶液历经数百个循环为耐受的。使用BIA评估程序将整个滴定系列(典型地产生一式两份)总体拟合至1:1朗缪尔结合模型。此举返回每个结合相互作用的独特的缔合和解离动力学速率常数对(分别为k缔合和k解离)，其比率给出平衡解离常数(KD＝k解离/k缔合)。表5和表6中列出了以此方式测定的亲和力(KD值)。
具有极慢解离速率的结合相互作用的高分辨率分析.对于具有极慢解离速率的相互作用(具体地说，抗体G1 Fab在25℃下结合于芯片上的人α-CGRP)，在两部分实验中获得亲和力。在作出以下修改的情况下使用上文所描述的方案。通过以100μL/min注射跨越550nM-1nM的2倍滴定系列(一式两份)30秒并且仅允许30秒解离阶段来测定缔合速率常数(k缔合)。通过一式两份地注射相同滴定系列的三个浓度(高、中以及低)30秒并且允许2-小时解离阶段来测定解离速率常数(k解离)。如表4中所示，通过将在两种类型的实验中所获得的k缔合和k解离值组合来获得每个相互作用的亲和力(KD)。
通过Biacore测定溶液亲和力.在37℃下通过Biacore测量抗体G1对大鼠α-CGRP和F37A(19-37)人α-CGRP的溶液亲和力。使用高容量CGRP芯片表面(选择高亲和力人α-CGRP用于检测目的)并且使HBS-EP操作缓冲液以5μL/min流动。将5nM(目标为等于或低于基于溶液的相互作用的预期KD)恒定浓度的抗体G1 Fab片段与以下竞争肽一起预孵育：大鼠α-CGRP或F37A(19-37)人α-CGRP，在3倍连续稀释液中最终浓度跨越1nM至1μM。在不存在或存在基于溶液的竞争肽的情况下将抗体G1 Fab溶液注射在芯片上的CGRP上并且监测在芯片表面处检测到的结合反应的减少作为溶液竞争的结果。使用校正曲线将这些结合反应转化为“游离Fab浓度”，校正曲线是通过在芯片上的CGRP上单独滴定抗体G1 Fab(5、2.5、1.25、0.625、0.325以及0nM)而构建的。使用针对竞争性的基于溶液的肽的浓度绘制的“游离Fab浓度”来产生每个数据点并且使用BIA评估软件拟合至溶液亲和力模型。表4和表6中示出了以此方式(间接)测定的溶液亲和力并且用于验证当在SA芯片上的N-生物素化CGRP上直接注射Fab时所获得的亲和力。通过这两种方法测定的亲和力之间紧密吻合证实将N-生物素化型式的CGRP拴系至芯片不改变其天然溶液结合活性。
下表4示出了通过Biacore通过使Fab片段流过SA芯片上的N-生物素化CGRP所测定的抗体G1对人α-CGRP、人β-CGRP、大鼠α-CGRP以及大鼠β-CGRP的结合亲和力。为更好地解析具有极慢解离速率的结合相互作用的亲和力，还在两部分实验中测定亲和力以补充此分析方向，还测定大鼠α-CGRP相互作用的溶液亲和力(如上文所描述)。两种分析方向中所测量的亲和力紧密吻合证实天然大鼠α-CGRP在其经N-生物素化并且拴系至SA芯片时在溶液中的结合亲和力不改变。
表4.在芯片上的CGRP上滴定的抗体G1 Fab的结合亲和力
*在高分辨率两部分实验中测定α-CGRP(大鼠和人)的亲和力，其中监测解离阶段2小时(k缔合、k解离以及KD的值表示n次重复实验的平均值，标准偏差以百分比偏差表示)。通过整体分析仅使用20-min解离阶段测定β-CGRP(大鼠和人)的亲和力，此未准确到足以定量其极端解离速率(其解离速率可能比在此所陈述的慢并且因此其亲和力可能甚至更高)。抗体G1 Fab极其缓慢地从所有CGRP(除了α-大鼠CGRP)解离，解离速率接近Biacore分析的分辨极限(尤其在25℃下)。
**通过测量对于与基于溶液的大鼠α-CGRP竞争者一起预孵育的抗体G1 Fab来说在芯片上的CGRP处所检测的结合反应的减少所测定的溶液亲和力。
下表5示出了与抗体G1相比具有氨基酸序列变化的抗体以及其对大鼠α-CGRP与人α-CGRP两者的亲和力。表5中所示的变体的所有氨基酸取代是相对于G1的序列来描述。通过Biacore通过使Fab片段流过SA芯片上的CGRP来测定Fab片段的结合亲和力。
表5.抗体G1变体的氨基酸序列和其在37℃下通过Biacore测定的结合亲和力数据.
所有CDR包括Kabat与Chothia CDR两者。氨基酸残基为依序编号(参见图5)。所有克隆具有与G1相同的L3+H1+H3序列。
KD＝k解离/k缔合.所有k解离值以筛选模式测定，除了加下划线的那些，它们是通过Fab浓度系列的整体分析(以高分辨率模式分析G1)获得。因此，加下划线的KD值是通过通过测量k缔合以实验方式测定的。其他k缔合值经估计与M25相同。
n.d.＝未测得
为确定人α-CGRP上由抗体G1识别的表位，使用上文所描述的Biacore分析。购得呈N-生物素化型式的人α-CGRP以使其能够经由SA传感器芯片高亲和力捕获。测定在不存在或存在CGRP肽情况下G1 Fab片段与芯片上的人α-CGRP的结合。典型地，将2000:1mol肽/Fab溶液(例如10μM肽于50nM G1 Fab中)注射在芯片上的人α-CGRP上。图6示出了由竞争肽阻断的结合百分比。图6中所示的数据表明，阻断100％的G1 Fab与人α-CGRP的结合的肽为人α-CGRP的1-37(WT)、8-37、26-37、P29A(19-37)、K35A(19-37)、K35E(19-37)以及K35M(19-37)；β-CGRP(WT)的1-37；大鼠α-CGRP(WT)的1-37；以及大鼠β-CGRP(WT)的1-37。所有这些肽均为在C端酰胺化的。人α-CGRP的肽F37A(19-37)和19-37(后者在C端未酰胺化)还阻断约80％至90％的G1 Fab与人α-CGRP的结合。人α-CGRP的肽1-36(在C端未酰胺化)阻断约40％的G1Fab与人α-CGRP的结合。人α-CGRP的肽片段19-36(在C端酰胺化)；人α-CGRP的肽片段1-13和1-19(两者中无一者在C端酰胺化)；以及人糊精、降钙素以及肾上腺髓质素(全部在C端酰胺化)不与G1 Fab竞争结合至芯片上的人α-CGRP。这些数据证实G1靶向CGRP的C端表位并且最末端残基(F37)的身份与其酰胺化两者对于结合均为重要的。
还测定了G1 Fab对人α-CGRP的变体的结合亲和力(在37℃下)。下表6示出了如通过在芯片上的N-生物素化人α-CGRP和变体上滴定G1 Fab直接测量的亲和力。表6中的数据表明抗体G1结合于C端表位，并且F37和G33为最重要的残基。当将额外氨基酸残基(丙氨酸)添加至C端(其经酰胺化)时，G1不结合于CGRP。
表6.在37℃下测量的G1 Fab对人α-CGRP和变体的结合亲和力(关于其氨基酸序列参见表3)
芯片上的CGRP k<sub>缔合</sub>(1/Ms) k<sub>解离</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(nM)
1-37(WT) 4.68x10<sup>5</sup> 7.63x10<sup>-5</sup> 0.16(高分辨率K<sub>D</sub>＝0.06)
19-37 4.60x10<sup>5</sup> 7.30x10<sup>-5</sup> 0.16
25-37 3.10x10<sup>5</sup> 8.80x10<sup>-5</sup> 0.28
F27A(25-37) 3.25x10<sup>5</sup> 1.24x10<sup>-4</sup> 0.38
V28A(25-37) 3.32x10<sup>5</sup> 9.38x10<sup>-5</sup> 0.28
P29A(25-37) 2.26x10<sup>5</sup> 1.78x10<sup>-4</sup> 0.79
T30A(25-37) 1.79x10<sup>5</sup> 8.41x10<sup>-5</sup> 0.47
N31A(25-37) 2.17x10<sup>5</sup> 1.14x10<sup>-4</sup> 0.53
V32A(25-37) 2.02x10<sup>5</sup> 3.46x10<sup>-4</sup> 1.71
G33A(25-37) 2.07x10<sup>5</sup> 0.0291 141
S34A(25-37) 2.51x10<sup>5</sup> 7.64x10<sup>-4</sup> 3.04
K35A(19-37) 2.23x10<sup>5</sup> 2.97x10<sup>-4</sup> 1.33
K35E(19-37) 5.95x10<sup>4</sup> 5.79x10<sup>-4</sup> 9.73
K35M(19-37) 2.63x10<sup>5</sup> 1.34x10<sup>-4</sup> 0.51
K35Q(19-37) 1.95x10<sup>5</sup> 2.70x10<sup>-4</sup> 1.38
F37A(25-37) 8.90x10<sup>4</sup> 8.48x10<sup>-3</sup> 95(溶液K<sub>D</sub>＝172nM)
38A(25-38A) ·- - 未检测到结合
以上数据表明，抗体G1结合的表位位于人α-CGRP的C末端，并且人α-CGRP上的氨基酸33和37对于抗体G1的结合为重要的。另外，残基F37的酰胺化对于结合为重要的。
实施例5：人源化单克隆抗CGRP抗体(夫瑞奈组单抗，TEV-48125)对三叉神经血管 神经元的选择性抑制
此研究的目的为更好地理解CGRP-mAb夫瑞奈组单抗(TEV-48125)如何调节脑膜感觉路径。为回答此问题，使用单细胞记录来测定夫瑞奈组单抗(30mg/kg，静脉内)和IgG2同型对照抗体(同型-对照Ab)对麻醉的雄性和雌性大鼠的脊髓三叉神经核中的原初和CSD敏化三叉神经血管神经元中的自发和诱发活动的影响。研究证实，在两种性别中，夫瑞奈组单抗均抑制原初高阈值(HT)三叉神经血管神经元，但不抑制广动力范围三叉神经血管神经元，并且对神经元的抑制作用限于其来自颅内硬脑膜而非面部皮肤或角膜的活化。另外，当给予充足时间时，夫瑞奈组单抗阻止通过皮层扩散抑制对HT神经元的活化和敏化。
A.材料和方法
手术准备
实验由贝丝以色列女执事医疗中心(Beth Israel Deaconess Medical Center)和哈佛医学院动物护理常务委员会(Harvard Medical School standing committees onanimal care)批准，并且根据美国国家卫生研究所实验室动物护理和使用指南(U.S.National Institutes of Health Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals)来进行。将雄性和雌性斯普雷格-多利大鼠(250-350g)用氨基甲酸酯(0.9-1.2g/kg，腹膜内)麻醉。为它们配备允许人工通气(0.1L/min的O2)的气管内套管以及用于随后输注药物的股骨内静脉套管。将大鼠放置于立体定位仪器中，并且使用加热毯将核心温度保持在37℃下。连续监测呼气末CO2并且保持在生理范围(3.5-4.5pCO2)内。在稳定后，用罗库溴铵(rocuronium bromide)(10mg/ml，1ml/小时连续静脉输注)使大鼠瘫痪并且通气。对于实验中随后的颅硬脑膜刺激，在顶骨和枕骨中在λ缝前面和后面紧接在左侧横窦上方小心地切出5x5-mm的开口。使用改性的合成间隙液(135mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、5mMCaCl2、10mM葡萄糖以及10mM Hepes，pH 7.2)使暴露的硬脑膜保持湿润。对于脊髓三叉神经核中的单细胞记录，从覆盖的组织揭开闩部与C2之间的脊髓段，剥掉硬脑膜，并且用矿物油保持湿润。
神经元鉴定和选择
为记录神经元活性，将钨微电极(阻抗3-4MΩ)重复降低至脊髓三叉神经核(STN)中，寻找接受来自硬脑膜和面部皮肤的会聚输入的中枢三叉神经血管神经元。首先基于对硬脑膜电刺激的反应来鉴定三叉神经血管神经元。如果它们响应于暴露的颅硬脑膜的同侧电刺激(0.1-3.0mA，0.5msec，0.5Hz脉冲)和机械(使用经校正的弗莱单丝)刺激以及面部皮肤和角膜的机械刺激表现出多阵离散放电，那么选择它们用于研究。通过使硬脑膜在内外和头尾相隔1mm的点处凹陷(用4.19g VFH单丝)来定位硬脑膜感受野。在≥50％的试验中硬脑膜凹陷产生反应的点被视为在神经元感受野内部。通过对所有面部皮肤区域和角膜施加无害和有害机械刺激来定位皮肤感受野。如果在≥50％的试验中无刺激产生反应，那么将区域视为在感受野外部。通过对皮肤感受野的最敏感部分施加短暂(10s)无害和有害刺激来测定对皮肤机械刺激的反应。无害刺激由使软质鬃刷在皮肤感受野上缓慢经过(从尾部至喙部一次5-s刷拭冲击以及从喙部至尾部一次5-s刷拭冲击)以及用松弛动脉钳施加压力组成。有害刺激由用强动脉钳夹捏组成(Palecek等,1992,J.Neurophysiol.67:1562-1573；Dado等,1994,J.Neurophysiol.71:981-1002；Burstein等,1998,J.Neurophysiol.79:964-982)。不使用更强烈或持久的刺激，以避免诱导自发神经元放电或反应特性的持久变化。对角膜机械刺激的反应由使用细画刷(约10个毛囊)的温和并且缓慢的刷拭冲击组成。因此鉴定两种类型的神经元：广动力范围(WDR)神经元(逐渐对刷拭、压力以及夹捏有反应)，以及高阈值(HT)神经元(对刷拭无反应)。使用实时波形鉴别器来形成并且储存研究中的神经元中由对硬脑膜的电脉冲诱发的动作电位的模板；获得匹配模板波形的活动尖峰并且使用Spike 2软件(CED,Cambridge,UK)进行在线和离线分析。
皮层扩散抑制的诱导和记录
通过将玻璃微量吸液管(端部直径25μm)插入视觉皮层中约1mm持续10sec来以机械方式诱导皮层扩散抑制(CSD)。在3-5mm/min的传播速率下，预期单个CSD波在皮层刺激1-2min内进入神经元感受野。对于CSD的验证，记录皮层活动(皮层脑电图)，将玻璃微量吸液管(0.9％盐水，约1兆欧，7um端部)放置于紧挨着大脑皮层表面的下方(约100μm)。将皮层脑电图电极安置于视觉皮层前约6mm处。
