CN110585262B - 一种治疗和/或预防肝胆疾病的中药组分组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医药领域，具体是一种治疗和/或预防肝胆疾病的中药组分组合物，由绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷组成；其中，所述的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷的重量份数比为1：0.2：0.2：0.2～1：10：20：30。本发明优点在于：本发明的CRGA组分药物能够有效改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积，疗效优于原药材配伍方的疗效，且药物组分清楚，质量容易控制。

Description

一种治疗和/或预防肝胆疾病的中药组分组合物及其应用

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体地说，是一种治疗和/或预防肝胆疾病的中药组分组合物及其应用。

背景技术

胆汁淤积是指肝内外各种原因造成胆汁形成、分泌和排泄障碍，胆汁流不能正常流入十二指肠而进入血液的病理状态，对肝细胞及机体造成损伤。长期发展，能够导致肝纤维化、肝硬化、肝衰竭，对慢性肝病具有重要的病理指示作用。胆汁淤积性肝病的治疗迄今仍是一国际难题，现有治疗药物大多疗效局限。因此，探求治疗胆汁淤积的药物具有重要的社会意义。

茵陈蒿汤是中医治疗胆汁淤积的传统方剂，始载于汉代张仲景的著作《伤寒论》：“阳明病，发热汗出者，此为热越，不能发黄也。但头汗出，身无汗，剂颈而还，小便不利，渴引水浆者，此为瘀热在里，身必发黄，茵陈蒿汤主之。茵陈蒿六两，栀子十四枚擘，大黄二两去皮。上三味，以水一斗，先煮茵陈减六升，纳二味，煮取三升，去滓，分温三服，小便当利，尿如皂角汁，色正赤，一宿腹减，黄从小便去也。”方中茵陈为治黄疸之专药，能清泄肝胆郁热，利湿退黄，为君药。栀子清利三焦湿热，为辅药；大黄降泄瘀热，为佐使药。大量统计资料显示，茵陈蒿汤仍用于临床治疗各种肝病，包括急慢性肝炎、肝纤维化、脂肪肝、肝硬化、肝衰竭和先天性胆管闭锁手术效果不良等。动物实验证实，茵陈蒿汤不仅可以治疗胆汁淤积，而且还具有显著的抑制肝损伤、改善肝纤维化作用。

黄芪汤是临床治疗胆汁性肝硬化的显效方剂黄芪汤出自宋代《太平惠民和剂局方》。方中黄芪为主，甘草为辅，二药相须配伍，具有益气补虚的功效。课题组前期发现黄芪汤治疗肝硬化患者48周，肝纤维化改善率为53.6％，肝组织炎症改善率为71.4％。

传统茵陈蒿汤汤剂和黄芪汤汤剂皆是按方配药，该方法存在服用量大，不方便，质量不可控等诸多缺点。中药复方是一复杂体系，其疗效作用的物质通常是一类或多类有活性的有效组分，它们起到主次、多靶点、有机整体协同的治疗效果。通过组分配伍配制成组成相对明确的中药，达到减毒增效的效果，同时减少药物的用量，是开发现代中药制剂的一种新途径。

发明内容

本发明前期使用胆管结扎BDL、DMN、ANIT等多种慢性肝病动物模型，采用均匀设计研究方案，确定茵陈蒿汤中4种组分绵茵陈绿原酸、栀子苷、制大黄多糖、制大黄鞣质(90％以上为没食子酸)为治疗胆汁淤积性肝纤维化的主要有效物质。药理研究发现，绿原酸有较强的细胞保护作用，具有显著的抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎能力，特别是能够显著改善急性胆汁淤积动物血清胆汁酸、胆红素浓度，下调白介素6、肿瘤坏死因子表达。

本发明前期使用均匀设计方法，评价黄芪汤中4种主要组分黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、甘草酸、甘草总黄酮抗DMN大鼠肝纤维化的疗效和作用机制。结果发现黄芪总皂苷与甘草酸是黄芪汤发挥抗肝纤维化疗效的主要组分。通过组方定量研究，确定黄芪总皂苷与甘草酸配伍比例3.41:1为抗肝纤维化的最优组方。黄芪总皂苷与甘草酸配伍在降低肝组织羟脯氨酸含量及血清谷丙转氨酶活性方面，不仅优于其分别单用，而且优于黄芪汤原方。黄芪总皂苷与甘草酸配伍后在降低肝组织胶原沉积和改善肝功能方面显示出显著的协同增效效应，提示黄芪总皂苷与甘草酸是黄芪汤发挥抗肝纤维化作用的主要物质基础。在调控肝纤维化大鼠胆汁酸转运体表达方面，黄芪总皂苷优于甘草酸。

茵陈蒿汤，黄芪汤均为治疗胆汁淤积性肝病的常用古方，茵陈蒿汤清热利湿，以祛邪为主要目的；黄芪汤益气补虚，以扶正为主要目的。此二首功效差别显著的方剂治疗胆汁淤积均有显著疗效，茵陈蒿汤和黄芪汤中的有效组分绿原酸、没食子酸、大黄多糖、栀子苷、黄芪总皂苷，组分配伍后治疗胆汁淤积的疗效，是本发明关注的焦点。

