CN104888219B - 一种基于细胞膜包覆的肿瘤光疗试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于细胞膜包覆的肿瘤光疗试剂，所述试剂为侧链含有光敏剂分子和聚乙二醇分子的高分子壳聚糖。本发明还公开了所述肿瘤光疗试剂的制备方法以及其在制备光敏剂中的应用。相对于现有技术，本发明试剂在没有光照的情况下对细胞的毒性非常低，但在一定波长的照射下，较游离卟啉分子其光动力学毒性极大提高。最重要的是，本发明还有效解决了卟啉分子之间的自猝灭效应，实现了基于卟啉分子的细胞膜成像及光动力学肿瘤治疗。

Description

一种基于细胞膜包覆的肿瘤光疗试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基于细胞膜包覆的肿瘤光疗试剂及其制备方法和应用，属于抗肿瘤光疗试剂领域。

背景技术

癌症是一种由控制细胞生长机制失常而引发的疾病，它可能在人体内各个组织出现并且会侵入周围正常组织从而发生转移，成为危害人类生命健康的重要因素。传统的癌症的治疗方法有外科手术切除、化学治疗和放射线治疗等，但由此造成的二次伤害往往大于癌症本身，因此这些治疗手段仍有待改进。光动力学疗法是近年来发展出的一种新型癌症辅佐性疗法，由于其对正常组织伤害小、无药物毒性积累及副作用小等优点而受到广泛关注。其中，光敏剂是光动力学疗法的关键组分，它通过将光能传递给周围的氧分子产生活性氧簇，从而杀死癌细胞。目前常见的光敏剂包括卟啉、吲哚菁绿、二氢卟吩E6、竹红菌甲素以及四氯四碘荧光素二钾等，都取得了一定的抗癌效果。卟啉作为第一代光敏物质在光动力学疗法领域应用最为广泛，它在可见光波段有密集的吸收带并且单线态氧产率高，光疗效果好。

但是，由于卟啉分子之间的π-π堆叠作用使其极易在水溶液中形成聚集体，这种自猝灭现象很大程度上削弱了单线态氧的产率及光疗的效率。

发明内容

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于细胞膜包覆的肿瘤光疗试剂及其制备方法和应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明提供了一种基于细胞膜包覆的肿瘤光疗试剂，所述试剂为侧链含有光敏剂分子和聚乙二醇分子的高分子壳聚糖。

作为优选，所述高分子壳聚糖为乙二醇壳聚糖，其分子量大于10000。

作为另一种优选，所述光敏剂分子通过与高分子壳聚糖上的氨基反应接枝在高分子壳聚糖上，其数量占壳聚糖重复单元数的百分比为0.2％-4％。

作为另一种优选，所述光敏剂分子为原卟啉、吲哚菁绿、二氢卟吩E6或卟啉衍生物。

作为另一种优选，所述聚乙二醇分子通过与高分子壳聚糖上的氨基反应接枝在高分子壳聚糖上，其数量占壳聚糖重复单元数的百分比为2％-30％。

作为另一种优选，所述聚乙二醇分子为X-聚乙二醇-Y，其中X是N-羟基琥珀酰亚胺酯或羧基，聚乙二醇分子量为1000-8000，Y是甲氧基、氨基或羧基。

本发明还提供了所述肿瘤光疗试剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)聚乙二醇-壳聚糖的合成：

称取壳聚糖和聚乙二醇，将二者分别溶于PBS缓冲液，迅速混合均匀后，室温下振荡过夜，反应结束后用截留分子量为10k的透析袋透析纯化，冷冻干燥，即得；

(2)羧基活化：

称取光敏剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，分别溶于二甲基亚砜，得各溶液；先将光敏剂溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液混合反应后，再加入N-羟基琥珀酰亚胺继续反应，使羧基活化完全，得待合成体系；

(3)光敏剂-聚乙二醇-壳聚糖的合成：

取步骤(1)所得聚乙二醇-壳聚糖溶于超纯水中，并与步骤(2)所得待合成体系混合，室温下振荡过夜，反应结束后用截留分子量为5k的透析袋在二甲基亚砜中透析纯化，再用超纯水透析纯化，然后冷冻干燥，即得，于-20℃中冷冻保存，备用；

