CN110511299A - 一种酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酞菁‑羧甲基壳聚糖偶联物及其制备方法与应用，属于药物制备领域。该酞菁‑羧甲基壳聚糖偶联物为单取代氨基类锌酞菁与羧甲基壳聚糖的偶联物，其由于具有酞菁和羧甲基壳聚糖的双功能基，可用于光动力抗菌、光动力抗癌、光动力诊断及光动力消毒；同时，羧甲基壳聚糖具有优良的水溶性和生物相容性，能够有效改善酞菁的两亲性和生物相容性，并降低酞菁的毒性，提高酞菁的临床应用价值。

Description

一种酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制备领域，具体涉及一种酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物及其制备方法与应用。
背景技术
光动力治疗（或称光动力疗法），本质上是光敏剂（或称光敏类药物）的光敏化反应在医学领域的应用。其一般作用过程是，光敏剂先被注入到机体，一段时间后（药物在靶体中相对富集），用特定波长的光照射靶体位置（体腔内目标可借助光纤等导入光源），使富集在靶体中的光敏剂在光照射下被激发，产生了一系列光物理化学反应，并产生能够破坏靶体（例如染菌部位和癌细胞、组织等）的物质，如：活性氧、单线态氧等。光动力治疗的关键在于光敏剂，然而自1995年美国FDA批准的第一个光敏剂Photofrin应用于临床癌症治疗至今，获准在临床上正式使用的光敏剂却很少，主要是由于光敏剂在临床应用中暴露出很多缺陷，如：暗毒性高、水溶性差、组织穿透力差、靶向性不足以及稳定性不足等。因此，开发新型的具有良好临床效应的光敏剂成为亟待解决的问题。
酞菁（phthalocyanine），是四苯并四氮杂卟啉的简称，被归属为第二代光敏剂，由于其稳定性高、光物理化学性质优良、具有一定的渗透能力而一直受到高度重视。但是，目前所报道的具有生物活性的酞菁配合物仍存在不足之处，例如：缺乏两亲性、暗毒性高、生物选择性不佳、合成路线复杂等，而限制其临床应用。人们借助各种载药工具，如多聚物、核酸和蛋白质等，试图解决酞菁在临床应用上的缺陷。
羧甲基壳聚糖是壳聚糖经改性后的一类两性聚电解质，其分子中具有大量的活性氨基和羧基。相比壳聚糖只溶于酸性水溶液，羧甲基壳聚糖能在很宽的pH范围内溶于水。除了保留壳聚糖本身良好的生物可降解性外，羧甲基壳聚糖由于引入了羧基，降低了铵根离子的电荷密度，降低了细胞毒性，从而具备更好的细胞相容性。同时，由于其水溶性明显提高，使其更有利于进入细胞中，减轻患者对药物的不耐受性，是理想的药物载体。在抗菌方面，羧甲基壳聚糖中存在大量未反应的-NH2，经质子化后转变为-NH3 +，能够渗透进入细菌细胞体内，吸附细胞体内带负电荷的分子基团，发生絮凝作用，阻碍细胞正常的生理活动；也可以吸附在细胞膜表面形成一层高分子膜，改变细胞膜的选择渗透性，细胞质壁分离，从而起到抑菌杀菌作用。另外，-COO-和-NH3 +两种基团可形成分子内或分子间氢键，使大分子链柔顺性下降，分子链更加舒展。在羧基的取代度不高时，-NH3 +的被包埋程度下降，暴露的-NH3 +能与微生物充分作用，因此可显示出更强的抗菌活性。然而目前针对性质更加优良的羧甲基壳聚糖作为光敏剂的载药系统的研究却很少。
发明内容
本发明针对现有酞菁临床应用暴露出的缺点，借助具有优良特性（如水溶性好、可生物降解、无免疫原性、无毒、可修饰性和抗菌性）的羧甲基壳聚糖作为药物载体，提供了一种酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物及其制备方法，所得酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物显示了良好的抗菌性和极高的光动力活性，作为光敏剂应用具有显著优势。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物，该偶联物是酞菁化合物中的氨基与羧甲基壳聚糖上的羧基以酰胺键偶联生成。
所述酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的制备方法是以酞菁化合物和羧甲基壳聚糖为反应原料，二甲亚砜和水为溶剂，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑为缩合试剂，在室温和氮气保护下反应过夜，然后经析出、抽滤和透析进行分离纯化，得到所述酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物；其具体制备步骤如下：
1）将1-羟基苯并三唑（HOBt）溶于二甲亚砜中，得HOBt溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）溶于水中，得EDCI溶液；将酞菁化合物溶于二甲亚砜中，得酞菁化合物溶液；
2）将羧甲基壳聚糖溶于1wt%的盐酸溶液中，然后先后加入制备好的HOBt溶液和EDCI溶液，室温下搅拌1 h以活化羧基，再缓慢滴加制备好的酞菁化合物溶液，于室温、氮气保护条件下搅拌反应过夜；
3）反应结束后浓缩至干，加水析出后用砂芯漏斗抽滤，再对滤液进行浓缩、透析，得到目标产物。
其中，所用羧甲基壳聚糖的分子量为10~300 kDa。
