CN110563811A - 一种皮肤保护肽hw-p1及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种皮肤保护肽HW‑P1及其制备方法与应用。所述的皮肤保护肽HW‑P1的氨基酸序列为QNSYADLWCQFHYMC。本发明从虎纹蛙皮肤分泌物中提取到一种促皮肤创伤修复的活性多肽，该多肽具有来源天然、高活性等特点。纯化得到的促皮肤创伤修复多肽HW‑P1显示了较强的创伤恢复活性，表明本发明“皮肤保护肽HW‑P1”有较大的医疗、化妆品应用前景。本发明所述的皮肤保护肽HW‑P1具有高效促进皮肤创伤修复的强活性的有益特点。

Description

一种皮肤保护肽HW-P1及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种皮肤保护肽HW-P1及其制备方法与应用。

背景技术

皮肤覆盖于人体表面，约占体重的16%，其面积可达到1.2-2.0㎡，是人体最大的器官之一。皮肤直接与外界接触，能阻挡异物与病原微生物的入侵，对人体有重要的保护作用，是人体免疫的第一道防线；同时能防止组织液丢失。皮肤内有丰富的感觉神经末梢，能感受多种刺激。此外，皮肤对维持体温恒定也有十分重要的作用。然而在生活中，皮肤极易受到外界因素的影响而发生损伤。如：机械、化学、电、和热等因素，因此，皮肤损伤是生活中比较常见的现象。但是皮肤损伤后的修复常常遇着两大难题，第一是修复过程中的问题，主要表现在容易受机体内外环境的影响，如：感染、糖尿病和肝硬化等，创伤转化为难愈合创伤，增加了患者的生理负担和经济负担。第二是创伤修复后形成的疤痕及创伤过度修复形成的瘢痕疙瘩。无论是普通损伤形成的疤痕还是过度修复形成的瘢痕疙瘩，都会影响外观及皮肤正常的生理功能。更甚会严重影响人们的生产活动，如皮肤纤维化引起的肌肉萎缩和严重烧伤修复后引起的组织粘连。因此创伤快速而稳健的修复是至关重要的。在创伤形成的初期，药物治疗扮演着至关重要的角色。在临床上主要用到的药物主要有两类，植物小分子化合物和生长因子类。而且这两类药物都有一定的局限性，前者不稳定，合成困难，活性不理想。后者需要苛刻的保存条件，在运输、保存和使用过程中容易失活，更重要的是，它会导致伤口过度修复，导致增生性瘢痕。因此，促皮肤创伤修复药仍有很大的提升空间，高活性、稳定、低成本的药物是符合市场需求的。在满足这类条件的筛选下，多肽类药物脱颖而出。自多肽类研发以来，已经有35种多肽类药物获得了上市与应用，取得了许多显著的成绩，如已经上市的埃塞那肽用于二型糖尿病、芋螺毒素样肽用于阵痛等。就埃塞那肽的全球销售额就已经达到了10亿/年。多肽类药物越来越受人们的关注。但是在创伤修复方面的多肽类药物较为少见，所以高活性、稳定、低成本的促创伤修复肽是有广阔的市场前景的。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种皮肤保护肽HW-P1；第二目的在于提供所述的皮肤保护肽HW-P1的制备方法；第三目的在于提供所述的皮肤保护肽HW-P1的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的皮肤保护肽HW-P1的氨基酸序列为QNSYADLWCQFHYMC。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、用电刺激法取云南虎纹蛙的皮肤分泌物，溶解于PBS，真空冷冻干燥后得到物料a于-80℃保存备用；

B、将物料a溶解于水中得到物料b，物料b经离心后收集上清液得到物料c，物料c经超滤得到物料d；

C、将物料d溶解于水中得到物料e，将物料e进行高效液相色谱反相层析得到标物皮肤保护肽HW-P1。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的皮肤保护肽HW-P1在制备促创伤修复保健食品、化妆品或药品中的应用。

本发明从虎纹蛙皮肤分泌物中提取到一种促皮肤创伤修复的活性多肽，该多肽具有来源天然、高活性等特点。纯化得到的促皮肤创伤修复多肽HW-P1显示了较强的促皮肤急性、慢性创伤修复、口腔溃疡粘膜修复和抑制皮肤纤维化活性，表明本发明皮肤保护肽HW-P1”有较大的医疗应用前景。本发明所述的皮肤保护肽HW-P1具有高效促进皮肤创伤修复的强活性的有益特点。

