CN110585215A - 氯化血红素及其复合物在医药中的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了氯化血红素和/或氯化血红素复合物在制备预防和治疗类风湿性关节炎药物中应用。氯化血红素或氯化血红素复合物在体外作用于巨噬细胞具有显著的抗炎效果、对大鼠关节炎模型能有效抑制足掌的肿胀，且能显著降低了后足炎症因子mRNA的表达和肝脾组织自身免疫相关因子的mRNA表达，说明了氯化血红素或氯化血红素复合物具有很好的预防和治疗类风湿性关节炎的作用。

Description

氯化血红素及其复合物在医药中的新应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及到氯化血红素及其复合物在医药中的新应用。
背景技术
氯化血红素(Hemin)，又称为血晶素或者氯化高铁血红素(Haemin or FerricChloride Heme)。Hemin是一种含三价铁离子的卟啉化合物。氯化血红素可由天然血红素氧化而来，前者与后者的化学性质相似。血红素普遍存在于动物的血液，肌肉和部分植物组织中，它是许多生物活性大分子(例如血红蛋白、肌蛋白、细胞色素和过氧化物酶等)的关键辅基，因此血红素是生物体中最重要的化合物之一。
氯化血红素CAS号16009-13-5，分子式为C34H32ClFeN4O4，相对分子质量为651.94。氯化血红素的化学结构如上所示。由于氯化血红素的化学结构式中含有较大的疏水的四吡咯环，所以其在水中溶解度小，而结构式中两个游离的羧基使其可溶于碱性水溶液中。除此之外，氯化血红素还可溶于二甲基亚砜和酸性丙酮等有机试剂中。
在临床治疗中，氯化血红素最广泛的应用是作为铁质强化剂治疗缺铁性贫血。与主要从蔬菜和植物性食物中释放出来的无机铁(非血红素铁)相比，血红素铁在体内以分子形式存在。因此血红素铁可被肠道黏膜直接摄取，其吸收率比非血红素铁高50％-87％，生物利用度也更高。此外，氯化血红素还具有无铁腥臭味、不造成胃肠道刺激、在体内不引起铁蓄积中毒等优点，是首选的纯天然生物补铁剂。
其次，氯化血红素在临床中还作为卟啉代谢校正剂用于治疗急性卟啉症。卟啉症可为遗传性或后天获得性的，其病理特征为血红素生物合成的特定酶的缺乏，血红素的合成减少，导致β-氨基乙酰丙酸(ALA)合成酶的代偿性诱导，卟啉合成的中间体的积累和排泄增加。氯化血红素的补充能抑制ALA合成酶的诱导，减少卟啉合成过程中潜在有害的中间体或代谢物的形成和积累，并一定程度上纠正体内的血红素缺乏症。目前已上市用于治疗卟啉症的氯化血红素产品有2种。有一种冻干形式的血红素制剂(商品名Panhematin)。另一种是氯化血红素与精氨酸复合的冻干粉(商品名)，以乙醇：丙二醇：水为混合溶剂，静脉注射用于治疗间歇性原卟啉症。
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是在遗传因素以及环境因素影响下导致的关节部位滑膜等组织的自身免疫疾病，甚至还能够引起全身效应的一种慢性炎症性疾病，是最常见的慢性炎性疾病之一。在RA中，其特征有异常增生的滑膜；出现相关细胞因子、趋化因子、自身抗体，如类风湿性因子(rheumatoid factor,RF)和抗凝血蛋白抗体(anticitrullinated protein antibody,ACPA)；还有破骨细胞生成、血管生成；严重者甚至伴随有全身性综合症如心血管，肺，心理和骨骼疾病。
目前，RA困扰了全世界范围内的大量患者，多达三分之一的RA患者在发病后2年内停止工作，并有很大可能在长期患病后产生永久性的、不可逆转的全身效应，比如诱发肺纤维化、类风湿性心脏病、中风、易感染等等，极大地降低了生活质量。简而言之，RA疾病极大影响了患者的身体健康和生活质量。因此，为更好地治疗RA，造福患者及社会，安全有效的RA治疗药物的研发是亟待解决的当务之急。
尽管RA的病因以及致病机制尚未被完全揭示，但截至目前已有大量的相关研究成果证明遗传、环境及疾病因素导致的自身免疫反应，进而诱导慢性的局部甚至全身炎症的发生是目前公认的疾病过程[1]。根据疾病进展阶段，人类白细胞抗原-DR4(humanleucocyte antigen,HLA-DR4)等位基因、自身免疫及炎症的激活在RA的发生中起到了重要的作用，而细胞因子则是炎症的发生和治疗当中需要考虑的重要因素及应用靶点。
HLA-DR和RA之间的联系最早在20世纪70年代发现，与RA的早期阶段的发展有关。HLA系统由人类的主要组织相容性(major histocompatibility,MHC)基因编码，MHC基因存在于大多数脊椎动物中，HLA基因在人体激活免疫反应抵抗疾病的机体防御功能方面发挥着重要作用，也是RA最重要的遗传风险等位基因，约占RA所有遗传影响因素的40％。在RA患病人群中具有MHCⅡ类HLA-DR4等位基因个体的比例高达约5/6。其具体易感RA的机制在于HLA-DR中的DRβ链第三高变区的70～74氨基酸(谷氨酰胺—亮氨酸—精氨酸—丙氨酸—丙氨酸)与DR4链中的一些氨基酸相同，且该序列为“易感性表位”。超过90％的RA患者至少表达其中一处变异。