用单克隆抗CGRP抗体夫瑞奈组单抗(TEV-48125)处理
夫瑞奈组单抗(也称为TEV-48125/LBR-101/RN-307)(TEVA PharmaceuticalIndustries Ltd.,Israel)为人源化单克隆抗CGRP抗体(CGRP-mAb)。将其在盐水中稀释至最终剂量为30mg/kg并且以静脉内方式施用(快速注射，总体积0.6-0.7ml)。也将对应人IgG2同型对照抗体(同型-对照Ab)在盐水中稀释至最终剂量为30mg/kg并且以静脉内方式施用(快速注射，总体积1.6-2.0ml)。
实验方案
实验方案包括两个部分。将第一部分设计成比较CGRP-mAb与同型-对照Ab对原初三叉神经血管神经元的自发和诱导活动的影响，并且将第二部分设计成测试CGRP-mAb与同型-对照Ab对三叉神经血管神经元由CSD活化和敏化的影响。两个部分均包括在雄性和雌性大鼠中对WDR和HT神经元进行取样。在第一部分中，如下建立基线神经元型态：(a)绘制硬脑膜、皮肤以及角膜感受野；(b)测量对硬脑膜(使用固定力)、皮肤(刷拭、压力、夹捏)以及角膜(刷拭)机械刺激的反应(平均每秒尖峰数)以及(c)测量自发放电率(在处理之前记录超过30min)。在建立基线后，施用CGRP-mAb或同型-对照Ab并且再次定位感受野，再次检验神经元对硬脑膜、皮肤以及角膜刺激的反应，并且在处理后1、2、3以及4小时时为自发性活动率进行再次取样。然后将每次测量的所得值与处理之前所获得的各别基线值相比较。在第二部分中，在施用CGRP-mAb或同型-对照Ab之后4小时时诱导CSD，并且在2小时后(即，处理之后6小时时)再次测量感受野尺寸、自发性活动率以及对硬脑膜、皮肤以及角膜刺激的反应量值。然后将每次测量的所得CSD后值与处理时间后4-小时时所获得的各别CSD前值相比较。仅在处理时间点后4-小时时大鼠的生理条件(心率、血压、呼吸、呼气末CO2)和神经元分离信号(信噪比≥1:3)稳定的情况下起始此部分。
当每个实验结束时，在所记录位点产生小的病变(阳极DC为15μA，持续15sec)并且如别处(Zhang等(2011)Ann.Neurol.69:855-865)所描述在死后使用组织学分析确定其在背角中的定位。每个动物中仅研究一个神经元。
数据分析
为计算对每种刺激的反应量值，将开始第一次刺激(对于自发性活动为30min，对于硬脑膜、皮肤以及角膜的机械刺激为10sec)之前出现的平均放电频率从在每种刺激的持续时间中出现的平均放电频率中扣除。在研究的第一部分中，将每次测量(在处理之后1、2、3、4小时时测定)的对应值与夫瑞奈组单抗或同型-对照Ab施用之前获得的各别基线值相比较。在研究的第二部分中，将2个处理组(夫瑞奈组单抗和同型-对照Ab)中每次测量的所得值(CSD诱导之后2小时时测定)与CSD诱导之前获得的各别值相比较。当神经元在CSD之后的平均放电率超过其平均基线活动达所述平均值的2个标准偏差持续>10min的时间(这转化为活动增加≥33％)时，将神经元视为被活化。如果发生CSD之后2小时时神经元对以下5种刺激中的至少3种表现出增强的反应：硬脑膜凹陷、刷拭、按压或夹捏皮肤以及刷拭角膜，那么将神经元视为被敏化。使用非参数统计(威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed-ranks test))比较各别值的平均放电率。将双尾显著性水平设定为0.05。
B.结果
用于测试CGRP-mAb与同型-对照Ab对原初三叉神经血管神经元的自发和诱导活动的影响的数据库由63个神经元组成。其中，31个归类为WDR并且32个归类为HT。在31个WDR神经元中，18个(雄性中11个，雌性中7个)是在施用CGRP-mAb之前和之后测试，并且13个(雄性中7个，雌性中6个)是在施用同型-对照Ab之前和之后测试。在32个HT神经元中，18个(雄性中11个，雌性中7个)是在施用CGRP-mAb之前和之后测试，并且14个(雄性中8个，雌性中6个)是在施用同型-对照Ab之前和之后测试。
用于测试CGRP-mAb与同型-对照Ab对神经元由CSD活化和敏化的影响的数据库由50个神经元组成。其中，23个归类为WDR并且27个归类为HT。在23个WDR神经元中，13个(雄性中7个，雌性中6个)是在CGRP-mAb处理的动物中测试并且10个(雄性中5个，雌性中5个)是在同型-对照Ab处理的动物中测试。在27个HT神经元中，14个(雄性中8个，雌性中6个)是在CGRP-mAb处理的动物中测试，并且13个(雄性中7个，雌性中6个)是在同型-对照Ab处理的动物中测试。
记录位点、感受野以及神经元类型
在针对CGRP-mAb所测试的神经元与以及针对同型-对照Ab所测试的神经元之间记录位点、硬脑膜和皮肤感受野图以及细胞类型并无不同(图7A至图7J)。所有所鉴定的记录位点均定位于第一颈段脊髓的板层I-II和IV-V以及尾核的尾部部分中。在所有情况下，硬脑膜感受野的最敏感区域为横窦沿线并且皮肤感受野的最敏感区域为眼睛周围，在超过90％的情况中涉及角膜。
原初中枢三叉神经血管神经元的自发性活动
在雄性大鼠中，静脉内施用CGRP-mAb减少HT的自发性活动，但不减少WDR神经元的自发性活动(图8A和图8B)。在HT组中，神经元放电在3-4小时内减少90％(p＝0.040)。偶而地，一些HT神经元的放电率在静脉内施用CGRP-mAb之后1-2小时内降低(图8D)。相比之下，静脉内施用同型-对照Ab不改变任一组神经元的自发性活动(图8E和图8F)。
在雌性中，与在雄性中不同，静脉内施用CGRP-mAb不减少HT或WDR神经元的自发性活动(图8C)。类似地，静脉内施用同型-对照Ab不改变任一组神经元的自发性活动(图8G)。关键地，在雄性和雌性大鼠之间HT和WDR神经元的基线(即，在任何处理之前)自发放电率并无不同(p＝0.14)。对于HT神经元，在雄性中在任何处理之前平均每秒尖峰数为1.7±1.1，相比之下在雌性中为1.9±1.0(p＝0.55)。对于WDR神经元，在雄性中在任何处理之前平均每秒尖峰数为0.3±0.6，相比之下在雌性中为2.2±1.1(p＝0.16)。
原初中枢三叉神经血管神经元对硬脑膜凹陷的敏感度
在雄性与雌性大鼠两者中，静脉内施用CGRP-mAb降低HT中对硬脑膜机械刺激的敏感度，但不降低WDR神经元中的敏感度(图9A至图9C)。在雄性中，HT神经元的放电减少75％(p＝0.047)，而在雌性中，它降低61％(p＝0.017)。与性别无关，静脉内施用同型-对照Ab不改变任一组神经元中对硬脑膜刺激的敏感度(图9D至图9F)。
原初中枢三叉神经血管神经元对眶周皮肤和角膜机械刺激的敏感度
在雄性或雌性大鼠中，静脉内施用CGRP-mAb(图10A至图10D)或同型-对照Ab(图10E至图10H)不改变HT或WDR神经元对无害(刷拭、压力)或有害(夹捏)皮肤或角膜(图11A至图11F)机械刺激的反应。
皮层扩散抑制
在50个神经元中测试CGRP-mAb(n＝27)或同型-对照Ab(n＝23)对中枢三叉神经血管神经元由CSD活化的影响，其中基线放电率(即，CSD诱导之前的平均每秒尖峰数)为可靠的并且历经数小时为一致的。在基线处(即，在CSD之前)，在雄性与雌性大鼠之间HT和WDR神经元的自发放电率并无不同(p＝0.14)。对于HT神经元，在雄性中在CSD诱导之前平均每秒尖峰数为1.2±0.6，相比之下在雌性中为3.3±1.7(p＝0.29)。对于WDR神经元，在雄性中在CSD诱导之前平均每秒尖峰数为1.5±0.6，相比之下在雌性中为3.5±2.2(p＝0.37)。
中枢三叉神经血管神经元中CSD诱导的活动
在雄性大鼠中，在CSD诱导之后两小时和同型-对照Ab施用之后6小时时，7个HT神经元的平均放电率从CSD之前1.1±0.8个尖峰/sec增加至CSD之后10.2±2.1(p＝0.019)，而5个WDR神经元的平均放电率未增加(CSD之前0.5±0.3个尖峰/sec相较于CSD之后1.6±0.5；p＝0.14)(图12A和图12B)。相比之下，在CGRP-mAb处理的大鼠中，8个HT神经元的反应量值在CSD诱导之后2小时和CGRP-mAb施用之后6小时时保持不变(CSD之前1.2±0.6个尖峰/sec相较于CSD之后1.9±1.5，p＝0.29)(图12D和图12E)。换言之，所预期的CSD诱导的HT神经元活化因CGRP-mAb处理而受阻。
在雌性大鼠中，在CSD诱导之后两小时和同型-对照Ab施用之后6小时时，6个HT神经元的平均放电率从CSD之前1.9±1.0个尖峰/sec增加至CSD之后10.0±4.5(p＝0.027)，而5个WDR神经元的平均放电率保持不变(CSD之前2.6±1.2个尖峰/sec相较于CSD之后2.2±0.9，p＝0.73)(图12C)。相比之下，在CGRP-mAb处理的大鼠中，6个HT神经元的反应量值在CSD诱导之后2小时和CGRP-mAb施用之后6小时时保持不变(CSD之前3.3±1.7个尖峰/sec相较于CSD之后5.0±3.4，p＝0.45)(图12F)。如在雄性中，所预期的CSD诱导的HT神经元活化因CGRP-mAb处理而受阻。
为进一步检验CGRP-mAb对WDR和HT神经元由CSD活化的影响，还进行了逐个情况的分析。在所有CGRP-mAb和同型-对照Ab处理的WDR神经元中，5/13和4/10由CSD活化，仅仅相差2％。相比之下，在所有CGRP-mAb和同型-对照Ab处理的HT神经元中，2/14和13/13由CSD活化，相差86％。
CSD诱导的敏化
与由CSD活化无关，11/13的HT神经元并且没有WDR神经元满足产生敏化的准则(规定于数据分析章节中)。因此，对于HT来说存在CGRP-mAb妨碍CSD之后产生敏化的能力，但对于WDR神经元来说不存在。
CSD之后硬脑膜感受野的扩大以及对硬脑膜机械刺激的增强反应
在同型-对照Ab处理组中，在雄性中5/7的HT神经元以及雌性中6/6的HT神经元中硬脑膜感受野扩大(图13A)。在CSD诱导之后两小时(同型-对照Ab施用之后6小时)时，在雄性中的所有7个HT神经元(CSD之前12.8±3.9个尖峰/sec相较于CSD之后22.0±3.7；p＝0.026)以及雌性中的6个HT神经元(CSD之前8.5±1.7相较于CSD之后21.6±5.1，p＝0.047)中神经元对使用VFH的硬脑膜凹陷的反应增加(图14A至图14C)。
相比之下，在CGRP-mAb处理组中，在雄性中的仅2/8的HT神经元以及雌性中的0/6中记录当发生时较小的硬脑膜感受野扩大(图13B)。在CSD诱导之后两小时(CGRP-mAb施用之后6小时)时，在雄性(CSD之前1.8±0.6相较于CSD之后1.9±1.5，p＝0.83)与雌性(CSD之前10.5±1.6相较于CSD之后8.1±6.4，p＝0.72，图14D至图14F)两者中在所有HT神经元中神经元对使用VFH的硬脑膜凹陷的反应保持不变，指示敏化受阻。因此，CGRP-mAb阻止雄性与雌性大鼠中的HT神经元中产生颅内机械超敏性。
CSD之后的皮肤感受野扩大以及对眶周皮肤机械刺激的增强反应(即，中枢敏化)
在同型-对照Ab处理组中，在雄性中5/7的HT神经元以及雌性中6/6的HT神经元中面部感受野扩大(图13A)。在CSD诱导之后两小时(同型-对照Ab施用之后6小时)时，在所有13个HT神经元中(雄性中7个，雌性中6个)对刷拭和压力的反应显著增加(图15A至图15C)。在雄性中，对刷拭和压力的反应分别从0.0增加至18.2±9.1个尖峰/sec(p＝0.046)和从16.6±4.2增加至35.8±9.1个尖峰/sec(p＝0.045)(图15B)。在雌性中，对刷拭和压力的反应分别从0.0增加至8±6.5个尖峰/sec(p＝0.027)和从9.3±2.7增加至31.8±13.6个尖峰/sec(p＝0.016)(图15C)。相比之下，在雌性中的所有HT神经元中对夹捏的反应显著增加(CSD之前19.3±5.0个尖峰/sec相较于CSD之后45.8±12.4个尖峰/sec，n＝6，p＝0.027)，但在雄性中未显著增加(CSD之前33.8±7.1个尖峰/sec相较于CSD之后52.4±10.3个尖峰/sec，n＝6，p＝0.068)(图15B和图15C)。
在CGRP-mAb处理的大鼠中，在雄性中仅2/8的HT神经元以及雌性中0/6的HT神经元中面部感受野扩大(图13B)。在CSD诱导之后两小时(CGRP-mAb施用之后6小时)时，在雄性与雌性两者中的所有HT神经元中神经元对刷拭(p＝0.35)、压力(p＝0.63)以及夹捏(p＝0.78)的反应保持不变(图15D至图15F)，表明CGRP-mAb阻止诱导敏化。
CSD之后对角膜刺激的增强反应
在同型-对照Ab处理的大鼠中，在雌性中HT神经元在CSD之后对角膜刺激的反应显著增加(CSD之前7.6±1.9个尖峰/sec相较于CSD之后21.0±6.4个尖峰/sec，n＝6，p＝0.044)，但在雄性中未显著增加(CSD之前11.0±2.6个尖峰/sec相较于CSD之后21.6±8.7个尖峰/sec，n＝7，p＝0.19)(图16A至图16C)。
在CGRP-mAb处理的雌性大鼠中，在6个HT神经元中对刷拭角膜的反应保持不变(p＝0.51)，表明敏化受阻；并且正如所料，在雄性中的8个HT神经元中也保持不变(CSDS之前10.8±3.3个尖峰/sec相较于CSD之后9.4±1.8个尖峰/sec，p＝0.60)(图16D至图16F)。因此，在雌性中CGRP-mAb阻止HT神经元中产生角膜超敏性，但在雄性大鼠中则不阻止。
C.讨论
研究证实，人源化单克隆抗CGRP抗体夫瑞奈组单抗抑制HT三叉神经血管神经元的活化和敏化，但不抑制WDR三叉神经血管神经元的活化和敏化(图17)。在雄性中，CGRP-mAb抑制原初HT神经元的自发性活动以及其对颅内硬脑膜刺激的反应，但不抑制对面部皮肤或角膜刺激的反应，而在雌性中，它仅抑制其对颅内硬脑膜刺激的反应。然而，当给予充足时间时，在两种性别中CGRP-mAb均阻止HT神经元被CSD活化以及随后的敏化，但不阻止WDR神经元的部分活化。这些发现表明，HT神经元以机械方式在起始头痛感知以及产生异常性疼痛和中枢敏化中发挥关键作用(以前未认识到)。临床上，本发明的发现可帮助解释CGRP-mAb在预防颅内来源的头痛(诸如偏头痛)中的治疗有效性以及为什么此治疗方法可能并非对每一位偏头痛患者均有效。
