JP2018506506A - 神経変性障害 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の前記ペプチドのペプトイド誘導体は、ペプチドの構造の知識から容易に設計できる。レトロペプトイド(すべてのアミノ酸がペプトイド残基で逆順に置換されている)も本発明における適切な誘導体である。レトロペプトイドは、ペプチドまたは1つのペプトイド残基を含むペプトイド−ペプチドハイブリッドと比較して、リガンド結合溝において反対方向に結合することが期待される。その結果、ペプトイド残基の側鎖は元のペプチドの側鎖と同じ方向を向くことができる。
配列同一性=(N/T)*100に代入することを含む。
「%AChE放出」は、T30(配列番号156)またはAβ(配列番号158)から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたPC12細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼの、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたPC12細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼと比較した百分率であり、「%PC12細胞生存率」は、T30(配列番号156)またはAβ(配列番号158)から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたPC12細胞調製物の生存率の、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたPC12細胞調製物の生存率と比較した百分率である。
材料および方法
PC12細胞の培養
PC12細胞は、副腎髄質由来のクローニングされた褐色細胞腫細胞株である(Greene and Tischler,1976,Proc Natl Acad Sci U S A 73:2424−2428; Mizrachi et al., 1990, Proc Natl Acad Sci U S A 87:6161−6165)。クロム親和性細胞は神経堤に由来するが、接近可能な末梢器官(副腎髄質)の中心に位置するため、脳に‘窓’を提供すると記載されている(Bornstein et al., 2012, Mol Psychiatry 17:354−358)。これらの細胞は、神経変性の依然として未知の一次過程を研究するための強力ではあるが、新規なin vitroモデルであり、なぜこのプロジェクトに有用であるかの理由は以下のとおりである:アルツハイマー病患者の副腎髄質は、たとえば、数多くのレビー小体様封入体、神経原線維変化および対になった、らせん状フィラメントであるCNSに見られるものを連想させる様々な病理学的特徴ならびにアミロイド前駆体タンパク質(APP)の発現を示す(Takeda et al., 1994, Neurosci Lett 168:57−60)。さらに、AppleyardおよびMacdonaldらは、(1991, Lancet 338: 1085−1086)おそらく血漿中への分泌が増強されたため、AD患者で上昇している、ADの副腎からの可溶性(すなわち,放出可能な)形態のAChEのみを選択的に低減することを示した(Atack et al., 1985, J Neurol Sci 70: 1−12; Berson et al., 2008, Brain 131: 109−119)。
β−アミロイド(1−42)繊維は提供者(アブカム,英国ケンブリッジ))の記載に従って調製した。1mgのβ−アミロイド(1−42)を1mLの100% 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HPIP)に溶解させた。この溶液を室温で1hインキュベートした。次に、溶液を10分間、超音波そして次いで高速真空乾燥機(サーモフィッシャーサイエンティフィック,ラフバラ,英国)で乾燥させ、そして−80℃で保管した。実験には、サンプルは100%DMSOに溶解させ、2h室温でインキュベートし、繊維の形成を確実にした。
Cell Counting Kit−8(CCK−8)は従来使用されていたSRB法を改良して使用した。高水溶性のテトラゾリウム塩WST−8を利用することにより、CCK−8を電子キャリアの存在下で還元すると水溶性ホルマザン色素を生成する。WST−8は細胞内のデヒドロゲナーゼで還元され、細胞培地に可溶な黄色の生成物(ホルマザン)を与える。細胞内のデヒドロゲナーゼの活性で生成したホルマザン色素の量は生細胞数に正比例している。PC12細胞は96ウェルプレートの実験の前日に200μLの完全増殖培地中に播種した。T30もしくはAβ単独、またはNBP−14と共にもしくはより小さなペプチドが追加され、1時間インキュベータでインキュベートした。次いで、100μLの増殖培地を抜き取り、10μLのCCK−8を加えた。プレートは2時間インキュベータでインキュベートし、吸光プレートリーダーに入れた。吸光度は450nmで測定する必要がある。
AChE活性はAChE活性の結果であるチオール基の存在を測定するEllman試薬を用いて測定した。細胞は細胞活性アッセイ実験の前日に播種した。T30もしくはAβ(5μM)単独、またはNBP−14と共にもしくはより小さなペプチド(0.5μM)で処理した。処理後、各処理の上澄み(灌流液)を集め、25μLの各条件を新しい平底96ウェルプレートに添加し、次いで175μLのEllman試薬(A液:KH2PO4 139mMおよびK2HPO4 79.66mM、pH7.0;B液(基質):ヨウ化アセチルコリン 11.5mM;C液(試薬):5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)8mMとNaHCO3 15mM)を加えた。前記Ellman試薬は33(A):3(B):4(C)の比の3液の混合で調製した。吸光度測定は一定間隔(3,10,30および60分)で実験を通して405nmで測定した。