适应和先天免疫系统的激活导致的自身免疫是RA临床阶段的开始。滑膜微血管内皮细胞通过表达粘附分子如整合素，选择素和趋化因子使白细胞迁移至滑膜，通过释放肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNFα)，活性氧和NO自由基，基质降解酶以及吞噬和抗原呈递作用导致早期滑膜炎；之后由于细胞因子和趋化因子的存在，T细胞、B细胞、髓系细胞、浆细胞样树突状细胞等多种免疫细胞聚集至滑膜，并释放细胞因子，相互影响，促进炎症的发展。
细胞因子具有广泛调节炎症过程的作用，因此RA的发病过程及机制与其密切相关。在早期RA中，T细胞和基质细胞表达细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-13、IL-14、IL-15诱导产生慢性疾病。检测RA患者的滑膜和血清，可以发现TNF-α是主要的细胞因子，其作用在于诱导促炎细胞因子，破坏促炎介质和抗炎介质之间的正常生理平衡。除此之外，TNF-α还能诱导内皮细胞粘附分子的表达，抑制调节性T细胞，刺激炎症部位血管生成和刺激疼痛产生。类似地，IL-6通过白细胞的活化和自身抗体的产生导致急性期反应，如贫血，认知功能障碍和脂质代谢失调。细胞因子还参与了破骨细胞的成熟和活化，核因子受体激活因子-κB配体(RANKL)与、TNF、IL-17和IL-1在此过程中具有分级作用。通过抗体阻断对比，这些细胞因子的重要作用已在RA患者得到证实。
由于关于RA的疾病发展机制尚未完全清楚，因此目前还没有药物能够完全控制RA造成的关节和周围骨组织的侵袭和损伤，也没有恢复损伤的有效药物。在治疗RA患者时，现有药物的治疗目的主要是为了减缓炎症和疼痛症状，保持关节功能，和防止病情恶化，常用的治疗药物可分为四类：
第一类为非甾体抗炎药(Non-steroid anti-inflammatory drugs,NSAIDs)，通过抑制环氧化酶，抑制花生四烯酸转化生成前列腺素，从而起到消炎止痛的作用，本发明中采用的该类对照药物为塞来昔布(celecoxib)，是一种选择性很强的可逆转COX-2抑制剂，但这类药物仅可以缓解症状，并不能预防和缓解软骨和骨损伤。
第二类为抗风湿药物(Disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)，该类药物主要是通过细胞毒作用及免疫抑制发挥一定的抗RA作用，能够延缓但不能预防关节损伤，而且这些药物也往往会随着时间的推移而失去效益。本发明中该类对照药物采用了RA临床治疗的一线药物甲氨喋呤，起到抑制二氢叶酸还原酶，抑制甲基转移酶活性导致与免疫系统功能相关的酶活性失活，抑制白细胞介素1-β对其细胞表面受体的影响等多种机制的抗RA作用。
第三类为糖皮质激素，该类药物具有强大的抗炎作用，但其半衰期短、在体内被大量代谢，并存在过强的免疫抑制以及骨质疏松甚至骨质坏死等一系列副作用，尤其针对本身具有骨关节病理改变的类风湿性关节炎治疗，其对机体骨骼的副作用尤为不利。因此临床上并不推荐长期或大剂量使用。本发明中采用的该类对照药物为醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)。
第四类为生物制剂，能够拮抗RA中的细胞因子等炎症相关蛋白，如英利昔单抗(肿瘤坏死因子拮抗剂)，托法替尼b(Jak抑制剂)，tocilizumab(IL-6拮抗剂)等，起到高效的RA缓解作用，并且可以和DMARDs联用。然而，这些药物与传统的DMARDS相比，价格十分昂贵，限制其临床应用的大量推广，也具有一定副作用，包括严重和机会性感染。
临床上需要更多更好的用于防治类风湿性关节炎的药物。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供氯化血红素或其复合物在医药中的新应用。
实现上述目的的技术方案如下。
氯化血红素和/或氯化血红素复合物在制备预防和治疗类风湿性关节炎药物中应用。
在其中一个实施中，所述氯化血红素复合物为氯化血红素与蛋白类、氨基酸或形成稳定的复合物，或所述氯化血红素复合物为氯化血红素与碱性小分子形成可溶性盐类，进一步优选氯化血红素钠盐、氯化血红素钾盐。
在其中一个实施中，所述蛋白类为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
在其中一个实施中，所述氨基酸类为精氨酸，赖氨酸，或组氨酸。
在其中一个实施中，所述药物的剂型为溶液型注射剂、冻干粉注射剂、皮下植入剂、片剂、胶囊、口服液、颗粒、滴丸、贴剂、微丸、微囊、脂质体、微球。
本发明的另一目的是提供一种预防和治疗类风湿性关节炎药物。
实现上述目的的技术方案如下。
一种预防和治疗类风湿性关节炎药物，其活性成分包括有氯化血红素和/或氯化血红素复合物。
在其中一些实施例中，该药物中包括所述药学上可接受的辅料，选自填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、吸附载体、溶剂、抗氧剂、吸附剂、渗透压调节剂、pH调节剂。
