CN110577565B

CN110577565B - 一种从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法

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Publication number: CN110577565B
Application number: CN201910985995.4A
Authority: CN
Inventors: 李兴飞; 华欲飞; 杨淑暖; 龙杰; 孔祥珍; 张彩猛; 陈业明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110577565A

Abstract

一种从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，属于蛋白质提取技术领域。本发明利用复凝聚原理，将带有相反电荷的蛋白质和聚电解质通过静电作用力形成电中和的不溶性复合物。以豌豆蛋白加工过程中产生的含蛋白质的豌豆乳清废水为原料，选择天然阳离子多糖壳聚糖作为凝聚剂，通过调节复凝聚条件，分步实现豌豆两种乳清蛋白PA2和psa LA的提取与分离纯化。本发明对豌豆乳清废水进行综合利用，设备要求低，操作简单，无环境污染，条件温和，避免了工业上的酸热条件，最大限度的保留了两种乳清蛋白的功能特性，且豌豆乳清蛋白回收率高，纯度高。

Description

一种从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法

技术领域

本发明涉及一种从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，具体是指一种利用壳聚糖选择性回收豌豆乳清中的PA2和psa LA两种功能蛋白的方法，属于蛋白质提取技术领域。

背景技术

豌豆作为高淀粉含量的作物，常用作粉丝和粉条的原料。而豌豆蛋白作为低致敏蛋白，多存在于豌豆乳清废水中，其中蛋白质含量占总豌豆蛋白的90%以上。目前对豌豆乳清废水中蛋白质的回收多以回收分离蛋白为主，采用等电点酸沉；在回收豌豆分离蛋白后，残留的豌豆乳清废水仍含有20%-30%的蛋白质组分存在于其中，即为豌豆乳清蛋白。豌豆乳清蛋白为高硫含量蛋白，硫含量可占总豌豆含硫蛋白的三分之二以上；另外，豌豆乳清蛋白被报道具有杀虫、防止病虫害的生理活性，因此，豌豆乳清蛋白的浪费不仅使得含硫蛋白的大量损失，大量排放也造成环境污染。

PA1和PA2是主要的豌豆乳清蛋白，其含量占豌豆乳清蛋白的70%以上。PA1是由PA1a和PA1b组成，其中PA1a又称psa LA，psa LA中的含硫氨基酸约占种子中总含硫量的50%，其分子量约6kDa。PA2的分子量约为26kDa，也含有高的含硫氨基酸，含硫量为总含硫量的16%。因此，对psa LA和PA2的回收，是使得含硫蛋白不被大量损失的关键。Psa LA和PA2防止作物病虫害的生理活性及形成机制也得到广泛研究。除主要的乳清蛋白外，豌豆乳清废水中还含有一定量的β-淀粉酶（90kDa），凝集素（20kDa），BBI（12kDa）等多种对豌豆的风味和储存具有重要影响的生理活性物质。

豌豆乳清蛋白本身的物理性质使得有效回收豌豆乳清蛋白仍存在一定困难。目前，国内外鲜有文献对豌豆乳清蛋白的回收及分离方法进行报道。国内现有的文献多利用酶解或微生物发酵，对豌豆蛋白进行利用，无法直接提取其中的蛋白组分进行再利用。Parrheim食品公司通过超滤喷雾干燥的方法对豌豆乳清中的蛋白进行提取；Gao等在Parrheim的基础上，采用高速离心（10,000g）后用两种超滤分子量的超滤膜组件再渗滤的方法对提取豌豆分离蛋白后的豌豆乳清蛋白进行回收。以上两种方法均存在高耗能和无法对蛋白进行目标性提取等问题；此外，两者对豌豆乳清蛋白的回收效率也不高，在高耗能条件下，对豌豆乳清蛋白的回收率仅为52%。

本发明采用了天然可食性的壳聚糖作为回收材料，充分利用蛋白质与多糖静电相互吸引形成不溶性复合物的复凝聚原理，控制复凝聚条件，使目标蛋白形成复凝聚物而被沉淀出来。由于壳聚糖的天然化学性质，其形成的复凝聚物既可以直接作为食品材料利用，也可以实现蛋白与壳聚糖的有效分离。从资源回收利用的角度来看，本发明不仅可以低损耗的回收豌豆乳清蛋白，还可以制备高纯度的豌豆Psa LA和PA2功能蛋白组分，为后续的研究提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，该发明简单易操作，制备的PA2及psa LA的纯度约90%-93%，仍然保持天然的功能活性。