PC12細胞を実験の前日に96ウェルプレートの200μLの完全増殖培地中に播種する。実験当日に、Fluo−8溶液(アブカム)を(提供者のプロトコールに基づいて)調製する。次いで、100μLの増殖培地を取り除き、100μLのFluo−8溶液を加える。T30またはAβをNBP−14または小さいペプチドとを加えた共存下で処理し、30分間インキュベータ中で、そして30分室温でインキュベートする。
脳スライスの調製およびex vivo記録
冠状ラット脳スライスを(Badin et al.,2013)に記載された手順に従って調製したが、今回は前脳基底部を含んでいた(ブレグマ(Paxinos and Watson,1998)から+0.70および−0.26ミリメートル(mm))。次いで、以前に記載されたように(Badin et al.,2013,Neuropharmacology.73C:10−18)、電圧感受性色素を用いた光学イメージングを行った。
VSDIデータは4×4mmの2次元像で記録し、100×100ピクセルに相当する−各ピクセルは40×40マイクロメートル(μm)であり、そこから重要なデータを抽出した。VSDIデータは実験を通してまとめていないが、実際は別々の周期で15分の長さで記録した。刺激の間の刺激間間隔(ISI)は28秒で、したがって、すべての録画期間は32の連続する刺激から構成される。全32の刺激から構成される前記のデータは、その後、各実験条件につき1つのファイルに平均化され、MatLab用に特別に作られたVSDIデータ解析ツールボックス(Bourgeois et al., 2014, PLoS One. 9:e108686)を用いて解析した。要するに、このツールボックスは、すべてのスライスと実験条件にわたって同じROIからデータを抽出して合成するために、各スライスに適用可能な決まった関心領域(ROI)ジオメトリの選択を可能にしている。ROIは、内側中隔核(MS)、対角帯の垂直脚(VDB)および対角帯の水平脚(HDB)を包含するスライスの中隔領域の軟膜表面に沿って選択した。ROIから取得したVSDIデータは、次いで、単独の平均時系列でプロットした。(図11)しかしながら、VSDIデータを定量するために、曲線下面積を刺激時点(t=0)から280ms後まで計算した(蛍光のわずかな変化を合算した、図11〜22);この定量化方法は中間および長時間応答のすべての成分を考慮に入れている。GraphPad Prism 6(v6.05; GraphPad Software Inc.,CA,USA)を使用して、すべての統計的試験(別段の記載がない限り、一元配置分散分析(ANOVA))を実施した。すべての統計的試験では、p<0.05を有意と見なし、データは平均±標準誤差として表した。
MEM、培地血清、抗体、コラーゲン、Cell Counting Kit−8および緩衝液試薬はSigma−Aldrich(セントルイス,ミズーリ州)から提供された。T30、AChEペプチドおよび環状T14はジェノスフェア・バイオテクノロジーズ(フランス)によって合成された。アミロイドベータおよびFluo−8はアブカム(ケンブリッジ,英国)より提供された。小さなペプチドはルーチンのペプチド合成法で合成した。ペプチドのストックは蒸留水で希釈した。
それぞれの異なる技法において、統計解析は率の平均値または12以上の実験から行った。GraphPAD Instat(GraphPADソフトウェア、サンディエゴ、カルフォルニア)を用いて、一元配置分散分析(ANOVA)およびTukeyの事後検定により、複数の治療群と同じ対照間の比較を行った。これらのテストでは、すべての治療の手段を他のすべての治療の手段と比較する;すなわち,すべてのペアワイズ比較のセットに同時に適用し、2つの平均の差が許容すると予想される標準誤差よりも大きい場所を特定する。統計的有意性はP値<0.05で得られた。GraphPAD Prism 6(GraphPADソフトウェア、サンディエゴ、カルフォルニア)を用いてグラフをプロットした。
‘テイルド’アセチルコリンエステラーゼ(T−AChE)はシナプスで発現され、本発明者らは以前、2つのペプチドがそのC−末端より切断でき、1つは“T14”(14アミノ酸長)と称され、他方は“T30”(30アミノ酸長)として知られ、双方が強い配列相同性を有している。
前記実施例1で議論されたNBP14の驚くべき結果に基づいて、本発明者はNBP14の配列に基づいた直鎖状ペプチド(4〜14アミノ酸長)、各直鎖ペプチド配列はNBP14の配列に沿った任意のアミノ酸位置で開始または終了する、ペプチドのアレイを調製した。前記直鎖状ペプチドのアレイを、図4a〜4kにまたがった大きな表に示す(配列番号2〜155として特定)。
NBP−14から誘導された小さな直鎖状ペプチド(配列番号2〜155)について、前記毒性T30直鎖状ペプチド(配列番号156)および野生型アミロイドベータ(1−42)(Aβ)(配列番号158)に対する3つのin vitroの系、すなわち、(i)PC12細胞から放出されたAChE、(iii)PC12細胞の生存率および(iii)PC12細胞へのカルシウムの流入の3つの系で解析した。
1.AChE放出に対するPC12細胞生存率(有意な負の相関がある);
2.In silicoにおけるα7ニコチン性受容体のアロステリック部位への結合;
3.PC12細胞へのカルシウムの流入;および
4.ペプチドの大きさ。