本申请的发明人发现，氯化血红素或氯化血红素复合物在体外作用于巨噬细胞具有显著的抗炎效果；体内实验对于大鼠关节炎模型具有良好的抑制足掌肿胀的效果，且能显著降低了后足炎症因子mRNA的表达和肝脾组织自身免疫相关的因子表达。氯化血红素的抗炎效果与激素类药物醋酸地塞米松相当且具有免疫抑制效果，其治疗效果优于非甾体抗炎药类，而无激素类药物的严重副作用。因此，氯化血红素或氯化血红素复合物具有很好的预防和治疗类风湿性关节炎的作用，为临床预防和治疗类风湿性关节炎提供了更多更好的选择。
附图说明
图1Raw264.7细胞的mRNA表达.利用LPS(500ng/ml)和IFN-γ(20ng/ml)刺激Raw264.7细胞6h，再加入Hemin(60μM)培养16h后，PCR检测mRNA表达，结果以mean±SD表示，以one-way ANOVA及Dunnett’s test进行统计学分析(n＝3,****，P＜0.0001)。
图2大鼠CIA模型各给药组的后足厚度变化.初次免疫后第15天开始给药，Hemin腹腔注射或皮下注射40mg/kg，每周2次；甲氨喋呤腹腔注射1mg/kg，每周2次；塞来昔布灌胃50mg/kg，每天一次；醋酸地塞米松肌肉注射0.45mg/kg，每2天一次.后足厚度变化(mm)＝致炎后足掌厚度(mm)-致炎前同侧足掌初始厚度(mm)，结果以mean±SD表示,n＝12。
图3大鼠CIA模型各给药组的关节炎指数临床评分.初次免疫后第15天开始给药，Hemin腹腔注射或皮下注射40mg/kg，每周2次；甲氨喋呤腹腔注射1mg/kg，每周2次；塞来昔布灌胃50mg/kg，每天一次；醋酸地塞米松肌肉注射0.45mg/kg，每2天一次，结果以mean±SD表示,n＝12。
图4大鼠CIA模型各给药组大鼠后足TNFα，IL-1β和IL-6的mRNA表达，于初次免疫后第28天处死大鼠，取致炎后足组织匀浆，PCR测定的mRNA表达.结果以mean±SD表示，以one-way ANOVA及Dunnett’s test进行统计学分析(n＝12,****，P＜0.0001)。
图5大鼠CIA模型各给药组大鼠后足肿胀度实物图，其中，a是模型对照组，b是Hemin腹腔注射给药组；c是Hemin皮下注射给药组；d是甲氨喋呤给药组；e是塞来昔布给药组；f是醋酸地塞米松给药组。
图6大鼠CIA模型各给药组大鼠肝和脾组织IL-17、IL-23和和Foxp3的mRNA表达.初次免疫后第15天开始给药，Hemin腹腔注射40mg/kg，每周2次，于致炎后第28天处死大鼠，取致炎后足组织匀浆，PCR测定IL-17、IL-23和Foxp3mRNA表达.结果以mean±SD表示，以one-way ANOVA及Dunnett’s test进行统计学分析(n＝6,****，P＜0.0001)。
具体实施方式
除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、药剂学、细胞生物学、其属于本领域技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明在其中的一个方面，涉及到将所述氯化血红素用于制备预防和治疗类风湿性关节炎的药物中。
另一方面，氯化血红素可与蛋白类、氨基酸类形成稳定的复合物，在其中一些实施例中，所述蛋白类为白蛋白，可为生物领域中常见的牛血清白蛋白或人血清白蛋白。选择碱性氨基酸氯化血红素组成复合物(Hemin的卟啉环中有羧基，可与碱性氨基酸成盐形成复合物，也可能是碱性氨基酸的供电子基团(胍基、咪唑基、氨基)可与卟啉环上有空轨道的N原子形成配位键)，在其中一个实例中，所述氨基酸是精氨酸。当然，根据氨基酸的性质，还可以是赖氨酸或组氨酸。
本发明在其中的一个方面，涉及到一种治疗类风湿性关节炎药物，该药物的活性成分包括有氯化血红素。该药物中还可以包括所述药学上可接受的辅料，根据各种剂型的需要，可以选自填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、吸附载体、溶剂、抗氧剂、吸附剂、渗透压调节剂、pH调节剂。此外，所述药物剂型可为溶液型注射剂、冻干粉注射剂、皮下植入剂、片剂(例如口崩片、缓释片)、胶囊、口服液(例如糖浆)、颗粒、滴丸、贴剂、微丸、微囊、脂质体、微球等缓控释制剂或控释制剂等剂型。所述药物的给药方式可为体内静脉注射、腹腔注射、皮下注射或口服给药。其有效剂量可为10-200mg/kg。
以下通过具体实施例，对本发明做进一步的阐释，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例一 Hemin的稳定复合物的制备
本实施例制备了hemin与白蛋白或氨基酸的稳定复合物。
(一)与白蛋白复合
Hemin用5mg/ml Na2CO3溶液溶解，白蛋白用pH 7.4PBS溶解后，取等摩尔数的白蛋白加入hemin溶液中，边加边搅拌，反应过夜即得hemin与白蛋白复合物。所述白蛋白为牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)或人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)。
(二)与氨基酸复合
