CN110579561A - 补肾和脉制剂的质量控制方法 - Google Patents

补肾和脉制剂的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药品检测技术领域，具体的涉及一种补肾和脉制剂的质量控制方法。包括特征图谱、含量测定和成分鉴定，特征图谱包括16个特征峰，含量测定包括对补肾和脉制剂中的黄芪甲苷和特女贞苷进行含量测定，采用照薄层色谱法对补肾和脉制剂的原料黄芪、女贞子、川芎、川牛膝和防风进行鉴定。本发明所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，建立了补肾和脉制剂的含量测定方法，填补了现有技术的空白，采用本发明所述的质量控制方法能更加准确全面的控制补肾和脉制剂的成品质量。

Description

补肾和脉制剂的质量控制方法
技术领域
本发明属于药品检测技术领域，具体的涉及一种补肾和脉制剂的质量控制方法。
背景技术
补肾和脉制剂处方由黄芪、黄精、寄生、女贞子、川牛膝、泽泻、杜仲、川芎、防风、水蛭、钩藤十一味药材组成，临床用于治疗老年高血压，现有技术中仅有对补肾和脉处方和临床应用的公开，医院制剂检验中仅对处方中的黄芪和女贞子进行鉴别，缺少含量测定项目。由于中药材质量良莠不齐，加之成分复杂，现有检测方法缺少处方中其他药材的质量信息，很难全面反应产品质量，更加难以控制药品质量。
中药特征图谱是一种综合的鉴定手段，它建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的匀一性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富化学成分信息的检测方法，建立中药特征图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。因此建立中药制剂特征图谱对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种补肾和脉制剂的质量控制方法。具有科学合理、简单易行的特点，全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
本发明所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，包括特征图谱、含量测定和成分鉴定，特征图谱包括16个特征峰，含量测定包括对补肾和脉制剂中的黄芪甲苷和特女贞苷进行含量测定，采用照薄层色谱法对补肾和脉制剂的原料黄芪、女贞子、川芎、川牛膝和防风进行鉴定。
其中：
所述的补肾和脉制剂采用如下方法制备，包括以下步骤：
(1)按重量份数比称取黄芪8份、黄精4份、寄生4份、泽泻8份、防风2.7份和川牛膝3份，加8倍量水煎煮2小时，滤过，药渣继续用6倍量水煎煮1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3；
(2)取女贞子4份、杜仲4份、川芎2.7份和钩藤2.7份，加8倍量60％乙醇回流提取2小时，滤过，药渣继续用6倍量的60％乙醇回流提取1小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3；
(3)取水蛭1.6份，用50％乙醇作溶剂，浸泡24小时后进行渗漉，收集10倍量渗漉液，渗漉液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3；
(4)合并以上浸膏，70℃减压干燥至固体，粉碎过80目筛，加入糊精混匀，制粒，干燥，整粒，即得补肾和脉制剂。
所述的特征图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)待测样品溶液的制备
取补肾和脉制剂，研细，加入提取溶剂并进行超声溶解，再加入提取溶剂补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取滤液即得待测样品溶液；
(2)参照物溶液的制备
取阿魏酸、升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品一定量，加甲醇溶解制成1ml含阿魏酸50μg、升麻素苷30μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷30μg、特女贞苷250μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷30μg的溶液，作为参照物溶液；
(3)测定法
分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录130分钟内的色谱图，特征图谱测定的色谱条件为：
色谱柱：选择C18；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A 0.1％甲酸水溶液–溶剂B甲醇；
溶剂A 0.1％磷酸水溶液–溶剂B甲醇；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下二个不同的洗脱方案中的一种：
①0～70min，10％～40％流动相B，70～100min，40％–60％流动相B，100～120min，60％–80％流动相B，120～121min，80％–10％流动相B，121～130min，10％流动相B；
②0～75min，10％～45％流动相B，75～100min，45％–60％流动相B，100～120min，60％–80％流动相B，120～121min，80％–10％流动相B，121～130min，10％流动相B；
柱温：25-35℃；
流速：1ml/min；
紫外检测波长：256-330nm。
步骤(1)中所述的待测样品溶液的制备中加入提取溶剂是体积浓度为70％的甲醇或乙醇水溶液中的一种。
其中：
所述的特征图谱包括16个特征峰，各特征峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：
1号峰相对保留时间RRT为0.20；2号峰相对保留时间RRT为0.41；3号峰的相对保留时间RRT为0.43；4号峰相对保留时间RRT为0.72；5号峰相对保留时间RRT为0.75；6号峰相对保留时间RRT为0.80；7号峰相对保留时间RRT为0.85；8号峰相对保留时间RRT为0.88；9号S峰相对保留时间RRT为1.00；10号峰相对保留时间RRT为1.15；11号峰相对保留时间RRT为1.35；12号峰相对保留时间RRT为1.43；13号峰相对保留时间RRT为1.43；14号峰相对保留时间RRT为1.55；15号峰相对保留时间RRT为1.72；16号峰相对保留时间RRT为1.75；其中：9号S峰是参照物的色谱峰。
所述的特征峰中4号特征峰是阿魏酸，6号特征峰是升麻素苷，7号特征峰是毛蕊异黄酮葡萄糖苷，9号特征峰是特女贞苷，10号特征峰是5-O-甲基维斯阿米醇苷。
所述的含量测定中，采用高效液相色谱法对补肾和脉制剂中的黄芪甲苷进行测定。
其中：
