CN110540942A - 耐冷荣氏毛霉及其在青腐乳生产应用 - Google Patents

耐冷荣氏毛霉及其在青腐乳生产应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开耐冷荣氏毛霉及其在青腐乳生产中的应用，属于生物技术领域。本发明的荣氏毛霉(Mucor rongensis)分离自腐乳生产车间，是一种新的毛霉物种，菌株原始编号为CICC 41726，菌种保藏编号为CGMCC No.17468。本发明提供了一套青腐乳生产菌种及工艺，利用该方法生产的青腐乳，风味独特、口感醇厚。

Description

耐冷荣氏毛霉及其在青腐乳生产应用
技术领域
本发明涉及一株耐冷荣氏毛霉及其在青腐乳生产中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
腐乳又称豆腐乳，是中国流传数千年的特色传统民间美食，因其口感好、营养高，深受消费者的喜爱，在国际上享有“中国奶酪”之称。根据发酵方法的不同，腐乳可分为四种类型：霉菌发酵腐乳、自然发酵腐乳、细菌发酵腐乳、酶法成熟腐乳。根据产品色泽不同通常分为白方、红方、青方、酱方四大类：其中“白方”为后发酵时不加红曲色素，呈淡黄色；“红方”为腐乳坯加红曲色素，产品呈红色；“青方”又名青腐乳，其在后发酵过程中以低度盐水为汤料酿制而成，呈豆青色；“酱方”为后发酵过程以豆酱、面酱为辅料进行酿制，呈酱褐色。
目前，腐乳主要以前发酵接种纯种微生物方式进行制坯生产，而后发酵过程属于自然发酵。根据已有文献报道，常用的腐乳前发酵制坯生产微生物包括毛霉型微生物、根霉型微生物、细菌型微生物，其中毛霉型微生物主要有总状毛霉(Mucor racemosus)、雅致放射毛霉(Actinomrcor elegans)卷枝毛霉原变型(Mucor circinelloidesf.circinelloides)、黄色毛霉(Mucor flavus)、印度毛霉(Mucor indicus)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)、高大毛霉(Mucor mucedo)；根霉型微生物主要有小孢根霉华变种(Rhizopus microspores var.chinensis)、小孢根霉少孢变种(Rhizopus microsporusvar.oligosporus)、米根霉(Rhizopus oryzae)；细菌型微生物主要有藤黄微球菌(Micrococcus luteus)。
目前腐乳生产过程存在的主要问题包括：(1)前期制坯阶段容易发生细菌污染导致豆腐白坯酸化腐败；(2)大部分腐乳生产菌株产生酸性蛋白酶，导致生产的腐乳产生酪氨酸结晶的白点；(3)白腐乳产品褐变问题；(4)目前腐乳生产为自然发酵工艺，存在发酵产品风味及品质不稳定的问题。
发明内容
本发明提供了一种耐冷荣氏毛霉及其青腐乳生产的应用，为结合毛霉型微生物和细菌型微生物为一体的发酵体系。前期制坯阶段采用耐冷荣氏毛霉低温发酵，抑制杂菌微生物生长；后期添加两种细菌型微生物提升产品风味；该工艺可实现纯菌种人工控制腐乳发酵生产，可以解决自然发酵产品风味及品质不稳定的问题；该工艺生产的青腐乳风味独特，无明显臭味，口感绵柔醇厚。
本发明是通过以下技术方案实现的：
(1)耐冷荣氏毛霉菌株的采集与保藏：本发明提供的耐冷荣氏毛霉(Mucorrongensis)菌株是通过传统的平板分离培养方法，从腐乳生产车间分离得到的，菌株原始编号为CICC 41726，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17468，该生物材料已于2019年4月15日由保藏中心收到，并登记入册。
(2)毛霉菌株的鉴定特征：本发明的耐冷荣氏毛霉菌株CGMCC No.
