CN110559339A

CN110559339A - 用于促进运动表现的益生菌制剂

Info

Publication number: CN110559339A
Application number: CN201910706552.7A
Authority: CN
Inventors: 吕淑伟; 杨志军; 郑宝华
Original assignee: Jiaxing Juetou Technology Co Ltd
Current assignee: Jiaxing Juetou Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-01
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2019-12-13

Abstract

本发明提供一种用于促进运动表现的益生菌制剂，属于微生物技术领域，包含通过如下制备方法制得：将五味子果实匀浆液加入含盐酸和高丝氨酸的乙醇溶液，混合均匀后超声波提取，浓缩，干燥，即得五味子提取物。益生菌制剂包含：至少一种乳杆菌属的益生菌；至少一种双歧杆菌属的益生菌；含有多酚和多糖的五味子提取物。本发明益生菌制剂对提高运动员的运动水平和运动能力、避免肠道运动紊乱、降低运动性疲劳、甚至提高成绩有积极作用，最终促进运动员的运动训练、表现和恢复；所用五味子提取物能够减轻长时间力竭运动对血睾酮的影响，增加机体内糖原储备，减轻血尿素氮的产生，提高血红蛋白含量，抑制肠道内致病菌的正常生长甚至死亡。

Description

用于促进运动表现的益生菌制剂

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及用于促进运动表现的益生菌制剂。

背景技术

肠道是人类消化食物和吸收营养的主要器官，是人类能量代谢调节和肠道微生物聚集的主要场所。肠道功能紊乱可能会引起肠道菌群失调、肠道屏障损伤、激素分泌失调和肠道免疫水平下降，将导致神经退行性疾病、肠道炎症等恶劣后果。运动员作为一类特殊人群，在训练、比赛期间进行高强度运动时，受到精神和生理上的双重压力，除可能发生骨骼与肌肉的意外伤害，引发胃肠道症状如恶心、痉挛、腹胀、腹泻、呕吐、绞痛和出血的风险也较正常人有所增加，上呼吸道感染也多有发生。因此，医护人员需格外注意，做好运动员日常保健与疾病预防工作。针对胃肠道和呼吸道症状，膳食保健是既方便又行之有效的辅助预防对策。益生菌制剂作为一种功能性保健食品，对专业运动员提高免疫力、快速恢复体力、缓解疲劳、甚至提高成绩有积极作用。益生菌可以是驻留也可以是瞬时的。驻留益生菌株在每个人的消化道内生活和繁殖。瞬时益生菌株通常通过摄取的食物或饮食补充剂引入体内。然而，理想的是为运动员定制益生菌制剂以帮助促进运动训练、表现和恢复。申请号为201780034682.X的专利提供了一种用于促进运动表现的益生菌制剂，其包含一种或多种细菌、菌株或菌种，所述细菌、菌株或菌种来自韦荣氏球菌属、粪杆菌属、考拉杆菌属、颤螺旋菌属、瘤胃球菌属、拟杆菌属、布劳特氏菌属、克里斯滕森菌科、小类杆菌属或蓝菌门。申请号为201680072126.7的专利提供具有改善的味道和口感的益生菌制剂，包含至少一种微生物有机体的营养组合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对提高运动员的运动水平和运动能力、避免肠道运动紊乱、降低运动性疲劳、甚至提高成绩有积极作用，最终促进运动员的运动训练、表现和恢复的用于促进运动表现的益生菌制剂，所用五味子提取物中多酚、多糖和花色苷的含量较高，能够减轻长时间力竭运动对血睾酮的影响，增加机体内糖原储备，减轻血尿素氮的产生，提高血红蛋白含量，抑制肠道内致病菌的正常生长甚至死亡。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含通过如下制备方法制得的五味子提取物：

