CN110591147A - 一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入磁性固定化蛋白酶K的缓冲液中加热酶解，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤。本发明利用固定化蛋白酶K消解藤壶生物组织提取微塑料，同样的时长内消化效率比化学消解率高，采用改性硅藻土吸附微塑料粒子，从而实现环境保护，适合广泛应用。

Description

一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法
技术领域
本发明涉及污染处理技术领域，具体涉及一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法。
背景技术
藤壶是浙江沿海潮间带岩岸生物群落组成中的主要种类，是重金属、石油烃等海洋污染物的重要指示生物。微塑料的吸收与藤壶个体大小正相关，主要吸收的微型塑料包括聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯。在用化学法消化藤壶组织过程中容易引起微塑料的降解，而利用生物酶温和水解藤壶生物组织对其体内的微塑料比较友好。
发明内容
本发明提供一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，通过利用固定化蛋白酶K消解藤壶生物组织提取微塑料，同样的时长内消化效率比化学消解率高且比化学消解法对微塑料更友好，采用改性硅藻土能够高效吸附微塑料，更加安全环保，吸附效率达到100%。
本发明提供一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入磁性固定化蛋白酶K的缓冲液中加热酶解，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤；
所述改性硅藻土的制备方法如下：
将硅藻土加入水中，不断搅拌下加入硅烷偶联剂，边搅拌边紫外光照射30min后，过滤，得到改性硅藻土；
所述硅藻土和硅烷偶联剂的质量比为100：（2-5）；所述硅藻土和水的质量体积比为1:（1-3）。
作为本发明进一步的改进，所述磁性固定化蛋白酶K的制备方法如下：
S1. 磁性纳米粒子的制备：在氮气氛中将六水氯化铁和四水氯化亚铁，升温到反应温度后滴加氨水，氮气保护下恒温反应2-5h，降至室温，将合成的磁性纳米粒子用去离子水洗涤多次，磁铁分离，待用；
S2. 固定化蛋白酶K的制备：将蛋白酶K用无菌水调节成浓缩液，等体积混合后，加入海藻酸钠混合均匀，使得海藻酸钠为5wt%，用注射器吸取混合液，逐滴滴入3.5wt%CaCl2溶液，制备固定化微球，交联12h之后，用无菌水洗净，研细至10-100nm，备用；
S3. 磁性固定化蛋白酶K的制备：将磁性纳米粒子和氨水分别加入到去离子水中，升温至反应温度后滴加硅烷偶联剂，氮气保护恒温反应3-6h，加入固定化蛋白酶K的，继续反应2-3h，降至室温，将合成的磁性固定化蛋白酶K用去离子水洗涤多次，磁铁分离，得到磁性固定化蛋白酶K。
作为本发明进一步的改进，所述反应温度为50-60℃，所述六水氯化铁和四水氯化亚铁的质量比为1：（2-3）；所述氨水的质量分数为20-24%；所述六水氯化铁和氨水的质量体积比为1：（10-30）；所述磁性纳米粒子、硅烷偶联剂和固定化蛋白酶K的质量比为2:（0.01-0.03）：2；磁性纳米粒子和氨水的质量体积比为1：（10-20）。
作为本发明进一步的改进，所述硅烷偶联剂为KH-550，KH-560，KH-570，KH-580，KH-590，KH-902,KH-903,KH-792中的一种或几种混合。
作为本发明进一步的改进，所述蛋白酶K的酶活力为1000-2000U/g，步骤S2中所述混合液中蛋白酶K的质量分数为10-20wt%。
作为本发明进一步的改进，所述酶解条件为酶解温度50-60℃，酶解时间为4-7h。
作为本发明进一步的改进，所述缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60mmol/L EDTA，105mmol/L NaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为4-12.5。
作为本发明进一步的改进，所述磁性固定化蛋白酶K的缓冲液中磁性固定化蛋白酶K的含量为10-15wt%，所述藤壶组织和磁性固定化蛋白酶K的质量比为1:（0.2-0.5）。
本发明进一步保护一种上述方法制得的微塑料提取液。
本发明进一步保护一种上述方法制得的微塑料提取液用在制备塑料制品中的应用。
本发明具有如下有益效果：本发明将磁性纳米粒子和固定化蛋白酶K通过硅烷偶联剂连接，制得的固定化复合酶具有磁性，便于磁性分离，避免了酶解反应后还需进行灭酶、过滤、离心等复杂步骤，简化操作，同时，使用后的磁性固定化酶没有经过灭活操作，依然有很高的酶活性，可以重复使用，降低成本；