本发明所要解决的技术问题是为了克服传统的茵陈蒿汤和黄芪汤存在服用量大、不方便、质量不可控等缺陷，而提供了一种治疗和/或预防肝胆疾病的中药组分组合物及其应用。本发明的中药组分组合物能够有效改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积，疗效优于原药材配伍方，且药物组分清楚，质量容易控制。

本发明的第一方面，提供一种治疗和/或预防肝胆疾病的中药组分组合物，由绿原酸(C)、没食子酸(R)、大黄多糖(G)和黄芪总皂苷(A)组成(以下简称CRGA)；其中，所述的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷的重量份数比为1：0.2：0.2：0.2～1：10：20：30。以上比例为各提取物干重的重量份数比。

所述的绿原酸，其纯度大于等于70％；没食子酸，其纯度大于等于70％；大黄多糖，其纯度大于等于60％；黄芪总皂苷以黄芪甲苷计，其纯度大于等于40％。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷的重量份数比为1.1：1.1：3.6：1.25。所述的绿原酸，纯度：＞98％；没食子酸，纯度：＞98％；大黄多糖，纯度：＞90％；黄芪总皂苷，以黄芪甲苷计，黄芪总皂苷纯度为61.2％。绿原酸、大黄多糖、没食子酸均为茵陈蒿汤原方各组分含量的2.0倍，黄芪总皂苷给药剂量为黄芪汤原方黄芪总皂苷含量4.0倍。所有组分配置于0.3％羧甲基纤维素钠的溶液中。

进一步的，所述的肝胆疾病为胆汁淤积。

更进一步的，所述的肝胆疾病为肝炎、胆汁淤积引起的黄疸或肝纤维化。

进一步的，将上述各成分简单混合，即可制得本发明的中药组分组合物。

进一步的，根据需要，按照本领域的知识，本发明的中药组分组合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。

进一步的，除特殊说明外，本发明设计的原料和试剂均市售可得。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的中药组分组合物在制备治疗和/或预防肝胆疾病的药物中的应用。

进一步的，所述的肝胆疾病为胆汁淤积。

更进一步的，所述的肝胆疾病为肝炎、胆汁淤积引起的黄疸或肝纤维化。

进一步的，所述的中药组分组合物改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的中药组分组合物在制备改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积的药物中的应用。

本发明的第四方面，提供一种如上所述的中药组分组合物在制备减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积的药物中的应用。

本发明的第五方面，提供一种以如上所述的中药组分组合物作为活性成份的药物制剂，所述的药物制剂是采用本领域常规制备方法制备成药剂学上的常用剂型。

进一步的，所述的药物制剂是汤剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、胶囊剂、口服液或滴丸剂。

进一步的，所述的药物制剂中还包括药学上允许的辅料。

本发明的第六方面，提供一种以如上所述的药物制剂在制备治疗和/或预防肝胆疾病的药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明的中药组分组合物药效物质基础明确，包括配伍比例明确的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷；

2、本发明的中药组分组合物中各组分的制备方法工艺稳定，且药物组分清楚，质量容易控制，因此所制备出的药物产品各批次之间质量差异小，有效控制本发明的药物产品的质量；

3、本发明通过ANIT诱导慢性胆汁淤积性肝损伤大鼠模型，研究茵陈蒿汤、黄芪汤及CRGA组分药物治疗慢性胆汁淤积性肝损伤的效应，结果表明，CRGA组分药物发挥了明显的协同增效作用，能够显著改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积。疗效显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤。本发明提供的中药组分混合物具有良好的应用前景。

附图说明

图1.肝组织病理切片H&E(100μm)、天狼星红染色(100μm)。注：A：Normal，正常组；Model，模型组；Chlorogenic acid-treated，绿原酸组；Rhubarb polysaccharides-treated，大黄多糖组；B：Gallic acid-treated，没食子酸组；Geniposide-treated，栀子苷组；CRGG-treated，茵陈蒿汤组分复方组；YCHT-treated，茵陈蒿汤组。

图2.胆汁淤积大鼠肝组织HYP含量变化及茵陈蒿汤组分干预作用。注：Normal，正常组；Model，模型组；Chlorogenic acid，绿原酸组；Rhubarb polysaccharides，大黄多糖组；Gallic acid，没食子酸组；Geniposide，栀子苷组；CRGG，茵陈蒿汤组分复方组；YCHT，茵陈蒿汤组；Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal；*，P＜0.05；**，P＜0.01；Data＝mean±SD。

图3.肝组织病理切片H&E(100μm)、天狼星红染色(100μm)。注：Normal，正常组；Model，模型组；HQT-treated，黄芪汤组；Astragalosides-treated，黄芪总皂苷组。