将五味子果实匀浆液加入含盐酸和高丝氨酸的乙醇溶液，混合均匀后超声波提取，浓缩，干燥，即得五味子提取物。

五味子提取物中的部分多酚类物质易收到pH值、温度、光照、氧化还原、金属离子、酸类物质、亚硫酸盐及酶类物质的影响，发生降解和褐变。制备过程用乙醇溶液中盐酸和高丝氨酸的存在一方面能够为制备方法提供酸性环境，增强多酚类物质的稳定性，进而提高五味子提取物中多酚的含量，另一反面能够使得乙醇溶液的极性与多酚和多糖相近，提高多酚和多糖在提取液中达到饱和状态时的量，溶出更多的多酚和多糖，此外，高丝氨酸残留在提取物中，在益生菌制剂使用过程中能够和五味子提取物发挥意料不到的作用，不仅能清除体内过量生成的自由基对机体细胞的损伤，激活抗老化酶的活性，降低脂质过氧化物的浓度，抑制脂褐素在组织细胞中的堆积，对腺体结构有很好的保护作用，使睾丸能够正常分泌睾酮，而且还能增强下丘脑-垂体-性腺轴系统功能，促进睾酮分泌。此外，睾酮水平的提高能够增强糖原合成和糖异生作用，且五味子提取所含有的多糖成分作为外源性糖分，可以补充或延缓运动对内源性糖的消耗，有利于机体内糖原储备的提高。总之，获得的五味子提取物能够减轻长时间力竭运动对血睾酮的影响，使得睾酮至少维持在正常生理水平，增加机体内糖原储备，减少糖损耗，进而提高运动员抗疲劳能力，最终提高运动员的运动能力，促进运动表现。

优选地，乙醇溶液含0.04-0.06‰盐酸和0.01-0.05‰高丝氨酸。

更优选地，五味子提取物通过如下制备方法制得：

将五味子果实匀浆液按照液料比为1:5-10加入含盐酸和高丝氨酸的60-70％乙醇溶液，混合均匀后在50-60℃、20-50W下超声波提取10-60min，浓缩，干燥，即得五味子提取物。

优选地，五味子提取物中多酚含量≥2.4mg/g、多糖含量≥10.0mg/g。

更为优选，五味子提取物中多酚含有6-9％的花色苷。

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含：

1)至少一种乳杆菌属的益生菌；

2)至少一种双歧杆菌属的益生菌；以及，

3)含有多酚和多糖的五味子提取物。

本发明用五味子提取物一方面可以增加体内糖元储备量，在大负荷运动过程中调整糖、脂肪和蛋白质的供能比例，增大糖供能的比例，减轻运动过程中机体对蛋白质的利用程度，减少血尿素氮的产生，提高运动员的运动水平；另一方面能有效地清除运动产生的过量自由基，避免了过剩自由基对红细胞膜的损伤，维持红细胞膜正常结构，使机体内血红蛋白氧化分解损失减少，提高血红蛋白含量，可提高机体的运动能力；此外，本发明用五味子提取物还能促进益生菌的生长增殖可并提高菌体总量，然后促进益生菌产生更多的乳酸和短链脂肪酸，形成酸性环境，抑制致病菌的正常生长，产生更多的胞外多糖粘附致病菌，同时产生抑菌蛋白导致致病菌死亡。总之，本发明益生菌制剂对提高运动员的运动水平和运动能力、避免肠道运动紊乱、降低运动性疲劳、甚至提高成绩有积极作用，最终促进运动员的运动训练、表现和恢复。

优选地，乳杆菌属的益生菌选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、路氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌或约氏乳杆菌。

优选地，双歧杆菌属的益生菌选自乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌或动物双歧杆菌。

更优选地，益生菌制剂，其特征在于：包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌12-17份；嗜酸乳杆菌25-50份；长双歧杆菌18-30份；含有多酚和多糖的五味子提取物5-25份。

优选地，益生菌制剂还含有益生元、氨基酸、维生素或矿物质。更优选的，益生菌制剂还含有抗菌肽，其全序列为：KFRKLMKRVRAAKEFKRN，SEQ ID NO:1，分子量为2307Da，等电点为12.43。该抗菌肽的抗菌谱广、杀菌作用强、对益生菌无杀菌作用，还能与五味子提取物发挥增益作用，协同提高血红蛋白含量。