本发明的技术方案，一种从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，以豌豆蛋白加工过程中产生的豌豆乳清废水为原料，配置天然阳离子多糖壳聚糖溶液，按照一定的蛋白质/多糖质量比加入到豌豆乳清废水中进行复凝聚；通过控制蛋白质/多糖质量比和复凝聚pH分别获得含有PA2和psa LA的两种类型复凝聚物；通过调节复溶解pH，离心除糖，超滤除肽，释放出单一的PA2和psa LA组分，再经冷冻干燥得到两种纯度较高的单一豌豆乳清蛋白产品PA2和psa LA。

具体步骤为：

（1）豌豆乳清废水的预处理：将豌豆乳清废水调至pH 4.5-5.0，静止1-2d，高速离心去除沉淀，得到初步处理所得的豌豆乳清废水，测定所得废水中的蛋白质含量；

（2）豌豆乳清蛋白与多糖复凝聚：

a、取固体壳聚糖粉末，溶解于质量浓度为0.1%-0.3%的乙酸水溶液中，配制固体壳聚糖最终质量浓度为0.1%-0.3%的溶液；

b、取步骤（1）初步处理所得的豌豆乳清废水，按照蛋白质：多糖质量比2-100:1添加步骤a配置所得壳聚糖溶液，调节pH至5.0-7.0，搅拌10~15min；25℃下4000-6000rpm离心15-20min，收集沉淀和上清液，测定上清液中的蛋白质含量；所得沉淀为PA2-壳聚糖复凝聚物，上清液为待处理的乳清废水；

（3）分离PA2乳清蛋白：将步骤（2）b中得到的PA2-壳聚糖复凝聚物直接悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至8.0-10.0，磁力搅拌20-30min，6000-9000rpm离心5-10min，收集上清液，即得初步纯化的PA2的蛋白溶液；

（4）分离psa LA乳清蛋白：

c、取步骤（2）b所得待处理的乳清废水，按照蛋白质：多糖质量比2-100:1，添加步骤（2）a配置所得壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至5.0-7.0，4000-6000rpm离心15-20min，收集沉淀，即得PA2/psa LA-壳聚糖复凝聚物；

d、将得到的PA2/psa LA-壳聚糖复凝聚物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，用pH调节剂调节pH至3.0-4.0，25℃下搅拌15-30min，4000-6000rpm离心15-20min，去除沉淀，收集上清液；再次调节pH至8.0-10.0，磁力搅拌25-30min，6000-9000rpm离心5-10min，去除沉淀，并收集上清液，即得含有psa LA的蛋白液；

（5）纯化PA2和psa LA：将步骤（3）所得PA2的蛋白溶液和步骤（4）所得psa LA蛋白液，分别经截留分子量为3000-3500Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为4000-5000rpm、30-45min，重复超滤离心步骤2-3次；收集截留液，即得纯化后的PA2蛋白液和psa LA蛋白液；

（6）冷冻干燥：将步骤（5）所得两种蛋白液，均置于-50~-60℃、10~25 Pa下真空冷冻干燥，即制备得到回收的PA2和psa LA豌豆乳清蛋白。

所述豌豆乳清废水来自商业化豌豆分离蛋白生产形成的副产物或实验室利用脱脂豆粕及醇洗豆粕提取的豌豆乳清废水。

步骤（1）中所述的高速离心条件为8000-10000 rpm，离心时间不低于20 min。

步骤（2）所述壳聚糖溶液的质量浓度与所使用的豌豆乳清废水的蛋白质量浓度保持一致。

步骤（2）b中制备PA2-壳聚糖的具体条件为蛋白质:多糖质量比40-100:1，调节pH至5.0-5.8。

步骤（4）c中制备PA2/psa LA-壳聚糖的具体条件为蛋白质:多糖质量比2-10:1，调节pH至6.0-7.0。

上述步骤中所述的pH调节剂为酸性，具体为盐酸或硝酸。调节pH时还可能使用到碱性调节剂，具体为氢氧化钠或者碳酸氢钠配置的溶液。

本发明的有益效果：本发明操作简单，设备要求低；对生理活性蛋白实现了高附加值回收；阳离子多糖壳聚糖的用量少，并且易于回收利用；回收的PA2和psa LA纯度较高，仍然保留其天然结构和活性。

附图说明

图1 ：PA2及psa LA的回收工艺流程图。

图2 ：PA2及psa LA的纯度的SEC-HPLC检测图谱。

图3 ：PA2及psa LA的纯度SDS-PAGE检测图谱。

具体实施方式

以下实施例中具体回收工艺流程如图1所示。

实施例1

（1）豌豆乳清废水的预处理：将豌豆乳清废水调至pH 4.5，静置1d，离心(9000rpm，30min) 除沉淀，收集上清液。测定豌豆乳清清液中的蛋白含量为1.82mg/mL；

