CN114874305B - 一种泽蛙来源促神经损伤修复活性多肽hw-p3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种泽蛙来源促神经损伤修复活性多肽HW‑P3及其应用。多肽HW‑P3的氨基酸序列为FLPAAICLVIKTC。其应用为在制备治疗或预防脑部神经损伤药物中的应用。本发明提供了一种来源于泽蛙皮肤的新的多肽HW‑P3，该多肽HW‑P3于体内和体外对都具有促进神经损伤修复的活性。且HW‑P3仅具有13个氨基酸，易合成，成本低，为神经损伤修复类药物的开发提供了新的途径，也为缺血性脑卒中治疗药物的开发提供了新的方向。

Description

一种泽蛙来源促神经损伤修复活性多肽HW-P3及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种泽蛙来源促神经损伤修复活性多肽HW-P3及其应用。
背景技术
缺血性脑卒中是由于大脑的供血动脉狭窄或闭塞、脑供血供氧不足导致的脑组织坏死的总称，约占全部脑卒中的70-80%。大脑缺血缺氧导致脑组织坏死、偏盲、失语、感觉障碍、意识障碍等。
缺血性脑卒中的高致残、高死亡率给世界和家庭造成了严重的负担，但有效的治疗方式及药物却非常有限。目前，重组组织纤溶酶原激活剂（rtPA）溶栓治疗是公认的脑卒中最有效的救治方式，但有严格的时间窗要求（4.5小时）。使用rtPA后可能会产生严重的过敏反应，并且溶栓后的再灌注会对脑组织及脑血管造成严重的二次损伤，炎症反应的加剧以及出血性转化（HT）的风险，增加致残率和死亡率。因此，开发新的治疗药物及手段迫在眉睫。
近年来，与小分子化合物相比，肽类药物具有来源天然，结构短，活性强，安全性高，与体内受体相对亲和力较高的优势，进而逐渐成为国内外研究的热点。本发明旨在提供一种从泽蛙皮肤中提取的在体内和体外均表现出促神经损伤神经修复活性肽。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种泽蛙来源促神经损伤修复活性多肽HW-P3，本发明的第二目的是提供所述活性多肽HW-P3的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，促神经损伤修复活性多肽HW-P3的氨基酸序列为FLPAAICLVIKTC，如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，所述促神经损伤修复活性多肽HW-P3的应用为在制备治疗脑部神经损伤药物以及脑部神经损伤后遗症药物中的应用。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种来源于泽蛙皮肤的新的多肽HW-P3，该多肽HW-P3于体内和体外对神经损伤的修复都具有促进作用，具有较优的神经保护活性。且HW-P3仅具有13个氨基酸，易合成，成本低，为神经损伤修复类药物的开发提供了新的途径，也为缺血性脑卒中治疗药物的开发提供了新的方向。
附图说明
图1为本发明多肽HW-P3的一级结构图；
图2为本发明多肽HW-P3在氧糖剥夺/复氧细胞模型中的神经保护活
性图；
图3为本发明多肽HW-P3的动物模型抗脑缺血再灌注损伤活性图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明提供了一种泽蛙来源促神经损伤修复活性多肽HW-P3，所述促神经损伤修复活性多肽HW-P3的氨基酸序列为FLPAAICLVIKTC。
本发明还提供了所述促神经损伤修复活性多肽HW-P3在制备治疗脑部神经损伤药物以及脑部神经损伤后遗症药物中的应用。
本发明进一步提供了一种药物组合物，包含作为活性剂所述促神经损伤修复活性多肽HW-P3及药学上有效的载体。
实施例1促神经损伤修复活性多肽HW-P3的筛选
第一步：样品来自泽蛙的皮肤。将成体泽蛙（来自中国云南省）饲养在一个 21 cm×21 cm ×15 cm的饲养缸中 7 天以适应环境，定期换水并以面包虫作为饲料喂食。再用去离子水冲洗泽蛙皮肤后，通过捣毁脑髓的方式快速处死并获取其皮肤。
第二步：泽蛙cDNA文库的构建：为筛选编码成熟HW-P3的cDNA，聚合酶链反应（PCR）模板来自以SMART技术合成的cDNA以及BGI公司（中国）合成的5'PCR引物（5'-CCAAA（G/C）ATGTTCACC（T/A）TGAAGAA-3'）和3'PCR引物（5'ATTCAGGCCGAGGCC GACA TG-3'）。获取的PCR产物被克隆到大肠杆菌DH5a活性细胞中，并使用Applied Biosystems DNA测序仪（美国加利福尼亚州福斯特市ABI 3730XL）进行DNA测序，结果如图1所示，cDNA的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，cDNA序列全长297bd(含有297个碱基)，编码60个氨基酸残基，成熟肽序列为“FLPAAICLVIKTC”（图1中碱基序列下划线部分）。通过检索，该肽是一种新肽，将其命名为HW-P3。
再采用常规化学合成或基因表达的方式制备得到多肽HW-P3。
实施例2多肽HW-P3促神经损伤修复活性检测
1、体外活性鉴定
实验方法：体外细胞氧糖剥夺/复氧实验