取hemin摩尔数3倍量的精氨酸溶于10％乙醇：40％乙二醇：水混合溶剂中(v/v)，搅拌下加入hemin，反应过夜后即得hemin与精氨酸的复合物(hemin arginate)。所述氨基酸也可为赖氨酸或组氨酸。
(三)氯化血红素可溶性盐类
取hemin溶解于1M NaOH溶液中，室温搅拌反应过夜后即得hemin钠盐，调节pH至9备用。所述碱性小分子也可为其他无机碱类(如KOH)或有机碱类(如小分子胺类)。
实施例二 Hemin及hemin的稳定复合物抗炎效果的体外评价
本实施例通过建立LPS+IFN-γ刺激的Raw264.7细胞炎症模型，考查hemin及hemin稳定复合物的体外抗炎效果。取对数生长期的Raw264.7细胞接种12孔板，培养24h后加入500ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和20ng/mlγ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)刺激6h建立巨噬细胞炎症模型(M1型巨噬细胞)，分别加入1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM、100μM、150μM、200μM hemin或相应hemin含量的hemin-白蛋白复合物、hemin arginate、hemin钠盐，培养16h后，提取RNA，PCR检测各分组(的炎症因子TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达，筛选抗炎效果最优的hemin浓度。以Hnrnpab为内参，利用2-△△t法计算相对表达量。以one-way ANOVA和Dunnett’s test进行统计学分析。
由图1所示，LPS(500ng/ml)和IFN-γ(20ng/ml)刺激Raw264.7细胞后，炎症因子TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平显著上调。加入Hemin(60μM)孵育16h后，各炎症因子的表达均明显下调，TNFα、IL-1β和IL-6的相对表达量(以LPS+IFNγ组相对表达量为1)分别降低至0.31、0.26和0.35。Hemin1-200μM浓度均能降低Raw264.7细胞炎症因子mRNA表达，且在1-100μM范围内呈浓度依赖性。Hemin 1μM可使TNFα、IL-1β和IL-6的相对表达量(以LPS+IFNγ组相对表达量为1)分别降低至0.65、0.53和0.61，30μM浓度条件可将上述三种炎症因子mRNA表达降低至0.44、0.39和0.46，100μM浓度条件可将上述三种炎症因子mRNA表达降低至0.24、0.11和0.13。浓度100μM以上时则与100μM条件的抗炎效果相当。证明Hemin在体外作用于巨噬细胞具有显著的抗炎效果。Hemin-白蛋白复合物和在各浓度条件下各炎症因子mRNA表达水平与相同浓度hemin的作用相当，hemin与蛋白类、氨基酸类、碱性小分子结合形成复合物后仍可保持hemin的抗炎效果。例如在Hemin-白蛋白复合物60μM浓度条件(含hemin 60μM)上述三种炎症因子的mRNA表达水平降低至0.33、0.29和0.32，在Hemin-arginate 60μM浓度条件(含hemin 60μM)上述三种炎症因子的mRNA表达水平降低至0.28、0.25和0.37，在hemin钠盐60μM浓度条件(含hemin 60μM)上述三种炎症因子的mRNA表达水平降低至0.39、0.33和0.21。
实施例三 Hemin arginate和hemin钠盐用于大鼠佐剂关节炎模型预防性给药的抗炎效果评价
本实施例通过建立弗氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎模型，第0天致炎前1h开始给予预防性给药，持续给药至致炎后28天，通过测量后足掌厚度(mm)和观察评价关节炎指数评分，考查hemin arginate和hemin钠盐对大鼠佐剂关节炎的预防和治疗效果。
1、实验动物：采用健康的Sprague-Dawley系(SD)大鼠，雄性，体重250-300g。
2、AIA的建立：
大鼠右后足跖皮内注射氟氏完全佐剂0.1ml/只致炎，诱导大鼠关节炎发生。
3、实验动物分组及给药：
将72只大鼠随机分为以下六组，每组12只：
模型对照组：作为模型对照不给药物处理；b.Hemin-arginate腹腔注射给药组：在大鼠AIA造模前1h，腹腔注射hemin arginate 60mg/kg，其后每周给药2次；c.Hemin钠盐腹腔注射给药组：在大鼠AIA造模前1h，腹腔注射hemin钠盐60mg/kg，其后每周给药2次；d.甲氨喋呤(Methotrexate)给药组：在大鼠AI A造模之前1h，腹腔注射MTX 1mg/kg，其后每周给药2次；e.塞来昔布给药组：在大鼠AIA造模之前1h，灌胃给予塞来昔布(Celecoxib)50mg/kg，其后每天给药1次；f.醋酸地塞米松(Dexamethasone Acetate)给药组：在大鼠AIA造模之前1h，肌肉注射醋酸地塞米松0.45mg/kg，其后每周给药2次。
4、观察指标：