最后，本发明提供了所述肿瘤光疗试剂在制备光敏剂中的应用。

作为优选，所述光敏剂为抗肿瘤光动力学疗法中所用的光敏剂。

作为另一种应用，所述光敏剂为细胞成像中所用光敏剂。

本发明光疗试剂的分子结构图见附图1。

为了实现不同的光疗效果，所以本发明试剂中所述光敏剂分子可以选自原卟啉、吲哚菁绿、二氢卟吩E6或卟啉衍生物中的一种。

由于卟啉分子可以通过疏水相互作用插入到细胞膜中，起到对高分子锚定的作用，因此本发明光疗试剂可以很快将细胞膜包覆，在短时间内即可用于之后的光动力学疗法与细胞成像。利用这种多位点锚定的细胞膜包覆策略，使得卟啉分子均匀分散在细胞膜表面而不被内吞，因此有效抑制了卟啉分子间由于聚集形成的自猝灭，在很大程度上提高的单线态氧产率与荧光亮度。

因此，本发明利用卟啉分子的疏水特性，将柔性的壳聚糖高分子锚定在细胞膜表面，从而把接枝的原卟啉分离开来。此外，聚乙二醇(PEG)侧链的引入进一步增强了高分子的两亲性，防止其在细胞膜表面形成自组装。原卟啉分子在特定波长的光照下，不仅可以产生单线态氧杀死癌细胞，还能实现具有免清洗效果的细胞膜成像。

综上所述，本发明试剂不仅大大增强了其作为光敏剂的光动力学疗效，还提高了原卟啉的荧光产率，进一步实现了该分子在免清洗成像方面的应用。

有益效果：相对于现有技术，本发明试剂在没有光照的情况下对细胞的毒性非常低，但在一定波长的照射下，较游离卟啉分子其光动力学毒性极大提高。最重要的是，本发明还有效解决了卟啉分子之间的自猝灭效应，实现了基于卟啉分子的细胞膜成像。

此外，本发明试剂还具有以下优势：

(1)卟啉作为第一代光疗试剂，已经在光动力学疗法领域拥有广泛的应用，并且在临床上取得了良好的效果，而本发明在此基础上进一步提高了卟啉的光动力学毒性；

(2)本发明光疗试剂的组成成分壳聚糖、PEG以及原卟啉都具备良好的生物相容性，因此该试剂对细胞的毒性很低。MTT试验显示，原卟啉含量为5μg/mL时，该试剂无光照条件下对细胞活力几乎无影响，从而证明了该试剂良好的生物相容性；

(3)壳聚糖高分子上剩余的氨基带有的正电荷，会与带负电荷的细胞膜发生静电相互作用，增加与细胞膜的亲和力，因而进一步延长了试剂在细胞膜上的保持时间；

(4)本发明可作为一种基于细胞膜包覆的光疗应用平台，通过替换光敏剂来达到不同的光疗效果。

附图说明

图1：本发明光疗试剂的分子结构图；

图2：本发明实施例1所得光疗试剂的结构式；

图3：本发明实施例1所得光疗试剂的分子结构图；

图4：为原卟啉、乙二醇壳聚糖-20％聚乙二醇和乙二醇壳聚糖-20％聚乙二醇-4％原卟啉在无光照条件下对A549肺癌细胞的毒性评价；

图5：为乙二醇壳聚糖-20％聚乙二醇-4％原卟啉与原卟啉在光照条件下对A549肺癌细胞的毒性评价；

图6：为乙二醇壳聚糖-20％聚乙二醇-4％原卟啉对A549肺癌细胞细胞膜的染色效果图；

图7：为经瘤内注射后原卟啉和乙二醇壳聚糖-20％聚乙二醇-4％原卟啉在裸鼠体内的荧光成像图；

图8：为经过原卟啉和乙二醇壳聚糖-20％聚乙二醇-4％原卟啉光动力学治疗后的裸鼠肿瘤体积随时间变化图。

具体实施方式

实施例1

(1)首先以乙二醇壳聚糖(glycol chitosan)和N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇2000-甲氧基(NHS-PEG2000-OMe)为原料，合成PEG分子占壳聚糖重复单元数的百分比为20％的前体，即壳聚糖-20％PEG。分别称取40mg NHS-PEG2000-OMe和20mg乙二醇壳聚糖，将二者分别溶于PBS缓冲液(pH 7.4，50mM)，迅速混合均匀后，在摇床中室温下反应过夜。反应结束后用截留分子量为10k的透析袋透析3天进行纯化，最后在冻干机中冻干制成壳聚糖-20％PEG。

(2)随后，以壳聚糖-20％PEG、原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为原料合成PpIX分子占壳聚糖重复单元数的百分比为4％的光疗试剂：壳聚糖-20％PEG-4％PpIX。称取2.2mg PpIX、6.6mg EDC和5.2mg NHS，并分别溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)。先将PpIX与EDC混合反应10min后，再加入NHS继续反应20min，使羧基活化完全。