附图说明

图1为所述多肽分离纯化图；

图2为所述多肽细胞水平的促HaCaT细胞增殖、迁移、划痕修复活性图；

图3为所述多肽的促普通小鼠创伤修复活性图活性图；

图4为所述多肽的促糖尿病小鼠创伤修复活性图活性图；

图5为所述多肽的促大鼠口腔溃疡修复活性图；

图6为所述多肽的小鼠皮肤纤维化治疗活性图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的皮肤保护肽HW-P1的氨基酸序列为QNSYADLWCQFHYMC。

本发明所述的皮肤保护肽HW-P1的制备方法，包括以下步骤：

A、用电刺激法取云南虎纹蛙的皮肤分泌物，溶解于PBS，真空冷冻干燥后得到物料a于-80℃保存备用；

B、将物料a溶解于水中得到物料b，物料b经离心后收集上清液得到物料c，物料c经超滤得到物料d；

C、将物料d溶解于水中得到物料e，将物料e进行高效液相色谱反相层析得到目标物皮肤保护肽HW-P1。

B步骤中所述的水为超纯水。

B步骤中所述的离心是在转速10000~15000r/min下离心15~25min。

所述的离心的温度控制在3~5℃。

B步骤中所述的超滤是采用Amicon超滤器超滤，截留分子量为10 kDa。

C步骤中所述的水为去离子水。

所述的高效液相色谱反相层析是将物料e上样到预先用含0.1%三氟乙酸的超纯水平衡好的Hypersil ODS2 5 mm柱子，在流速为1ml/min的挑拣下，用乙腈在线性梯度条件下进行洗脱，检测波长为220nm。

本发明所述的皮肤保护肽HW-P1的应用为所述的皮肤保护肽HW-P1在制备促创伤修复食品或药品中的应用。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

新型促皮肤创伤修复肽HW-P1分离纯化和鉴定

1、分离纯化

采自云南的虎纹蛙，用电刺激法取其皮肤分泌物（溶解于PBS），真空冷冻干燥，-80°保存备用。

第一步：将冻干后的分泌物重新溶解在超纯水中，然后在12000×g的速度，4°C下离心20分钟，收集上清液，然后用Amicon超滤器超滤，截留分子量为10 kDa（MerckMillipor，德国）。

第二步：高效液相色谱反相层析：

取第一步所得溶解于去离子水中的样品，上样到预先用超纯水（含0.1%的三氟乙酸）平衡好的Hypersil ODS2 5 mm柱子（伊利特产品，尺寸为4.6 mm ×300 mm），实验仪器为Waters 1525高压液相系统，在流速为1 ml/min的条件下，用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）在线性梯度（0-100% in 100 min）条件下进行洗脱，监测波长为220 nm，所得的分离纯化图谱如图1所示，箭头所指为促创伤修复活性肽HW-P1所在峰。

2、分子鉴定

氨基酸序列的测定：

纯化得到的新型促皮肤创伤修复肽HW-P1在全自动蛋白质序列测定仪（岛津PPSQ-31A）上经Edman 降解法，测定了新型促皮肤创伤修复肽HW-P1氨基酸全序列，结果表明新型促皮肤创伤修复肽HW-P1具有氨基酸序列QNSYADLWCQFHYMC。

实施例2

多肽HW-P1的HaCaT细胞划痕修复活性检测

用含10%的胎牛血清和1%双抗 （青霉素, 链霉素，100 U/mL） 的DMEM/F12（BI,Israel） 培养基在细胞培养瓶里培养人永生化角化上皮细胞 （HaCaT）。用 24 孔板做细胞划痕实验，在每孔中接种 2.5×10 ⁵个 HaCaT，培养时间约 12–24 h，待每孔的细胞长满，用黄色的 200μL枪头（Axygen, USA） 在每孔划痕，之后把每孔含有死细胞的培养基弃除，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗每孔两次，最后每孔加入 500μL含不同浓度样品（100 pM、1 nM、10 nM） 不含胎牛血清的空培养基。用显微镜（Zeiss, Germany）每隔 12h 拍照记录划痕愈合状况，连续记录 24 h。我们通过 Image J 软件（National Institutes of Health,Bethesda, MD,USA）计算无细胞区域的总的区域面积来评估细胞创伤愈合的百分比。结果如图2A-B所示: 多肽的促HaCaT划痕修复活性呈浓度和时间依赖性。