优选地，益生菌制剂在训练和运动期间提高训练耐力或表现耐力。对运动员施用有效量的本发明益生菌制剂，能提高运动员的运动水平和运动能力、避免肠道运动紊乱、降低运动性疲劳，促进运动员的运动训练、表现和恢复。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明益生菌制剂用五味子提取物中多酚、多糖和花色苷的含量较高，能够减轻长时间力竭运动对血睾酮的影响，使得睾酮至少维持在正常生理水平，增加机体内糖原储备，减少糖损耗，提高运动员抗疲劳能力，最终提高运动员的运动能力，促进运动表现；本发明益生菌制剂用五味子提取物还可以增加大鼠体内糖元储备量，减轻运动过程中机体对蛋白质的利用程度和血尿素氮的产生，提高血红蛋白含量，同时还能促进益生菌的生长增殖可并提高菌体总量，产生更多的乳酸、短链脂肪酸、胞外多糖和抑菌蛋白，抑制致病菌的正常生长并使致病菌死亡；本发明益生菌制剂对提高运动员的运动水平和运动能力、避免肠道运动紊乱、降低运动性疲劳、甚至提高成绩有积极作用，最终促进运动员的运动训练、表现和恢复。

本发明采用了上述技术方案提供用于促进运动表现的益生菌制剂，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1为本发明实施例9中抗菌肽的质谱；

图2为本发明试验例1中五味子提取物中多酚和多糖含量测定结果；

图3为本发明试验例1中多酚中花色苷的含量测定；

图4为本发明试验例2中五味子提取物对血清睾酮水平的影响结果；

图5为本发明试验例2中五味子提取物对肝、肌糖原储量的影响结果；

图6为本发明试验例2中五味子提取物对血尿素氮和血红蛋白水平的影响结果；

图7为本发明试验例3中益生菌的生长曲线；

图8为本发明试验例3中益生菌代谢产物-短链脂肪酸的测定结果；

图9为本发明试验例3中葡萄糖标准曲线；

图10为本发明试验例3中益生菌代谢产物-胞外多糖的测定结果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

除非另外说明，本发明中所公开的试验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌12份；嗜酸乳杆菌25份；长双歧杆菌18份；含有多酚和多糖的五味子提取物5份。

上述五味子提取物通过如下制备方法制得：

将五味子果实匀浆液按照液料比为1:5加入含0.04‰盐酸和0.01‰高丝氨酸的60％乙醇溶液，混合均匀后在50℃、20W下超声波提取10min，浓缩，干燥，即得五味子提取物。

实施例2：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌17份；嗜酸乳杆菌50份；长双歧杆菌30份；含有多酚和多糖的五味子提取物25份。

上述五味子提取物通过如下制备方法制得：

将五味子果实匀浆液按照液料比为1:10加入含0.06‰盐酸和0.05‰高丝氨酸的70％乙醇溶液，混合均匀后在60℃、50W下超声波提取60min，浓缩，干燥，即得五味子提取物。

实施例3：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌14份；嗜酸乳杆菌38份；长双歧杆菌24份；含有多酚和多糖的五味子提取物16份。

上述五味子提取物通过如下制备方法制得：

将五味子果实匀浆液按照液料比为1:8加入含0.05‰盐酸和0.02‰高丝氨酸的65％乙醇溶液，混合均匀后在55℃、50W下超声波提取30min，浓缩，干燥，即得五味子提取物。

实施例4：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌14份；嗜酸乳杆菌38份；乳酸双歧杆菌24份；实施例3所得的五味子提取物16份。

实施例5：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌14份；嗜酸乳杆菌38份；长双歧杆菌24份；实施例3所得的五味子提取物16份。

实施例6：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：植物乳杆菌14份；嗜酸乳杆菌38份；长双歧杆菌24份；实施例3所得的五味子提取物16份。

实施例7：

实施例8：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：嗜酸乳杆菌52份；长双歧杆菌24份；实施例3所得的五味子提取物16份。