17468是通过形态学特征和核酸序列系统发育分析来准确确定其分类学地位的。菌株形态学特征为：PDA培养基上，20℃培养5天,，菌落直径46～48mm，菌落浅黄色，质地丝绒状，菌丝疏松直立，反面浅黄色，无渗出液产生，无可溶性色素产生。孢囊梗壁平滑、透明，主要发生于基质，大于4000μm，偶有分支，近囊轴部位变窄；孢子囊近球形，直径40～80μm；孢子囊老后，囊轴具明显囊领；囊轴近球形至烧瓶形，长轴直径为35～70μm；孢囊孢子浅褐色、壁光滑，椭圆形、滴状、柱状或不规则形状,长轴直径5.5～17μm；未观察到假根；未见厚垣孢子；菌株的生长温度范围为3℃～28℃；生长pH范围为4～11；菌株分子生物学特征为：ITS rDNA序列NCBI登录号为MK903013。
(3)耐冷荣氏毛霉菌液制备：将耐冷荣氏毛霉菌株接种至麸皮固体培养基上，10℃～15℃培养，培养完成后加水混匀，利用无菌纱布过滤得到毛霉菌孢子悬液，浓度约104～106CFU/mL。
(4)豆腐白坯前期培菌：将上述耐冷荣氏毛霉菌液喷洒在豆腐白坯上，室内温度控制15℃左右，培养5～7天，豆腐表面包裹一层嫩黄色菌丝皮膜(简称毛坯)，撮毛拢坯，下盐腌坯。
(5)青腐乳腌坯：将毛坯码放在腌坯盒内，均匀撒上一层盐，一般码放三层，上面撒盐量比下边多一些，毛坯与食用盐质量比为7.5:1。腌制5～6天，食盐基本溶解，黄浆水腌出，转入下道工序。
(6)后发酵混合菌液制备：通过LB液体培养基分别培养嗜盐片球菌(Pediococcushalophilus)、马葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)，得到106～108浓度菌液，三种菌混合菌液配比为嗜盐片球菌:马葡萄球菌:巴氏葡萄球菌＝2:1:1。
(7)青腐乳汤配置：将卤花水、黄浆水和清水按体积比为1:3:6混合后，加入食用盐，使盐浓度达到11％左右，再按0.5％～1％接种上述(6)中制备的混合菌液即可。
(8)浇汤封缸进行后发酵：将上述(5)中腌好的咸坯，码放入发酵缸内，将(7)中配置好的青腐乳汤注入臭腐乳缸内，浇入量控制与咸坯齐平，上面覆盖2kg左右13％食盐腌好的豆腐渣，牛皮纸和塑料布封缸处理，发酵6个月以上即可。
该新型毛霉为一种耐冷微生物，在低温环境下生长快、菌丝长，可在较低温度下进行腐乳生产，低温环境可以抑制杂菌生长保证制坯阶段顺利进行；毛霉菌种发达的菌丝体将豆腐坯体紧紧包裹，非常有助于维持腐乳的外观形状；在青腐乳后发酵阶段添加三种细菌型微生物均为可在10％NaCl的盐浓度下生长的耐盐微生物，其中嗜盐片球菌可提高产品挥发性风味物质含量，并可减少生物胺类有害物质的含量；马葡萄球菌可促进物质转换，提升风味物质；巴氏葡萄球菌有利于提升产品风味及营养成分。本发明提供的青腐乳生产工艺，可以解决自然发酵产品风味及品质不稳定的问题，该工艺生产的青腐乳风味独特，无明显臭味，口感细腻醇厚，滋味鲜美。
本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下明显效果：
(1)本发明涉及的耐冷荣氏毛霉种(Mucor rongensis)耐低温，用于低温生产腐乳可抑制杂菌生长；该毛霉菌种产碱性蛋白酶，可以解决常见毛霉菌产酸性蛋白酶导致腐乳出现白点等问题；该毛霉菌种产生的发达菌丝体将豆腐坯体紧紧包裹，有助于盐渍期维持腐乳的外观形状。
(2)本发明采用毛霉型微生物和细菌型微生物为一体的发酵体系，后发酵过程接种嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、马葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)可提明显升产品风味。
(3)本发明提供的青腐乳生产菌种及工艺，可实现人工控制纯菌种发酵生产青腐乳，可以解决自然发酵产品风味及品质不稳定的问题。
(4)该工艺生产的青腐具有外观完整、色泽纯正，臭味淡雅，口感细腻、鲜美等特征。
附图说明
图1荣氏毛霉菌株CICC 41726的形态学照片。
图2荣氏毛霉菌株CICC 41726与相关种的ITS rDNA序列系统发育树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1毛霉菌株的鉴定
(1)形态学鉴定
将耐冷荣氏毛霉菌株CICC 41726接种至马铃薯土豆培养基上(PDA培养基)，20℃培养5天，进行菌落拍照，菌体显微观察以及扫描电镜观察，具体形态特征详见图1；图1中，A:PDA培养基上20℃培养5天，菌落照片；B：光学显微镜照片，孢子囊；C：扫描电镜照片，囊轴和囊领结构；D：扫描电镜照片，孢囊孢子。
(2)分子生物学鉴定