实施例3

多肽HW-P1的HaCaT细胞增殖活性检测

待细胞在培养瓶长满后，用胰酶将细胞消化下来，离心，弃上清，用空培养基将细胞吹打成细胞悬液，然后将细胞接种在 96 孔板（HaCaT：5000个/孔, 90 μL） 培养2-4 h，待细胞贴壁后，每孔再加入10μl不同浓度的样品（HaCaT ：100 pM、1 nM、10 nM,），空培养基加样品溶剂（生理盐水）作为空白对照, 培养24 h后，按照CellTiter 96® AQueous溶液细胞增殖检测试剂盒 （Promega,Madison, WI, USA）说明书使用说明进行检测。结果如图2C所示：多肽的促HaCaT细胞增殖活性呈浓度和时间依赖性。

实施例4

多肽HW-P1的HaCaT细胞迁移活性检测

采用24孔培养板和transwell 小室（8-微米孔；Corning，U.S.A.）测试HaCaT细胞的迁移。待细胞长满瓶底时消化细胞做成细胞密度为5×10⁵个/ml的单细胞悬液，悬浮在DMEM（无血清，浓度为2×10⁵／mL）的细胞被加到每个上室（100μL/孔）中。然后将含有不同浓度的样品（100 pM、1 nM、10 nM）的DMEM加入下室（600μL），在37℃孵育24小时。在小室的上表面，仔细地除去非迁移的细胞。用甲醇固定细胞20分钟，用0.1%结晶紫染色20分钟，洗脱染色细胞，酶标法测定吸收值，测定570nm处的OD值。结果如图2D-E所示：与空白对照（0 nM）相比，HW-P1（100 pM、1 nM、10 nM）在24小时显著增加了HACAT细胞迁移的数量，HW-P1以浓度依赖的方式促进细胞迁移。

实施例5

多肽HW-P1的促普通昆明小鼠创伤模型修复活性试验

选体重22~24g的SPF级雄性昆明小鼠进行实验，首先给小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠[剂量：1 µL/ g（体重）]麻醉小鼠，然后将小鼠背部毛剃除干净，并用75%的酒精消毒，最后在小鼠背部两侧打孔器凿出两个大小对称的孔,约直径为8 mm的圆孔。术后将小鼠放在加热器旁待其醒后放回饲养室继续正常饲养。每天两次上样，每孔每次给药约30 μL；分别涂抹康复新(KFX) 1 mg/mL和1 nM、10 nM、50 nM的所述多肽溶液以及生理盐水(Saline)。每隔2天拍照记录小鼠背部创伤情况，最后通过Image J 软件计算创伤修复率。

结果如图3所示：多肽的促创伤修复活性呈浓度和时间依赖性。创伤图片显示小鼠全皮层损伤模型随着时间的增长，创伤逐渐恢复，而50 nM组的恢复最好。数据显示：生理盐水组的创伤修复率明显低于康复新组或者多肽组；多肽处理组的创伤修复率显著高于生理盐水组（P<0.001），与阳性对照组相比，所述多肽也具有较强的修复活性。

实施例6

所述多肽的促糖尿病C57小鼠创伤模型修复活性试验

糖尿病创伤小鼠模型的构建，雄性C57BL/6（6-8周，19-23 g）高脂饲料喂养一个月，小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ，Sigma，USA）（30 mg/kg/天，）连续5天。使用血糖仪（瑞士巴塞尔罗氏）测定血糖，最后将空腹血糖水平≥11.1 mm的小鼠归类为糖尿病，然后用1%戊巴比妥钠麻醉并用电剪刀除去背毛，暴露背皮肤，用酒精消毒。在小鼠背部两侧用凿孔器凿出两个大小直径为8 mm的圆孔。用50 μL阴性对照（生理盐水）、不同浓度的HW-P1溶液和阳性对照康复新（KFX，10 mg/ml，美国蟑螂乙醇提取物，中国内蒙古精新药业有限公司）一天两次局部治疗小鼠伤口。每隔一天拍摄一张显示皮肤伤口愈合进程的图像，并用图像处理软件Image j软件计算愈合率。