图4.胆汁淤积大鼠肝组织HYP含量及黄芪总皂苷干预作用。注：Normal，正常组；Model，模型组；HQT，黄芪汤组；Astragalosides，黄芪总皂苷组；*，P<0.05，**，P<0.01，Data＝mean±SD。

图5.肝组织病理切片H&E(100μm)、天狼星红染色(100μm)。注：A：Normal，正常组；Model，模型组；CRGA-treated，CRGA组分复方组；B：YCHT-treated，茵陈蒿汤组，HQT-treated，黄芪汤组；UDCA-treated，熊去氧胆酸组。

图6.胆汁淤积大鼠肝组织HYP含量变化及CRGA组分复方干预作用。注：Normal，正常组；Model，模型组；CRGA，CRGA组分复方组；YCHT，茵陈蒿汤组；HQT，黄芪汤组；UDCA，熊去氧胆酸组。Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal；*，P＜0.05；**，P＜0.01；vs.Model；Data＝mean±SD。

图7.肝组织病理切片HE(100μm)、天狼猩红染色(100μm)。A：Normal，正常组；Model，模型组；CRGA-treated，CRGA组分复方组；B：YCHT-treated，茵陈蒿汤组，HQT-treated，黄芪汤组；UDCA-treated，熊去氧胆酸组。Sirius red,天狼猩红。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用药材除另有注明，均可以从医药销售公司获得。所获得的药材为中药材饮片或组分中药。饮片既可以从销售公司获得，也可以是获得后经加工而成。

本发明根据课题组前期使用均匀设计方法，明确茵陈蒿汤中绿原酸、没食子酸、大黄多糖、栀子苷为其主要药效组分，黄芪汤中黄芪总皂苷为其主要药效组分的研究结果，拟分别以茵陈蒿汤和黄芪汤为阳性对照药，探索绿原酸、没食子酸、大黄多糖、栀子苷、黄芪总皂苷调控胆汁淤积大鼠的治疗效应。

实施例1：茵陈蒿汤组分对ANIT诱导的胆汁淤积性肝损伤大鼠治疗效应比较研究

1.1.1动物

雄性Wistar大鼠76只，6周龄，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2013-0016，批号2008001657852。

1.1.2药物

茵陈蒿，购于上海余天成中药饮片有限公司，原料产地陕西，生产批号：2013012303。生栀子，购于上海华宇药业有限公司，原料产地江西，生产批号：2012110001。制大黄，购于上海雷允上中药饮片厂，原料产地甘肃，生产批号：20121001508。没食子酸，批号160277，纯度：＞98％；大黄多糖，批号160409，纯度：＞90％；绿原酸，批号160316，纯度：＞98％；栀子苷，批号：160129，纯度：＞98％，均购自上海融禾医药科技发展有限公司。

大黄多糖不易融于水，即所有组分配置于0.3％羧甲基纤维素钠的溶液中，正常组、模型组以0.3％羧甲基纤维素钠溶液灌胃。

1.2.3分组与给药

(1)分组

将76只雄性Wistar大鼠随机分成2组，即正常组(Normal)8只，模型组68只。于造模第9周首日，将模型大鼠随机分为7组，即模型组(Model，n＝12)、绿原酸组(Chlorogenicacid，n＝9)、大黄多糖组(Rhubarb polysaccharides，n＝9)、没食子酸组(Gallic acid，n＝9)、栀子苷组(Geniposide，n＝9)、CRGG组分复方组(绿原酸+大黄多糖+没食子酸+栀子苷，n＝10)、茵陈蒿汤组(YCHT，n＝10)。

(2)给药

茵陈蒿汤组：给予大鼠茵陈蒿汤0.695g/kg/d(相当于生药4.183g/kg/d)，为65kg体质量成人临床用量的10倍，用蒸馏水10ml稀释，以10ml/kg大鼠体质量的剂量灌胃给药，每日1次，共计4周。

茵陈绿原酸组：给予茵陈绿原酸110mg/kg；

大黄多糖组：给予制大黄多糖360mg/kg；

没食子酸组：给予没食子酸110mg/kg；

栀子苷组：给予栀子苷120mg/kg；

CRGG组：给予绵茵陈绿原酸110mg/kg、大黄多糖360mg/kg、没食子酸110mg/kg、栀子苷120mg/kg。

以上各组分给药剂量均为课题组前期均匀设计研究筛选获得的最佳效应剂量。绿原酸、大黄多糖、没食子酸均为茵陈蒿汤原方各组分含量的2.0倍，栀子苷为1.0倍。

2结果

2.1大鼠一般情况

动物模型复制过程中，正常组大鼠体重逐渐增加，毛色光泽，精神状态良好。模型大鼠精神状态欠佳，毛色逐渐失去光泽，颜色偏黄。

模型大鼠体重增加缓慢。与正常大鼠比较，模型大鼠体重显著降低，肝脏、脾脏重量显著增加(P<0.01)。模型大鼠肝重/体重比值、脾重/体重比值均显著高于正常大鼠(P<0.01)。(表1)