实施例9：

用于促进运动表现的益生菌制剂，包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌14份；嗜酸乳杆菌38份；长双歧杆菌24份；实施例3所得的五味子提取物16份；抗菌肽0.5份。该抗菌肽的为人工设计合成的活性多肽，以C-BF为模板，通过分子设计对其进行改良，改良方式包括，替换模板肽氨基酸、改变肽链长度、改变分子疏水性以及增加芳香族氨基酸比例等，通过化学合成方式合成改良肽，该抗菌肽包含18个氨基酸残基，其全序列为：KFRKLMKRVRAAKEFKRN，其质谱图如图1所示，分子量为2306.82Da。该抗菌肽的抗菌谱广、杀菌作用强、对益生菌无杀菌作用，还能与五味子提取物发挥增益作用，协同提高血红蛋白含量。

对比例1：

与实施例3相比，本对比例的不同之处为：乙醇溶液中不含盐酸。

对比例2：

与实施例3相比，本对比例的不同之处为：乙醇溶液中不含高丝氨酸。

对比例3：

与实施例3相比，本对比例的不同之处为：乙醇溶液中不含盐酸和高丝氨酸。

对比例4：

与实施例3相比，本对比例的不同之处为：益生菌制剂中不含五味子提取物。

试验例1：

1.五味子提取物中多酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸为标准品。称取0.1108g没食子酸用水溶解后定容于100mL容量瓶中摇匀，再用移液管分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别于100mL的容量瓶中用水定容至刻度，摇匀，浓度分别为11.08、22.16、33.24、44.32、55.40μg/mL。分别移取上述不同浓度溶液、蒸馏水和五味子提取物测试液各1.0mL到10mL的比色管中，在每个比色管加入5.0mL的10％福林酚试剂，摇匀。反应3-8min内，加入4.0m L7.5％NaCO₃摇匀。室温下放置60min，在765nm波长条件下用分光光度计测其吸光度值(A)。以吸光度为纵坐标，没食子酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得标准曲线线性回归方程，将样品吸光度值代入该方程，计算样品多酚含量。每个试验做两组，每个样品做三个平行，五味子提取物中多酚含量计算公式如下：

多酚含量(mg/g)＝(C×V)/m；

其中，C-根据标准曲线计算出的样品多酚浓度(mg/mL)；

V-五味子提取物测试液的总体积(mL)；

m-五味子提取物质量(g)。

2.五味子提取物中多糖含量测定

采用苯酚硫酸法，称取0.1g葡萄糖，用dH₂O溶解，定容至10mL，得10mg/mL的葡萄糖储备液。取葡萄糖储备液200μL，加入9.8mL dH₂O，稀释得200μg/mL葡萄糖工作液。分别取100μL、200μL、400μL、800μL、1600μL葡萄糖工作液于15mL玻璃试管中，再分别加水至2mL，再依次加入1mL 5％苯酚溶液、5mL浓硫酸，混匀，沸水浴加热15min，紫外分光光度计490nm下测定吸光度值(A)。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出葡萄糖吸光度浓度标准曲线，求得标准曲线线性回归方程，将五味子提取物测试液的吸光度值代入该方程，计算五味子提取物中多糖含量。五味子提取物中多糖含量计算公式如下：

多糖含量(mg/g)＝(C×V)/m；

其中，C-根据标准曲线计算出的样品葡萄糖浓度(mg/mL)；

V-五味子提取物测试液的总体积(mL)；

m-五味子提取物质量(g)。

图2为实施例1-3、对比例1-3所得五味子提取物中多酚和多糖的含量测定结果，从图2中可以看出，实施例1-3所得五味子提取物中多酚和多糖的含量明显高于对比例1-3，这说明，制备过程用乙醇溶液中盐酸和高丝氨酸的存在能够提高多酚和多糖在提取液中达到饱和状态时的量，溶出更多的多酚和多糖。

3.多酚中花色苷的含量测定

花色苷含量的测定pH示差法。取1.0mL五味子提取物待测液，分别用pH 1.0和pH4.5的缓冲液定容到10mL，室温下放置15min，以蒸馏水为对照，用分光光度计在510nm和700nm波长下测定吸光度值(A)，计算花色苷含量，然后进行换算，得到多酚中花色苷的含量。五味子提取物中花色苷含量计算公式如下：