(1)连续给药至致炎后28天，给药和致炎后用游标卡尺每天测量大鼠右后足掌厚度，足掌厚度变化△thickness(mm)＝致炎后足掌厚度(mm)-致炎前同侧足掌初始厚度(mm)。
(2)观察关节肿胀度进行关节炎指数评价：
0分：无红斑和肿胀的证据
1分：红斑和轻度肿胀局限于足中段或踝关节
2分：红斑和轻度肿胀从踝关节蔓延至足中段
3分：红斑和轻度肿胀从踝关节蔓延至趾关节
4分：红斑和轻度肿胀包括了踝、足、趾
5、大鼠后足组织炎症因子mRNA表达测定：连续给药28天后，过量麻醉处死大鼠，取后足组织加入RNA提取试剂trizol后研磨匀浆，提取RNA，测定mRNA表达,以Hnrnpab为内参，利用2-△△t法计算相对表达量。以one-way ANOVA和Dunnett’s test进行统计学分析。
模型组大鼠给予右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂致炎后，迅速出现急性期炎症反应，后足掌明显肿胀，致炎后24h后足掌厚度增加(△thickness)可高达2.89mm(关节炎指数评分4分)。给予hemin arginate腹腔注射处理后能有效抑制炎症反应急性期足掌的肿胀，不出现肿胀高峰，致炎后24h后足掌厚度增加仅为0.22mm(关节炎指数评分1分)，给予hemin钠盐腹腔注射处理组24h后足掌厚度增加仅为0.31mm，hemin arginate和hemin钠盐对急性期炎症的抑制效果十分显著且优于激素类药物醋酸地塞米松(致炎后24h厚度增加0.85mm，关节炎指数评分2分)。给予塞来昔布灌胃处理组对急性期的后足肿胀抑制效果十分微弱，厚度增加为1.94mm(关节炎指数评分3分)，而甲氨蝶呤短期给药无法体现其药效，厚度增加值与模型组相当(关节炎指数评分4分)。长期给药至致炎后第28天，模型组厚度增加值为1.62mm(关节炎指数评分4分)。与模型组相比，hemin arginate腹腔注射仍保持其显著的治疗效果，后足厚度增加值为0.32mm(关节炎指数评分1分)，hemin钠盐处理组后足掌厚度增加值为0.43mm，而醋酸地塞米松组后足厚度增加值为0.93mm(关节炎指数评分2分)，说明hemin arginate腹腔注射长期给药的治疗效果优于醋酸地塞米松。给予甲氨喋呤的长期给药处理未见对后足肿胀的抑制效果。给予塞来昔布灌胃组的厚度增加为1.33mm(关节炎指数评分3分)，与模型组相比有微弱的治疗效果。甲氨蝶呤给药组的厚度增加为1.45mm(关节炎指数评分3分)，对后足炎症肿胀抑制作用较弱。
造模后第28天取大鼠组织测炎症因子mRNA表达，hemin arginate腹腔注射给药组与模型组(mRNA相对表达量为1)相比，后足组织TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调至0.38，0.17和0.23，hemin钠盐腹腔注射组则下调至0.42、0.35和0.28，效果与醋酸地塞米松相当。塞来昔布给药处理对上述三种炎症因子mRNA表达有微弱的下调作用，分别下调至0.67、0.54和0.62。甲氨蝶呤给药组的炎症因子mRNA表达接近造模组水平。
实施例四 Hemin用于大鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型治疗性给药的抗炎效果评价
本实施例通过建立胶原诱导的大鼠关节炎(CIA)模型，初次免疫后第15天开始给药，持续给药至初次免疫后28天，通过测量后足掌厚度(mm)和观察评价关节炎指数评分，考查hemin对大鼠CIA的治疗效果。
1、实验动物：采用健康的Sprague-Dawley系(SD)大鼠，雄性，体重250-300g。
2、CIA的建立：
将牛Ⅱ型胶原蛋白用0.05M醋酸溶液溶解配成2mg/ml胶原溶液，加入等体积弗氏不完全佐剂用匀浆机乳化后，每只大鼠在其右后足跖以及尾部距尾根约2cm处分别皮内注射100μL乳剂(含Ⅱ型胶原100μg，每只大鼠共200μg胶原)进行初次免疫，并在初次免疫7天时给予加强免疫，尾根部和右后足跖皮内各注射50μl乳化后胶原。
3、实验动物分组及给药如下，首次致炎后第15天开始给药。
将72只大鼠随机分为以下六组，每组12只：
a.模型对照组：作为模型对照不给药物处理；b.Hemin腹腔注射给药组：腹腔注射hemin 40mg/kg，每周给药2次；c.Hemin皮下注射给药组：皮下注射hemin40mg/kg，每周给药2次；d.甲氨喋呤给药组：腹腔注射MTX 1mg/kg，每周给药2次；e.塞来昔布给药组：灌胃给予塞来昔布50mg/kg，每天给药1次；f.醋酸地塞米松给药组：肌肉注射醋酸地塞米松0.45mg/kg，每2天给药1次。
4、观察指标：
(1)连续给药至初次免疫后28天，初次免疫和给药后用游标卡尺每天测量大鼠右后足掌厚度，足掌厚度变化△thickness(mm)＝致炎后足掌厚度(mm)-致炎前同侧足掌初始厚度(mm)。
(2)观察关节肿胀度进行关节炎指数评价：同实施例三。
5、大鼠后足组织炎症因子mRNA表达测定：连续给药至初次免疫后第28天，过量麻醉处死大鼠，取后足组织加入RNA提取试剂trizol后研磨匀浆，提取RNA，测定的mRNA表达,以Hnrnpab为内参，利用2-△△t法计算相对表达量。以one-way ANOVA和Dunnett’s test进行统计学分析。