はじめに、その相関のため、本発明者らは、T30および/またはAβに対する各直鎖状ペプチドの保護的なまたは毒性的な作用を示す“係数値(value coefficient(X)”を得るため、以下の式を用いてアッセイ(i)および(ii)を組み合わせた。本発明者らは係数値(X)を以下のように求めた:
係数値(X)=(%AChE放出)/(%細胞生存率)
ここで、「%AChE放出」は、T30(配列番号156)またはAβ(配列番号158)から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたPC12細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼの、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたPC12細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼ(すなわち、コントロール)と比較した百分率であり、
「%PC12細胞生存率」は、T30(配列番号156)またはAβ(配列番号158)から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたPC12細胞調製物の生存率の、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたPC12細胞調製物の生存率(すなわち、コントロール)と比較した百分率である。
本発明者らは、α7ニコチン性受容体のアロステリック部位に対するin silicoにおける理論的結合親和性を試験し、前記値についても表1および表2に示した。
本発明者らはさらに、細胞生存率および上記で議論した3番目のパラメータ(iii)すなわち、PC12細胞へのカルシウム流入との関係を調査した。しかしながら、図6bに示すように、非常に異なる時間スケールを有するこれらのパラメータは相関しておらず、0.026(n=10)の相関係数しか持たないことが分かった。本発明者らはまた、AChE活性とPC12細胞へのカルシウム流入との関係を調べた。しかしながら、これらのパラメータは、図6aに示すように、相関係数が0.21(n=10)しかなく、異なる時間スケールにわたるこのパラメータも相関していないことが分かった。
最後に、本発明者らは8アミノ酸より大きい(理論分子量が900Daより大きい)ペプチドは神経変性障害を治療する現実的で有力な候補化合物を提示しないと考えている。
よって、これらの大きなペプチドを除外した。したがって、活性なペプチドの総数はフィルタ3の12個から、続くフィルタ4によって8個にまで絞り込まれた。
このように、全4つのフィルタを考慮すると、T30に対する神経保護剤の候補の数は6つのペプチド(すなわち、NBP−601、603、613、705、708および804)であり、そして、Aβに対する薬剤の数は2つのペプチドのみ(すなわち、NBP−611および710)となった。表1および表2において、緑の値は保護的または活性なペプチドに相当し、赤は毒性または不活性なペプチドに相当することを示す。よって、フィルタの複合的な利用は、構造と同様に機構や機能によって、神経保護的な直鎖状ペプチドの単離を可能にする。このように、本発明者らはin vivoにおける効果を確信している。
本発明者らは、環状NBP−14由来の直鎖状ペプチドの小さなサブセットがT30毒性に対して驚くべき保護的な活性を示し、ペプチドの別のサブセットがAβに対して保護的であることを明らかに示した。Aβは、現在,アルツハイマー病のような神経変性障害を引き起こすためのより一般的に受け容れられている毒性の機構であることが理解されよう。したがって、ペプチドNBP−611および710の1つまたは複数が、神経変性障害の治療に特に有用である。
図5および図20には、α7ニコチン性受容体の標的部位の枠で示されたように、本発明の直鎖状ペプチドの様々な実施形態を作り出す前記ペプチドの理論的結合親和性を図示した。
環状NBP−14の選択された小さな直鎖状変異体を用いて、T30に対する用量依存性試験を行い、その結果を図8および図9に示した。これらの試験は、実施例7で議論された脳スライスで得られた結果を裏付けている。
図10は、内側中隔、垂直対角帯および水平対角線帯を含む基底前脳の位置を示す。VSDI実験の目的は、30Vの電気刺激を用いて基底前脳で誘発された応答を特徴づけること、およびこれらの応答が高濃度のT30(2μM;図11)の添加によってどのように最初に調節されるかを見ることであった。
Claims (24)
- アセチルコリンエステラーゼ(AChE)のC末端、その環化変異体、またはその短小化体由来の5〜8個のアミノ酸の配列を含み、またはこれからなり、1.0〜1.1の係数値xを有するペプチド、その誘導体または類似体:
この際、x=%AChE放出/%PC12細胞生存率であり、
「%AChE放出」は、T30(配列番号156)またはAβ(配列番号158)から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたPC12細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼの、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたPC12細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼと比較した百分率であり、