此研究测试了CGRP-mAb对不同类别的中枢三叉神经血管神经元的反应性的影响。先前，Storer和同事证实，CGRP-R拮抗剂BIBN4096BS抑制原初中枢三叉神经血管神经元对电刺激上矢状窦和微电泳施用L-谷氨酸盐的反应(Storer等,2004,Br.J.Pharmacol.142:1171-1181)。
夫瑞奈组单抗对HT和WDR的影响
当以静脉内方式给予时，CGRP-mAb减少HT神经元中的基线自发性活动，但不减少WDR神经元中的基线自发性活动。考虑当前和以前的证据表明WDR三叉神经血管神经元被用于研究偏头痛病理生理学的多种硬脑膜刺激活化(Davis和Dostrovsky,1988,J.Neurophysiol.59:648-666；Burstein等,1998,J.Neurophysiol.79:964-982；Storer等,2004,Brit.J.Pharmacol.142:1171-1181；Zhang等,2011,Ann.Neurol.69:855-865)，得出以下结论是合理的：单独活化WDR不足以在通过CGRP-mAb疗法完全或几乎完全预防头痛的阵发性偏头痛患者中诱导头痛感知(Bigal等,2015,Lancet Neurol.14:1081-1090)。相反地，推测单独活化WDR三叉神经血管神经元可足以在那些未受益于CGRP-mAb疗法的阵发性偏头痛患者中诱导头痛感知也是合理的，因为头痛可能不受从HT三叉神经血管神经元发送至丘脑的信号消除的影响。
在偏头痛和三叉神经血管系统以外，HT和WDR神经元已被认为在有害刺激的加工和疼痛的感知中发挥不同作用(Craig AD,2002,Nat.Rev.Neurosci.3:655-666；Craig AD,2003,Trends Neurosci.26:303-307；Craig AD,2003,Annu.Rev.Neurosci.26:1-30)。虽然大多数HT神经元表现出小感受野并且排他地对有害机械刺激作出反应，但大多数WDR神经元表现出大感受野并且对机械与热有害刺激两者作出反应(Price等,1976,J.Neurophysiol.39:936-953；Price等,1978,J.Neurophysiol.41:933-947；Hoffman等,1981,Neurophysiology 46:409-427；Dubner和Bennett,1983,Annu.Rev.Neurosci.6:381-418；Bushnell等,1984,J.Neurophysiol.52:170-187；Surmeier等,1986,J.Neurophysiol.56:328-350；Ferrington等,1987,J.Physiol.(Lond)388:681-703；Dubner等,1989,J.Neurophysiol.62:450-457；Maixner等,1989,J.Neurophysiol.62:437-449；Laird和Cervero,1991,J.Physiol.434:561-575)。基于这些差异，普遍认为HT神经元对疼痛的空间编码(尺寸、位置)作出较大贡献并且对疼痛模式的编码的贡献较小，而WDR神经元对疼痛的辐射性质作出较大贡献。如上所述，以下也是合理的：对夫瑞奈组单抗无反应的那些患者为头痛影响头部的较大区域(即，额部、颞部、枕部、两侧)的患者，而头痛良好地定位至小的并且独特的区域的患者将属于反应者。
在头痛中的有效性
夫瑞奈组单抗降低对硬脑膜机械刺激的反应性(在雄性与雌性两者中)，但不降低对皮肤或角膜无害或有害刺激的反应性。此发现以及CGRP-mAb还阻止HT三叉神经血管神经元被CSD活化的事实为夫瑞奈组单抗在预防颅内来源的头痛中的有效性提供科学基础。相反地，对调节在面部皮肤和角膜中产生的感觉和伤害感受性信号的加工缺乏影响预测此类别的药物对治疗长期三叉神经痛疾患(诸如干眼症和疱疹诱发的三叉神经痛)将几乎无治疗作用。鉴于夫瑞奈组单抗抑制来自硬脑膜(机械，CSD)的中枢三叉神经血管神经元的活化，但不抑制来自皮肤或角膜的中枢三叉神经血管神经元的活化，并且此分子的尺寸过大而不能容易地穿透血脑屏障，提出以下结论为合理的：上文所描述的抑制作用为周边三叉神经血管系统神经元对硬脑膜凹陷和CSD的反应的(原发性)抑制的继发性抑制。
鉴于CGRP纤维在体内的广泛分布(Kruger等,1988,J.Comp.Neurol.273:149-162；Kruger等,1989,J.Comp.Neurol.280:291-302；Silverman and Kruger,1989,J.Comp.Neurol.280:303-330)，其存在于多个脊髓段中(Hansen等,2016,Pain 157:666-676；Nees等,2016,Pain157:687-697)以及多个感觉背根神经节中(Edvinsson等,1998,J.Auton.Nerv.Syst.70:15-22；Edvinsson等,2001,Microsc.Res.Techniq.53:221-228；Cho等,2015,J.Korean Med.Sci.30:1902-1910；Kestell等,2015,J.Comp.Neurol.523:2555-2569；Spencer等,2016,J.Comp.Neurol.524:3064-3083)，CGRP-mAb对中枢神经元对皮肤和角膜有害刺激的反应几乎没有影响或没有影响是令人惊讶的。如果一个人接受CGRP-mAb主要在外周起作用的观点，那么提出以下结论可为合理的：周边形势对脑膜的感觉支配以及此支配影响背角中的感觉传输的方式与皮肤、角膜或其他(体细胞)疼痛的产生中所涉及的不同。对夫瑞奈组单抗在其他疼痛疾患的动物模型中的影响的研究将允许更准确的解释CGRP-mAb在硬脑膜与颅外组织中的影响之间的差异不被认为在偏头痛中具有独特起始作用。
CSD诱导的活化和敏化的抑制
此研究证实CSD对中枢三叉神经血管神经元的敏化。在雄性与雌性两者中在HT神经元中观测到但在WDR神经元未观测到的此敏化因CGRP-mAb施用而受阻。这些发现表明，发作时前面有预兆的皮肤异常性疼痛(Burstein等,2000,Ann.Neurol.47:614-624)是由HT神经元介导的，HT神经元在基线处(在患者中在发作间和在动物中在CSD诱导之前)对皮肤无害机械刺激无反应，但在CSD之后变得对刷拭具机械反应性。根据此方案，在有预兆偏头痛患者之中，使用CGRP-mAb的预防性治疗的反应者将不显示皮肤异常性疼痛的迹象。
雄性相较于雌性
此研究还测试了CGRP-mAb在雄性与雌性大鼠两者中的影响。虽然按性别进行的全面分析表明，此类别药物的治疗益处在雄性和雌性偏头痛患者中将为类似的，但它还表明在原初状态中，CGRP-mAb减少雄性中的自发性活动，但不减少雌性HT神经元的自发性活动，并且在CSD诱导敏化之后，仅在雌性中记录的HT神经元表现出对皮肤和角膜有害刺激的敏化迹象。鉴于偏头痛在女性中比男性中更常见，所述差异可表明在有预兆偏头痛期间在女性中比男性中更可能产生痛觉过敏(而非异常性疼痛)，并且在发作间状态中试图用CGRP-mAb降低神经元兴奋性(即，作为预防剂)在女性中可能也比在男性中更具挑战性。以机械方式，三个所观测到的差异可归因于雌性HT神经元的可兴奋性更大，这是由于这些神经元的内部特性或由于其从周边伤害感受器收到的输入强度的差异。尽管不存在数据支持第一选择，但有可能与雄性相比雌性中硬脑膜免疫细胞和炎性分子的活化的差异(McIlvried等(2015)Headache 55:943-957)可支持第二选择。考虑夫瑞奈组单抗减少雄性大鼠中的自发性活动但不减少雌性大鼠中的自发性活动的能力，可将表明雌性大鼠在三叉神经节和脊髓三叉神经核中表达更少的CGRP受体并且在背角中表达更高水平的CGRP编码mRNA的数据考虑在内(Stucky等(2011)Headache 51:674-692)。
最后，CGRP-mAb的抑制作用达到显著性仅需要几小时。此相对短的时间(数小时而非数天)是使用静脉内施用实现的。
实施例6.使用行为和心理物理学工具评估抗CGRP抗体(TEV-48125)反应者
大部分寻求二级或三级医疗护理的阵发性偏头痛患者在偏头痛急性期期间表现出皮肤异常性疼痛和痛觉过敏的迹象，但在无疼痛时不表现出这些迹象(BursteinR等(2000)Ann.Neurol.47:614-624)。相比之下，慢性偏头痛患者通常在急性偏头痛发作期间与发作间期期间均表现出皮肤异常性疼痛和痛觉过敏的迹象。认为异常性疼痛和痛觉过敏以机械方式由脊髓三叉神经核中的中枢三叉神经血管神经元的敏化介导(Burstein R等(1998)J.Neurophysiol.79(2):964-982；Burstein R等(2000)Ann.Neurol.47:614-624；以及Lipton等(2008)Ann.Neurol.63(2):148-58)。相比之下，慢性偏头痛患者通常在急性偏头痛发作期间与发作间期期间均表现出皮肤异常性疼痛和痛觉过敏的迹象。认为异常性疼痛和痛觉过敏以机械方式由脊髓三叉神经核中的中枢三叉神经血管神经元的敏化介导(参见Burstein(1998))。实施例5证实，TEV-48125通过其在周边脑膜伤害感受器中的抑制作用能够阻止脊髓三叉神经核中高阈值(HT)神经元的活化和敏化，程度远超过其抑制广动力范围(WDR)神经元的能力(还参见Melo-Carrillo等(2017)J.Neurosci.37(30):7149-63)。鉴于HT神经元排他地对有害(疼痛)刺激作出反应，而WDR神经元优先对有害刺激作出反应(即，其对有害刺激的反应大于其对无害刺激的反应)，可合理地假设与异常性疼痛相比阻断HT将更有效地防止痛觉过敏。
迄今为止，在药物实例的文献中没有仅降低脊髓三叉神经核中这两种类型的伤害感受性神经元中的一者的活化和敏化的实例或暗示。鉴于夫瑞奈组单抗抑制脑膜Aδ但不抑制C-纤维，选择性抑制Aδ-纤维潜在地解释了抗体对HT神经元的选择性抑制(参见Melo-Carillo等(2017)J.Neurosci.37(44):10587-96)。另外，由于C-纤维可不影响HT神经元的活性，因此，夫瑞奈组单抗可实现对上行伤害感受性三叉神经血管路径的非常具选择性的影响，上行伤害感受性三叉神经血管路径为活性取决于外周的CGRP释放的那些伤害感受性三叉神经血管路径。
不希望受任何特定理论限制，相信反应者为需要持续周边输入来维持WDR和HT神经元中的中枢敏化的受试者，而非反应者为不需要持续周边输入来维持WDR和HT神经元中的中枢敏化的受试者。因为夫瑞奈组单抗阻断Aδ-纤维的活化，所以在反应者中此阻断可足以使得HT神经元完全静止(即，终止其敏化)。夫瑞奈组单抗还可减少驱动WDR神经元的敏化状态的总输入，达到神经元从解锁C-纤维收到的输入仅诱导兴奋性突触后电位(EPSP)，但不诱导实际动作电位的程度。WDR与HT神经元两者的敏化状态可由夫瑞奈组单抗逆转，并且因此，在反应者中异常性疼痛/痛觉过敏将被逆转。相反地，在非反应者中，HT或WDR神经元或两者的敏化完全不依赖于周边输入，与其起源于Aδ-纤维或C-纤维无关。因此，在治疗之后非反应者将为异常性疼痛和/或痛觉过敏的。其他抗CGRP抗体(例如本文所描述的抗CGRP抗体)预期将表现出与夫瑞奈组单抗相同的性质。
研究设计∶
总体策略：为确定皮肤疼痛阈值(其测试异常性疼痛)以及在4种不同条件下在慢性偏头痛患者中响应于重复阈上机械和热刺激的疼痛评分(其测试痛觉过敏)：(a)在没有偏头痛时在治疗之前，(b)在没有偏头痛时在治疗之后，以及(如果可能)(c)在急性偏头痛发作期间在治疗之前和之后。注意：(c)部分不为鉴定CM群体之中的反应者所必需的。它可与鉴定高频率阵发性患者之中的反应者有关。
参与者选择和招募：具有慢性偏头痛的个体将被考虑参与此研究。主要纳入准则将为(1)年龄18-64岁，(2)基于国际头痛病症分类(International Classification ofHeadache Disorders)(第3版)的慢性有预兆或无预兆偏头痛史持续至少3年，以及(3)用英语沟通的能力(以便理解和遵循测试指示)。排除准则将包括：(1)每月头痛少于十五天；(2)妊娠；(3)有冠状动脉旁路手术史、心脏病史、心绞痛史、中风史、严重胃肠道出血史、消化性溃疡疾病史；或慢性肾脏疾病史；(5)患有需要使用利尿剂或日常抗凝剂的医学疾患。
开放标签设计：在将在预定日期(访视1)进行的筛选之后，将使用问卷获得研究参与者的偏头痛史，并且将针对异常性疼痛和痛觉过敏进行定量感觉测试。当参与者没有头痛时，将在访视2之前至少30天时进行访视1。参与者将被指示在此期间维持每天头痛日记。
在研究参与者具有偏头痛时将进行访视2，并且将包括3个循环的疼痛评分以及用于评估异常性疼痛和痛觉过敏的QST。在治疗之前和发作之后至少2小时时将进行第一个循环的疼痛评分。将患者随机化以按皮下方式接受安慰剂(同型对照抗体)或675mg的夫瑞奈组单抗。在治疗之后两小时时将进行第二个循环的疼痛评分。在治疗之后4小时时将进行第三个循环的疼痛评分。参与者将被指示在整个研究中维持每天头痛日记。
访视3将在治疗之后1周时进行并且将包括头痛日记查阅、头痛强度评分以及关于异常性疼痛和痛觉过敏的QST测试。
访视3将在治疗之后4周时进行并且将包括头痛日记查阅、头痛强度评分以及关于异常性疼痛和痛觉过敏的QST测试。
在每次访视中，将记录基线头痛强度、对定量机械和热刺激的疼痛阈值以及响应于阈上机械和热刺激的头痛强度得分。
定量感觉测试(QST)：测试将在远离噪音和干扰的安静房间中进行。在感觉测试期间患者将能够选择其最舒适的姿势(坐在椅子上或躺在床上)。在每个测试阶段中，将在被称疼痛的位点上方的皮肤中确定对热和机械刺激的疼痛阈值。此位点最通常包括眶周和颞部区域。将通过以恒定压力连接至皮肤的30x30mm2热电极(Q-Sense 2016,Medoc)递送热皮肤刺激并且将通过使用限制法(Method of Limit)来测定其疼痛阈值。