表1胆汁淤积大鼠体重、肝重、脾重、肝/体重比值、脾/体重比值变化及茵陈蒿汤组分干预作用

注：Normal，正常组；Model，模型组；Chlorogenic acid，绿原酸组；Rhubarbpolysaccharides，大黄多糖组；Gallic acid，没食子酸组；Geniposide，栀子苷组；CRGG，茵陈蒿汤组分复方组；YCHT，茵陈蒿汤组；Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal；*，P＜0.05；**，P＜0.01；vs.Model，Data＝mean±SD。

2.2胆汁淤积大鼠肝脏病理组织学变化及茵陈蒿汤组分干预作用

H&E染色显示，正常大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，未见肝细胞坏死及炎性细胞浸润。模型大鼠肝脏汇管区、肝小叶周边可见小叶间胆管增生显著，炎性细胞浸润。与模型大鼠比较，绿原酸、没食子酸、大黄多糖均能显著改善肝组织炎性改变，减少小叶间胆管增生。栀子苷对模型大鼠肝组织炎性及小叶间胆管增生作用不显著。(图1)

天狼星红染色显示，模型大鼠肝脏汇管区胶原纤维沉积显著，胶原纤维沿肝小叶周边伸展、分隔原有肝小叶。绿原酸、没食子酸、大黄多糖干预后，肝组织胶原纤维沉积显著减少。栀子苷组对模型大鼠肝组织胶原纤维沉积改善作用不显著。(图1)

2.3胆汁淤积大鼠肝组织羟脯氨酸含量变化及茵陈蒿汤组分干预作用

与正常大鼠比较，模型大鼠肝组织羟脯氨酸含量显著升高(P＜0.01)；与模型大鼠比较，茵陈蒿汤、绿原酸均能显著降低肝组织羟脯氨酸含量(P＜0.01)。(表2，图2)

2.4胆汁淤积大鼠血清肝肾功能、血脂、血糖变化及茵陈蒿汤组分干预作用

与正常大鼠比较，模型大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、CHE活性及TBIL、DBIL、TBA、TCH、HDL、LDL含量显著升高(P＜0.01)，ALB、BUN、ApoE、TG、GLU含量显著降低(P＜0.01)。(表2)

与模型大鼠比较，绿原酸、大黄多糖、没食子酸，均能够显著降低模型大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、CHE活性及TBIL、DBIL、TBA含量(P＜0.01)。其中，绿原酸、没食子酸，均能够显著增加模型大鼠血清ALB含量(P＜0.01)，大黄多糖能够显著增加模型大鼠血清ApoE含量(P＜0.01)。栀子苷、CRGG组分复方能够显著降低模型大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT活性，升高血清ALB、BUN含量(P＜0.01)，但对血清TBIL、DBIL、TBA含量未见显著改善作用。栀子苷、CRGG组分复方降低血清ALT、AST活性作用显著优于绿原酸、大黄多糖、没食子酸、茵陈蒿汤(P<0.05)，但能够进一步增加模型大鼠血清HDL、LDL，降低血清ApoE、TG含量(P<0.01)。(表2)

表2.胆汁淤积大鼠血清肝肾功能、血脂、血糖，肝组织羟脯氨酸含量变化及茵陈蒿汤组分干预作用

注：Normal，正常组；Model，模型组；Chlorogenic acid，绿原酸组；Rhubarbpolysaccharides，大黄多糖组；Gallic acid，没食子酸组；Geniposide，栀子苷组；CRGG，茵陈蒿汤组分复方组；YCHT，茵陈蒿汤组；Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal；*，P＜0.05；**，P＜0.01；vs.Model，Data＝mean±SD。

实施例2：黄芪汤及其组分对ANIT诱导的胆汁淤积性肝损伤大鼠治疗效应研究

1.1.1动物

雄性Wistar大鼠39只，6周龄，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2013-0016，批号2008001657852。

1.1.2药物

黄芪汤颗粒，课题组委托江阴天江药业有限公司制备，生产批号：1212353。规格：每克黄芪汤颗粒含生药5.263g，每袋重1.96g。65kg体质量成人黄芪汤生药临床用量为0.538g/kg。

黄芪总皂苷，以黄芪甲苷计，采用分光光度法测定黄芪总皂苷纯度为61.2％。黄芪总皂苷给药剂量为课题组前期均匀设计研究筛选获得的最佳效应剂量，为黄芪汤原方黄芪总皂苷含量的4.0倍。

1.2方法

1.2.3分组与给药

(1)分组

将39只Wistar雄性大鼠随机分成2组，即正常组8只，模型组31只。于造模第9周首日，将模型大鼠随机分为3组，即模型组(n＝12)、黄芪汤组(n＝10)、黄芪总皂苷组(n＝9)。