「%PC12細胞生存率」は、T30(配列番号156)またはAβ(配列番号158)から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたPC12細胞調製物の生存率の、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたPC12細胞調製物の生存率と比較した百分率である。 - 前記アセチルコリンエステラーゼが実質的に配列番号157で記載されたアミノ酸配列、またはその機能性変異体もしくは断片を含む、またはこれからなる、請求項1に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- アセチルコリンエステラーゼのC末端を形成する40個または30個のアミノ酸から誘導されるアミノ酸配列、またはその短小化体を含む、またはこれからなる、請求項1または2に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- α7ニコチン受容体のアロステリック部位に対して−7.0kcal・mol−1未満、または−7.1kcal・mol−1未満、または−7.8kcal・mol−1未満の理論的結合活性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- カルシウム流入値が120より小さいか、または97〜120の値を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 分子量が1000Daより小さいか、または900Daより小さい、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 5および8個のアミノ酸残基、または5および7個のアミノ酸、または6および8個のアミノ酸からなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 6個のアミノ酸からなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 実質的に配列番号30、32、40、または42に記載されたアミノ酸配列を含む、またはこれからなる、請求項8に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 7個のアミノ酸からなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 実質的に配列番号48、51、または54に記載されたアミノ酸配列を含む、またはこれからなる、請求項10に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 8個のアミノ酸からなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 実質的に配列番号61に記載されたアミノ酸配列を含む、またはこれからなる、請求項12に記載のペプチド、その誘導体または類似体。
- 実質的に配列番号30、32、40、42、48、51、53、または61に記載されたアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体または類似体。
- 治療に有効な量の1つまたは複数の請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド、誘導体または類似体と、任意の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
- 請求項15に記載の医薬組成物の製造方法であって、
治療に有効な量の1つまたは複数の請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド、誘導体または類似体と、薬学的に許容される賦形剤とを組み合わせることを含む、製造方法。 - 治療または診断に用いられる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
- 神経変性障害の治療、改善または予防に用いられる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
- 治療される前記神経変性障害が‘グローバル’ニューロン(‘Global’ neurons)の損傷または死によって特徴づけられる、請求項18に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
- 前記神経変性障害が、アルツハイマー病;パーキンソン病;ハンチントン病;運動ニューロン病;脊髄小脳変性症1型、2型、および3型;筋萎縮性側索硬化症(ALS);統合失調症;レビー小体型認知症;および前頭側頭型認知症からなる群から選択される、請求項18または19に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
- 治療される前記神経変性障害がアルツハイマー病;パーキンソン病;ハンチントン病;または運動ニューロン病である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
- 治療される前記神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項18〜21のいずれか1項に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
- 2以上のペプチドを、前記神経変性障害の治療に組み合わせて使用する、請求項18〜22のいずれか1項に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
- T30毒性に対して保護的な1つまたは複数のペプチドを、Aβ毒性に対して保護的な1つまたは複数のペプチドと組み合わせて使用する、請求項23に記載の1以上のペプチド、その誘導体または類似体。
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