色谱检测条件为：色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(体积比为32:68)为流动相；蒸发光散射检测器检测；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂，研细，取约4g，精密称定，加水50ml微热使溶解，放冷，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次50ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，将正丁醇液蒸干，残渣加水10ml微热使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
所述的含量测定中，采用高效液相色谱法对补肾和脉制剂中的特女贞苷进行测定。
其中：
色谱检测条件为：色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱梯度为0～10min，20％流动相B，10～20min，20％～40％流动相B，20～40min，40％流动相B，40～41min，40～100％流动相B，41～50min，100％流动相B，51～60min，20％流动相B，检测波长为224nm，理论板数按特女贞苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备：取特女贞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂，研细，取约3g，精密称定，置50ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
所述的鉴别方法包括采用照薄层色谱法对补肾和脉制剂中的黄芪、女贞子、川芎、川牛膝、防风分别进行鉴别。
所述的黄芪鉴别方法为：
(1)供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂10g，加水50ml，微热使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50ml，弃去乙酸乙酯液，水液继续用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100-200目，5g，内径1cm)上，用甲醇10ml洗脱，弃去洗脱液，再用30％甲醇10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水2ml使溶解，加在D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用体积浓度40％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)测定方法：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(体积比为3:8:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
所述女贞子的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂10g，研细，加乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)测定方法：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液2μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5:2:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
所述川芎的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取女贞子鉴别项下的供试品溶液，加在中性氧化铝柱(100-200目，5g，内径1cm)上，用乙酸乙酯10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取欧当归内酯A对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)测定方法：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环已烷-乙酸乙酯(体积比为2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
所述川牛膝和防风的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物10g，加水50ml，微热使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50ml，弃去乙酸乙酯液，水液继续用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100-200目，5g，内径1cm)上，用甲醇15ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，加在D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、升麻素苷对照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)测定方法：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-浓氨溶液(体积比为50:20:10:2.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热2分钟，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，建立了补肾和脉制剂的含量测定方法，填补了现有技术的空白，采用本发明所述的质量控制方法能更加准确全面的控制补肾和脉制剂的成品质量。
(2)本发明所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，建立了补肾和脉制剂的特征图谱方法，并指认了其中5个特征峰的化学结构，提供的质量控制方法能更全面的反应药品质量，当药品质量发生问题或出现不良反应时，能更准确的确认是组方中哪味药材出现了问题，对指导工业生产控制药品质量具有重要的意义。
(3)特征图谱建立的基础是药材，本发明提供的方法中药材均来自全国各主产区，其中道地药材居多，更具有代表性，能更好的反应工业生产中的药材质量，而现有技术中制备补肾和脉制剂的药材多为只从一个产地购买的一批药材，不具有代表性。
(4)现有技术虽公开了补肾和脉制剂中黄芪的鉴别方法，但仅采用黄芪对照药材进行鉴别，黄芪甲苷具有降压作用，为补肾和脉制剂的有效成分之一，本发明采用黄芪甲苷作为对照品，对补肾和脉制剂中的黄芪进行了鉴别，此外，本发明还建立了防风、川牛膝及川芎的鉴别方法，相比现有技术更全面，更详实。
附图说明
图1为18062501-18062514批样品特征图谱(图1中，4、阿魏酸；6、升麻素苷；7、毛蕊花糖苷；9、特女贞苷；10、5-O-甲基维斯阿米醇苷)；
图2为特征图谱特征峰对照品图谱(图2中，1、阿魏酸；2、升麻素苷；3、毛蕊花糖苷；4、特女贞苷；5、5-O-甲基维斯阿米醇苷)；
图3为18062501批样品黄芪鉴别图谱(图中斑点从左到右依次为黄芪甲苷、18062501批供试品)；