PC12细胞在含10%胎牛血清和1% 抗生素(100 U/mL 青霉素，100 U/mL链霉素)的DMEM/F12培养基中培养，温度为37℃，湿度为5% CO2。采用96孔板培养PC12细胞 (5000个/孔)。细胞贴壁后，阴性对照组细胞按照上述方式继续培养，除阴性对照组外的PC12细胞用PBS清洗两次后用无糖DMEM代替原培养基，并置于95%N2和5%CO2的环境中进行培养。4h后复氧，将氧糖剥夺/复氧模型构建后PC12细胞的无糖DMEM培养基替换为原完全培养基，置于37℃，5% CO2环境下继续培养24h。
细胞复氧后，模型组和给药组分别使用PBS以及不同浓度的HW-P3进行干预并继续培养24 h。按照制造商提供的说明，向各孔加入CellTiter 96® AQueous One SolutionAssay并测定其在490 nm处的吸光度值。以阴性对照组为100%对各组细胞的活力进行计算。
结果：如图2所示，多肽HW-P3能够减少氧糖剥夺造成的细胞死亡，说明多肽HW-P3在体外具有一定的促神经损伤修复活性。
2、体内活性鉴定
实验方法：大鼠脑缺血再灌注实验
SD大鼠随机分为假手术组、模型组、给药组（造模后给予不同浓度HW-P3干预）。采用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。在大鼠的颈内动脉内插入一根0.36mm的人工线栓，将其向前推进至遇到阻力(18-22mm)，以阻断大脑中动脉。2h后，轻轻取出线栓以构建再灌注并缝合伤口。HW-P3在缝合伤口后进行干预，假手术组大鼠采用相同的手术方法但不插入线栓。
为了评估大鼠脑损伤的程度，进行了脑梗死体积以及神经功能缺损的评估。
梗死体积的计算通过2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色进行。将各组大鼠过量麻醉后快速断头处死，小心将其大脑取出后在 -20℃ 冰箱中冷冻20min，之后将冷冻后的大脑沿冠状面切成2mm厚的六部分，去除嗅球和小脑。将其置于2% 的TTC溶液中避光水浴30分钟（37°C）。脑切片中的正常部分呈红色，梗死部分呈白色，使用Image J软件计算每个脑切片的全部区域及梗死区域，并将结果表示为（梗死体积/全脑体积）×100% 。大鼠的神经功能缺损评分在I/R术后72 h进行。改良的神经严重程度评分（mNSS）被使用以评估大鼠的神经损伤程度。
结果：由图3A和图3B可知，HW-P3能够明显减少脑缺血再灌注大鼠的脑梗死面积，图3C则显示HW-P3能够明显减轻神经功能缺损。
综上可知，本发明提供的神经保护肽HW-P3于体内体外均具有较强的促神经损伤修复活性，具有一定的临床应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学
<120> 一种泽蛙来源神经保护肽HW-P3及其应用
<130> 202205
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 神经保护肽HW-P3的氨基酸序列
<400> 1
Phe Leu Pro Ala Ala Ile Cys Leu Val Ile Lys Thr Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 297
<212> DNA
<213> cDNA的核苷酸序列
<400> 2
atgttcacca tgaagaaatc tctgttactc cttttcttcc ttgggaccat caatttatct 60
ctctgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gaagaaagaa gagatgatca agataaaatg 120
gatgttgaaa tggaaaaacg atttttgcca gcagctattt gtttagttat caaaacttgt 180
tgaaacttga attttaaatc atctgatgtg gaatatcatt tagctaaatg cacatcagat 240
gtcttataaa aaaataaaca tgttgcataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 297

Claims (4)

1.一种泽蛙来源促神经损伤修复活性多肽HW-P3，其特征在于，所述多肽HW-P3的氨基酸序列为FLPAAICLVIKTC。
2.权利要求1所述多肽HW-P3在制备治疗或预防脑部神经损伤药物中的应用。
3.权利要求1所述多肽HW-P3在制备治疗脑部神经损伤后遗症药物中的应用。
4.一种药物组合物，包含作为活性剂的权利要求1所述多肽HW-P3及药学上有效的载体。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3705140A (en) * 1967-10-05 1972-12-05 Luigi Bernardi Peptides related to the c-terminal sequence of cck-pz and caerulein
CN110563811A (zh) * 2019-09-25 2019-12-13 昆明医科大学 一种皮肤保护肽hw-p1及其制备方法与应用
CN110606869A (zh) * 2019-10-12 2019-12-24 昆明医科大学 一种促皮肤愈合肽oa-gp11及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

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