(2)给药

黄芪汤组：给予大鼠黄芪汤颗粒0.72g/kg/d(相当于生药3.766g/kg/d)，为65kg体质量成人临床用量的7倍，用蒸馏水10ml稀释，以10ml/kg大鼠体质量的剂量灌胃给药，每日1次，共计4周。

黄芪总皂苷组(Astragalosides)：黄芪总皂苷125mg/kg/d，灌胃给药，每日1次，连续4周。

2结果

2.1大鼠一般情况

动物模型复制过程中，正常组大鼠体重逐渐增加，毛色光泽，精神状态良好。模型大鼠精神状态欠佳，毛色逐渐失去光泽，颜色偏黄。黄芪汤组大鼠精神状态较好，毛色恢复光泽。

模型大鼠体重增加缓慢。与正常大鼠比较，模型大鼠体重显著降低，肝脏、脾脏重量显著增加(P<0.01)。模型大鼠肝重/体重比值、脾重/体重比值均显著高于正常大鼠(P<0.01)。(表3)

表3胆汁淤积大鼠体重、肝重、脾重、肝/体重比值、脾/体重比值变化及黄芪总皂苷干预作用

注：Normal，正常组；Model，模型组；HQT，黄芪汤组；Astragalosides，黄芪总皂苷组。Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal；*，P＜0.05；**，P＜0.01；vs.Model，Data＝mean±SD。

2.2胆汁淤积大鼠肝脏病理组织学变化及黄芪总皂苷干预作用

H&E染色显示，正常大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，未见肝细胞坏死及炎性细胞浸润。模型大鼠肝脏汇管区、肝小叶周边可见小叶间胆管增生显著，炎性细胞浸润。与模型大鼠比较，黄芪总皂苷能够显著改善肝组织炎性改变，减少小叶间胆管增生。(图3)

天狼星红染色显示，模型大鼠肝脏汇管区胶原纤维沉积显著，胶原纤维沿肝小叶周边伸展、分隔原有肝小叶。黄芪总皂苷干预后，肝组织胶原纤维沉积显著减少。(图3)

2.3胆汁淤积大鼠肝组织羟脯氨酸含量变化及黄芪总皂苷干预作用

与正常大鼠比较，模型大鼠肝组织羟脯氨酸含量显著升高(P＜0.01)；与模型大鼠比较，黄芪总皂苷能显著降低肝组织羟脯氨酸含量(P＜0.01)。(表4，图4)

2.4胆汁淤积大鼠血清肝肾功能、血脂、血糖变化及黄芪总皂苷干预作用与正常大鼠比较，模型大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、CHE活性及TBIL、DBIL、TBA、TCH、HDL、LDL含量显著升高(P＜0.01)，ALB、BUN、ApoE、TG、GLU含量显著降低(P＜0.01)。(表4)

与模型大鼠比较，黄芪总皂苷能够显著降低血清ALT、AST、ALP、GGT、CHE活性及TBIL、DBIL、TBA、HDL、LDL含量(P＜0.01)，增加血清ALB、TG、ApoE含量(P＜0.01)。(表4)

表4.胆汁淤积大鼠血清肝肾功能、血脂、血糖，肝组织羟脯氨酸含量变化以及黄芪总皂苷干预作用

注：Normal，正常组；Model，模型组；HQT，黄芪汤组；Astragalosides，黄芪总皂苷组。Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal；*，P＜0.05；**，P＜0.01；vs.Model，Data＝mean±SD。

3小结

绿原酸、没食子酸、大黄多糖、黄芪总皂苷，是茵陈蒿汤和黄芪汤治疗慢性胆汁淤积的主要效应组分。栀子苷具有降酶作用，但对降低血清胆红素、胆汁酸未见显著治疗作用，其机制在于抑制肝细胞胆汁酸转运体表达，减少肝细胞从肝血窦摄取胆汁酸、胆红素，减少肝细胞向毛细胆管和肝血窦排泌胆汁。栀子苷阻断胆汁酸肠肝循环，降低了绿原酸、没食子酸、大黄多糖合用治疗胆汁淤积疗效。且栀子苷具有肝毒性，不能长期服用。

实施例3：CRGA组分复方调控胆汁酸转运体、核激素受体治疗胆汁淤积效应研究

实施例1和实施例2的研究结果提示，绿原酸(C)、没食子酸(R)、大黄多糖(G)、黄芪总皂苷(A)是茵陈蒿汤和黄芪汤治疗慢性胆汁淤积的主要效应组分。4种药效组分单独使用均能够调控胆汁酸转运体、胆汁酸配体(核激素受体、TGR5)表达，改善胆汁酸肠肝循环。本章研究内容，以茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸为阳性对照药，探索4种组分配伍组成CRGA组分复方，治疗胆汁淤积能否发挥协同增效作用。

1材料和方法

1.1.1动物

雄性Wistar大鼠58只，6周龄，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2013-0016，批号2008001662572。