异常性疼痛测试：为测定疼痛阈值，将允许皮肤对32℃的温度适应5分钟，然后以缓慢速率(1℃/sec)升温直到察觉到痛觉为止，此时受试者通过按患者反应单元上的按钮来停止刺激。每次将使热刺激重复三次并且将把所记录温度的平均值视为阈值。将通过使用一组20个经校正弗莱毛(VFH,Stoelting)来测定对机械刺激的疼痛阈值。按递升次序为每个VFH单丝分配标量数(1＝0.0045g，2＝0.023g，3＝0.027g，4＝0.07g，5＝0.16g，6＝0.4g，7＝0.7g，8＝1.2g，9＝1.5g，10＝2.0g，11＝3.6g，12＝5.4g，13＝8.5g，14＝11.7g，15＝15.1g，16＝28.8g，17＝75g，18＝125g，19＝281g)。因为力的对数与排列的数字之间存在线性关系，所以以VFH数目(#)而非其力(g)来表示机械疼痛阈值。每个单丝将对皮肤施用3次(持续2sec)并且能够在三分之二的试验中诱导疼痛的最小VFH数目将被视为阈值。还将通过记录受试者对轻柔皮肤刷拭的感知来确定皮肤敏感性，轻柔皮肤刷拭为一种的动态机械刺激，它不同于VFH，VFH为静态机械刺激，它不同于VFH，VFH为静态机械刺激。
痛觉过敏测试：当疼痛刺激被察觉为比往常更疼时，认为受试者为痛觉过敏的。为确定受试者是否为痛觉过敏的，将对皮肤施加3次阈上热和机械刺激。将在以上异常性疼痛测试期间测定阈上刺激的值。举例来说，如果热疼痛阈值为45℃，那么我们将在痛觉过敏测试中用46℃。在此测试中，将使皮肤暴露于3次阈上刺激(超过阈值1)，每次持续10秒并且相隔10秒(即，刺激间间隔为10秒)。在每次刺激结束时，患者将有10秒使用0-10(O＝没有疼痛，10＝最大可想象疼痛)的视觉模拟量表(VAS)来确定疼痛强度。将使用阈上机械刺激施以类似测试。
用于定量感觉测试的设备已经FDA批准。它是全国的神经病学家、护士以及疼痛专家常规使用的。它不产生危险或不适，并且因为它由患者控制，所以可在任何时间停止刺激。
QST的解释：
异常性疼痛：因为疼痛阈值的检测取决于主观数据输入，所以已研发若干算法来使主观变异最小化，并且使结果尽可能客观。这些算法被合并到控制热和机械感觉分析仪(Q-Sense 2016)的软件程序中。在健康受试者中，热和机械皮肤刺激的疼痛阈值分别在42-47℃和75-281g之间变化(参见Lindblom(1994)Analysis of abnormal touch,pain,andtemperature sensation in patients.Boivie J,Hansson P,Lindblom U编.Touch,temperature and pain in health and disease:mechanism and assessments.第3卷.Progress in brain research and management.Seattle:IASP press.第63-84页；以及Strigo等(2000)Anesthesiology 92(3):699-707。使用更严格的准则，如果受试者的疼痛阈值对于热来说低于41℃以及对于使用经校正弗莱毛的皮肤凹陷来说低于30g，那么她/他将被视为异常性疼痛的。满足任一模式的准则将足以确定受试者为异常性疼痛的(Burstein等(2004)Ann.Neurol.47(5):614-24；以及Burstein等(2004)Ann.Neurol.55(1):19-26)。
痛觉过敏：疼痛评分中的任何大于30％的变化均将被视为痛觉过敏的证据(例如如果按VAS阈上刺激#1被评分为6/10，那么阈上刺激#3将必定被评分为8/10或更高)。
数据分析将考虑治疗之前和之后的机械和热疼痛阈值的值。
数据分析：
数据分析将包括完成所有4次访视和6个测试阶段的受试者。
主要结果测量为相较于非反应者在反应者中在干预(1个月)之后存在或不存在异常性疼痛。最初将反应者定义为经历最少50％的每月头痛天数减少；将非反应者定义为经历最多不到50％的每月头痛天数减少。二级定义将反应者解释为经历最少60％的每月头痛天数减少；将非反应者定义为经历最多不到40％的每月头痛天数减少。另一二级定义将反应者解释为经历最少75％的每月头痛天数减少；将非反应者定义为经历最多不到25％的每月头痛天数减少。
将使用卡方(χ2)测试对一级结果测量进行检验，以评估异常性疼痛的存在(是/否)与受试者的反应性(是/否)之间的分类关联。二级结果测量为干预(1个月)之前和之后的偏头痛持续时间(小时)以及干预之后2小时和4小时时的头痛强度变化。
首先将测试连续二级结果测量的数据的正态性，以便确定参数分析还是非参数分析为适当的。因此，将使用中心分布(平均值/中值)的参数来评估反应者与非反应者之间这些变量的差异。
分析还将检验以下因子对一级和二级结果测量的影响：具有偏头痛的年数、具有CM的年数、家族史、相关症状(例如恶心、呕吐、畏光、畏声、畏嗅、预兆、肌肉压痛)、常见触发因素(例如应力、持久觉醒食物缺乏、月经)和急性治疗史以及预防性治疗史。
功效分析：
功效分析是基于卡方(χ2)拟合优度和Z比例比较检验。合并5％的α(显著性水平)、90％的1-β错误概率(功效)、0.36的w(影响大小；χ2拟合优度检验)以及1:1的分配比率(Z比例比较检验)。分层分析包括变量组(安慰剂相较于治疗)、反应性(反应者相较于非反应者；参见以上定义)以及异常性疼痛(存在相较于不存在)。主要假设为在治疗和安慰剂组中干预后反应者比例(根据上述定义为每月头痛天数阈值减少50％)将分别为55％和25％(基于Bigal等(2015)Lancet Neurol.14(11):1091-100所公布的数据)。此计算在安慰剂和处理组中的每一者中产生所需数目的64个受试者(df＝5；临界χ2＝11.07；非中心参数λ＝16.51，图4)。额外的20％被认为是可能退出的。因此，每一组中要招募总共77个患者，在整个研究中产生总共144个患者。
实施例7.抗CGRP抗体(夫瑞奈组单抗)对一级三叉神经血管神经元的选择性抑制
大量证据支持CGRP在偏头痛的病理生理学中的重要作用。此证据使得全球努力研发降低偏头痛患者中CGRP的可获得性的新一代治疗剂。最近，发现第二代此类药物CGRP-mAb有效降低慢性或阵发性偏头痛的频率。为研究此治疗作用的神经基础，对夫瑞奈组单抗CGRP-mAb对脑膜感觉路径中一级和二级神经元的活动的影响进行了测试。此研究显示了夫瑞奈组单抗对三叉神经节中的一级神经元的影响(图18A至图21B)。
设计/方法：
使用单细胞细胞外记录技术来测定夫瑞奈组单抗(30mg/kg，静脉内)和其同型(对照)对氨基甲酸酯麻醉的雄性大鼠中由皮层扩散抑制(CSD)诱发的三叉神经节中一级三叉神经血管神经元的活动的影响。在药物/同型输注之后4小时时通过针刺来诱导CSD。
结果：
CSD诱导同型处理的动物中40％的所测试神经元以及夫瑞奈组单抗处理的动物中20％的所测试神经元的活化。如图21A(a-δ)中所示，在同型处理的动物中，CSD活化所有a-δ纤维中的54％，这类似于未处理的动物中由CSD活化的a-δ纤维的百分比。相比之下，在用夫瑞奈组单抗处理的动物中，CSD仅活化所有a-δ纤维中的14％。此差异为统计学显著的(Z检验p＝.001)。在同型处理的动物(图21B；C型)中，CSD活化所有C-纤维中的31％，这类似于未处理的动物中由CSD活化的C-纤维的百分比。类似地，在用夫瑞奈组单抗处理的动物中，CSD活化所有C-纤维中的23％。此差异为统计学不显著的(Z检验p>0.05)。
因此，夫瑞奈组单抗的作用对A-δ神经元具选择性：对CSD作出反应的A-δ神经元的百分比从54％(同型)显著降低(p<0.05)至14％(夫瑞奈组单抗)(图21A)，而对CSD作出反应的C-纤维神经元的百分比未显示显著变化(31％相较于23％，同型相较于夫瑞奈组单抗)(图21B)。
夫瑞奈组单抗对A-δ而非C-纤维一级神经元的选择性作用可帮助解释对二级高阈值而非广动力范围神经元的选择性抑制。对于慢性和阵发性偏头痛因夫瑞奈组单抗而缓解的患者，所述发现增加了A-δ神经元在起始和慢性化头痛感知中发挥关键作用的可能性，而C-纤维神经元促成相关异常性疼痛和中枢敏化。
不希望受任何特定理论限制，提供建议用于用抗CGRP单克隆抗体预防偏头痛的机制。简单来说，CSD诱导软脑膜动脉的短暂收缩、短暂舒张和持久收缩以及含有CGRP的C-纤维脑膜伤害感受器的立即活化和延迟活化。在其非CGRP依赖性活化后，脑膜C-纤维在硬脑膜中释放CGRP并且通过这样做，介导附近Aδ-纤维的CGRP依赖性活化。在活化后，C-纤维脑膜伤害感受器集中于脊髓三叉神经核中的WDR神经元并且将其活化，而Aδ-纤维集中于WDR与HT神经元两者并且将其活化，从而最终将伤害感受性信号从硬脑膜传输至丘脑。脑膜C-纤维上不存在CGRP受体使得C-WDR路径的活化为非CGRP依赖性的，并且因此对抗CGRP单克隆抗体无反应。相比之下，脑膜Aδ-纤维上存在CGRP受体使得Aδ-HT路径的活化为CGRP依赖性的，并且因此，对抗CGRP单克隆抗体有反应。
实施例8：抗CGRP拮抗剂抗体预防发作后头痛(PIH)
使用单细胞电生理学技术来研究与未处理的大鼠相比在用夫瑞奈组单抗(TEV-48125)处理的大鼠中脊髓三叉神经核中的周边和中枢三叉神经血管神经元响应于癫痫发生的反应型态。使用皮层电极来描记癫痫样发作的量值、程度以及进展。
手术准备和单细胞记录.如先前研究中所描述从三叉神经节和背角中的神经元获得单细胞记录(Burstein等(1998)J.Neurophysiol.79:964-82；Strassman和Levy(2006)J.Neurophysiol.95:1298-306；Strassman等(1996)Nature 384:560-4；Zhang等(2010)J.Neurosci.30:8807-14；以及Zhang等(2011)Ann.Neurol.69:855-65)。在成年斯普雷格-多利大鼠(250g至350g)中进行实验。用氨基甲酸酯将动物麻醉(1.2-1.5g/kg)，人工通入氧气，并且使其瘫痪。控制体温，并且监测呼气末CO2和氧饱和。对于神经节记录，进行四个单独颅骨切开术：在对侧皮层上，以推入微电极；在同侧顶叶皮层上和同侧枕叶皮层上，用于施加木防己苦毒素和记录皮层脑电图活动；以及在同侧横窦上，用于硬脑膜传入神经的电刺激和机械刺激以及利多卡因(lidocaine)施加。对于背角记录，在同侧皮层和同侧横窦上进行相同颅骨切开术，但未进行对侧颅骨切开术。替代地，进行椎板切除术以暴露上部颈脊髓(C1-2)用于微电极记录。在三叉神经节与背角记录实验中，用于发现硬脑膜敏感性神经元的检索刺激为适用于覆盖横窦的硬脑膜的单冲击电刺激。
癫痫诱导和皮层脑电图记录.通过向大脑皮层表面施加木防己苦毒素来诱导癫痫(10μl，施加于一小片明胶海绵上，对于局灶性或全身癫痫浓度分别为5mM或100mM)。为验证癫痫诱导，使用放置在紧挨着大脑皮层表面下顶骨和枕骨位点的玻璃微量吸液管(0.9％盐水，约1兆欧，7μm端部)记录皮层活动。
用单克隆抗CGRP抗体TEV-48125治疗.TEV-48125(TEVA PharmaceuticalIndustries Ltd.,Israel)为一种人源化单克隆抗CGRP抗体(CGRP-mAb)。将其在盐水中稀释至最终剂量为30mg/kg并且在癫痫诱导之前四小时时以静脉内方式施用(总体积0.8ml)。
结果.在未处理的动物中，癫痫诱导触发周边和中枢三叉神经血管神经元的持久活化。在神经节中，活动在癫痫到达其感受野之后数分钟时开始增加并且只要癫痫活动持续就保持上升(图22A至图22D)。在延髓背角中，28/30(93％)的神经元因癫痫而活化超过2小时(图23A至图23E)。相比之下，在TEV-48125处理的动物中，仅2/13(15％)的神经元因癫痫而活化(图24)。
结论.此实施例显示三叉神经血管路径因癫痫而活化以及此类活化因TEV-48125而受阻。因为三叉神经血管路径介导发作后头痛(PIH)，所以所述发现证实如果预防性地给予，那么TEV-48125可预防PIH。关键地，结果表明，在未处理的动物中，癫痫诱导在28/30(93％)的神经元中触发持久活化，而在TEV-48125处理的动物中，仅2/13(15％)神经元因癫痫而活化。
抗体序列
G1重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSS
G1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK
G1 CDR H1(延长的CDR)(SEQ ID NO:3)
GFTFSNYWIS
G1 CDR H2(延长的CDR)(SEQ ID NO:4)
EIRSESDASATHYAEAVKG
G1 CDR H3(SEQ ID NO:5)
YFDYGLAIQNY
G1 CDR L1(SEQ ID NO:6)
KASKRVTTYVS
G1 CDR L2(SEQ ID NO:7)
GASNRYL
G1 CDR L3(SEQ ID NO:8)
SQSYNYPYT
G1重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:9)
GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC
G1轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:10)
GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAA
G1重链全抗体氨基酸序列(包括如本文所描述的经修饰的IgG2)(SEQ ID NO:11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
G1轻链全抗体氨基酸序列(SEQ ID NO:12)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
G1重链全抗体核苷酸序列(包括如本文所描述的经修饰的IgG2)(SEQ ID NO:13)
GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA
G1轻链全抗体核苷酸序列(SEQ ID NO:14)
GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA
人CGRP和大鼠CGRP的氨基酸序列比较(人α-CGRP(SEQ ID NO:15)；人β-CGRP(SEQ ID NO:43)；大鼠α-CGRP(SEQ ID NO:41)；以及大鼠βCGRP(SEQ ID NO:44)
NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2(人α-CGRP)
NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2(人β-CGRP)
NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2(大鼠α-CGRP)
NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2(大鼠β-CGRP)
轻链可变区LCVR17氨基酸序列(SEQ ID NO:58)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK
重链可变区HCVR22氨基酸序列(SEQ ID NO:59)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGDTRYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSS
轻链可变区LCVR18氨基酸序列(SEQ ID NO:60)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK
重链可变区HCVR23氨基酸序列(SEQ ID NO:61)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSS
轻链可变区LCVR19氨基酸序列(SEQ ID NO:62)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK
重链可变区HCVR24氨基酸序列(SEQ ID NO:63)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS
轻链可变区LCVR20氨基酸序列(SEQ ID NO:64)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIDKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK
重链可变区HCVR25氨基酸序列(SEQ ID NO:65)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTLVTVSS
轻链可变区LCVR21氨基酸序列(SEQ ID NO:66)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK
重链可变区HCVR26氨基酸序列(SEQ ID NO:67)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS
轻链可变区LCVR27氨基酸序列(SEQ ID NO:68)
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR
重链可变区HCVR28氨基酸序列(SEQ ID NO:69)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS
轻链可变区LCVR29氨基酸序列(SEQ ID NO:70)
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR
重链可变区HCVR30氨基酸序列(SEQ ID NO:71)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS
轻链可变区LCVR31氨基酸序列(SEQ ID NO:72)
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR
重链可变区HCVR32氨基酸序列(SEQ ID NO:73)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS
轻链可变区LCVR33氨基酸序列(SEQ ID NO:74)
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKR
重链可变区HCVR34氨基酸序列(SEQ ID NO:75)
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS
轻链可变区LCVR35氨基酸序列(SEQ ID NO:76)
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR
重链可变区HCVR36氨基酸序列(SEQ ID NO:77)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS
轻链可变区LCVR37氨基酸序列(SEQ ID NO:78)
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGTWDSRLSAVVFGGGTKLTVL
重链可变区HCVR38氨基酸序列(SEQ ID NO:79)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGMAVWGQGTTVTVSS

Claims (143)

1.一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：
a)选择患者，所述患者的头痛由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导，其中所述敏化取决于来自脑膜的疼痛信号；以及
b)向所述患者施用足以降低所述患者的头痛频率的量的阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述患者为慢性或阵发性偏头痛患者并且所述头痛为偏头痛。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述患者患有脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述头痛是归因于脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
5.如权利要求1-4中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
6.如权利要求1-5中的一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用一个或多个额外剂量的所述单克隆抗体。
7.如权利要求1-6中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体为抗CGRP拮抗剂抗体。
8.如权利要求1-6中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体为抗CGRP受体抗体。
9.如权利要求1-8中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体为人抗体或人源化抗体。
10.如权利要求1-7中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体为人源化抗CGRP拮抗剂抗体。
11.如权利要求1-10中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
12.如权利要求1-11中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体在所述患者没有头痛时施用。
13.如权利要求1-12中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体由预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器施用。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:3中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDR L3。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的轻链。
17.如权利要求14-16中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以约225mg至约900mg的剂量施用。
18.如权利要求14-16中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以约225mg的剂量施用。
19.如权利要求14-16中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以每月或每季约225mg的剂量施用。
20.如权利要求14-16中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以约675mg的剂量施用。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述剂量为初始剂量，并且所述方法还包括在向所述患者施用所述初始剂量的月份之后两个月中的每个月内每月一次向所述患者施用另一剂量的约225mg的所述单克隆抗体。
22.如权利要求14-16中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以每月或每季约675mg的剂量施用。
23.如权利要求14-16中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以约900mg的剂量施用。
24.如权利要求14-16中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以每月或每季约900mg的剂量施用。
25.如权利要求14-24中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以包含浓度为至少约150mg/mL的所述单克隆抗体的制剂的形式施用。
26.如权利要求14-25中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以小于2mL的体积施用。
27.如权利要求14-26中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:87中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的轻链。
31.如权利要求28-30中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以约100mg、约300mg或约1000mg的剂量施用。
32.如权利要求28-31中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
33.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:93中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。
34.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
35.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的轻链。
36.如权利要求33-35中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以约120mg或约240mg的剂量施用。
37.如权利要求33-36中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
38.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:103中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。
39.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
40.如权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的轻链。
41.如权利要求38-40中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以约70mg或约140mg的剂量施用。
42.如权利要求38-41中的一项所述的方法，其中所述单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
43.一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：
a)选择患者，所述患者表现出能够通过施用阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的第一单克隆抗体而减轻的痛觉过敏；以及
b)向所述患者施用足以降低所述患者的头痛频率的量的阻断、抑制、阻抑或减少所述CGRP路径的第二单克隆抗体。
44.如权利要求43所述的方法，其中表现出痛觉过敏的所述患者还表现出异常性疼痛，所述异常性疼痛通过施用阻断、抑制、阻抑或减少所述CGRP路径的所述第一单克隆抗体而逆转或消除。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中选择表现出痛觉过敏的所述患者包括对所述患者施以定量感觉测试(QST)。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述QST在施用所述第一单克隆抗体之前和之后并且在所述患者没有头痛时施用。