A＝(A₅₁₀-A₇₀₀)_{pH 1.0}-(A₅₁₀-A₇₀₀)_{pH 4.5}

花色苷含量(W/W)＝(A×M_W×D_F×V)/(ε×L×M_t)×100％

其中，ε-矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数26900；

M_W-矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子质量449.2；

D_F-稀释倍数；

V-五味子提取物测试液的总体积(mL)；

M_t-五味子提取物质量(g)；

L-光路路径长度(1cm)。

图3为实施例1-3、对比例1-3所得五味子提取物中多酚中花色苷的含量测定结果，从图2中可以看出，实施例1-3多酚中花色苷的含量为6.0-9.0％，明显高于对比例1-3，这说明，制备过程用乙醇溶液中盐酸和高丝氨酸的存在能够增强多酚类物质的稳定性，溶出更多的花色苷。

试验例2：

五味子提取物对运动训练大鼠睾酮含量、物质代谢的影响

1.动物分组

试验大鼠适应性饲养4d后，以20min/d的运动量对其进行为期3d的筛选，淘汰个别不适应游泳训练者，将剩余大鼠以数字随机分组法分为6组：静止对照组(0组)、运动对照组(1组)、运动+实施例2五味子提取物(2组)，运动+对比例1五味子提取物(3组)，运动+对比例2五味子提取物(4组)，运动+对比例3五味子提取物(5组)，运动+实施例9五味子提取物(6组)，每组15只。2-5组每天自由摄食饮水，每天灌胃给药1次，每次剂量为2g/kg/d。0-1组灌胃等量生理盐水。

2.训练及测试方案

0组不进行任何运动。其他组进行负重游泳运动，均采用100cm×50cm×60cm的玻璃泳槽作为大鼠游泳训练装置，水深50cm，水温(31±2)℃，为防止大鼠在水面漂浮不动，特在游泳箱底部放置水泵形成流动水。训练42d，第1周不负重，第2周负2％体重，第3周负4％体重，第4～6周负5％体重，每次游泳训练至力竭。大鼠开始游泳至力竭所用时间为力竭运动能力。力竭标准以大鼠下沉后10s不露出水面为度。处死前的最后1次为无负重力竭游泳训练，记录力竭时的游泳时间。

3.指标测定

各组在末次训练24h后称重，乙醚适度麻醉，从颈总动脉处取20μL全血测定血红蛋白含量，取0.5mL全血测定尿素氮含量，取2～3mL全血测定血清睾酮和血清皮质醇含量。加入柠檬酸钠溶液抗凝，37℃水浴中30min后，4℃3000r/min离心10min，分离制备血清，用于并迅速取肝脏、双侧睾丸和深层股四头肌，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污，再用滤纸吸干后置于-20℃冰箱保存备用。组织匀浆制备：精确称取100mg肝脏组织、500mg肌肉组织，按W(g)组织块质量/V(mL)匀浆介质为1/9的比例加取预冷的匀浆介质(0.9％的NaCl溶液)于烧杯中，迅速剪碎组织块(以上全部操作在冰水浴中进行)。匀浆经3000r/min低温离心15min，分离提取上清液，在4℃冰箱冷藏即用或-20℃冰箱冰冻备用。血清睾酮、血清皮质酮、促黄体生成素和促卵泡刺激素采用放射免疫分析法测定。肝糖原、肌糖原采用化学比色法测定。血清尿素采用UV-GLDH法测定。血红蛋白采用高铁氰化钾氧法测定，蛋白质定量采用双缩脲法。以上各指标的测定严格按照试剂盒说明书进行，计算公式等详见试剂盒使用说明书。

五味子提取物对血清睾酮水平的影响结果如图4所示，可以看出，1-5组的血清睾酮水平低于0组，而2组的血清睾酮水平高于3-5组，而1组和3-5组无显著差异，亦即本发明五味子提取物能清除体内过量生成的自由基对机体细胞的损伤，激活抗老化酶的活性，降低脂质过氧化物的浓度，抑制脂褐素在组织细胞中的堆积，对腺体结构有很好的保护作用，使睾丸能够正常分泌睾酮，而且还能增强下丘脑-垂体-性腺轴系统功能，促进睾酮分泌，进而提高大鼠运动训练时的血清睾酮水平，对比例1-3五味子提取物对大鼠运动训练时的血清睾酮水平无影响。