结果如图4所示：多肽具有良好的糖尿病促创伤修复活性。创伤图片显示小鼠糖尿病促创模型随着时间的增长，创伤逐渐恢复，10 nM浓度下就能促糖尿病创伤修复。数据显示：生理盐水组的创伤修复率明显低于埃塞那肽组或者多肽组；多肽处理组的创伤修复率显著高于生理盐水组（P<0.001），与阳性对照组相比，所述多肽也具有较强的修复活性。

实施例7

所述多肽的促大鼠口腔溃疡修复活性检测

RL-RF10促进口腔溃疡愈合实验，用含30%戊巴比妥钠溶液（100μl/100 g）对SD大鼠（8-10周，180-200 g）进行腹腔注射麻醉，用15μL 50%乙酸浸泡圆形滤纸（直径6 mm），然后涂于下唇的牙龈上，60 s。导致均匀的圆形溃疡的形成。实验组在口腔溃疡形成后，每日两次，用50μL的HW-P1（1 nM、10 nM、50 nM）液体局部涂于溃疡上，阴性对照组用生理盐水，阳性对照组用KFX（10mg/ml）溶液。每隔一天拍摄口腔溃疡愈合进程的图像，用图像处理软件Image j软件计算愈合率。

结果如图5所示：多肽具有良好的糖尿病促创伤修复活性。创伤图片显示小鼠糖尿病促创模型随着时间的增长，创伤逐渐恢复，10 nM浓度下就能促糖尿病创伤修复。数据显示：生理盐水组的创伤修复率明显低于埃塞那肽组或者多肽组；多肽处理组的创伤修复率显著高于生理盐水组（P<0.001），与阳性对照组相比，所述多肽也具有较强的修复活性。

实施例8

所述多肽的促小鼠皮肤纤维化修复活性检测

皮肤纤维化模型的构建，雄性C57BL/6小鼠（6-8周，19-23 g），将博莱霉素（1 mg/ml，150 μL，中国辉瑞制药有限公司）或生理盐水每隔一天皮下注射到小鼠剃毛后的背部，注射六周。在第一次注射两周后，给小鼠注射每日剂量的HW-P1（1 nM、10 nM、50 nM），生理盐水持续4周。最后，处死小鼠，用苏木精伊红（H&E）和马松三色染色皮肤组织，分析组织学变化。利用图像J软件计算了蓝色染色面积与总染色面积之比，定量测定了Masson三色染色切片的胶原沉积量。

结果如图6所示：HE染色和马松三色染色显示HW-P1具有预防小鼠纤维化模型中组织过度增生和纤维化的活性。数据显示：加入多肽的预防组增生厚度和纤维化程度都明显低于造模组（P＜0.05）。

Claims (9)

1.一种皮肤保护肽HW-P1，其特征在于所述的皮肤保护肽HW-P1的氨基酸序列为QNSYADLWCQFHYMC。

2.一种权利要求1所述的皮肤保护肽HW-P1的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、用电刺激法取云南虎纹蛙的皮肤分泌物，溶解于PBS，真空冷冻干燥后得到物料a于-80℃保存备用；

B、将物料a溶解于水中得到物料b，物料b经离心后收集上清液得到物料c，物料c经超滤得到物料d；

C、将物料d溶解于水中得到物料e，将物料e进行高效液相色谱反相层析得到目标物皮肤保护肽HW-P1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的水为超纯水。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的离心是在转速10000~15000r/min下离心15~25min。

5.根据权利要求2或4所述的制备方法，其特征在于所述的离心的温度控制在3~5℃。

6.根据权利要求2或4所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的超滤是采用Amicon超滤器超滤，截留分子量为10 kDa。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述的水为去离子水。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的高效液相色谱反相层析是将物料e上样到预先用含0.1%三氟乙酸的超纯水平衡好的Hypersil ODS2 5 mm柱子，在流速为1ml/min的挑拣下，用乙腈在线性梯度条件下进行洗脱，检测波长为220nm。

9.一种权利要求1所述的皮肤保护肽HW-P1的应用，其特征在于所述的皮肤保护肽HW-P1在制备促创伤修复保健食品、化妆品或药品中的应用。