图4为18062501批样品女贞子鉴别图谱(图中斑点从左到右依次为齐墩果酸、18062501批供试品)；
图5为18062501批样品川芎鉴别图谱(图中斑点从左到右依次为欧当归内酯A、18062501批供试品)；
图6为18062501批样品川牛膝和防风鉴别图谱(图中斑点从左到右依次为升麻素苷、5-O-维斯阿米醇苷、杯苋甾酮、18062501批供试品)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
补肾和脉制剂的制备：
分别从全国主要药材产区及道地产区购买处方药材共14批，产地信息见表1。
表1补肾和脉制剂药材产地信息
处方：黄芪1620g、黄精810g、寄生810g、川牛膝604.8g、泽泻1620g、防风600g、女贞子810g、川芎600g、钩藤600g、杜仲810g、水蛭324g。
制备方法：以上十一味，女贞子粉碎破壁与杜仲、川芎、钩藤用60％乙醇回流提取二次，第一次2小时，第二次1小时，第一次加8倍量60％乙醇，第二次加6倍量60％乙醇，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3(60℃)；黄芪、黄精、寄生、川牛膝、泽泻、防风加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，第一次加8倍量水，第二次加6倍量水，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3(60℃)；取水蛭，用50％乙醇作溶剂，浸泡24小时后进行渗漉，收集10倍量渗漉液，渗漉液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3；合并以上浸膏，减压干燥(≤70℃)至固体，粉碎过80目筛，加入适量糊精，混匀，制粒，干燥，整粒，即得。按表2分别取处方饮片，制备成14批补肾和脉颗粒。
表2 14批补肾和脉颗粒处方饮片信息
实施例1
补肾和脉颗粒特征图谱
1.仪器与试药
高效液相色谱仪(Agilent 1260)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；
色谱柱：Inertsil ODS-SP(4.6×250mm，5μm)；
试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；
试药：补肾和脉颗粒(批号：18062501-18062514)。
2.色谱条件：以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱条件为0～70min，10％-40％B，70～100min，40％–60％B，100～120min，60％–80％B，120～121min，80％–10％B，121～130min，10％B。流速为每分钟1ml/min；柱温25℃；检测波长为330nm。理论板数按特女贞苷峰计算不低于4000。
3.参照物溶液的制备：取阿魏酸、升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇溶解制成1ml含阿魏酸50μg、升麻素苷30μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷30μg、特女贞苷250μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷30μg的溶液，作为参照物溶液。
4.供试品溶液的制备：取补肾和脉颗粒，研细，取约1g，精密称定，置25ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
5.测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪中，测定，记录130分钟色谱图。
特征图谱包括16个特征峰，各峰相对保留时间为：
1号峰12.178min；2号峰24.710min；3号峰26.022min；4号峰43.300min；5号峰45.201min；6号峰47.783min；7号峰50.829min；8号峰53.145min；9号峰60.096min；10号峰69.023min；11号峰81.279min；12号峰85.698min；13号峰86.188min；14号峰92.872min；15号峰103.568min；16号峰105.177min。
各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：
1号峰相对保留时间RRT为0.20；2号峰相对保留时间RRT为0.41；3号峰的相对保留时间RRT为0.43；4号峰相对保留时间RRT为0.72；5号峰相对保留时间RRT为0.75；6号峰相对保留时间RRT为0.80；7号峰相对保留时间RRT为0.85；8号峰相对保留时间RRT为0.88；9号S峰相对保留时间RRT为1.00；10号峰相对保留时间RRT为1.15；11号峰相对保留时间RRT为1.35；12号峰相对保留时间RRT为1.43；13号峰相对保留时间RRT为1.43；14号峰相对保留时间RRT为1.55；15号峰相对保留时间RRT为1.72；16号峰相对保留时间RRT为1.75；其中：9号S峰是参照物的色谱峰，4号峰为阿魏酸、6号峰为升麻素苷、7号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、9号峰为特女贞苷、10号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷，见附图1。
参照物图谱2中，1号峰是阿魏酸，2号峰是升麻素苷，3号峰是毛蕊异黄酮葡萄糖苷，4号峰是特女贞苷，5号峰是5-O-甲基维斯阿米醇苷。
实施例2
补肾和脉制剂特征图谱
1.仪器与试药
高效液相色谱仪(Agilent 1260)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；
试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；
试药：补肾和脉颗粒(批号：18062501-18062514)；
2.色谱条件：以0.1％磷酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱条件0～75min，10％～45％B，75～100min，45％–60％B，100～120min，60％–80％B，120～121min，80％–10％B，121～130min，10％B。流速为每分钟1ml；柱温35℃；检测波长为256nm。理论板数按特女贞苷峰计算不低于4000。
3.参照物溶液的制备：取阿魏酸、升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇溶解制成1ml含阿魏酸50μg、升麻素苷30μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷30μg、特女贞苷250μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷30μg的溶液，作为参照物溶液。
4.供试品溶液的制备：取补肾和脉颗粒，研细，取约1g，精密称定，置25ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