将毛霉菌株CICC 41726通过ITS rDNA序列系统发育分析，将其准确鉴定到种，系统发育树详见图2。图2采用MEGA5.0软件，邻位连接法显示“荣氏毛霉菌株CICC 41726”与相关种的ITS rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于70％数值，上标“T”代表模式菌株。
(3)生长温度测定
将毛霉菌株CICC 41726接种至PDA平皿上，分别在3℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃条件下培养，试验结果显示荣氏毛霉菌在3℃下可以生长，在28℃条件下不生长，最适生长温度为10℃～15℃。
(4)生长pH范围测定
将毛霉菌株CICC 41726接种至pH值为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11的PDA平皿上，在20℃条件下培养3天，不同pH值下菌落均良好生长，即在4～11的pH值范围内菌落可良好生长。
实施例2青腐乳的发酵生产
(1)三角瓶毛霉菌孢子液制备
选用新鲜麸皮100g，加水100～110mL，在容器中充分拌匀，然后将此料装入瓶中(500毫升的三角瓶装湿料40-50g)，把包扎好的三角瓶置于121℃压力灭菌器内灭菌45～50min，趁热用手将瓶内培养基团块打散，冷却至室温，将试管斜面接入三角试瓶内。将接入试管的三角瓶摇匀，让瓶内培养基摊平，放于15℃霉菌培养箱内恒温培养10天。每瓶三角瓶毛霉菌种加2.5kg冷开水，充分摇匀后，用纱布过滤得孢子悬浮液备用。
(2)豆腐白坯制作
磨浆和煮浆：精选无杂质，无霉变结块，无异味的当年产大豆，大豆与泡豆水比例为1：4(水温15℃左右)，浸泡12～18h。用豆腐磨浆机，边冲水边加入浸泡好的黄豆，控制1公斤干黄豆出5～6kg豆浆，磨浆时加入油脚或消泡剂刹沫，将磨好的生豆浆泵入煮浆桶内，打开电加热开关，加热至豆浆表面没有白色泡沫，沸腾翻滚2～3min。
凝固成型：凝固剂的浓度控制在14-18°Be′，点浆的温度控制在80～85℃，全过程控制在5min之内完成。蹲脑时间在15min。压榨成型后，为防止污染，应及时划块降温。豆腐白坯的规格4×4×1.5㎝/块，水分约75％；每15公斤干黄豆产出1000块豆腐白坯。
(3)豆腐白坯前期培菌
将豆腐白坯摆放在培菌盒内，每行白坯之间距离约2.5cm，将(1)中毛霉菌孢子悬液均匀喷洒在豆腐白坯上，豆腐坯的接种量为每100㎏使用2支三角瓶菌液，喷菌液后盒子要品字形排列，目的散去坯子表面的水分。48h后豆腐块表面开始长出细细的菌丝，捣盒一次上面盖上席或干净的白布保温保潮。根据生长均匀程度第3天捣盒一次，毛霉菌丝1cm长布满了豆腐块表面，第五天菌丝长1.5cm，菌丝淡黄而发亮再捣盒一次。第6天豆腐表面包裹一层嫩黄色菌丝皮膜(简称毛坯)，撮毛拢坯，下盐腌坯。整个培菌过程室内温度控制15℃左右。
(4)腌坯
将15kg毛坯码放在腌坯盒内，均匀撒上一层盐，一般码放三层，上面撒盐量比下边多一些，每盒用精制食用盐2kg。腌制6天，食盐基本溶解，黄浆水腌出，转入下道工序。
(5)后发酵混合菌液制备
通过LB液体培养基，35℃分别培养嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、马葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)，得到106～108浓度菌液，三种菌混合菌液配比为嗜盐片球菌:马葡萄球菌:巴氏葡萄球菌＝2:1:1。
(6)青腐乳汤配置
将卤花水、黄浆水和清水按体积比为1:3:6混合后，加入食用盐，使盐浓度达到11％左右，再按0.5％接种上述(5)中制备的混合菌液即可。
(7)拌坯下缸
洗去没溶解的食用盐，将咸坯控去浮水，将没有皮膜的一面朝向缸壁(目的保持发酵的产品块型好)。坯子每层外围成圆圈码放，中间平行码放，松紧适度，装缸离缸沿15公分左右即可。
(8)浇汤封缸进行后发酵
将上述(5)中腌好的咸坯，码放入发酵缸内，并注入(6)中配置好的青腐乳汤，浇入量控制与咸坯齐平，上面覆盖2kg左右13％食盐腌好的豆腐渣，先用牛皮纸覆盖缸口，再用塑料布覆盖，用胶带将塑料布与缸体密闭粘牢，上盖席编缸帽，防雨淋日晒，发酵6个月以上即可。
实施例3荣氏毛霉与常用腐乳生产菌种的性能比较及其生产的青腐乳品质鉴定
荣氏毛霉与常用腐乳生产菌种(包括总状毛霉、米根霉、雅致放射毛霉等)的性能比较见表1，由表1可知荣氏毛霉较其他菌具有生长温度低、低温生长速度快、不产酸性蛋白酶、后发酵微生物可控制等特征，适合低温生产青腐乳。按照SB/T 10170-2007《腐乳行业标准》对发酵好的青腐乳进行理化及感官评价，评价结果见表2，根据表2可知本发明工艺生产的青腐乳均符合标准中感官和理化指标要求。
表1荣氏毛霉与常用腐乳生产菌种的性能比较
注：[1]周锦绣,林奇,唐卿燕.我国腐乳生产用菌的研究现状[J].食品科技,2007,2007(11):20-23.