图5是大鼠CIA模型各给药组大鼠后足肿胀度结果示意图，从图中可以看出，模型组大鼠后足发生明显肿胀，厚度明显增加，给予hemin腹腔注射或皮下注射处理后肿胀明显消退，其效果与醋酸地塞米松处理组相当。而甲氨蝶呤和塞来昔布给药组大鼠后足肿胀程度与造模组比虽有一定消退但效果不明显。由图2可知，CIA造模后模型组的脚掌厚度急剧增加，出现明显肿胀；而给予hemin腹腔注射或皮下注射处理后能有效抑制足掌的肿胀，抑制肿胀效果与醋酸地塞米松相当。给予塞来昔布灌胃处理组对急性期的后足肿胀抑制效果不明显，长期给药后与模型组相比有一定治疗效果但肿胀度仍高于hemin组。给予甲氨喋呤的长期给药处理未见对后足肿胀的抑制效果。由图3可知，模型组和甲氨喋呤组的临床评分在实验期间一直维持在3-4分，给予hemin处理的效果与醋酸地塞米松相当，临床评分降至1-2分，而塞来昔布给药组则连续给药2周后临床评分才降至2分，说明hemin对大鼠关节炎有良好的治疗效果。参见图4所示，模型组大鼠后足的炎症因子的mRNA表达水平显著高于正常组，给予hemin腹腔注射或皮下注射处理后，显著降低了后足炎症因子的表达。
实施例五 Hemin-白蛋白复合物用于大鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型治疗性给药的抗炎效果评价
本实施例通过建立胶原诱导的大鼠关节炎(CIA)模型，初次免疫后第15天开始给药，持续给药至初次免疫后28天，通过测量后足掌厚度(mm)和观察评价关节炎指数评分，考查hemin对大鼠CIA的治疗效果。
1、实验动物：采用健康的Sprague-Dawley系(SD)大鼠，雄性，体重250-300g。
2、CIA的建立：
将牛Ⅱ型胶原蛋白用0.05M醋酸溶液溶解配成2mg/ml胶原溶液，加入等体积弗氏不完全佐剂用匀浆机乳化后，每只大鼠在其右后足跖以及尾部距尾根约2cm处分别皮内注射100μL乳剂(含Ⅱ型胶原100μg，每只大鼠共200μg胶原)进行初次免疫，并在初次免疫7天时给予加强免疫，尾根部和右后足跖皮内各注射50μl乳化后胶原。
3、实验动物分组及给药如下，首次致炎后第15天开始给药。
将60只大鼠随机分为以下五组，每组12只：
a.模型对照组：作为模型对照不给药物处理；b.Hemin-白蛋白复合物皮下注射给药组：腹腔注射hemin-白蛋白复合物40mg/kg，每周给药2次；c.甲氨喋呤给药组：腹腔注射MTX 1mg/kg，每周给药2次；d.塞来昔布给药组：灌胃给予塞来昔布50mg/kg，每天给药1次；e.醋酸地塞米松给药组：肌肉注射醋酸地塞米松0.45mg/kg，每2天给药1次。
4、观察指标：
(1)连续给药至初次免疫后28天，给药和致炎后用游标卡尺每天测量大鼠右后足掌厚度，足掌厚度变化△thickness(mm)＝致炎后足掌厚度(mm)-致炎前同侧足掌初始厚度(mm)。
(2)观察关节肿胀度进行关节炎指数评价：同实施例三。
5、大鼠后足组织炎症因子mRNA表达测定：连续给药至初次免疫后第28天，过量麻醉处死大鼠，取后足组织加入RNA提取试剂trizol后研磨匀浆，提取RNA，测定TNFα，IL-1β和IL-6的mRNA表达,以Hnrnpab为内参，利用2-△△t法计算相对表达量。以one-way ANOVA和Dunnett’s test进行统计学分析。
CIA模型组初次免疫和加强免疫后脚掌厚度急剧增加，出现明显肿胀。给予hemin-白蛋白复合物皮下注射处理后能有效抑制足掌的肿胀，连续给药至初次免疫后第28天时，足掌厚度增加值从首次给药前的1.98mm下降至0.80mm，关节炎指数评分由4分降低为1分，抑制肿胀效果与醋酸地塞米松(初次免疫后28天足掌厚度增加值为0.68mm)相当，而此时模型组的足掌厚度增加值仍高达2.23mm。
造模后第28天取大鼠组织测炎症因子mRNA表达，hemin-白蛋白复合物皮下注射给药组与模型组(mRNA相对表达量为1)相比，后足组织TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调至0.53，0.36和0.47。
实施例六 Hemin用于大鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型治疗性给药的抗炎效果评价
本实施例通过建立胶原诱导的大鼠关节炎(CIA)模型，初次免疫后第15天开始给药，持续给药至初次免疫后28天，通过测量后足掌厚度(mm)和观察评价关节炎指数评分，考查hemin对大鼠CIA的治疗效果。
1、实验动物：采用健康的Sprague-Dawley系(SD)大鼠，雄性，体重250-300g。
2、CIA的建立：
将牛Ⅱ型胶原蛋白用0.05M醋酸溶液溶解配成2mg/ml胶原溶液，加入等体积弗氏不完全佐剂用匀浆机乳化后，每只大鼠在其右后足跖以及尾部距尾根约2cm处分别皮内注射100μL乳剂(含Ⅱ型胶原100μg，每只大鼠共200μg胶原)进行初次免疫，并在初次免疫7天时给予加强免疫，尾根部和右后足跖皮内各注射50μl乳化后胶原。