所用酞菁化合物与羧甲基壳聚糖重复单元数（羧甲基壳聚糖的质量与单个重复单元平均摩尔质量的比值）的摩尔比为1:20~200；所用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑与羧甲基壳聚糖重复单元数的摩尔比均为1:2~20。
所述酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物可用于制备光动力药物，其包括光动力抗癌药物、光动力抗菌药物、光动力诊断剂和光动力消毒剂等。所述光动力治疗可以是恶性肿瘤的光动力治疗，或是良性肿瘤的光动力治疗，或是非癌症疾病的光动力治疗。所述的非癌症疾病，可以是细菌感染，或是口腔疾病，或是黄斑变性眼病，或是动脉硬化，或是创伤感染，或是皮肤病，或是病毒感染。所述光动力消毒可以是血液或血液衍生物的光动力灭菌净化，或是水的光动力灭菌消毒，或是医用或生活用器的光动力消毒。
其应用方法为：用水或水和其它物质的混合溶液作为溶剂，溶解酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物，配制成相应药剂（药剂中酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的浓度不高于其饱和浓度）；制成的药剂中还可加入抗氧化剂、缓冲剂和等渗剂，以保持光敏药剂的化学稳定性和生物相容性；
所述混合溶液中其它物质的质量分数不高于10％，所述其它物质为蓖麻油衍生物、二甲亚砜、乙醇、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300~3000、环糊精、葡萄糖、吐温、聚乙二醇单硬脂酸酯中的一种或几种。
本发明的有益效果和突出优势在于：
（1）本发明提供的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的制备过程简便、易操作、重现性高。
（2）本发明所用原料羧甲基壳聚糖来源丰富、价格低廉。
（3）本发明所制备的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物能降低酞菁的暗毒性，明显改善氨基酞菁在水相中的聚集行为。
（4）本发明所制备的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物不仅保留了单纯氨基酞菁锌的光活性，也保存了羧甲基壳聚糖的优良天然活性，如与菌细胞壁膜上带负电的残基相结合从而改变壁膜的渗透性而发挥抗菌效果。
（5）本发明所制备的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的抗菌效果显著，对白色念珠菌Candida albicans的IC90可低至0.72 μM，优于单纯氨基酞菁锌的对应值（IC90~5 μM）。
附图说明
图1为氨基酞菁锌在水中的电子吸收光谱（少量DMSO作为助剂）。
图2为实施例1偶联物在水中的电子吸收光谱。
图3为实施例2偶联物在水中的电子吸收光谱。
图4为实施例3偶联物在水中的电子吸收光谱。
图5为实施例4偶联物在水中的电子吸收光谱。
具体实施方式
一种酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物，其是以酞菁化合物和羧甲基壳聚糖为反应原料（酞菁化合物与羧甲基壳聚糖重复单元数的摩尔比为1:20~200），二甲亚砜和水为溶剂，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑为缩合试剂（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑与羧甲基壳聚糖重复单元数的摩尔比均为1:2~20），在室温和氮气保护下反应过夜，然后经析出、抽滤和透析进行分离纯化，制备得到。
所述酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物可用于制备光动力药物，其包括光动力抗癌药物、光动力抗菌药物、光动力诊断剂和光动力消毒剂等。所述光动力治疗可以是恶性肿瘤的光动力治疗，或是良性肿瘤的光动力治疗，或是非癌症疾病的光动力治疗。所述的非癌症疾病，可以是细菌感染，或是口腔疾病，或是黄斑变性眼病，或是动脉硬化，或是创伤感染，或是皮肤病，或是病毒感染。所述光动力消毒可以是血液或血液衍生物的光动力灭菌净化，或是水的光动力灭菌消毒，或是医用或生活用器的光动力消毒。
本发明酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物在光动力治疗、光动力抗菌、光动力诊断和光动力消毒中的应用，需配套适宜的光源，所述适宜的光源可以由普通光源连接合适的滤光片来提供或由特定波长的激光来提供，光源的波长范围为600～800nm，优选600-690nm。
其具体应用方法为：用水或水和其它物质的混合溶液作为溶剂，溶解酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物，配制成相应药剂（药剂中酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的浓度不高于其饱和浓度）；所述混合溶液中其它物质的质量分数不高于10％，所述其它物质为蓖麻油衍生物、二甲亚砜、乙醇、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300~3000、环糊精、葡萄糖、吐温、聚乙二醇单硬脂酸酯中的一种或几种。制成的药剂中还可加入抗氧化剂、缓冲剂和等渗剂，以保持光敏药剂的化学稳定性和生物相容性。