5.测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪中，测定，记录130分钟色谱图。
特征图谱包括16个特征峰，各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：
1号峰相对保留时间RRT为0.20；2号峰相对保留时间RRT为0.42；3号峰的相对保留时间RRT为0.44；4号峰相对保留时间RRT为0.73；5号峰相对保留时间RRT为0.77；6号峰相对保留时间RRT为0.81；7号峰相对保留时间RRT为0.83；8号峰相对保留时间RRT为0.88；9号S峰相对保留时间RRT为1.00；10号峰相对保留时间RRT为1.15；11号峰相对保留时间RRT为1.35；12号峰相对保留时间RRT为1.43；13号峰相对保留时间RRT为1.43；14号峰相对保留时间RRT为1.55；15号峰相对保留时间RRT为1.72；16号峰相对保留时间RRT为1.75；其中：9号S峰是参照物的色谱峰，4号峰为阿魏酸、6号峰为升麻素苷、7号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、9号峰为特女贞苷、10号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷。
补肾和脉制剂特征图谱方法学考察：
1.精密度实验
取供试品溶液(批号18062501)，按实施例2中的方法制备供试品溶液并进行检测，连续进样6次，分别对特征峰相对保留时间和相对峰面积进行考察。供试品中特征峰相对保留时间的RSD＜0.3％，相对峰面积的RSD＜3％，表明仪器精密度良好。
2.重现性实验
取供试品溶液(批号18062501)，按实施例2中的方法制备供试品溶液并进行检测，分别对特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察；供试品中特征峰的相对保留时间的RSD＜0.3％，相对峰面积的RSD＜3％，表明重复性良好。
3.稳定性试验
取供试品溶液(批号18062501)，按实施例2中的方法制备供试品溶液并进行检测，分别于0，2，4，8，12，24h进样分析，分别对特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，供试品中特征峰相对保留时间的RSD＜0.3％，相对峰面积的RSD＜3％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
实施例3
补肾和脉颗粒黄芪甲苷含量测定
1.仪器与试药
高效液相色谱仪(Agilent 1260)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；蒸发光检测器(Alltech ELSD 6000)；
色谱柱：Inertsil ODS-SP(4.6×250mm，5μm)；
试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；
试药：补肾和脉颗粒(批号：18062501-18062514)；
2.色谱条件：以乙腈-水(32:68)为流动相。流速为每分钟1ml；柱温30℃；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
3.对照品溶液的制备方法为：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
4.供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂，研细，取约4g，精密称定，加水50ml微热使溶解，放冷，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次50ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，将正丁醇液蒸干，残渣加水10ml微热使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
5.测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
6.黄芪甲苷含量测定结果：见表3。
表3 14批补肾和脉颗粒黄芪甲苷含量测定结果
补肾和脉颗粒批号 黄芪甲苷含量(mg/g)
18062101 0.25
18062102 0.28
18062103 0.37
18062104 0.46
18062105 0.26
18062106 0.39
18062107 0.52
18062108 0.37
18062109 0.47
18062110 0.48
18062111 0.32
18062112 0.33
18062113 0.55
18062114 0.54
补肾和脉颗粒标准规定黄芪甲苷含量不得少于0.25mg/g，18062101-18062114批样品全部合格。
实施例4
补肾和脉颗粒特女贞苷含量测定
1.仪器与试药
高效液相色谱仪(Agilent 1260)、分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)；
色谱柱：Inertsil ODS-SP(4.6×250mm，5μm)；
试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯，参照物均购自中国食品药品检定研究院；
试药：补肾和脉颗粒(批号：18062501-18062514)。
2.色谱条件：以水为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱梯度为0～10min，20％流动相B，10～20min，20％～40％流动相B，20～40min，40％流动相B，40～41min，40～100％流动相B，41～50min，100％流动相B，51～60min，20％流动相B，检测波长为224nm，理论板数按特女贞苷峰计算应不低于4000。
3.对照品溶液的制备：取特女贞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；
4.供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂，研细，取约3g，精密称定，置50ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
5.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.特女贞苷含量测定结果：见表4。
表4 14批补肾和脉颗粒特女贞苷含量测定结果
补肾和脉颗粒批号 特女贞苷含量(mg/g)
18062101 1.88
18062102 1.89
18062103 2.78
18062104 3.06
18062105 2.07
18062106 1.56
18062107 3.06
18062108 3.48
18062109 4.23
18062110 2.96
18062111 1.96
18062112 2.67
18062113 2.61
18062114 2.73