本发明利用固定化蛋白酶K消解藤壶生物组织提取微塑料，同样的时长内消化效率比化学消解率高且比化学消解法对微塑料更友好，适合广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例6中得到的微塑料提取液在放大100倍后的照片图；
图2为本发明测试例1中各组对藤壶体内微塑料的提取率对比图；
图3为本发明测试例2中各组对微塑料提取液中微塑料的吸附率对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
磁性固定化蛋白酶K的制备方法如下：
S1. 磁性纳米粒子的制备：在氮气氛中将10g六水氯化铁和20g四水氯化亚铁，升温到反应温度后滴加100mL 20wt%氨水，氮气保护下50℃恒温反应2h，降至室温，将合成的磁性纳米粒子用去离子水洗涤多次，磁铁分离，待用；
S2. 固定化蛋白酶K的制备：将蛋白酶K（酶活力为1000U/g）用无菌水调节成浓缩液，等体积混合后，加入海藻酸钠混合均匀，使得海藻酸钠为5wt%，用注射器吸取混合液（蛋白酶K的质量分数为10wt%），逐滴滴入3.5wt%CaCl2溶液，制备固定化微球，交联12h之后，用无菌水洗净，研细至10nm左右，备用；
S3. 磁性固定化蛋白酶K的制备：将2g磁性纳米粒子和20mL 20wt%氨水分别加入到去离子水中，升温至反应温度后滴加0.01g硅烷偶联剂KH-792，氮气保护恒温反应3h，加入2g固定化蛋白酶K的，继续反应2h，降至室温，将合成的磁性固定化蛋白酶K用去离子水洗涤多次，磁铁分离，得到磁性固定化蛋白酶K，得率为92%。
实施例2
磁性固定化蛋白酶K的制备方法如下：
S1. 磁性纳米粒子的制备：在氮气氛中将10g六水氯化铁和30g四水氯化亚铁，升温到反应温度后滴加300mL 24wt%氨水，氮气保护下60℃恒温反应5h，降至室温，将合成的磁性纳米粒子用去离子水洗涤多次，磁铁分离，待用；
S2. 固定化蛋白酶K的制备：将蛋白酶K（酶活力为2000U/g）用无菌水调节成浓缩液，等体积混合后，加入海藻酸钠混合均匀，使得海藻酸钠为5wt%，用注射器吸取混合液（蛋白酶K的质量分数为20wt%），逐滴滴入3.5wt%CaCl2溶液，制备固定化微球，交联12h之后，用无菌水洗净，研细至100nm左右，备用；
S3. 磁性固定化蛋白酶K的制备：将2g磁性纳米粒子和40mL 24wt%氨水分别加入到去离子水中，升温至反应温度后滴加0.03g硅烷偶联剂KH-570，氮气保护恒温反应6h，加入2g固定化蛋白酶K的，继续反应3h，降至室温，将合成的磁性固定化蛋白酶K用去离子水洗涤多次，磁铁分离，得到磁性固定化蛋白酶K，得率为95%。
实施例3
磁性固定化蛋白酶K的制备方法如下：
S1. 磁性纳米粒子的制备：在氮气氛中将10g六水氯化铁和25g四水氯化亚铁，升温到反应温度后滴加200mL 22wt%氨水，氮气保护下55℃恒温反应3.5h，降至室温，将合成的磁性纳米粒子用去离子水洗涤多次，磁铁分离，待用；
S2. 固定化蛋白酶K的制备：将蛋白酶K（酶活力为1500U/g）用无菌水调节成浓缩液，等体积混合后，加入海藻酸钠混合均匀，使得海藻酸钠为5wt%，用注射器吸取混合液（蛋白酶K的质量分数为15wt%），逐滴滴入3.5wt%CaCl2溶液，制备固定化微球，交联12h之后，用无菌水洗净，研细至50nm左右，备用；
S3. 磁性固定化蛋白酶K的制备：将2g磁性纳米粒子和30mL 22wt%氨水分别加入到去离子水中，升温至反应温度后滴加0.02g硅烷偶联剂KH-550，氮气保护恒温反应4.5h，加入2g固定化蛋白酶K的，继续反应2.5h，降至室温，将合成的磁性固定化蛋白酶K用去离子水洗涤多次，磁铁分离，得到磁性固定化蛋白酶K，得率为97%。
对比例1
与实施例3相比，制备工艺参数不同。
磁性固定化蛋白酶K的制备方法如下：
S1. 磁性纳米粒子的制备：在氮气氛中将10g六水氯化铁和5g四水氯化亚铁，升温到反应温度后滴加50mL 10wt%氨水，氮气保护下25℃恒温反应1h，降至室温，将合成的磁性纳米粒子用去离子水洗涤多次，磁铁分离，待用；
将蛋白酶K（酶活力为100U/g）用无菌水调节成浓缩液，等体积混合后，加入海藻酸钠混合均匀，使得海藻酸钠为1wt%，用注射器吸取混合液（蛋白酶K的质量分数为5wt%），逐滴滴入1wt%CaCl2溶液，制备固定化微球，交联2h之后，用无菌水洗净，研细至500nm左右，备用；
S3. 磁性固定化蛋白酶K的制备：将1g磁性纳米粒子和10mL 10wt%氨水分别加入到去离子水中，升温至反应温度后滴加0.05g硅烷偶联剂KH-550，氮气保护恒温反应1h，加入1g固定化蛋白酶K的，继续反应1h，降至室温，将合成的磁性固定化蛋白酶K用去离子水洗涤多次，磁铁分离，得到磁性固定化蛋白酶K，得率为52%。
实施例4
一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入实施例1制备的磁性固定化蛋白酶K的缓冲液（缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60 mmol/L EDTA，105mmol/LNaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为4）中加热酶解，酶解温度50℃，酶解时间为4h，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤；