47.如权利要求43-46中的一项所述的方法，其中所述患者为慢性或阵发性偏头痛患者并且所述头痛为有预兆或无预兆偏头痛。
48.如权利要求43-46中的一项所述的方法，其中所述患者患有脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
49.如权利要求43-46中的一项所述的方法，其中所述头痛是归因于脑膜炎、硬膜外出血、硬膜下出血、蛛网膜下出血或脑肿瘤。
50.如权利要求43-49中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体为相同的。
51.如权利要求43-50中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体各自独立地以静脉内或皮下方式施用给所述患者。
52.如权利要求43-51中的一项所述的方法，其还包括向所述患者施用一个或多个额外剂量的所述第二单克隆抗体。
53.如权利要求43-52中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体各自独立地选自抗CGRP拮抗剂抗体和抗CGRP受体抗体。
54.如权利要求43-53中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体为人抗体或人源化抗体。
55.如权利要求43-54中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体为人源化抗CGRP拮抗剂抗体。
56.如权利要求43-55中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体为人源化抗CGRP拮抗剂抗体。
57.如权利要求43-56中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体各自独立地选自IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4抗体。
58.如权利要求43-57中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体在所述患者没有头痛时施用。
59.如权利要求43-58中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体由预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器施用给所述患者。
60.如权利要求43-59中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体由预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器施用给所述患者。
61.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含如SEQ ID NO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDR L3。
62.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
63.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的轻链。
64.如权利要求61-63中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体以约225mg至约900mg的剂量施用。
65.如权利要求61-63中的一项所述的方法，其中所述第一单克隆抗体以约225mg、约675mg或约900mg的剂量施用。
66.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含如SEQ ID NO:87中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。
67.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
68.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的轻链。
69.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含如SEQ ID NO:93中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。
70.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
71.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的轻链。
72.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含如SEQ ID NO:103中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。
73.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
74.如权利要求43所述的方法，其中所述第一单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的轻链。
75.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含如SEQ ID NO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDR L3。
76.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
77.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的轻链。
78.如权利要求75-77中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以约225至约900mg的剂量施用。
79.如权利要求75-77中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以约225mg的剂量施用。
80.如权利要求75-77中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以每月或每季约225mg的剂量施用。
81.如权利要求75-77中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以约675mg的剂量施用。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述剂量为初始剂量，并且其中所述方法还包括在向所述患者施用所述初始剂量的月份之后两个月中的每个月内每月一次向所述患者施用另一剂量的约225mg的所述第二单克隆抗体。
83.如权利要求75-77中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以每月或每季约675mg的剂量施用。
84.如权利要求75-77中的一项所述的方法，其中以约900mg的剂量施用所述第二单克隆抗体。
85.如权利要求75-77中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以每月或每季约900mg的剂量施用。
86.如权利要求75-85中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以包含浓度为至少约150mg/mL的所述抗体的制剂的形式施用。
87.如权利要求75-86中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以小于2mL的体积施用。
88.如权利要求75-87中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
89.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含如SEQ ID NO:87中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。
90.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
91.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的轻链。
92.如权利要求89-91中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以约100mg、约300mg或约1000mg的剂量施用。
93.如权利要求89-92中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
94.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含如SEQ ID NO:93中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。
95.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
96.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的轻链。
97.如权利要求94-96中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以约120mg或约240mg的剂量施用。
98.如权利要求94-97中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
99.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含如SEQ ID NO:103中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。
100.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
101.如权利要求43所述的方法，其中所述第二单克隆抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的轻链。
102.如权利要求99-101中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以约70mg或约140mg的剂量施用。
103.如权利要求99-102中的一项所述的方法，其中所述第二单克隆抗体以静脉内或皮下方式施用。
104.一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：
a)选择患者，所述患者主要在头部的一部分中经历头痛；以及
b)向所述患者施用足以降低所述患者的头痛频率的量的阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述头部的所述部分为单侧眶周、单侧颞部或一只眼睛。
106.阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体用于制造用于降低患者的头痛频率的药剂的用途，所述患者的头痛由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导。
107.阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体用于制造用于降低患者的头痛频率的药剂的用途，所述患者表现出能够通过施用阻断、抑制、阻抑或减少所述CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏。
108.阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体用于制造用于降低患者的头痛频率的药剂的用途，所述患者主要在头部的一部分中经历头痛。
109.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:6中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDRL3。
110.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
111.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:11中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的轻链。
112.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:87中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。
113.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:82中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