补肾和脉颗粒标准规定特女贞苷含量不得少于1.5mg/g，18062101-18062114批样品全部合格。
实施例5
补肾和脉颗粒中黄芪、女贞子、川芎、川牛膝、防风的鉴别
1.仪器与试药
分析天平(METTLER TOLEDO XS/205DU)、超声清洗机(KQ-5200E)、电热套、烘箱(FXB101-0型)、三用紫外仪(ZF-7型)。
试剂：试剂均为分析纯，所用对照品均购自中国食品药品检定研究院。
试药：补肾和脉颗粒(批号为18062501)。
2.黄芪鉴别
(1)取补肾和脉制剂10g，加水50ml，微热使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50ml，弃去乙酸乙酯液，水液继续用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100-200目，5g，内径1cm)上，用甲醇10ml洗脱，弃去洗脱液，再用30％甲醇10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水2ml使溶解，加在D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(3:8:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.女贞子鉴别
(1)取补肾和脉制剂10g，研细，加乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)另取齐墩果酸对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液2μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(5:2:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4.川芎鉴别
(1)取女贞子鉴别项下的供试品溶液，加在中性氧化铝柱(100-200目，5g，内径1cm)上，用乙酸乙酯10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)另取欧当归内酯A对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环已烷-乙酸乙酯(2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5.川牛膝和防风鉴别
(1)取装量差异项下的本品内容物10g，加水50ml，微热使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50ml，弃去乙酸乙酯液，水液继续用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱(100-200目，5g，内径1cm)上，用甲醇15ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，加在D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)另取杯苋甾酮对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、升麻素苷对照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-浓氨溶液(50:20:10:2.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热2分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：包括特征图谱、含量测定和成分鉴定，特征图谱包括16个特征峰，含量测定包括对补肾和脉制剂中的黄芪甲苷和特女贞苷进行含量测定，采用照薄层色谱法对补肾和脉制剂的原料黄芪、女贞子、川芎、川牛膝和防风进行鉴别。
2.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：所述的补肾和脉制剂采用如下方法制备，包括以下步骤：
(1)按重量份数比称取黄芪8份、黄精4份、寄生4份、泽泻8份、防风2.7份、川牛膝3份，加8倍量水煎煮2小时，滤过，药渣继续用6倍量水煎煮1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3；
(2)取女贞子4份、杜仲4份、川芎2.7份、钩藤2.7份，加8倍量60％乙醇回流提取2小时，滤过，药渣继续用60％乙醇回流提取1小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3；
(3)取水蛭1.6份，用50％乙醇作溶剂，浸泡24小时后进行渗漉，收集10倍量渗漉液，渗漉液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20-1.30g/cm3；
(4)合并以上浸膏，70℃减压干燥至固体，粉碎过80目筛，加入糊精混匀，制粒，干燥，整粒，即得补肾和脉制剂。
3.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：所述的特征图谱的建立方法，色谱条件如下：
色谱柱：选择C18；
流动相选自以下流动相中的一种：
溶剂A0.1％甲酸水溶液–溶剂B甲醇；
溶剂A0.1％磷酸水溶液–溶剂B甲醇；
采用梯度洗脱进行洗脱，所述梯度洗脱：选自以下二个不同的洗脱方案中的一种：
①0～70min，10％～40％B，70～100min，40％–60％B，100～120min，60％–80％B，120～121min，80％–10％B，121～130min，10％B；
②0～75min，10％～45％B，75～100min，45％–60％B，100～120min，60％–80％B，120～121min，80％–10％B，121～130min，10％B；
柱温：25-35℃；
流速：1ml/min；
进样量为10μl；
紫外检测波长：256-330nm。
4.根据权利要求3所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：所述的特征图谱包括16个特征峰，各特征峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：
1号峰相对保留时间RRT为0.20；2号峰相对保留时间RRT为0.41；3号峰的相对保留时间RRT为0.43；4号峰相对保留时间RRT为0.72；5号峰相对保留时间RRT为0.75；6号峰相对保留时间RRT为0.80；7号峰相对保留时间RRT为0.85；8号峰相对保留时间RRT为0.88；9号S峰相对保留时间RRT为1.00；10号峰相对保留时间RRT为1.15；11号峰相对保留时间RRT为1.35；12号峰相对保留时间RRT为1.43；13号峰相对保留时间RRT为1.43；14号峰相对保留时间RRT为1.55；15号峰相对保留时间RRT为1.72；16号峰相对保留时间RRT为1.75；其中：9号S峰是参照物的色谱峰；
其中：4号特征峰是阿魏酸，6号特征峰是升麻素苷，7号特征峰是毛蕊异黄酮葡萄糖苷，9号特征峰是特女贞苷，10号特征峰是5-O-甲基维斯阿米醇苷。