对于局部给药用的制剂，可以将本发明酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物溶解在渗透性溶剂中，或注入到软膏、洗液或凝胶中。所述渗透性溶剂优选0.5-35wt%的二甲亚砜水溶液。
以下采用非限制性实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将13.5 mg的1-羟基苯并三唑（HOBt，0.1 mmol）溶于0.5 mL二甲亚砜中，得HOBt溶液，19.2 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI，0.1 mmol）溶于0.5 mL水中，得EDCI溶液，7.09 mg的氨基酞菁锌（0.01 mmol）溶于0.5 mL二甲亚砜中，得酞菁化合物溶液，备用。然后将175.2 mg羧甲基壳聚糖（MW=50 kDa，0.7mmol重复单元数）溶于10 mL的1%盐酸溶液中，先后加入HOBt溶液和EDCI溶液，于室温下搅拌1 h以活化羧基。将酞菁化合物溶液缓慢滴加至该混合物中，于室温、氮气保护下搅拌反应过夜。反应结束后浓缩至干，加入150 mL水溶解，用砂芯漏斗反复抽滤3次，对滤液进行浓缩，用透析袋（MWCO:10000）透析2天，袋外溶液的pH=1（每隔3小时换一次袋外溶液）。再将透析袋内产物的pH调至7~8，用纯化水透析1天，浓缩，冻干，得蓝色网状物，即为酞菁与平均分子量为50 kDa的羧甲基壳聚糖的偶联物，产率为22.5％。根据紫外-可见光吸收光谱法测得该偶联物中酞菁的含量为0.85wt%。
将产物从-COONa转变为-COOH，相应的红外光谱特征峰为：FT-IR（cm-1）：3370（-OH，-NH，-NH2），2918（-CH，-CH2），1727（-COOH，C=O），1627（amide I，C=O），1373（C-N，-CH3），1071（C-O-C）。
实施例2
将实施例1中羧甲基壳聚糖的用量调整250.3mg，使得其重复单位数与酞菁的摩尔比为100:1，其余步骤同实施例1，制得酞菁与平均分子量为50 kDa的羧甲基壳聚糖的偶联物，产率为18.4％，酞菁含量为0.31%。
将产物从-COONa转变为-COOH，相应的红外光谱特征峰为：FT-IR（cm-1）：3373（-OH，-NH，-NH2），2888（-CH，-CH2），1727（-COOH，C=O），1618（amide I，C=O），1320（C-N，-CH3），1061（C-O-C）。
实施例3
将实施例1中羧甲基壳聚糖的分子量调整为170 kDa，用量调整为150.2mg，使得其重复单位数与酞菁的摩尔比为60:1，其余步骤同实施例1，制得酞菁与平均分子量为170 kDa的羧甲基壳聚糖的偶联物，产率为27.1％，酞菁含量为1.50%。
将产物从-COONa转变为-COOH，相应的红外光谱特征峰为：FT-IR（cm-1）：3362（-OH，-NH，-NH2），2890（-CH，-CH2），1728（-COOH，C=O），1625（amide I，C=O），1374（C-N，-CH3），1058（C-O-C）。
实施例4
将实施例1中羧甲基壳聚糖的分子量调整为170 kDa，用量调整为500.6mg，使得其重复单位数与酞菁的摩尔比为200:1, 其余步骤同实施例1，制得酞菁与平均分子量为170 kDa的羧甲基壳聚糖的偶联物，产率为21.9％，酞菁含量为0.38%。
将产物从-COONa转变为-COOH，相应的红外光谱特征峰为：FT-IR（cm-1）：3364（-OH，-NH，-NH2），2889（-CH，-CH2），1729（-COOH，C=O），1625（amide I，C=O），1375（C-N，-CH3），1061（C-O-C）。
与单纯氨基酞菁锌在水中的电子吸收光谱（图1）相比，本发明所得偶联物的电子吸收光谱（图2-图5）在680nm处的峰高（代表酞菁以单体存在）明显高于630nm处的峰高（代表酞菁以聚集体存在），说明酞菁在水中以单体形式存在居多，证明当酞菁与羧甲基壳聚糖偶联后，能明显改善其在水中的聚集行为。
实施例5
利用本发明所得酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物制备光动力药物（即光敏药剂）的方法是：用水或水和其它物质的混合溶液（混合溶液中其它物质的含量不高于10wt％）作为溶剂，溶解本发明酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物，配制成蓝色均匀的药剂（药剂中酞菁的浓度为0.1mM）；所述其它物质为蓖麻油衍生物、二甲亚砜、乙醇、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300~3000、环糊精、葡萄糖、吐温、聚乙二醇单硬脂酸酯中的一种或几种。制成的药剂中还可加入抗氧化剂、缓冲剂和等渗剂，以保持光敏药剂的化学稳定性和生物相容性。