114.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:83中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的轻链。
115.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:93中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。
116.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:97中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
117.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:99中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的轻链。
118.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO:103中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。
119.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:107中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
120.如权利要求106-108中的一项的用途，其中所述单克隆抗体包含含有如SEQ IDNO:109中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的轻链。
121.一种阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体，所述单克隆抗体用于降低患者的头痛频率，其中所述患者为头痛由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导的患者。
122.如权利要求121所述的抗体，其中所述患者已被确定为患有由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导的头痛。
123.一种阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体，所述单克隆抗体用于降低患者的头痛频率，其中所述患者为表现出能够通过施用阻断、抑制、阻抑或减少所述CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏的患者。
124.如权利要求123所述的抗体，其中所述患者已被确定为表现出痛觉过敏。
125.如权利要求124所述的抗体，其中所述患者已被确定为患有能够通过施用阻断、抑制、阻抑或减少所述CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏。
126.一种阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体，所述单克隆抗体用于降低患者的头痛频率，其中所述患者为主要在头部的一部分中经历头痛的患者。
127.如权利要求126所述的抗体，其中所述患者已被确定为主要在头部的一部分中经历头痛。
128.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:3中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:4中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:5中所示的CDR H3；如SEQ ID NO:6中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:7中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:8中所示的CDR L3。
129.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
130.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的轻链。
131.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:87中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:88中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:89中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:84中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:85中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:86中所示的CDR L3。
132.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
133.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的轻链。
134.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:93中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:94中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:95中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:91中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:92中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:90中所示的CDR L3。
135.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
136.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列的轻链。
137.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:103中所示的CDR H1；如SEQ ID NO:104中所示的CDR H2；如SEQ ID NO:105中所示的CDR H3；如SEQ IDNO:100中所示的CDR L1；如SEQ ID NO:101中所示的CDR L2；以及如SEQ ID NO:102中所示的CDR L3。
138.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:107中所示的氨基酸序列的重链可变区，以及含有如SEQ ID NO:106中所示的氨基酸序列的轻链可变区。
139.如权利要求121-127中的一项的抗体，其中所述抗体包含含有如SEQ ID NO:109中所示的氨基酸序列的重链，以及含有如SEQ ID NO:108中所示的氨基酸序列的轻链。
140.一种药盒，所述药盒包括：
预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器，所述预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器包含一定剂量的阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体；以及
说明书，所述说明书用于确定患者的头痛是否由高阈值(HT)神经元的活化和敏化介导。
141.一种药盒，所述药盒包括：
预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器，所述预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器包含一定剂量的阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体；以及
说明书，所述说明书用于确定患者是否表现出能够通过施用阻断、抑制、阻抑或减少所述CGRP路径的单克隆抗体而减轻的痛觉过敏。
142.一种药盒，所述药盒包括：
预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器，所述预填充注射器、带针头安全装置的预填充注射器、注射笔或自动注射器包含一定剂量的阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的单克隆抗体；以及
说明书，所述说明书用于确定患者是否主要在头部的一部分中经历头痛。
143.一种降低患者的头痛频率的方法，所述方法包括：
a)选择患者，所述患者通过施用阻断、抑制、阻抑或减少降钙素基因相关肽(CGRP)路径的第一单克隆抗体而表现出异常性疼痛和痛觉过敏的消除；以及
b)向所述患者施用足以降低所述患者的头痛频率的量的阻断、抑制、阻抑或减少所述CGRP路径的第二单克隆抗体。
CN201880029375.7A 2017-03-02 2018-03-01 选择对针对降钙素基因相关肽的抗体有反应的头痛患者 Pending CN110621343A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762466158P 2017-03-02 2017-03-02
US62/466158 2017-03-02
US201762490953P 2017-04-27 2017-04-27
US62/490953 2017-04-27
US201762514346P 2017-06-02 2017-06-02
US62/514346 2017-06-02
US201762516406P 2017-06-07 2017-06-07
US62/516406 2017-06-07
PCT/US2018/020536 WO2018160896A1 (en) 2017-03-02 2018-03-01 Selecting headache patients responsive to antibodies directed against calcitonin gene related peptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110621343A true CN110621343A (zh) 2019-12-27

Family

ID=61622824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880029375.7A Pending CN110621343A (zh) 2017-03-02 2018-03-01 选择对针对降钙素基因相关肽的抗体有反应的头痛患者

Country Status (10)

Country Link
US (4) US20190071490A1 (zh)
EP (1) EP3589317A1 (zh)
JP (1) JP7195262B2 (zh)
KR (1) KR20190133174A (zh)
CN (1) CN110621343A (zh)
AU (1) AU2018226811A1 (zh)
CA (1) CA3055195A1 (zh)
MX (1) MX2019010397A (zh)
RU (1) RU2770066C2 (zh)
WO (2) WO2018160896A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107602700A (zh) * 2011-05-20 2018-01-19 奥尔德生物控股有限责任公司 抗cgrp组合物及其用途

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015214502B2 (en) 2014-02-05 2019-06-06 Merck Sharp & Dohme Llc Tablet formulation for CGRP-active compounds
AU2018226811A1 (en) 2017-03-02 2019-09-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Selecting headache patients responsive to antibodies directed against calcitonin gene related peptide
TWI754772B (zh) * 2017-09-06 2022-02-11 美商美國禮來大藥廠 用於治療偏頭痛之拉米迪坦(lasmiditan)與cgrp拮抗劑之組合療法
US10899826B1 (en) 2018-09-13 2021-01-26 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Pharmaceutical compositions for an anti-CGRP antagonist antibody
EA202190815A1 (ru) 2018-09-20 2021-07-02 Тева Фармасьютикалз Интернэшнл Гмбх Инъекторная пружина для состаренного, предварительно заполненного шприца и автоинъектор