(3)随后，将壳聚糖-20％PEG溶于1mL超纯水中，并与以上反应体系混合，在摇床中室温下反应过夜。反应结束后，先用截留分子量为5k的透析袋在DMSO中透析纯化3天，再用超纯水透析纯化1天。最后在冻干机中冷冻干燥制得光疗试剂：壳聚糖-20％PEG-4％PpIX，并于-20℃中冷冻保存。

上述方法所得试剂记为乙二醇壳聚糖-20％聚乙二醇-4％原卟啉，其结构式和分子结构图分别见附图2和附图3。

实施例2

按照实施例1方法，将原卟啉替换为吲哚菁绿，调整各组分的用量，合成PEG占壳聚糖重复单元数的百分比为2％，吲哚菁绿分子占壳聚糖重复单元数的百分比为0.2％的试剂。

实施例3

按照实施例1方法，将原卟啉替换为二氢卟吩E6，调整各组分的用量，合成PEG占壳聚糖重复单元数的百分比为30％，二氢卟吩E6分子占壳聚糖重复单元数的百分比为2％的试剂。

实施例4

按照实施例1方法，将原卟啉替换为光卟啉，调整各组分的用量，合成PEG占壳聚糖重复单元数的百分比为10％，卟啉衍生物分子占壳聚糖重复单元数的百分比为3％的试剂。

实施例5

按照实施例1方法，将N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇2000-甲氧基替换为N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇2000-氨基，调整各组分的用量，合成聚乙二醇分子占壳聚糖重复单元数的百分比为10％，原卟啉分子占壳聚糖重复单元数的百分比为3％的试剂。

实施例6

按照实施例1方法，将N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇2000-甲氧基替换为N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇2000-羧基，调整各组分的用量，合成聚乙二醇分子占壳聚糖重复单元数的百分比为10％，原卟啉分子占壳聚糖重复单元数的百分比为3％的试剂。

实施例7

按照实施例1方法，调整各组分的用量，合成PEG占壳聚糖重复单元数的百分比为15％，原卟啉分子占壳聚糖重复单元数的百分比为2％的试剂。

实验例本发明所得光疗试剂检测

1、细胞毒性评价

A549肺癌细胞在96孔板上培育12小时后，先吸取原有培养基，再在每孔中加入100μL含有游离PpIX和实施例1所得光疗试剂的DMEM完全培养基(每孔中PpIX浓度分别为0.1、0.5、1、5μg/mL)，放回二氧化碳培养箱孵育24小时。随后利用MTT方法对细胞活性进行检测，结果见附图4。

由图4结果可得，在无光照条件下对细胞的毒性非常低，对细胞活力几乎无影响，从而证明了本发明试剂具有良好的生物相容性。

2、体外光疗实验

A549肺癌细胞在96孔板上培育12小时后，先吸取原有培养基，再在每孔中加入100μL含有游离PpIX或实施例1所得光疗试剂的DMEM完全培养基(每孔中PpIX含量均为0.5μg)，放回二氧化碳培养箱孵育40分钟。随后，利用激发波长650nm，功率密度为5mW/cm²的激光器，分别对孵育有游离PpIX和光疗试剂的细胞按时间梯度进行照射(0、1、2、5、10和15min)。完成后，再将96孔板放入培养箱孵育3小时，利用MTT方法对细胞活性进行检测，进而评价光疗效果，结果见附图5。

由图5结果可得，在一定光照条件下，相比较游离原卟啉分子，本发明试剂光动力学毒性极大提高。

3、细胞膜染色成像实验

实施例1所得光疗试剂溶于细胞培养用PBS，制成1mg/mL的储存液，并用0.22μm的无菌过滤头进行过滤除去细菌制得工作液。A549肺癌细胞在共聚焦培养板上培养12小时后，先吸去原有培养基，PBS清洗两次，再加入1.8mL新鲜DMEM完全培养基(DMEM不完全培养基+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素双抗)，以及200μL光疗试剂并放回二氧化碳培养箱孵育40分钟。孵育结束后，将培养板置于共聚焦显微镜下，设置激发波长为552nm，接受波段为620nm至700nm，并用63倍油镜观察细胞膜染色情况，结果见附图6。

由图6结果可得，本发明所得光疗试剂能够很好地锚定在细胞膜上，实现细胞膜包覆的目的；此外该试剂在细胞膜上的荧光大大增强，而游离环境中的试剂则几乎观察不到荧光，因此可以实现免清洗成像。