1.1.2药物

茵陈蒿，生栀子，制大黄，没食子酸，大黄多糖，绿原酸，同实施例1；

黄芪汤颗粒，黄芪总皂苷，同实施例2；

熊去氧胆酸：商品名：优思弗；进口药品注册证号：H20150365；产品批号：14L0901bL，购自上海中医药大学附属曙光医院国大药房。

1.2.3分组与给药

(1)分组

58只Wistar雄性大鼠随机分成2组，即正常组8只，模型组50只。于造模第9周首日，将模型大鼠随机分为5组，即模型组(Model，n＝12)、CRGA组分复方组(CRGA，n＝10)、茵陈蒿汤组(YCHT，n＝10)、黄芪汤组(HQT，n＝10)、熊去氧胆酸组(UDCA，n＝8)。

(2)给药

茵陈蒿汤组：给药同实施例1；

黄芪汤组：给药同实施例2；

熊去氧胆酸组：按照70mg/kg体重，灌胃给药，每日1次，连续4周；

CRGA组分复方组：绵茵陈绿原酸110mg/kg+制大黄多糖360mg/kg+没食子酸110mg/kg+黄芪总皂苷125mg/kg，灌胃给药，每日1次，连续4周。

2结果

2.1大鼠一般情况

动物模型复制过程中，正常组大鼠体重逐渐增加，毛色光泽，精神状态良好。模型大鼠精神状态欠佳，毛色逐渐失去光泽，颜色偏黄。

模型大鼠体重增加缓慢。与正常大鼠比较，模型大鼠体重显著降低，肝脏、脾脏重量显著增加(P<0.01)。模型大鼠肝重/体重比值、脾重/体重比值均显著高于正常大鼠(P<0.01)。(表5)

表5.胆汁淤积大鼠体重、肝重、脾重、肝/体重比值、脾/体重比值变化及CRGA组分复方干预作用

注：Normal，正常组；Model，模型组；CRGA，CRGA组分复方组，YCHT，茵陈蒿汤组；HQT，黄芪汤组；UDCA，熊去氧胆酸组。Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal。*，P＜0.05；**，P＜0.01；vs.Model，Data＝mean±SD。

2.2胆汁淤积大鼠肝脏病理组织学变化及CRGA组分复方干预作用

H&E染色显示，正常大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，未见肝细胞坏死及炎性细胞浸润。模型大鼠肝脏汇管区、肝小叶周边可见小叶间胆管增生显著，炎性细胞浸润。与模型大鼠比较，CRGA组分复方能够显著改善肝组织炎性改变，减少小叶间胆管增生。(图5)

天狼星红染色显示，模型大鼠肝脏汇管区胶原纤维沉积显著，胶原纤维沿肝小叶周边伸展、分隔原有肝小叶。CRGA组分复方干预后，肝组织胶原纤维沉积显著减少。(图5)

2.3胆汁淤积大鼠肝组织羟脯氨酸含量变化及CRGA组分复方干预作用

与正常大鼠比较，模型大鼠肝组织羟脯氨酸含量显著升高(P＜0.01)；与模型大鼠比较，CRGA组分复方、茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸均能显著降低肝组织羟脯氨酸含量(P＜0.01)。CRGA组分复方降低肝组织羟脯氨酸含量作用显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸(P＜0.05)。(表6，图6)

2.4胆汁淤积大鼠血清肝肾功能、血脂、血糖变化及CRGA组分复方干预作用

与正常大鼠比较，模型大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、CHE活性及TBIL、DBIL、TBA、TCH、HDL、LDL含量显著升高(P＜0.01)，ALB、BUN、ApoE、TG、GLU含量显著降低(P＜0.01)。(表6)

与模型大鼠比较，CRGA组分复方、茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸均能够显著降低血清ALT、AST、ALP、GGT、CHE活性及TBIL、DBIL、TBA含量(P＜0.01)，增加血清ALB含量(P＜0.01)。CRGA组分复方降低血清TBIL、DBIL、TBA含量作用显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸。(表6)

表6.胆汁淤积大鼠血清肝肾功能、血脂、血糖，肝组织羟脯氨酸含量变化以及CRGA组分复方干预作用

注：Normal，正常组；Model，模型组；CRGA，CRGA组分复方组；YCHT，茵陈蒿汤组；HQT，黄芪汤组；UDCA，熊去氧胆酸组。Δ，P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；Model vs.Normal。*，P＜0.05；**，P＜0.01；vs.Model，Data＝mean±SD。

3小结

CRGA组分复方能够显著改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积，均显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸。

结论如下：

本发明采用ANIT诱导慢性胆汁淤积性肝损伤大鼠模型，比较清热利湿的茵陈蒿汤和益气补虚的黄芪汤治疗慢性胆汁淤积的共性和个性特征，剖析茵陈蒿汤和黄芪汤治疗慢性胆汁淤积的主要效应组分，优化组分复方，以期达到协同增效之目的，为开发组分复方新药提供依据。通过研究获得如下结论：