（2）豌豆乳清蛋白与多糖复凝聚：

a、称取0.182g的壳聚糖，溶解于100mL 0.2%的冰乙酸水溶液中，磁力搅拌使其完全溶解。

b、将步骤（1）所得豌豆乳清和壳聚糖溶液分别调至pH4.0。向豌豆乳清中加入2.5%（v/v）的壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至5.3，离心（4000rpm，20min），收集沉淀，即得PA2-壳聚糖的复凝聚物，上清液为待处理的乳清废水。

（3）分离和纯化PA2产品：

在所得PA2-壳聚糖的复凝聚物中，加入10mL的去离子水，调pH至9.0，离心（8000rpm，5min）取上清液，即得初步纯化的PA2蛋白溶液；

过截留分子量为3000 Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为4000rpm、45min，重复2次，收集最后一次的截留液，真空冷冻干燥，即得纯化的PA2产品。

（4）分离和纯化psa LA乳清蛋白：

继续向步骤（2）b所得待处理的乳清废水中加入17.5%（v/v）的壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至6.2，离心（4000rpm，20min），收集沉淀，即得PA2/psa LA-壳聚糖复凝聚物。

加入15mL的去离子水，用1.0M盐酸调节pH至4.0，磁力搅拌30min，4000rpm离心15min，去除沉淀，收集上清液，再次调节pH至9.0，8000rpm，5min，去除沉淀，过截留分子量为3000Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为4000rpm、45min，重复2次，收集最后一次的截留液，真空冷冻干燥，即得纯化的psa LA。

对纯化的psa LA与PA2溶液测定蛋白含量，过0.22μm微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。

经测定，以上实例所得psa LA的蛋白纯度为91.04%，蛋白含量约占干基的83.65%，总糖10.85%，灰分5.53%；以上实例所得PA2，蛋白纯度为92.18%，蛋白含量约占干基的85.03%，总糖6.87%，灰分6.90%。

实施例2

（1）豌豆乳清废水的预处理：将豌豆乳清废水调至pH 4.5，静置1d，离心(8000rpm，30min) 除沉淀，收集上清液，测定豌豆乳清中的蛋白含量为1.5mg/mL；

（2）豌豆乳清蛋白与多糖复凝聚：

a、称取0.15g的壳聚糖，溶解于100mL 0.2%的冰乙酸水溶液中，磁力搅拌使其完全溶解。

b、将步骤（1）所得豌豆乳清和壳聚糖溶液分调至pH4.0。向豌豆乳清中加入2.0%（v/v）的壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至5.2，离心（4000rpm，20min），收集沉淀，即得PA2-壳聚糖复凝聚物，上清液为待处理的乳清废水。

（3）分离和纯化PA2产品：加入10mL的去离子水，调pH至10.0，离心（8000rpm，5min）取上清液，过截留分子量为3000 Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为5000 rpm、30min，重复3次，收集最后一次的截留液，真空冷冻干燥，即得纯化的PA2产品。

（4）分离和纯化psa LA乳清蛋白：继续向步骤（2）b所得待处理的乳清废水中加入8.0%（v/v）的壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至6.0，离心（4000rpm，20min），收集沉淀，即得PA2/psa LA-壳聚糖复凝聚物。

加入10mL的去离子水，用1.0 M盐酸调节pH至3.5，磁力搅拌30min，4000rpm离心15min，去除沉淀，收集上清液，再次调节pH至10.0，8000rpm，5min，去除沉淀，过截留分子量为3000Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为5000rpm、30min，重复3次，收集最后一次的截留液，真空冷冻干燥，即得纯化的psa LA。

对纯化的psa LA与PA2溶液测定蛋白含量，过0.22μm微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析；所得纯度的SEC-HPLC检测图谱具体如图2所示，纯度SDS-PAGE检测图谱如图3所示。

经测定，以上实例所得psa LA，蛋白纯度为91.53 %，蛋白含量约占干基的85.05%，总糖8.90%，灰分4.21%；以上实例所得PA2，蛋白纯度为92.85%，蛋白含量约占干基的88.04%，总糖4.04%，灰分6.67%。

实施例3

（1）豌豆乳清废水的预处理：将豌豆乳清废水调至pH 4.5，静置1d，离心(9500rpm，30min) 除沉淀，收集上清液，测定豌豆乳清中的蛋白含量为2.0 mg/mL。

（2）豌豆乳清蛋白与多糖复凝聚：

a、称取0.2g的壳聚糖，溶解于100mL 0.2%的冰乙酸水溶液中，磁力搅拌使其完全溶解。

b、将上述豌豆乳清和壳聚糖溶液分调至pH4.0。向豌豆乳清中加入1.67%（v/v）的壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至5.0，离心（4000rpm，20min），收集沉淀，即得PA2-壳聚糖的复凝聚物，上清液为待处理的乳清废水。