5.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：采用高效液相色谱法对补肾和脉制剂中的黄芪甲苷进行测定，包括以下步骤：
(1)色谱检测条件的确定：色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32:68的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器检测；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
(2)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂研细，取4g精密称定，加水50ml使溶解，放冷，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次50ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，将正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
(4)分别精密吸取对照品溶液10μl和20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得黄芪甲苷的含量。
6.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：采用高效液相色谱法对补肾和脉制剂中的特女贞苷进行测定，包括以下步骤：
其中：
(1)色谱检测条件的确定：色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱梯度为0～10min，20％流动相B，10～20min，20％～40％流动相B，20～40min，40％流动相B，40～41min，40～100％流动相B，41～50min，100％流动相B，51～60min，20％流动相B，检测波长为224nm，理论板数按特女贞苷峰计算应不低于4000；
(2)对照品溶液的制备：取特女贞苷对照品精密称定，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂研细，取3g精密称定，置50ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
(4)测试：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
7.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：所述的黄芪鉴别方法为：
(1)供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂10g，加水50ml，微热使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50ml，弃去乙酸乙酯液，水液继续用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱上，用甲醇10ml洗脱，弃去洗脱液，再用30％甲醇10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水2ml使溶解，加在D101型大孔吸附树脂柱上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用体积浓度40％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)测定方法：照薄层色谱法试验，吸取上供试品溶液10μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为3:8:1的乙酸乙酯-丙酮-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色。
8.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：所述女贞子的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取补肾和脉制剂10g，研细，加乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)测定方法：照薄层色谱法(中国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液2μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:2:0.1的石油醚-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色。
9.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：所述川芎的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取女贞子鉴别项下的供试品溶液，加在中性氧化铝柱上，用乙酸乙酯10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取欧当归内酯A对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)测定方法：照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为2:1的环已烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。
10.根据权利要求1所述的补肾和脉制剂的质量控制方法，其特征在于：所述川牛膝和防风的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物10g，加水50ml，微热使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50ml，弃去乙酸乙酯液，水液继续用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱上，用甲醇15ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，加在D101型大孔吸附树脂柱上，用水100ml洗脱，弃去水液，再用80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品、升麻素苷对照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)测定方法：照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为50:20:10:2.5的三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-浓氨溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热2分钟，置紫外光灯下检视。
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