五味子提取物对肝、肌糖原储量的影响结果如图5所示，可以看出，1-5组的肝、肌糖原储量低于0组，而2组的肝、肌糖原储量高于3-5组，而1组和3-5组无显著差异，睾酮水平的提高能够增强糖原合成和糖异生作用，且本发明用五味子提取所含有的多糖成分作为外源性糖分，可以补充或延缓运动对内源性糖的消耗，有利于大鼠运动训练时的肝、肌糖原储量，对比例1-3五味子提取物对大鼠运动训练时的肝、肌糖原储量无影响。

五味子提取物对血尿素氮和血红蛋白水平的影响如图6所示，可以看出，1-6组的血尿素氮水平高于0组，而2组的血尿素氮水平低于3-5组，且2组的血尿素氮水平和6组相当，这说明本发明五味子提取物可以增加大鼠体内糖元储备量，在大负荷运动过程中调整糖、脂肪和蛋白质的供能比例，增大糖供能的比例，减轻运动过程中机体对蛋白质的利用程度，减少血尿素氮的产生，提高运动员的运动水平，且抗菌肽对五味子的该作用无影响。1-6组的血红蛋白水平低于0组，而2组的血红蛋白水平高于3-5组，且2组的血红蛋白水平低于6组，这说明本发明五味子提取物能有效地清除运动产生的过量自由基，避免了过剩自由基对红细胞膜的损伤，维持红细胞膜正常结构，使大鼠机体内血红蛋白氧化分解损失减少，提高血红蛋白含量，可提高机体的运动能力，且抗菌肽能与五味子提取物发挥增益作用，协同提高血红蛋白含量。

试验例3：

五味子提取物对益生菌的影响

1.益生菌生长曲线的测定

益生菌生长曲线的测定采用比色管浊度法

将实施例3、对比例1-4益生菌制剂分别接种到装有MRS液体培养基的厌氧瓶中，置于37℃隔水式细菌培养箱中静置活化24-48h。将活化后的益生菌制剂分别按5％的接种量转接至MRS液体培养基中，于37℃隔水式细菌培养箱中静置培养36h，期间每2h取样，测发酵液OD_600nm值，分别绘制生长曲线。结果如图7所示，可以看出，接种后的4h内，益生菌的生长比较缓慢，4-12h内，益生菌的生长比较快，实施例3益生菌的生长速度和菌体总量均高于对比例1-4，这说明本发明用五味子提取物能促进益生菌的生长增殖可并提高菌体总量。

2.益生菌代谢产物-短链脂肪酸的测定

短链脂肪酸的测定采用高效液相色谱检测法

将培养好的发酵液8000rpm离心弃菌体，收集上清液，过0.22μm滤膜，4℃保存备用。混合酸标样为乳酸、甲酸、乙酸、草酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸的混合物。高效液相色谱检测条件：色谱柱为BIO-RAD色谱柱，流动相为0.008N H₂SO₄，流速为0.6mL/min，进样量20μm。结果如图8所示，可以看出，实施例3益生菌的生长速度和菌体总量均高于对比例1-4，这说明本发明用五味子提取物能促进益生菌产生更多的乳酸和短链脂肪酸，形成酸性环境，抑制致病菌的正常生长。

3.益生菌代谢产物-胞外多糖的测定

益生菌胞外多糖的测定采用苯酚-硫酸法

绘制标准曲线：称取葡萄糖化1g于1000mL容量瓶中，加水补足至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8mL，补足至2.0mL，加入1.0mL 6％苯酚及5.0mL浓硫酸，摇匀冷却至室温放置30mm后，于490nm波长处测定吸光度值。空白对照为2.0mL蒸馏水按同样显色操作，葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。如图9所示。