（3）分离和纯化PA2产品：将步骤（2）b中得到的PA2-壳聚糖复凝聚物加入10mL的去离子水，调pH至9.5，离心（8000rpm，5min）取上清液，过截留分子量为3000 Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为4500 rpm、40min，重复2次，收集最后一次的截留液，真空冷冻干燥，即得纯化的PA2产品。

（4）分离和纯化psa LA乳清蛋白：继续向步骤（2）b所得待处理的乳清废水中加入10.83%（v/v）的壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至6.15，离心（4000rpm，20min），收集沉淀，即得PA2/psa LA-壳聚糖复凝聚物。加入12mL的去离子水，用2.0 M盐酸调节pH至3.0，磁力搅拌30min，4000rpm离心15min，去除沉淀，收集上清液，再次调节pH至9.5，8000rpm，5min，去除沉淀，过截留分子量为3000 Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为4500 rpm、40min，重复2次，收集最后一次的截留液，真空冷冻干燥，即得纯化的psa LA。

经测定，以上实例所得psa LA，蛋白纯度为91.22%，蛋白含量约占干基的84.05%，总糖9.55%，灰分4.22%；以上实例所得PA2，蛋白纯度为93.26%，蛋白含量约占干基的85.67%，总糖5.08%，灰分6.87%。

Claims

1.一种从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，其特征在于：

以豌豆蛋白加工过程中产生的豌豆乳清废水为原料，配制天然阳离子多糖壳聚糖溶液，按照一定的蛋白质/多糖质量比加入到豌豆乳清废水中进行复凝聚；

通过控制蛋白质/多糖质量比和复凝聚pH分别获得含有PA2和psa LA的两种类型复凝聚物；

制备得到含有PA2的复凝聚物时，控制蛋白质:多糖质量比40-100:1，调节pH至5.0-5.8；

制备得到含有psa LA复凝聚物时，控制蛋白质:多糖质量比2-10:1，调节pH至6.0-7.0；

通过调节复溶解pH，离心除糖，超滤除肽，释放出单一的PA2和psa LA组分；

含有PA2的复凝聚物分离得到PA2乳清蛋白时，需要调节pH至8.0-10.0；

含有psa LA的复凝聚物分离得到psa LA乳清蛋白时，需要首先调节pH至3.0-4.0，随后再次调节pH至8.0-10.0；

最后经冷冻干燥得到两种纯度较高的单一豌豆乳清蛋白产品PA2和psa LA。

2.根据权利要求1所述从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，其特征在于步骤为：

（2）豌豆乳清蛋白与多糖复凝聚：

b、取步骤（1）初步处理所得的豌豆乳清废水，按照蛋白质：多糖质量比40-100:1添加步骤a配制所得壳聚糖溶液，调节pH至5.0-5.8，搅拌10~15min；25℃下4000-6000rpm离心15-20min，收集沉淀和上清液，测定上清液中的蛋白质含量；所得沉淀为PA2-壳聚糖复凝聚物，上清液为待处理的乳清废水；

（3）分离PA2乳清蛋白：将步骤（2）b中得到的PA2-壳聚糖复凝聚物直接悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至8.0-10.0，磁力搅拌20-30min，6000-9000rpm离心5-10min，收集上清液，即得初步纯化的PA2蛋白溶液；

（4）分离psa LA乳清蛋白：

c、取步骤（2）b所得待处理的乳清废水，按照蛋白质：多糖质量比2-10:1，添加步骤（2）a配制所得壳聚糖溶液，磁力搅拌，将pH调至6.0-7.0，4000-6000rpm离心15-20min，收集沉淀，即得PA2/psa LA-壳聚糖复凝聚物；

（5）纯化PA2和psa LA：将步骤（3）所得PA2蛋白溶液和步骤（4）所得psa LA蛋白液，分别经截留分子量为3000-3500Da的超滤装置进行超滤离心，离心参数为4000-5000rpm，30-45min，重复超滤离心步骤2-3次；收集截留液，即得纯化后的PA2蛋白液和psa LA蛋白液；

3.根据权利要求2所述从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，其特征在于：所述豌豆乳清废水来自商业化豌豆分离蛋白生产形成的副产物或实验室利用脱脂豆粕及醇洗豆粕提取的豌豆乳清废水。

4.根据权利要求2所述从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的高速离心条件为8000-10000 rpm，离心时间不低于20 min。

5.根据权利要求2所述从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，其特征在于：步骤（2）所述壳聚糖溶液的质量浓度与所使用的豌豆乳清废水的蛋白质量浓度保持一致。

6.根据权利要求2所述从豌豆乳清废水回收PA2及psa LA的方法，其特征在于：所述的pH调节剂为酸性，具体为盐酸或硝酸。