4、体内成像实验

取健康状况良好的4周龄BALA/c无胸腺的雌性裸鼠若干只，并皮下注射A549细胞。当肿瘤体积达到100mm³左右时，将原卟啉和实施例1所得光疗试剂通过瘤内注射的方式注射到裸鼠体内，注射计量为100μL(PpIX含量均为5μg)。然后将裸鼠用异氟烷气体麻醉后放入成像暗箱平台，在小动物活体成像系统中用540nm激发光激发并接收650—700nm波段的发射光，曝光时间为750ms。分别在不同时间点(0、2、4、6和9小时)采集成像数据，并进行数据分析。实验结果见附图7。

由图7结果可得，原卟啉在注射进入裸鼠体内后几乎观察不到荧光，而本发明所得光疗试剂则呈现出非常明显的体内荧光，并且可以在肿瘤区域滞留至少9小时，极大延长了药物在体内的保留时间。

5、体内光疗实验

当肿瘤体积达到50mm³左右时，将PpIX和实施例1所得光疗试剂通过瘤内注射的方式注射到裸鼠体内，注射计量为100μL(PpIX含量均为5μg)，连续注射三天。每次注射完成30分钟后，用635nm的红色激光照射肿瘤区域，激光功率为5mW/cm²，照射时间为20分钟。每隔一天测量肿瘤大小及裸鼠体重，肿瘤体积＝0.5*肿瘤长度*肿瘤宽度²，结果见图附图8。

由图8结果可得，相比较使用生理盐水和原卟啉，使用本发明所得光疗试剂进行光动力学抗肿瘤治疗，可以显著抑制小鼠体内肿瘤体积的增大。

Claims (10)

1.一种基于细胞膜包覆的肿瘤光疗试剂，其特征在于，所述试剂为侧链含有光敏剂分子和聚乙二醇分子的高分子壳聚糖；所述光敏剂分子通过与高分子壳聚糖上的氨基反应接枝在高分子壳聚糖上，聚乙二醇分子通过与高分子壳聚糖上的氨基反应接枝在高分子壳聚糖上。

2.根据权利要求1所述的肿瘤光疗试剂，其特征在于，所述高分子壳聚糖为乙二醇壳聚糖，其分子量大于10000。

3.根据权利要求1所述的肿瘤光疗试剂，其特征在于，其中光敏剂分子的数量占壳聚糖重复单元数的百分比为0.2％-4％。

4.根据权利要求1所述的肿瘤光疗试剂，其特征在于，所述光敏剂分子为原卟啉或二氢卟吩E6。

5.根据权利要求1所述的肿瘤光疗试剂，其特征在于，其中聚乙二醇分子的数量占壳聚糖重复单元数的百分比为2％-30％。

6.根据权利要求1所述的肿瘤光疗试剂，其特征在于，所述聚乙二醇分子为X-聚乙二醇-Y，其中X是N-羟基琥珀酰亚胺酯或羧基，聚乙二醇分子量为1000-8000，Y是甲氧基、氨基或羧基。

7.权利要求1-6任一项所述的肿瘤光疗试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)聚乙二醇-壳聚糖的合成：

称取壳聚糖和聚乙二醇，将二者分别溶于PBS缓冲液，迅速混合均匀后，室温下振荡过夜，反应结束后用截留分子量为10k的透析袋透析纯化，冷冻干燥，即得；

(2)羧基活化：

称取光敏剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，分别溶于二甲基亚砜，得各溶液；先将光敏剂溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液混合反应后，再加入N-羟基琥珀酰亚胺继续反应，使羧基活化完全，得待合成体系；

(3)光敏剂-聚乙二醇-壳聚糖的合成：

取步骤(1)所得聚乙二醇-壳聚糖溶于超纯水中，并与步骤(2)所得待合成体系混合，室温下振荡过夜，反应结束后用截留分子量为5k的透析袋在二甲基亚砜中透析纯化，再用超纯水透析纯化，然后冷冻干燥，即得，于-20℃中冷冻保存，备用；

8.权利要求1-6任一项所述的肿瘤光疗试剂的应用，其特征在于，所述试剂在制备光敏剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的肿瘤光疗试剂的应用，其特征在于，所述光敏剂为抗肿瘤光动力学疗法中所用的光敏剂。

10.根据权利要求8所述的肿瘤光疗试剂的应用，其特征在于，所述光敏剂为细胞成像中所用光敏剂。