3、实验动物分组及给药如下，首次致炎后第15天开始给药。
将72只大鼠随机分为以下六组，每组12只：
a.模型对照组：作为模型对照不给药物处理；b.Hemin尾静脉注射注射给药10mg/kg组：尾静脉注射hemin 10mg/kg，每周给药2次；c.Hemin尾静脉注射注射给药20mg/kg组：尾静脉注射hemin 20mg/kg，每周给药2次；d.甲氨喋呤给药组：腹腔注射MTX 1mg/kg，每周给药2次；e.塞来昔布给药组：灌胃给予塞来昔布50mg/kg，每天给药1次；f.醋酸地塞米松给药组：肌肉注射醋酸地塞米松0.45mg/kg，每2天给药1次。
4、观察指标：
(1)连续给药至初次免疫后28天，给药和致炎后用游标卡尺每天测量大鼠右后足掌厚度，足掌厚度变化△thickness(mm)＝致炎后足掌厚度(mm)-致炎前同侧足掌初始厚度(mm)。
(2)观察关节肿胀度进行关节炎指数评价：同实施例三。
5、大鼠后足组织炎症因子mRNA表达测定：连续给药至初次免疫后第28天，过量麻醉处死大鼠，取后足组织加入RNA提取试剂trizol后研磨匀浆，提取RNA，测定TNFα，IL-1β和IL-6的mRNA表达,以Hnrnpab为内参，利用2-△△t法计算相对表达量。以one-way ANOVA和Dunnett’s test进行统计学分析。
CIA模型组初次免疫和加强免疫后脚掌厚度急剧增加，出现明显肿胀。给予hemin10mg/kg和20mg/kg尾静脉注射处理后能有效抑制足掌的肿胀，连续给药至初次免疫后第28天时，足掌厚度增加值从首次给药前的2.45mm(10mg/kg组)和2.33mm(20mg/kg组)下降至0.76mm(10mg/kg组)和0.63mm(20mg/kg组)，关节炎指数评分由4分降低为1分，抑制肿胀效果与醋酸地塞米松(初次免疫后28天足掌厚度增加值为0.68mm)相当，而此时模型组的足掌厚度增加值仍高达2.23mm。
造模后第28天取大鼠组织测炎症因子mRNA表达，hemin尾静脉注射10mg/kg给药组与模型组(mRNA相对表达量为1)相比，后足组织TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调至0.62，0.54和0.49。hemin尾静脉注射20mg/kg给药组与模型组(mRNA相对表达量为1)相比，后足组织TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调至0.62，0.54和0.49。
实施例七 不同用量Hemin用于大鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型治疗性给药的抗炎效果评价
本实施例通过建立胶原诱导的大鼠关节炎(CIA)模型，初次免疫后第15天开始给药，持续给药至初次免疫后28天，通过测量后足掌厚度(mm)和观察评价关节炎指数评分，考查hemin对大鼠CIA的治疗效果。
1、实验动物：采用健康的Sprague-Dawley系(SD)大鼠，雄性，体重250-300g。
2、CIA的建立：
将牛Ⅱ型胶原蛋白用0.05M醋酸溶液溶解配成2mg/ml胶原溶液，加入等体积弗氏不完全佐剂用匀浆机乳化后，每只大鼠在其右后足跖以及尾部距尾根约2cm处分别皮内注射100μL乳剂(含Ⅱ型胶原100μg，每只大鼠共200μg胶原)进行初次免疫，并在初次免疫7天时给予加强免疫，尾根部和右后足跖皮内各注射50μl乳化后胶原。
3、实验动物分组及给药如下，首次致炎后第15天开始给药。
将84只大鼠随机分为以下七组，每组12只：
a.模型对照组：作为模型对照不给药物处理；b.Hemin灌胃给药80mg/kg组：灌胃给药hemin 80mg/kg，每周给药2次；c.Hemin灌胃给药100mg/kg组：灌胃给药hemin 100mg/kg，每周给药2次；d.Hemin灌胃给药200mg/kg组：灌胃给药hemin 200mg/kg，每周给药2次；e.甲氨喋呤给药组：腹腔注射MTX 1mg/kg，每周给药2次；f.塞来昔布给药组：灌胃给予塞来昔布50mg/kg，每天给药1次；g.醋酸地塞米松给药组：肌肉注射醋酸地塞米松0.45mg/kg，每2天给药1次。
4、观察指标：
(1)连续给药至初次免疫后28天，给药和致炎后用游标卡尺每天测量大鼠右后足掌厚度，足掌厚度变化△thickness(mm)＝致炎后足掌厚度(mm)-致炎前同侧足掌初始厚度(mm)。
(2)观察关节肿胀度进行关节炎指数评价：同实施例三。
5、大鼠后足组织炎症因子mRNA表达测定：连续给药至初次免疫后第28天，过量麻醉处死大鼠，取后足组织加入RNA提取试剂trizol后研磨匀浆，提取RNA，测定TNFα，IL-1β和IL-6的mRNA表达,以Hnrnpab为内参，利用2-△△t法计算相对表达量。以one-way ANOVA和Dunnett’s test进行统计学分析。
CIA模型组初次免疫和加强免疫后脚掌厚度急剧增加，出现明显肿胀。给予hemin灌胃处理后能有效抑制足掌的肿胀，连续给药至初次免疫后第28天时，80mg/kg灌胃组足掌厚度增加值从首次给药前的2.21mm下降至0.98mm，100mg/kg灌胃组抑制肿胀效果与80mg/kg组相近。200mg/kg灌胃组足掌厚度增加值从首次给药前的2.14mm下降至0.79mm。而此时模型组的足掌厚度增加值仍高达2.23mm。