[2]李幼筠.一株总状毛霉菌株及利用其生产豆腐乳的工艺:中国，02113284.4[P].2003.
[3]姚翔,邓放明,陆宁.自然发霉条件下腐乳醅中优势微生物的分离与初步鉴定[J].食品工业科技,2012,33(11):209-211.
[4]全明海.以雅致放射毛霉和少根根霉发酵腐乳的研究[D].2006.
表2本工艺生产的青腐乳感官特征及比对评价结果
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东正信味业食品有限公司
中国食品发酵工业研究院有限公司
<120> 耐冷荣氏毛霉及其在青腐乳生产应用
<130> 20190207
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> Mucor rongensis
<400> 1
gtcgacgatt ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc 60
attaaataat ttgatattct gaaagaaaaa tttatttttt ttttcagtaa tattctattt 120
tactgtgaac tgtattatta cgagatgttt gagggatgct taccgactat aaggataggt 180
cggtaggatg ttaaccgagt cttgatcaag cttttttttt tttaagcttg gtatcctatt 240
attatttacc aaaagaattc agtataaaat attgtaacat agacctaaaa aatctataaa 300
aacaactttt aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat gaagaacgta gcaaagtgcg 360
ataactagtg tgaattgcat attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca tcttgcgctc 420
attggtattc caatgagcac gcctgtttca gtatcagaaa caccccacat tcaaaatctt 480
tttttttttt tgaatggaac tgagtcgttt acggtttata tttttcaata tagactgttc 540
gctttaaaaa tattaggcct ggaatttagt attttcttgt ttttgcctga actttttttt 600

Claims (7)

1.一株耐冷荣氏毛霉(Mucor rongensis)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17468。
2.如权利要求1所述的耐冷荣氏毛霉，其特征在于：最高生长温度为27℃，最低生长温度为3℃；最适生长温度为10℃～15℃；适宜生长温度为5℃～20℃；生长pH范围为4～11；产碱性蛋白酶。
3.权利要求1所述的耐冷荣氏毛霉在青腐乳生产中的用途。
4.一种青腐乳，其特征在于使用如权利要求1中所述的耐冷荣氏毛霉生产。
5.如权利要求4中所述的青腐乳，其特征在于其制备方法如下：
(1)将权利要求1所述耐冷荣氏毛霉制备104～106CFU/mL孢子悬液喷洒于白豆腐坯上，进行培菌制成毛坯；
(2)将步骤(1)中制成的毛坯与食用盐混匀，进行腌坯；
(3)将步骤(2)中得到的腌坯置于青腐乳汤中，接种嗜盐片球菌(Pediococcushalophilus)、马葡萄球菌(Staphylococcus equorum)和巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)的混合菌液，进行后发酵。
6.如权利要求5所述的青腐乳，其特征在于，所述的青腐乳汤由以下方法制备：卤花水、黄浆水和清水混合，体积比为1:3:6。
7.如权利要求5所述的青腐乳，其特征在于，所述的嗜盐片球菌(Pediococcushalophilus)、马葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)的混合菌液特征在于：每种菌摇瓶液体培养得到106～108菌体浓度，混合菌液的配比为嗜盐片球菌:马葡萄球菌:巴氏葡萄球菌＝2:1:1，接种量为每100mL青腐乳汤中接种混合菌液0.5～1mL。
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