所述改性硅藻土的制备方法如下：
将100g硅藻土加入100mL水中，不断搅拌下加入2g硅烷偶联剂KH550，边搅拌边紫外光照射30min后，过滤，得到改性硅藻土，收率为92%。
实施例5
一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入实施例2制备的磁性固定化蛋白酶K的缓冲液（缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60 mmol/L EDTA，105mmol/LNaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为12.5）中加热酶解，酶解温度60℃，酶解时间为7h，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤；
所述改性硅藻土的制备方法如下：
将100g硅藻土加入300mL水中，不断搅拌下加入5g硅烷偶联剂KH560，边搅拌边紫外光照射30min后，过滤，得到改性硅藻土，收率为95%。
实施例6
一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入实施例3制备的磁性固定化蛋白酶K的缓冲液（缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60 mmol/L EDTA，105mmol/LNaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为7）中加热酶解，酶解温度55℃，酶解时间为5h，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，结果见图1，放大100倍可见有许多微塑料体。
向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤；
所述改性硅藻土的制备方法如下：
将100g硅藻土加入200mL水中，不断搅拌下加入3.5g硅烷偶联剂，边搅拌边紫外光照射30min后，过滤，得到改性硅藻土，收率为97%。
对比例2
一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入对比例1制备的磁性固定化蛋白酶K的缓冲液（缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60 mmol/L EDTA，105mmol/LNaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为7）中加热酶解，酶解温度55℃，酶解时间为5h，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤；
所述改性硅藻土的制备方法如下：
将100g硅藻土加入200mL水中，不断搅拌下加入3.5g硅烷偶联剂，边搅拌边紫外光照射30min后，过滤，得到改性硅藻土，收率为97%。
对比例3
与实施例3相比，用普通蛋白酶K代替磁性固定化蛋白酶K。
一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入蛋白酶K的缓冲液（缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60 mmol/L EDTA，105mmol/L NaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为7，其中蛋白酶K的酶活力为100U/g，质量分数5wt%）中加热酶解，酶解温度55℃，酶解时间为5h，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤；
所述改性硅藻土的制备方法如下：
将100g硅藻土加入200mL水中，不断搅拌下加入3.5g硅烷偶联剂KH550，边搅拌边紫外光照射30min后，过滤，得到改性硅藻土，收率为97%。
对比例4
采用普通硅藻土替代改性硅藻土。
一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，将藤壶组织加入蛋白酶K的缓冲液（缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60 mmol/L EDTA，105mmol/L NaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为7，其中蛋白酶K的酶活力为100U/g，质量分数5wt%）中加热酶解，酶解温度55℃，酶解时间为5h，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤。