1.清热利湿的茵陈蒿汤和益气补虚的黄芪汤，均能够治疗慢性胆汁淤积。调控胆汁酸代谢，改善胆汁酸肠肝循环，是此二首不同功效方剂治疗慢性胆汁淤积发挥疗效的共同作用环节。黄芪汤促进肝细胞向毛细胆管和肝血窦排泌胆汁、减轻肝细胞胆汁淤积作用优于茵陈蒿汤；而茵陈蒿汤抑制胆汁酸合成，促进胆汁酸代谢作用优于黄芪汤。

2.绿原酸、没食子酸、大黄多糖、黄芪总皂苷是治疗慢性胆汁淤积的主要效应组分。

3.栀子苷具有降酶作用，但对降低血清胆红素、胆汁酸未见显著治疗作用，其机制在于抑制肝细胞胆汁酸转运体(NCTP、OATP1a1)表达，减少肝细胞从肝血窦摄取胆汁酸、胆红素，减少肝细胞向毛细胆管和肝血窦排泌胆汁。栀子苷阻断胆汁酸肠肝循环，降低了绿原酸、没食子酸、大黄多糖合用治疗胆汁淤积疗效。

4.CRGA组分复方能够显著改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积。均显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸。调控胆汁酸代谢，改善胆汁酸肠肝循环，是CRGA组分复方治疗慢性胆汁淤积的主要效应机制。

实施例4：本发明的组分复方制备

所述的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷的重量份数比为1：0.2：0.2：0.2。

绿原酸，纯度：＞70％；没食子酸，纯度：＞70％；大黄多糖，纯度：＞60％；黄芪总皂苷以黄芪甲苷计，其纯度大于等于40％。

实施例5：本发明的组分复方制备

所述的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷的重量份数比为1：10：20：30。

绿原酸，纯度：＞70％；没食子酸，纯度：＞70％；大黄多糖，纯度：＞60％；黄芪总皂苷以黄芪甲苷计，其纯度大于等于40％。

实施例6：本发明的组分复方制备

所述的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷的重量份数比为1.1：1.1：3.6：1.25。

绿原酸，纯度：＞98％；没食子酸，纯度：＞98％；大黄多糖，纯度：＞90％；黄芪总皂苷以黄芪甲苷计，其纯度为61.2％。

实施例7：组分复方干预胆汁淤积的药效学实验

SPF级雄性Wistar大鼠，6周龄，随机分成2组：正常组8只，造模组50只。造模大鼠给予ANIT3 ml/kg大鼠体重的剂量灌胃，隔天1次，共12周。正常大鼠经口灌胃给予同剂量的生理盐水。于造模第9周首日，将造模大鼠随机分为5组，即模型组(n＝12)、CRGA组分药物组(n＝10)、茵陈蒿汤组(n＝10)、黄芪汤组(n＝10)、熊去氧胆酸组(n＝8)。茵陈蒿汤组、黄芪汤组分别以10ml/kg大鼠体质量的剂量灌胃给药，每天1次，共计4周。熊去氧胆酸组：以70mg/kg大鼠体质量的剂量灌胃给药，每天1次，共计4周；CRGA组分药物组：给予组分复方(绵茵陈绿原酸110mg/kg+制大黄多糖360mg/kg+没食子酸110mg/kg+黄芪总皂苷125mg/kg)灌胃给药，每天1次，共计4周。疗程结束后收集标本作相关指标检测，进行药效学观察。

用异氟烷呼吸麻醉，取下腔静脉血，离心分离血清。各大鼠取肝脏相同部位组织，4％多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋，切片厚度为4μm，用于病理组织学和胶原沉积检测。检测血清学指标血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸(TBA)。采用Jamall氏法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)。计量资料写成均数±标准差(mean±SD)。方差齐性用最小显著差异法(LSD)作两两比较，方差不齐作非参数检验。

表7列出了各组药物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠肝组织Hyp含量的影响。与正常组大鼠比较，模型组大鼠肝组织Hyp含量显著升高(P＜0.01)；与模型大鼠比较，CRGA组分药物、茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸均能显著降低肝组织Hyp含量(P＜0.05，P＜0.01)。CRGA组分药物降低肝组织Hyp含量作用显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸(P＜0.05，P＜0.01)。

表7各组药物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠肝组织Hyp含量的影响

组别	Hyp(μg/g湿肝)
		正常组	134.9±10.26
模型组	437.5±139.7<sup>△△</sup>
		CRGA组分药物组	248.0±39.23**
茵陈蒿汤组	352.2±75.34*<sup>##</sup>
		黄芪汤组	321.9±30.63**<sup>#</sup>
熊去氧胆酸组	320.0±37.68**<sup>#</sup>

注：与正常组比较，^ΔΔP<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与CRGA组分药物组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