将本发明所得酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物溶解在0~35wt%二甲亚砜的水溶液中，可作为局部给药用的制剂。
实施例6
本发明所制备的光动力药物、光敏药剂或光敏剂，在光动力抗癌、光动力抗菌、光动力诊断和光动力消毒中的使用方法与已有技术中运用非本发明所述的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物制备的光敏药剂或光敏剂的使用方法相同，但需配套适宜的光源，所述适宜的光源可以由普通光源连接合适的滤光片来提供或由特定波长的激光来提供，光源的波长范围为600～800nm，优选600-690nm。
实施例7
将实施例1、2制备的两种偶联物分别溶于水中，制成100 μM（以酞菁计）的光敏药剂；另配制1 mM酞菁化合物的DMSO溶液；测试对白色念珠菌Candida albicans的暗毒性和光动力活性。
将上述制备的光敏药剂和酞菁化合物分别与106 CFU/mL菌悬液混合，并用PBS进行稀释，使含光敏药剂的混合菌悬液中酞菁的含量分别为0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM和20μM，含酞菁化合物的混合菌悬液中酞菁的含量分别为1μM、5μM、10μM和20μM，然后在培养箱中37℃培养4h，以不加光敏药剂的空白菌悬液作为对照组。在≥610 nm的红光（15mW/cm2）下照射30 min，光照结束后，用移液枪定量取20 μL混合菌悬液，稀释一定倍数后，均匀涂布在SDA培养基表面，37℃恒温避光倒置培养，间隔48 h观察计数。
上述波长大于610nm的红光是通过500W的卤素灯连接隔热水槽加大于610nm的滤光片来提供的。
结果表明，当偶联物的溶液浓度高达20μM时，若不进行光照，则对白色念珠菌没有杀伤和生长抑制作用，表明它没有暗毒性。在光照条件下，实施例1和2所得偶联物的IC90（即杀死90％白色念珠菌所需的药物浓度）分别是0.72μM和2.43μM，而酞菁的IC90为4.48μM。
实施例8
按照实施例7对实施例3和4的偶联物进行光毒性以及暗毒性实验，其中含光敏药剂的混合菌悬液中酞菁的含量分别用PBS稀释到1μM、5μM、10μM和20μM。结果显示，当偶联物的浓度高达20 μM时，若不进行光照，则对白色念珠菌没有杀伤和生长抑制作用，表明它没有暗毒性。在光照条件下，实施例3和4中偶联物的IC90分别是4.55μM和5.18μM，与酞菁的IC90（4.48μM）相当。
因此，与单纯酞菁相比，本发明所得的部分酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物具有更高的光动力活性。另外，即便部分部分酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物与单纯酞菁的光动力活性相当，但是在药剂配制上更加方便。因为单纯酞菁不能直接溶于水，需要在少量辅助试剂如二甲基亚砜（DMSO）或聚氧乙烯蓖麻油(CEL)的帮助下才能溶于水，而本发明酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物能直接溶于水进行药剂配制，而不需要其他任何辅助试剂，可避免因辅助试剂的加入而带来的风险，如CEL会引起极性超敏反应和外周神经毒性等副作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1. 一种酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物，其特征在于：该偶联物是酞菁化合物中的氨基与羧甲基壳聚糖上的羧基以酰胺键偶联生成。
2.一种如权利要求1所述的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的制备方法，其特征在于：以酞菁化合物和羧甲基壳聚糖为反应原料，二甲亚砜和水为溶剂，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑为缩合试剂，在室温和氮气保护下反应过夜，然后经析出、抽滤和透析进行分离纯化，得到所述酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物。
3. 根据权利要求2所述的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的制备方法，其特征在于：所用羧甲基壳聚糖的分子量为10~300 kDa。
4.根据权利要求2所述的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物的制备方法，其特征在于：所用酞菁化合物与羧甲基壳聚糖重复单元数的摩尔比为1:20~200；所用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑与羧甲基壳聚糖重复单元数的摩尔比均为1:2~20。
5.一种如权利要求1所述的酞菁-羧甲基壳聚糖偶联物在制备光动力药物中的应用，其特征在于：所述光动力药物包括光动力抗癌药物、光动力抗菌药物、光动力诊断剂和光动力消毒剂。
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