测试例1
将本发明实施例4-6和对比例2-3提取得到的微塑料提取液进行检测，结果见图2。
由图2可知，本发明实施例4-6得到的微塑料提取液对藤壶体内的微塑料提取率高，达到95%以上。与对比例2相比，对比例2中采用对比例1制备的磁性固定化蛋白酶K，其酶解效果较差，对藤壶体内微塑料的提取率较低。对比例3中采用普通蛋白酶K进行酶解，其效果不如磁性固定化蛋白酶K，对藤壶体内微塑料的提取率较低。
测试例2
将本发明实施例4-6和对比例4进行微塑料的吸附能力测试，结果见图3。
由图3可知，实施例4-6将硅藻土改性后对微塑料提取液中微塑料进行吸附，吸附效率高，达到98-100%，对比例4采用普通硅藻土，吸附效率大大降低，仅为52%。
与现有技术相比，本发明将磁性纳米粒子和固定化蛋白酶K通过硅烷偶联剂连接，制得的固定化复合酶具有磁性，便于磁性分离，避免了酶解反应后还需进行灭酶、过滤、离心等复杂步骤，简化操作，同时，使用后的磁性固定化酶没有经过灭活操作，依然有很高的酶活性，可以重复使用，降低成本；
本发明利用固定化蛋白酶K消解藤壶生物组织提取微塑料，同样的时长内消化效率比化学消解率高且比化学消解法对微塑料更友好，适合广泛应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，将藤壶组织加入磁性固定化蛋白酶K的缓冲液中加热酶解，磁铁分离，过滤，得到微塑料提取液，向提取液中加入改性硅藻土，充分搅拌吸附微塑料后过滤；
所述改性硅藻土的制备方法如下：
将硅藻土加入水中，不断搅拌下加入硅烷偶联剂，边搅拌边紫外光照射30min后，过滤，得到改性硅藻土；
所述硅藻土和硅烷偶联剂的质量比为100：（2-5）；所述硅藻土和水的质量体积比为1:（1-3）。
2.根据权利要求1所述一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，所述磁性固定化蛋白酶K的制备方法如下：
S1. 磁性纳米粒子的制备：在氮气氛中将六水氯化铁和四水氯化亚铁，升温到反应温度后滴加氨水，氮气保护下恒温反应2-5h，降至室温，将合成的磁性纳米粒子用去离子水洗涤多次，磁铁分离，待用；
S2. 固定化蛋白酶K的制备：将蛋白酶K用无菌水调节成浓缩液，等体积混合后，加入海藻酸钠混合均匀，使得海藻酸钠为5wt%，用注射器吸取混合液，逐滴滴入3.5wt%CaCl2溶液，制备固定化微球，交联12h之后，用无菌水洗净，研细至10-100nm，备用；
S3. 磁性固定化蛋白酶K的制备：将磁性纳米粒子和氨水分别加入到去离子水中，升温至反应温度后滴加硅烷偶联剂，氮气保护恒温反应3-6h，加入固定化蛋白酶K的，继续反应2-3h，降至室温，将合成的磁性固定化蛋白酶K用去离子水洗涤多次，磁铁分离，得到磁性固定化蛋白酶K。
3.根据权利要求2所述一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，所述反应温度为50-60℃，所述六水氯化铁和四水氯化亚铁的质量比为1：（2-3）；所述氨水的质量分数为20-24%；所述六水氯化铁和氨水的质量体积比为1：（10-30）；所述磁性纳米粒子、硅烷偶联剂和固定化蛋白酶K的质量比为2:（0.01-0.03）：2；磁性纳米粒子和氨水的质量体积比为1：（10-20）。
4.根据权利要求1或2所述一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为KH-550，KH-560，KH-570，KH-580，KH-590，KH-902,KH-903,KH-792中的一种或几种混合。
5.根据权利要求2所述一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，所述蛋白酶K的酶活力为1000-2000U/g，步骤S2中所述混合液中蛋白酶K的质量分数为10-20wt%。
6.根据权利要求1所述一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，所述酶解条件为酶解温度50-60℃，酶解时间为4-7h。
7.根据权利要求1所述一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，所述缓冲液含有400mmol/L Tris-Hcl缓冲液，60 mmol/L EDTA，105mmol/L NaCl和1wt%的十二烷基硫酸钠，pH值为4-12.5。
8.根据权利要求1所述一种酶解提取藤壶体内微塑料的方法，其特征在于，所述磁性固定化蛋白酶K的缓冲液中磁性固定化蛋白酶K的含量为10-15wt%，所述藤壶组织和磁性固定化蛋白酶K的质量比为1:（0.2-0.5）。
9.一种如权利要求1-8任一项权利要求所述方法制得的微塑料提取液。
10.一种如权利要求1-8任一项权利要求所述方法制得的微塑料提取液用在制备塑料制品中的应用。
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