表8列出了各组药物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠血清ALT、AST、ALB、ALP、GGT、TBIL、DBIL、TBA的影响。与正常组大鼠比较，模型组大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT活性及TBIL、DBIL、TBA含量显著升高(P＜0.01)，ALB含量显著降低(P＜0.01)。与模型大鼠比较，CRGA组分药物、茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸均能够显著降低血清ALT、AST、ALP、GGT活性及TBIL、DBIL、TBA含量(P＜0.01)，增加血清ALB含量(P＜0.01)。CRGA组分复方降低血清TBIL、DBIL、TBA含量作用显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤、熊去氧胆酸(P＜0.05，P＜0.01)。

表8各组药物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、ALB及DBIL、TBIL、TBA的影响

组别

ALT(U/L)

AST(U/L)

ALP(U/L)

GGT(U/L)

ALB(g/L)

DBIL(μmol/l)

TBIL(μmol/l)

TBA(μmol/l)

正常组

39.63±4.72

81.57±4.72

82.71±10.64

1.15±0.4

36.26±1.31

3.39±0.33

11.79±2.57

16.55±3.6

模型组

108.9±39.86<sup>ΔΔ</sup>

141.7±38.98<sup>ΔΔ</sup>

179.8±37.67<sup>ΔΔ</sup>

6.3±1.36<sup>ΔΔ</sup>

33.63±1.9<sup>ΔΔ</sup>

8.13±1.93<sup>ΔΔ</sup>

44.17±12.41<sup>ΔΔ</sup>

100.1±23.9<sup>ΔΔ</sup>

CRGA组分药物组

49.50±6.61<sup>**</sup>

88.0±10.5<sup>**</sup>

130.9±16.74<sup>**</sup>

2.44±0.61<sup>**</sup>

36.54±1.24<sup>**</sup>

3.53±0.79<sup>**</sup>

13.7±3.17<sup>**</sup>

22.8±5.03<sup>**</sup>

茵陈蒿汤组

50.19±14.11<sup>**</sup>

98.95±18.48<sup>**</sup>

138.3±27.3<sup>**</sup>

2.97±1.1<sup>**</sup>

36.17±1.29<sup>**</sup>

4.88±1.12<sup>**#</sup>

29.52±6.08<sup>**##</sup>

41.17±18.51<sup>**#</sup>

黄芪汤组

59.86±15.64<sup>**</sup>

105.9±7.12<sup>**</sup>

139.4±30.0<sup>**</sup>

2.38±0.53<sup>**</sup>

35.93±3.14<sup>*</sup>

4.7±1.15<sup>*</sup>

26.64±7.84<sup>**##</sup>

50.7±9.29<sup>**##</sup>

熊去氧胆酸组

52.13±12.23<sup>**</sup>

98.0±6.66<sup>**</sup>

137.30±41.23<sup>**</sup>

2.11±0.55<sup>**</sup>

36.08±1.49<sup>*</sup>

5.41±1.2<sup>**##</sup>

21.71±5.61<sup>**#</sup>

29.62±6.83<sup>**</sup>

注：与正常组比较，^ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与CRGA组分药物组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

本发明的CRGA组分药物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠模型的治疗效应的肝组织病理切片分析。

本发明的CRGA组分药物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠模型的治疗效应的肝组织病理切片进行显微镜拍摄，见图7。

图7列出了各组药物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠肝脏病理组织学的影响。HE染色显示，正常大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，未见肝细胞坏死及炎性细胞浸润。模型大鼠肝脏汇管区、肝小叶周边可见小叶间胆管增生显著，炎性细胞浸润。与模型大鼠比较，CRGA组分药物能够显著改善肝组织炎性改变，减少小叶间胆管增生。天狼猩红染色显示，模型大鼠肝脏汇管区胶原纤维沉积显著，胶原纤维沿肝小叶周边伸展、分隔原有肝小叶。CRGA组分药物干预后，肝组织胶原纤维沉积显著减少。

结论如下：

由以上研究结果表明，CRGA组分药物能够显著改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积。组分复方药物降低血清TBIL、DBIL、TBA含量显著优于茵陈蒿汤、黄芪汤。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种治疗胆汁淤积的中药组分组合物，其特征在于，由绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷组成；其中，所述的绿原酸、没食子酸、大黄多糖和黄芪总皂苷的重量份数比为1：0.2：0.2：0.2~1：10：20：30；

所述的绿原酸，其纯度大于等于70%；没食子酸，其纯度大于等于70%；大黄多糖，其纯度大于等于60%；黄芪总皂苷以黄芪甲苷计，其纯度大于等于40%。

2.一种如权利要求1所述的中药组分组合物在制备治疗胆汁淤积的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的中药组分组合物在制备治疗胆汁淤积的药物中的应用，其特征在于，所述的中药组分组合物改善慢性胆汁淤积血清肝功能、降低肝组织羟脯氨酸含量，减轻肝组织炎症损伤、小叶间胆管增生和胶原纤维沉积。

4.一种以如权利要求1所述的中药组分组合物作为活性成分的药物制剂，所述的药物制剂是采用本领域常规制备方法制备成药剂学上的常用剂型。

5.一种如权利要求4所述的药物制剂在制备治疗胆汁淤积的药物中的应用。

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