造模后第28天取大鼠组织测炎症因子mRNA表达，hemin尾静脉注射80mg/kg给药组与模型组(mRNA相对表达量为1)相比，后足组织TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调至0.67，0.62和0.55。hemin 100mg/kg和200mg/kg灌胃组后足组织TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达与80mg/kg组效果相当。实施例八Hemin用于大鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型的免疫抑制作用体内评价
本实施例通过建立胶原诱导的大鼠关节炎(CIA)模型，初次免疫后第15天开始给药，持续给药至初次免疫后28天，取肝脾组织考查IL-17、IL-23、Foxp3的mRNA表达变化，证明hemin对Th17细胞介导的自身免疫具有抑制作用。
1、实验动物：采用健康的Sprague-Dawley系(SD)大鼠，雄性，体重250-300g。
2、CIA的建立：
将牛Ⅱ型胶原蛋白用0.05M醋酸溶液溶解配成2mg/ml胶原溶液，加入等体积弗氏不完全佐剂用匀浆机乳化后，每只大鼠在其右后足跖以及尾部距尾根约2cm处分别皮内注射100μL乳剂(含Ⅱ型胶原100μg，每只大鼠共200μg胶原)进行初次免疫，并在初次免疫7天时给予加强免疫，尾根部和右后足跖皮内各注射50μl乳化后胶原。
3、实验动物分组及给药如下，首次致炎后第15天开始给药。
将24只大鼠随机分为以下六组，每组12只：
a.模型对照组：作为模型对照不给药物处理；b.Hemin腹腔注射40mg/kg组，每周给药2次
4、Hemin的免疫抑制作用考查：初次免疫28天后，过量麻醉处死大鼠，取肝脾组织剪碎后加入RNA提取试剂trizol后研磨匀浆，提取RNA，测定IL-17，IL-23和Foxp3的mRNA表达,以Hnrnpab为内参，利用2-△△t法计算相对表达量。以one-wayANOVA和Dunnett’s test进行统计学分析。
Th17细胞及其分泌的IL-17在自身免疫病的发生发展中具有重要作用，同时抗原提呈细胞分泌的IL-23可促进Th17细胞的分化，而Foxp3+的调节性T细胞(regulatory Tcells,Treg)介导对自身免疫病的抑制作用。由图6可知，hemin给药组与模型组相比，肝、脾组织的IL-17(Th17细胞的标志)和IL-23(促进Th17细胞分化)表达量显著下调，而Foxp3(Treg标志)表达上调，证明hemin给药后对IL23/IL17介导的自身免疫具有抑制作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.氯化血红素和/或氯化血红素复合物在制备预防和治疗类风湿性关节炎药物中应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氯化血红素复合物为氯化血红素与蛋白类、氨基酸形成的稳定复合物，或所述氯化血红素复合物为氯化血红素与碱性小分子形成可溶性盐类，优选氯化血红素钠盐、氯化血红素钾盐。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白类为白蛋白，所述白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨基酸类为精氨酸，赖氨酸，或组氨酸或其组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为溶液型注射剂、冻干粉注射剂、皮下植入剂、片剂、胶囊、口服液、颗粒剂、滴丸、贴剂、微丸、微囊、脂质体、微球。
6.一种预防和治疗类风湿性关节炎药物，其特征在于，其活性成分包括有氯化血红素和/或氯化血红素复合物。
7.根据权利要求6所述的预防和治疗类风湿性关节炎药物，其特征在于，该药物中包括所述药学上可接受的辅料，所述辅料选自填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、吸附载体、溶剂、抗氧剂、吸附剂、渗透压调节剂、pH调节剂。
8.根据权利要求6所述的预防和治疗类风湿性关节炎药物，其特征在于，所述氯化血红素复合物为氯化血红素与蛋白类、氨基酸形成的稳定复合物，或所述氯化血红素复合物为氯化血红素与碱性小分子形成的可溶性盐类。
9.根据权利要求6所述的预防和治疗类风湿性关节炎药物，其特征在于，所述氨基酸为精氨酸，赖氨酸，或组氨酸。
10.根据权利要求6-9任一项所述的预防和治疗类风湿性关节炎药物，其特征在于，所述蛋白类为白蛋白，所述白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
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