益生菌胞外多糖的提取及测定：取培养至对数期的发酵液各10mL，100℃水浴作用10min，室温放置冷却，加入80％的三氯乙酸至终浓度为5％，4℃静置过夜，除去蛋白；然后10000rpm离必15min，收集上清液于透析袋中，双蒸水透析至无色，收集透析袋内液体，定容至10mL，作为样品液。移取0.2mL的样品液，采用上述苯酚-硫酸法进行益生菌胞外多糖的测定。葡萄糖(mg/L)标准曲线计算益生菌胞外多糖含量。

益生菌胞外多糖量的变化曲线：将活化后的实施例3、对比例1-4益生菌制剂分别按5％的接种量转接至MRS液体培养基中，于37℃隔水式细菌培养箱中静置培养36h，期间每2h取样10mL，按益生菌胞外多糖的提取和测定步骤对益生菌胞外多糖产量进行试验。结果如图10所示，可以看出，实施例3益生菌胞外多糖量高于对比例1-4，这说明本发明用五味子提取物能促进益生菌产生更多的胞外多糖，然后胞外多糖粘附致病菌，抑制致病菌的正常生长。

4.益生菌代谢产物-细菌素的测定

益生菌代谢产物-细菌素的测定采用牛津杯法测定

细菌素产量的多少可由对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈大小进行表示。通过设置不同处理组，比较代谢产物经不同处理后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果的变化，用于验证细菌素的存在。

空白组：将培养好的发酵液8000rpm离心弃菌体，收集上清液，过0.22μm滤膜，4℃保存备用。

蛋白酶K组：将培养好的发酵液8000rpm离心弃菌体，收集上清液，过0.22μm滤膜，向滤液中加入蛋白酶K，使蛋白酶K最终浓度为200μg/mL，37℃恒温水浴反应1.5h，4℃保存备用。细菌素的产量表示为对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小，细菌素对致病菌的抑菌圈大小记为δ，即发酵液未经处理组的抑菌圈大小与蛋白酶K处理组的抑菌圈大小之差。结果如表1所示，实施例3所得细菌素对致病菌的抑菌圈大于对比例1-4，这说明本发明用五味子提取物能促进益生菌产生更多的细菌素，亦即本发明用五味子提取物能促进益生菌产生抑菌蛋白导致致病菌死亡。

表1细菌素对致病菌的抑菌圈δ

组别	大肠杆菌(mm)	金黄色葡萄球菌(mm)
			实施例3	2.94	3.01
对比例1	1.54	1.59
			对比例2	1.79	1.68
对比例3	1.46	1.42
			对比例4	0.86	1.13

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 嘉兴市爵拓科技有限公司

<120> 用于促进运动表现的益生菌制剂

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Phe Arg Lys Leu Met Lys Arg Val Arg Ala Ala Lys Glu Phe Lys

1 5 10 15

Arg Asn

Claims

1.用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：包含通过如下制备方法制得的五味子提取物：

2.根据权利要求1所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述乙醇溶液含0.04-0.06‰盐酸和0.01-0.05‰高丝氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述五味子提取物中多酚含量≥2.4mg/g、多糖含量≥10.0mg/g。

4.根据权利要求3所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述五味子提取物中多酚含有6-9％的花色苷。

5.用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：包含：

1)至少一种乳杆菌属的益生菌；

2)至少一种双歧杆菌属的益生菌；以及，

3)含有权利要求1-4任一项所述的五味子提取物。

6.根据权利要求5所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述乳杆菌属的益生菌选自鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、路氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌或约氏乳杆菌。

7.根据权利要求5所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述双歧杆菌属的益生菌选自乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌或动物双歧杆菌。

8.根据权利要求5或6或7所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述益生菌制剂，其特征在于：包含如下成分及其重量份：鼠李糖乳杆菌12-17份；嗜酸乳杆菌25-50份；长双歧杆菌18-30份；含有多酚和多糖的五味子提取物5-25份。

9.根据权利要求5所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述益生菌制剂还含有益生元、氨基酸、维生素或矿物质。

10.根据权利要求5所述的用于促进运动表现的益生菌制剂，其特征在于：所述益生菌制剂在训练和运动期间提高训练耐力或表现耐力。