US20210128724A1 (en) * 2019-07-05 2021-05-06 Allergan Pharmaceuticals International Limited Cgrp antagonists and clostridial derivatives for the treatment of cortical spreading depression associated disorders
EP4034156A4 (en) * 2019-09-25 2024-01-24 Allergan Pharmaceuticals Int Ltd COMBINATION THERAPY WITH CGRP ANTAGONISTS
WO2022140537A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Allergan Pharmaceuticals International Limited Treatment of migraine

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102946905A (zh) * 2010-06-10 2013-02-27 伊莱利利公司 Cgrp抗体
CN103421114A (zh) * 2005-11-14 2013-12-04 礼纳特神经系统科学公司 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法
CN103596593A (zh) * 2011-03-11 2014-02-19 贝丝以色列女执事医疗中心 抗cd40抗体及其用途
CN103702685A (zh) * 2011-05-20 2014-04-02 奥尔德生物控股有限责任公司 抗cgrp抗体和抗体片段用于在有需要的受试者、尤其是偏头痛患者中预防或抑制畏光或厌光的用途
EP2987451A1 (en) * 2014-08-18 2016-02-24 Tools 4 Patient sa Method and tools for predicting a pain response in a subject
US20160311913A1 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 Amgen Inc. Methods for treating or preventing migraine headache
CN106456759A (zh) * 2014-03-21 2017-02-22 泰华制药国际有限公司 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法
CN107206057A (zh) * 2014-11-12 2017-09-26 纽瑞莱特Hd有限公司 用hcg处理和治疗慢性疼痛的方法
US20190135927A1 (en) * 2017-09-29 2019-05-09 Bhl Patent Holdings, Llc Migraine, headache, chronic pain treatment, and prophylaxis options
US20210309725A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-07 H. Lundbeck A/S Treatment of most bothersome symptom (mbs) associated with migraine using anti-cgrp antibodies

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
WO2000053211A2 (en) 1999-03-09 2000-09-14 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
RU2522493C2 (ru) * 2008-03-04 2014-07-20 Пфайзер Лимитед Способы лечения хронической боли
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
HUE054437T2 (hu) 2011-05-20 2021-09-28 H Lundbeck As Anti-CGRP készítmények és alkalmazásuk
US10287337B2 (en) * 2015-06-01 2019-05-14 Afasci, Inc. Compositions and methods for treating acute and chronic pain by local antagonism of CGRP receptors, or combination with sodium channel inhibition or with anti-inflammatory agents
AR104847A1 (es) 2015-06-17 2017-08-16 Lilly Co Eli Formulación de anticuerpo anti-cgrp
AU2018226811A1 (en) 2017-03-02 2019-09-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Selecting headache patients responsive to antibodies directed against calcitonin gene related peptide

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103421114A (zh) * 2005-11-14 2013-12-04 礼纳特神经系统科学公司 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法
CN102946905A (zh) * 2010-06-10 2013-02-27 伊莱利利公司 Cgrp抗体
CN104292332A (zh) * 2010-06-10 2015-01-21 伊莱利利公司 Cgrp抗体
CN103596593A (zh) * 2011-03-11 2014-02-19 贝丝以色列女执事医疗中心 抗cd40抗体及其用途
CN103702685A (zh) * 2011-05-20 2014-04-02 奥尔德生物控股有限责任公司 抗cgrp抗体和抗体片段用于在有需要的受试者、尤其是偏头痛患者中预防或抑制畏光或厌光的用途
CN106456759A (zh) * 2014-03-21 2017-02-22 泰华制药国际有限公司 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法
EP2987451A1 (en) * 2014-08-18 2016-02-24 Tools 4 Patient sa Method and tools for predicting a pain response in a subject
CN107206057A (zh) * 2014-11-12 2017-09-26 纽瑞莱特Hd有限公司 用hcg处理和治疗慢性疼痛的方法
US20160311913A1 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 Amgen Inc. Methods for treating or preventing migraine headache
US20190135927A1 (en) * 2017-09-29 2019-05-09 Bhl Patent Holdings, Llc Migraine, headache, chronic pain treatment, and prophylaxis options
US20210309725A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-07 H. Lundbeck A/S Treatment of most bothersome symptom (mbs) associated with migraine using anti-cgrp antibodies

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID W DODICK等: "Safety and efficacy of ALD403, an antibody to calcitonin gene-related peptide, for the prevention of frequent episodic migraine: a randomised, double-blind, placebo-controlled, exploratory phase 2 trial" *
LARS EDVINSSON等: "CGRP receptor antagonism and migraine" *
MARCELO E BIGAL等: "Safety, tolerability, and efficacy of TEV-48125 for preventive treatment of chronic migraine: a multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b study" *
MARCELO E BIGAL等: "Safety, tolerability, and efficacy of TEV-48125 for preventive treatment of high-frequency episodic migraine: a multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b study" *
MARCELO E. BIGAL等: "Therapeutic antibodies against CGRP or its receptor" *
王佳: "三叉神经通路中CGRP介导针刺缓解大鼠偏头痛的作用机制研究" *
连亚军等: "偏头痛患者血浆一氧化氮和降钙素基因相关肽含量测定及发病机制探讨" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107602700A (zh) * 2011-05-20 2018-01-19 奥尔德生物控股有限责任公司 抗cgrp组合物及其用途
CN107602700B (zh) * 2011-05-20 2021-12-17 H.伦德贝克公司 抗cgrp组合物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018160896A1 (en) 2018-09-07
US11718664B2 (en) 2023-08-08
US20190085061A1 (en) 2019-03-21
US20190071490A1 (en) 2019-03-07
MX2019010397A (es) 2020-08-20
RU2770066C2 (ru) 2022-04-14
KR20190133174A (ko) 2019-12-02
EP3589317A1 (en) 2020-01-08
RU2019130867A3 (zh) 2021-07-02
WO2018160897A1 (en) 2018-09-07
WO2018160896A8 (en) 2019-09-26
AU2018226811A1 (en) 2019-09-26
US10766952B2 (en) 2020-09-08
US20230303674A1 (en) 2023-09-28
US20200385449A1 (en) 2020-12-10
JP7195262B2 (ja) 2022-12-23
JP2020510667A (ja) 2020-04-09
CA3055195A1 (en) 2018-09-07
RU2019130867A (ru) 2021-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11718664B2 (en) Methods for reducing migraine frequency in a subject in need thereof
US11028161B2 (en) Treating refractory migraine
JP6892891B2 (ja) カルシトニン遺伝子関連ペプチドに対するアンタゴニスト抗体及びその使用方法
ES2433251T3 (es) Anticuerpos antagonistas dirigidos contra un péptido relacionado con el gen de la calcitonina y procedimientos que utilizan los mismos
KR20230157986A (ko) 편투통 발생의 치료 및/또는 저감
ES2326080T3 (es) Metodos para tratar neuropatia sensorial inducida por taxol.
EP4194471A1 (en) Anti-gd2 administration regimen
CN117999078A (zh) 偏头痛的发生的治疗和/或降低
NZ792154A (en) Treating refractory migraine
NZ724442B2 (en) Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination