CN110506120A - 用于生产化合物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于产生目标化合物的蛋白质、核酸、载体和宿主分子，及其使用方法。

Description

用于生产化合物的组合物和方法
发明背景
聚酮天然产物通过与其它修饰酶（tailoring enzyme）结合的聚酮合酶（PKS），例如I型聚酮合酶而生物合成产生。聚酮合酶（PKS）是大型多结构域蛋白质家族，其催化功能被组构成模块以产生聚酮。聚酮合酶簇的基本功能单元是模块，其编码例如衍生自丙二酰基-CoA的2-碳延伸单元。一般存在于聚酮合酶中的模块包括i）加载模块；ii）延伸模块；以及iii）释放模块。在该模块内，聚酮链延伸和延长所需的最小结构域体系结构包括酮合酶（KS）、酰基转移酶（AT）和ACP（酰基-载体蛋白）结构域，并且每个模块的特定化学由AT结构域和存在的β-酮加工结构域编码：酮还原酶（KR）、脱水酶（DH）和烯酰还原酶（ER）结构域。聚酮合酶生物合成通过两个关键机制进行：由聚酮合酶延伸模块的聚酮链延长和聚酮中间产物在模块之间的转运。生产链延长取决于模块内和模块之间的众多催化结构域的协调功能。
组合生物合成是通用策略，其已用于改造的聚酮合酶（PKS）基因簇，以产生新型药物候选物（Weissman和Leadlay，Nature Reviews Microbiology，2005）。迄今为止，这些策略已依赖改造PKS结构域缺失和/或模块内的结构域交换或通过交换来自另一个簇的整个模块以产生嵌合簇。该方法的问题在于经由大批结构域替换、插入或缺失的聚酮巨型合酶（megasynthases）的蛋白质改造可能扰乱PKS的“装配线”体系结构，因此急剧减少了合成的聚酮的量。
发明概述
本发明提供了通过模拟和加速通过经由进化“打开”或“关闭”结构域活性的机制，可用于促进聚酮的组合生物合成而无化合物产生的显著损失的组合物和方法（图1）。
更具体地，本发明提供了通过利用控制酶促活性的β-酮加工结构域，即酮还原酶（KR）、脱水酶（DH）和烯酰还原酶（ER）结构域中的短蛋白质序列，用于结构域水平的PKS改造的组合物和方法（图2A和2B）。将推定的死亡结构域序列移植到活结构域上，以使结构域活性失活并且改变由簇编码的聚酮的化学结构。然后可以使用链霉菌属（Streptomyces）表达宿主中修饰的簇的异源表达来产生新型化合物。可以通过将多个结构域水平改造操作执行到一个簇内来进一步利用该方法，以生成改造分子的组合文库。
相应地，在一个方面，本发明提供了改造的聚酮合酶，其中所述聚酮合酶包括相对于包括未修饰的结构域的参考聚酮合酶具有改变的酶促活性的一个或多个修饰的结构域，其中所述改造的聚酮合酶能够在适合于允许通过改造的聚酮合酶表达化合物的条件下表达时产生聚酮。
在一些实施方案中，改造的聚酮合酶包括具有改变的酶促活性的两个或更多个修饰的结构域。
在一些实施方案中，至少一个修饰的结构域具有降低的酶促活性（例如，至少一个修饰的结构域是功能性失活的）。
在一些实施方案中，修饰的结构域是β-酮加工结构域（例如，酮还原酶、脱水酶或烯酰还原酶）。
在另一个方面，本发明提供了包括以下的聚酮合酶：
（a）包括第一聚酮合酶的结构域的保守区域的第一结构域；和
（b）包括第二聚酮合酶的结构域的保守区域的第二结构域。
在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域中的至少一个是β-酮加工结构域（例如，酮还原酶、脱水酶或烯酰还原酶）。在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域均为β-酮加工结构域。
在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域中的至少一个是功能性失活的结构域。在一些实施方案中，第一结构域和第二结构域两者均为功能性失活的结构域。
在一些实施方案中，聚酮合酶包括（c）第三聚酮合酶的结构域（例如，功能性失活的结构域）的保守区域或第二聚酮合酶的第二结构域的保守区域。
在一些实施方案中，聚酮合酶包括（d）第四聚酮合酶的结构域（例如，功能性失活的结构域）的保守区域、第三聚酮合酶的第二结构域的保守区域或第二聚酮合酶的第三结构域的保守区域。
在一些实施方案中，功能性失活的结构域包括SEQ ID NO：1-9中任何一个的保守区域的氨基酸序列。
在任何前述聚酮合酶的一些实施方案中，β-酮加工结构域包括与SEQ ID NO：1-9中任何一个的保守区域具有至少90%序列同一性的部分。
在任何前述聚酮合酶的一些实施方案中，β-酮加工结构域是酮还原酶，其中所述酮还原酶（a）在对应于保守的YAAAN催化基序中的酪氨酸的位置处包括除酪氨酸外的氨基酸，并且不包括SEQ ID NO：1中保守的αFG螺旋；（b）在对应于SEQ ID NO：2中S9-pksA ORF（S9中的变化）的丙氨酸6632的位置处包括谷氨酸残基；或（c）不包括对应于SEQ ID NO：3的WT S12-pksB ORF的氨基酸3386至3516的氨基酸。
在任何前述聚酮合酶的一些实施方案中，β-酮加工结构域是脱水酶，其中所述脱水酶包括（a）在对应于SEQ ID NO：4的保守HXXXGXXXXP基序中的S679-pksB ORF的pksB中位置4288处的甘氨酸的位置处的天冬氨酸；（b）在对应于SEQ ID NO：5的S12-pksB ORF中的位置3066至3070的位置处的保守LPFXW基序中的取代；（c）在SEQ ID NO：6的S679-pksA ORF的Pro 6844和Trp 6874之间的缺失；或（d）在对应于SEQ ID NO：7的A、B、C和D的位置处的取代或缺失。
在任何前述聚酮合酶的一些实施方案中，β-酮加工结构域是烯酰还原酶，其中所述烯酰还原酶在对应于SEQ ID NO：8中S12-pksB ORF的位置1546的位置处不包括赖氨酸和/或在对应于SEQ ID NO：8或9中S12-pksB的位置1568的位置处不包括天冬氨酸。
在另一个方面，本发明提供了嵌合聚酮合酶，其中与具有SEQ ID NO：10或11的序列的聚酮合酶相比，所述聚酮合酶的至少一个结构域已得到修饰，其中所述修饰导致改变的酶促活性。
在另一个方面，本发明提供了嵌合聚酮合酶，其中至少一个酮还原酶结构域（a）在对应于保守的YAAAN催化基序中的酪氨酸的位置处包括除酪氨酸外的氨基酸，并且不包括SEQ ID NO：1中保守的αFG螺旋；（b）在对应于SEQ ID NO：2中S9-pksA ORF的丙氨酸6632的位置处包括谷氨酸残基；或（c）不包括对应于SEQ ID NO：3的WT S12-pksB ORF的氨基酸3386至3516的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了嵌合聚酮合酶，其中至少一个脱水酶结构域（a）在对应于SEQ ID NO：4的保守HXXXGXXXXP基序中S679-pksB ORF的pksB中的位置4288处的甘氨酸的位置处的天冬氨酸；（b）包括在对应于SEQ ID NO：5中的S12-pksB ORF中的位置3066至3070的位置处的保守LPFXW基序中的取代；（c）包括在对应于SEQ ID NO：6的S679-pksA ORF的Pro 6844和Trp 6874之间位置的缺失；或（d）包括在对应于SEQ ID NO：7的A、B、C和D的位置处的取代或缺失。
在另一个方面，本发明提供了嵌合聚酮合酶，其中至少一个烯酰还原酶结构域不包括在对应于SEQ ID NO：8中的S12-pksB ORF的位置1546的位置处的赖氨酸和/或在对应于SEQ ID NO：8或9中的S12-pksB的位置1568的位置处的天冬氨酸。
在另一个方面，本发明提供了嵌合聚酮合酶，其包括与以下的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的结构域：(a) SEQ ID NO: 12、13或14；(b) SEQ ID NO: 15、16或17；(c)SEQ ID NO: 18、19或20；(d) SEQ ID NO: 21、22或23；(e) SEQ ID NO: 24、25、26或27；(f)SEQ ID NO: 28、29、30或31；(g) SEQ ID NO: 32、33、34或35；或者(h) SEQ ID NO: 36或37。
在一些实施方案中，本发明的聚酮合酶的至少一个烯酰还原酶结构域由与SEQ IDNo：35-36中任何一个具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）序列同一性的核酸编码。
在另一个方面，本发明提供了编码任何前述聚酮合酶的核酸。
在本发明的一些实施方案中，核酸进一步编码LAL，其中所述LAL包括与SEQ IDNO：38的氨基酸序列具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）序列同一性的部分。在一些实施方案中，LAL包括具有SEQ ID NO：38的序列的部分。在一些实施方案中，LAL具有SEQ ID NO：38的序列。在一些实施方案中，核酸在至少一个开放读码框中缺乏TTA调节密码子。
在一些实施方案中，核酸进一步包括LAL结合位点，例如与SEQ ID NO：39（CTAGGGGGTTGC）的序列具有至少80%（例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）同一性的LAL结合位点。。在一些实施方案中，LAL结合位点包括SEQ ID NO：39的序列。在一些实施方案中，LAL结合位点具有SEQ ID NO：39的序列。在一些实施方案中，LAL结合位点包括序列SEQ ID NO：40（GGGGGT）。
在一些实施方案中，核酸进一步包括这样定位的开放读码框，使得LAL与LAL结合位点的结合促进开放读码框的表达。在一些实施方案中，开放读码框编码产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）。
在一些实施方案中，核酸进一步编码非核糖体肽合酶。在一些实施方案中，核酸进一步编码第一P450酶。在一些实施方案中，核酸进一步编码第二P450酶。
在一些实施方案中，表达载体包括任何前述核酸。在一些实施方案中，表达载体是人工染色体（例如，细菌人工染色体）。
在另一个方面，本发明提供了包括任何前述载体或聚酮合酶的宿主细胞。在一些实施方案中，聚酮合酶对于宿主细胞是异源的。
在本发明的一些实施方案中，宿主细胞（例如，天然缺乏LAL和/或LAL结合位点的宿主细胞）改造为表达重组LAL（例如，异源LAL）。在一些实施方案中，LAL是组成型活性的。在一些实施方案中，通过在核酸中插入LAL结合位点来改造宿主细胞。在一些实施方案中，重组LAL与LAL结合位点的结合促进核酸的转录（例如，编码产生化合物的蛋白质如聚酮合酶的核酸）。在一些实施方案中，LAL结合位点对于LAL是异源的。在一些实施方案中，LAL结合位点对于LAL是内源的。在一些实施方案中，LAL结合位点包括序列GGGGGT（SEQ ID NO：40）。
在一些实施方案中，宿主细胞包括核酸，其包括与开放读码框可操作地连接的异源LAL结合位点，使得LAL与异源LAL结合位点的结合促进开放读码框的表达。在一些实施方案中，异源LAL结合位点是合成的LAL结合位点。在一些实施方案中，异源LAL结合位点比促进与开放读码框可操作地连接的内源LAL结合位点更大的表达。在一些实施方案中，异源LAL结合位点包括C1-T2-A3-G4-G5-G6-G7-G8-T9-T10-G11-C12（SEQ ID NO：39）的至少8个邻接核苷酸，其中无一或除G4、G5、G6、G7、G8、T9和T10的任何三个核苷酸（例如，G4、G7和T9；G5、G8和T10；或G6、G7和G8）外的最多六个核苷酸替换为任何其它核苷酸。
在一些实施方案中，重组LAL包括与SEQ ID NO：38的序列具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%）序列同一性的部分。在一些实施方案中，重组LAL包括具有SEQ ID NO：38的序列的部分。在一些实施方案中，重组LAL具有SEQ IDNO：38的氨基酸序列。
在一些实施方案中，宿主细胞是细菌（例如，放线菌（actinobacterium）如生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens）、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）或马来亚链霉菌（Streptomyces malayensis）。在一些实施方案中，放线菌是S1391、S1496或S2441。
在一些实施方案中，宿主细胞已进行修饰，以增强产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）的表达。例如，在一些实施方案中，宿主细胞已通过以下进行修饰，以增强产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）的表达：（i）缺失表达产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）的内源基因簇；（ii）插入表达产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）的异源基因簇；（iii）宿主细胞暴露于抗生素攻击；和/或（iv）引入异源启动子，与同源启动子相比，所述异源启动子导致化合物的表达中的至少两倍增加。增强聚酮表达的另外方法是优化用于培养基的生长条件。这包括培养基的特定化学和营养组成，无论发酵是在液体还是固体培养基中进行、发酵的时间过程以及发酵运行的体积/规模。
在另一个方面，本发明提供了生产聚酮的方法，该方法包括在合适的条件下培养任何前述宿主细胞的步骤。
在另一个方面，本发明提供了产生聚酮的方法，该方法包括在适合于聚酮合酶产生聚酮的条件下，培养改造为表达任何前述聚酮合酶的宿主细胞的步骤。
在另一个方面，本发明提供了调节聚酮合酶的活性的方法，该方法包括以下步骤：（a）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸序列；以及（b）修饰亲本核酸序列的至少一个密码子，其中所述密码子指定亲本聚酮合酶的至少一个结构域的保守基序中的残基，其中所述修饰导致至少一个结构域的酶促活性或调节活性的改变（例如，改变导致结构域的失活）。
在另一个方面，本发明提供了产生化合物的方法，该方法包括以下步骤：（a）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸；（b）修饰亲本核酸的至少一个密码子（例如，编码β-酮加工结构域的核酸部分中的密码子），以产生编码能够产生化合物的修饰的聚酮合酶的修饰的核酸，其中所述密码子指定聚酮合酶的至少一个结构域的保守结构域中的残基，并且其中所述修饰导致聚酮合酶的至少一个结构域的酶促活性的改变；（c）将修饰的核酸引入宿主细胞；以及（d）在适合于允许通过修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下培养宿主细胞，从而产生化合物。
在另一个方面，本发明提供了产生化合物的方法，该方法包括以下步骤：（a）提供能够产生化合物的亲本聚酮合酶；（b）确定亲本聚酮合酶的氨基酸序列；（c）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸；（d）修饰亲本核酸的至少一个密码子，以产生编码能够产生化合物的修饰的聚酮合酶的修饰的核酸序列，其中所述密码子指定聚酮合酶的至少一个结构域（例如，β-酮加工结构域）的保守结构域中的残基，并且其中所述修饰导致至少一个结构域的酶促活性的改变（例如，活性降低）；（e）将修饰的核酸引入宿主细胞；（f）在适合于允许通过修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下培养宿主细胞；以及（g）回收通过修饰的聚酮合酶产生的化合物，从而产生化合物。
在另一个方面，本发明提供了产生化合物的方法，该方法包括以下步骤：（a）确定亲本聚酮合酶的结构；（b）产生编码亲本聚酮合酶的亲本核酸；（c）修饰核酸以产生编码修饰的聚酮合酶的修饰的核酸，其中所述修饰的聚酮合酶的至少一个结构域（例如，β-酮加工结构域）具有与亲本聚酮合酶相比改变的酶促活性（例如，降低的酶促活性）；（d）将修饰的核酸序列引入宿主细胞；以及（e）在适合于允许通过修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下培养宿主细胞，从而产生化合物。
在另一个方面，本发明提供了产生化合物文库的方法，该方法包括以下步骤：（a）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸序列；（b）修饰亲本核酸序列的至少一个密码子，以产生编码能够产生化合物的第一修饰的聚酮合酶的第一修饰的核酸；（c）修饰亲本核酸的至少一个密码子，以产生编码能够产生化合物的第二修饰的聚酮合酶的第二修饰的核酸，其中所述第一修饰的核酸和第二修饰的核酸是不同的；（d）将第一修饰的核酸和第二修饰的核酸序列引入一种或多种宿主细胞；以及（e）在适合于允许通过第一修饰的聚酮合酶和第二修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下培养一种或多种宿主细胞，从而产生化合物文库。
在另一个方面，本发明提供了通过任何前述方法产生的化合物。
定义
如本文使用的，术语“结构域的保守区域”指在其为活性的相同类型的所有结构域中基本上相同的聚酮合酶结构域的部分。
如本文使用的，术语“改造的聚酮合酶”用于描述其设计和/或生产涉及人为动作的非天然聚酮合酶。例如，在一些实施方案中，通过产生编码聚酮合酶的非天然多核苷酸来制备“改造的”聚酮合酶。
“改造以包含”和/或“改造以表达”的细胞指已进行修饰以包含和/或表达在细胞中并非天然存在的蛋白质的细胞。例如通过引入包括核酸的载体，通过引入编码蛋白质的核酸，可以将细胞改造为含有蛋白质。
如本文使用的，术语“功能性失活的”指聚酮合酶的结构域没有活性或具有低于检测点的活性。
如本文使用的，术语“产生小分子的基因簇”指编码一种或多种产生化合物的蛋白质的基因簇。
如本文使用的，术语“异源的”指并非天然存在的两种或更多种蛋白质、核酸、化合物和/或细胞之间的关系。例如，具有SEQ ID NO：38序列的LAL天然存在于S18链霉菌属（Streptomyces）菌株中，并且因此对于该菌株是同源的，因此对于S12链霉菌属菌株是异源的。
如本文使用的，术语“同源的”指天然存在的两种或更多种蛋白质、核酸、化合物和/或细胞之间的关系。例如，具有SEQ ID NO：38序列的LAL天然存在于S18链霉菌属菌株中，并且因此对于该菌株是同源的。
如本文使用的，术语“修饰的结构域”指聚酮合酶的结构域，其中至少一个氨基酸残基已从参考序列改变。
“聚酮合酶”指属于能够产生聚酮的多结构域酶家族的酶。聚酮合酶可以在细菌、真菌、植物或动物中天然表达。
如本文使用的，术语“重组”指使用合成方法产生的蛋白质。
如本文使用的，术语“参考聚酮合酶”指与改造的聚酮合酶的序列（除了其被修饰的结构域序列）具有至少80%同一性（例如，至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或100%同一性）的序列的聚酮合酶。
附图简述
图1是示出了通过聚酮合酶的聚酮生物合成的图。
图2A和2B是示出了通过聚酮合酶的结构域修饰丙二酰基β-酮的图。
图3是示出了聚酮的生物合成的图。
图4A和4B是示出了导致聚酮合酶中的失活结构域的突变的序列比对。
图5A是示出了酮还原酶结构域的失活的图。
图5B和5C是示出了通过修饰的聚酮合酶生成化合物的图。
图6A-6C是示出了通过修饰的聚酮合酶生成化合物的图。
图7A是通过修饰的聚酮合酶生成的化合物的图。
图7B是示出了通过修饰的聚酮合酶生成化合物的图表。
图7C是示出了化合物与CEP250的结合的图。
图7D是示出了化合物与CEP250结合的图表。
图8A是示出了用于测定粗提物中的化合物的靶ID方法的图。
图8B是示出了化合物与CEP250和CBY1的结合的图。
图9A是示出了聚酮合酶中的酮还原酶结构域的失活的图。
图9B是示出了通过聚酮合酶中的酮还原酶结构域的失活生成扩环化合物的图。
发明详述
本发明人已发现，导致失活的β-酮加工结构域（即酮还原酶（KR）、脱水酶（DH）和烯酰还原酶（ER）结构域）的聚酮合酶中的短蛋白质序列，可以移植到另一个聚酮合酶的活结构域上，以使结构域活性失活，并且改变由聚酮合酶产生的聚酮的化学结构。
化合物
可以用本发明的方法产生的化合物包括但不限于聚酮和聚酮大环内酯类抗生素如红霉素；杂合聚酮/非核糖体肽如雷帕霉素和FK506；碳水化合物包括氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素；苯并呋喃类化合物（benzofuranoids）；苯并吡喃类化合物（benzopyranoids）；黄酮类化合物；糖肽包括万古霉素；脂肽包括达托霉素；单宁类；木脂素类；多环芳香族天然产物、萜类化合物、甾类、甾醇类、噁唑烷酮类包括利奈唑胺；氨基酸、肽和肽抗生素包括多粘菌素、非核糖体肽、β-内酰胺类抗生素包括碳青霉烯、头孢菌素和青霉素；嘌呤、蝶啶、聚吡咯、四环素、喹诺酮和氟喹诺酮；和磺胺类。
蛋白质
聚酮合酶
聚酮合酶（PKS）是产生聚酮的多结构域酶家族。I型聚酮合酶是大型模块化蛋白质，其包括组构成模块的几个结构域。一般存在于聚酮合酶中的模块包括i）加载模块；ii）延伸模块；以及iii）取决于最终的聚酮是线性还是环状的释放和/或环化模块。一般在模块中发现的结构域是酰基转移酶、酰基载体蛋白、酮合酶、酮还原酶、脱水酶、烯酰还原酶、甲基转移酶、磺基水解酶（sulfhydrolase）和硫酯酶。
聚酮链和起始基团一般通过硫酯键与酮合酶结构域（聚酮链）和酰基转移酶结构域（加载基团和丙二酰基延伸单元）中的活性位点半胱氨酸的硫醇基团结合。与酰基载体蛋白（ACP）的结合由磷酸泛酰巯基基团的硫醇介导，其与ACP的丝氨酸羟基结合，以形成与生长的聚酮链的硫酯键。生长的聚酮链通过反式酰化从一个硫醇基团移交给另一个硫醇基团，并且在合成后通过水解或环化释放。
聚酮的合成由起始单元开始，所述起始单元加载到加载模块中由酰基转移酶催化的PKS的酰基载体蛋白结构域上。将延伸单元例如丙二酰辅酶A加载到由另一个酰基转移酶结构域催化的当前模块的酰基载体蛋白结构域上。然后，在从模块n的酰基载体蛋白结构域传递到n+1模块的酮合酶结构域之后，聚酮链通过后续延伸模块延长。酰基载体蛋白结合的延伸单元与结合到酮合酶结构域的聚酮链反应，伴随CO2的排出，以产生与酰基载体蛋白结合的延长的聚酮链。每个添加的延伸单元然后可以通过β-酮加工结构域，即酮还原酶（其将延伸基团的羰基还原为羟基）、脱水酶（其放出H2O以产生烯烃）和烯酰还原酶（其使烯烃还原以产生饱和烃）进行修饰。一旦聚酮的合成完成，释放模块中的硫酯酶结构域就从最后延伸模块的酰基载体蛋白水解完成的聚酮链。然后可以通过其它蛋白质（例如非核糖体肽合酶）进一步修饰从PKS释放的化合物。通过PKS合成聚酮的实例在图3中示出。在一些情况下（例如，雷帕霉素和X1，编码化合物1的簇），生物合成簇包含聚酮合酶和非核糖体肽合酶（NRPS）。该杂合体系结构被称为杂合PKS/NRPS。在雷帕霉素和化合物1的情况下，NRPS模块将哌啶酸酯（pipecolate）部分插入分子的FKBP12结合区中（图3）。
β-酮加工结构域
β-酮加工结构域是PKS中的结构域，其导致在聚酮合成期间添加的延伸基团的修饰。每个β-酮加工结构域能够改变延长基团的氧化状态。β-酮加工结构域包括酮还原酶（其将延伸基团的羰基还原为羟基）、脱水酶（其放出H2O以产生烯烃）和烯酰还原酶（其使烯烃还原以产生饱和烃类）。
非功能性结构域
β-酮修饰结构域的综合分析指示存在非功能性β-酮修饰结构域，其不影响聚酮的最终结构。这些结构域可能是“死亡的”（图3）。与使用功能相关结构域的晶体结构作为模板的同源性建模组合的蛋白质序列比对，揭示了这些非功能性结构域在关键的催化和底物结合基序中具有使其失活的突变（图4A和4B）。然而，这些“死亡的”结构域通过进化保留在基因簇中，提示它们反而起到结构作用，即维持模块中催化结构域的适当空间组构，用于有效的装配线聚酮合成。结构域活性可能已通过进化选择性地“关闭”，修饰了天然产物化学结构、蛋白质靶接合和进化分子的生理化学性质。
对于酮还原酶结构域水平改造，已分析了三个KR死亡结构域：来自S9的KR3、KR6-S303和KR3-S399。来自S9的KR3包括在保守的催化YAAAN基序附近的单个Ala至Glu取代。虽然不受理论束缚，但同源性建模（使用PDB 2FRO）提示，在该位置处的谷氨酸可能与附近的精氨酸形成盐桥，并且所得到的盐桥将阻断底物加帽区域（αFG）的移动性，并且防止酮还原酶促活性位点对聚酮底物的接近。S303和S399的死亡KR6结构域包括更显著的病变。在S303中，催化Tyr替换为Phe，并且αFG螺旋被缺失。在S399中，存在涵盖催化和底物结合残基的更大的150残基缺失。
在一些实施方案中，本发明的聚酮合酶的至少一个酮还原酶结构域由与SEQ IDNo：12-23中任何一个具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）序列同一性的核酸编码。
对于脱水酶结构域水平改造，分析了四个“死亡”DH结构域：S679-DH7、S12-DH6、S12-DH7、S679-DH4和S12-DH2。DH结构域的基本活性位点残基分布跨越四个关键的保守基序：HXXXGXXXXP、GYXYGPXF、DXXX（Q/H）和LPFXW。S679-DH7具有在HXXXGXXXXP基序中的单个Gly至Asp取代，其含有使聚酮底物去质子化以引发脱水反应的His残基。S12-DH6和S12-DH7具有在LPFXW基序中的取代。S679-DH4含有显著的内部缺失，并且S12-DH2具有在包含DH活性位点的所有四个关键基序中的突变。杂合PKS/NRPS簇如雷帕霉素需要羟基用于大环化，并且因此S12-DH2“死亡”DH结构域必须保持失活用于环化和生物活性。
在一些实施方案中，本发明的聚酮合酶的至少一个脱水酶结构域由与SEQ ID No：24-35中任何一个具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）序列同一性的核酸编码。
对于烯酰还原酶结构域水平改造，分析了来自S12和S61的两个ER结构域。两个死亡ER结构域均位于每个簇的加载模块中，并且因此与起始单元而不是丙二酰基衍生的聚酮链的化学相关。在两个死亡结构域中，不变的Lys-Arg二联体被取代或缺失。
在一些实施方案中，本发明的聚酮合酶的至少一个烯酰还原酶结构域由与SEQ IDNo：36或37具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）序列同一性的核酸编码。
LAL
LAL包括三个结构域：核苷酸结合结构域、诱导剂结合结构域和DNA结合结构域。包括LAL的调节蛋白结构类别的定义特征是AAA+ ATP酶结构域的存在。核苷酸水解与蛋白质和/或多聚化中的大构象变化偶联，并且核苷酸结合和水解代表控制LAL活性的“分子计时器”（例如，LAL活性的持续时间）。LAL通过小分子配体与诱导剂结合位点的结合激活。在大多数情况下，LAL的变构诱导剂是未知的。在相关蛋白质MalT的情况下，变构诱导剂是麦芽三糖。LAL蛋白的可能诱导剂包括在环境中发现的触发化合物（例如，聚酮）生物合成的小分子。LAL的调节控制产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）的产生，导致在外部环境刺激的存在下化合物（例如，聚酮）生产的活化。因此，产生小分子的基因簇（例如，PKS基因簇）虽然存在于菌株中，但不产生化合物，因为（i）LAL未被激活，（ii）该菌株具有不同于共有区的LAL结合位点，（iii）该菌株缺乏LAL调节剂，或（iv）LAL调节剂在实验室条件下可能表达不佳或不表达。由于已知PKS LAL的LAL的DNA结合区是高度保守的，因此已知的LAL可以互换使用以激活PKS基因簇，而不是它们天然调节的那些。在一些实施方案中，LAL是融合蛋白。
在一些实施方案中，可以修饰LAL以包括非LAL DNA结合结构域，从而形成包括LAL核苷酸结合结构域和非LAL DNA结合结构域的融合蛋白。在某些实施方案中，非LAL DNA结合结构域能够结合启动子，所述启动子包括这样定位的蛋白质结合位点，使得DNA结合结构域与启动子的蛋白质结合位点的结合促进目标基因（例如，编码产生化合物的蛋白质的基因，如本文所述）的表达。非LAL DNA结合结构域可以包括本领域已知的任何DNA结合结构域。在一些情况下，非LAL DNA结合结构域是转录因子DNA结合结构域。非LAL DNA结合结构域的实例包括但不限于基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）结构域、亮氨酸拉链结构域（例如基本的亮氨酸拉链结构域）、GCC盒结构域、螺旋-转角-螺旋结构域、同源结构域、srf样结构域、配对盒结构域、翼状螺旋结构域、锌指结构域、HMG-盒结构域、Wor3结构域、OB-折叠结构域、免疫球蛋白结构域、B3结构域、TAL效应结构域、Cas9 DNA结合结构域、GAL4 DNA结合结构域和本领域已知的任何其它DNA结合结构域。在一些情况下，启动子定位于目标基因的上游，使得融合蛋白可以与启动子结合，并且诱导或抑制目标基因的表达。在某些情况下，启动子是引入含有目标基因的核酸（例如，染色体、质粒、F粘粒或本领域已知的任何其它核酸构建体）的异源启动子。在其它情况下，启动子是定位于目标基因上游的预先存在的启动子。启动子内的蛋白质结合位点可以是例如非LAL蛋白质结合位点。在某些实施方案中，蛋白质结合位点结合非LAL DNA结合结构域，从而形成同源DNA结合结构域/蛋白质结合位点对。
在一些实施方案中，LAL由与SEQ ID No：41-62中任何一个具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）序列同一性的核酸编码，或具有与SEQ ID No：63-73中任何一个具有至少70%（例如，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%）序列同一性的序列。
LAL结合位点
在一些实施方案中，基因簇（例如，PKS基因簇）包括包含一个或多个LAL结合位点的一个或多个启动子。LAL结合位点可以包括多核苷酸共有LAL结合位点序列（例如，如本文所述）。在一些情况下，LAL结合位点包括核心AGGGGG（SEQ ID NO：74）基序。在某些情况下，LAL结合位点包括与SEQ ID NO：39具有至少80%（例如，80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%）同源性的序列。LAL结合位点可以包括已恢复以与共有区或优化的LAL结合位点的序列匹配的突变位点。在一些实施方案中，LAL结合位点是合成的LAL结合位点。在一些实施方案中，合成的LAL结合位点可以通过以下进行鉴定：（a）提供包括至少八个核苷酸的多种合成核酸；（b）使包括至少八个核苷酸的多种核苷酸中的一种或多种与一种或多种LAL接触；（c）确定步骤（a）的核酸与步骤（b）的LAL之间的结合亲和力，其中如果合成核酸和LAL之间的亲和力大于X，则合成核酸被鉴定为合成的LAL结合位点。然后可以将鉴定的合成LAL结合位点引入宿主细胞内产生化合物的簇（例如，PKS簇）中。
在一些实施方案中，可以通过以下来鉴定与天然对相比具有增加的表达的一对LAL结合位点和异源LAL或异源LAL结合位点和LAL：（a）提供一个或多个LAL结合位点，（b）使一个或多个LAL结合位点与一种或多种LAL接触；（c）确定LAL结合位点和LAL之间的结合亲和力，其中如果LAL结合位点与LAL之间的亲和力大于LAL结合位点与其同源LAL和/或在其同源LAL结合位点处的LAL之间的亲和力，则鉴定具有增加的表达的对。在一些实施方案中，LAL结合位点和LAL之间的结合亲和力通过确定包括LAL和LAL结合位点两者的细胞的蛋白质或化合物的表达来确定。
组成型活性LAL
在一些实施方案中，重组LAL是组成型活性LAL。例如，LAL的氨基酸序列已以这样的方式进行修饰，使得它不需要诱导剂化合物的存在，用于改变的LAL接合其同源结合位点，并且激活产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）的转录。组成型活性LAL对宿主细胞的引入可能导致产生化合物的蛋白质（例如，聚酮合酶）的表达增加，并且依次又增加相应化合物（例如聚酮）的产生。
改造单向LAL
FkPhD基因簇排列有由多重双向启动子-操纵子驱动的多顺反子体系结构，所述双向启动子-操纵子具有假定为LAL结合位点的保守的（以单个或多重，并且彼此反转和/或直接重复）GGGGGT（SEQ ID NO：40）基序。通过策略性地缺失相反的启动子之一，但维持串联LAL结合位点（如果天然启动子中LAL的结合是协调的，如对于MalT所证实的），可以将双向LAL启动子转换为单向的那种（UniLAL）。在功能上，这通过去除反义链（可能含有-35和-10启动子序列）上存在的保守GGGGGT（SEQ ID NO：40）基序3'的所有序列来实现，但使有义链上的整个序列完整留下。作为该缺失的结果，转录仅在一个方向上被激活。该前馈回路体系结构的优点是在链霉菌属营养和发酵生长条件的复杂生命周期期间调节和/或最大化LAL表达。
宿主细胞
在一些实施方案中，宿主细胞是细菌，例如放线菌。例如，在一些实施方案中，宿主细胞是链霉菌属菌株。在一些实施方案中，宿主细胞是环圈链霉菌（Streptomyces anulatus）、抗菌素链霉菌（Streptomyces antibioticus）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、波赛链霉菌（Streptomyces peucetius）、链球菌属物种ATCC 700974、暗灰链霉菌（Streptomyces canus）、结节链霉菌（Streptomyces nodosus）、链霉菌属（多个物种）、Streptoalloteicus hindustanus、吸水链霉菌、阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）、产绿色链霉菌（Streptomyces viridochromogenes）、轮枝链霉菌（Streptomyces verticillus）、教酒链霉菌（Streptomyces chartruensis）、链霉菌属（多个物种）、易变糖丝菌（Saccharothrix mutabilis）、郝氏链霉菌（Streptomyces halstedii）、棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus）、委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）、产玫瑰色链霉菌（Strteptomyces roseochromogenes）、东方拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis orientalis）、棒状链霉菌、利尻链霉菌（Streptomyces rishiriensis）、淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）、玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）、野野村氏菌属菌种（Nonomuraea sp.）、波赛链霉菌、红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）、菲律宾链霉菌（Streptomyces filipinensis）、吸水链霉菌、绛红色小单孢菌（Micromonospora purpurea）、吸水链霉菌、那波链霉菌（Streptomyces narbonensis）、卡那霉素链霉菌（Streptomyces kanamyceticus）、山丘链霉菌（Streptomyces collinus）、拉沙里链霉菌（Streptomyces lasaliensis）、林肯链霉菌（Streptomyces lincolnensis）、桔橙指孢囊菌（Dactosporangium aurantiacum）、毒三素链霉菌（Streptomyces toxitricini）、吸水链霉菌、褶皱链霉菌（Streptomyces plicatus）、淡紫灰链霉菌、加纳链霉菌（Streptomyces ghanaensis）、肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis）、金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）、纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）、恰塔努加链霉菌L10（Streptomyces chattanoogensis）、利迪链霉菌A02（Streptomyces lydicus）、弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）、生二素链霉菌、唐德链霉菌（Streptomyces tendae）、诺尔斯链霉菌（Streptomyces noursei）、阿维链霉菌、龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）、威德摩尔链霉菌（Streptomyces wedmorensis）、可可链霉菌（Streptomyces cacaoi）、始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）、始旋链霉菌、游动放线菌属物种（Actinoplanes sp.）ATCC 33076、吸水链霉菌、产气列契瓦尼尔氏菌（Lechevalieria aerocolonegenes）、地中海氏拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis mediterranei）、苍黄拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis lurida）、白色链霉菌（Streptomyces albus）、灰色链霉菌（Streptomyces griseolus）、壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）、刺糖多胞菌（Saccharopolyspora spinosa）、生二素链霉菌、Streptomyces staurosporeus、灰色链霉菌、链霉菌属（多个物种）、Streptomyces acromogenes、筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）、垣霉素游动放线菌（Actinoplanes teichomyceticus）、淡青链霉菌（Streptomyces glaucescens）、龟裂链霉菌、牲畜链霉菌（Streptomyces cattleya）、远青链霉菌（Streptomyces azureus）、印度异壁链霉菌（Streptoalloteicus hindustanus）、教酒链霉菌、弗氏链霉菌、天蓝色链霉菌、吸水链霉菌、链霉菌属11861、弗吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）、Amycolatopsis japonicum、糖肽霉素拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis balhimycini）、白色链霉菌J1074、天蓝色链霉菌M1146、变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）、因卡那特链霉菌（Streptomyces incarnates）、紫红链霉菌（Streptomyces violaceoruber）或灰褐链霉菌（Streptomyces griseofuscus）。在一些实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属（Escherichia）菌株，例如大肠杆菌（Escherichia coli）。在一些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属（Bacillus）菌株，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。在一些实施方案中，宿主细胞是假单胞菌属（Pseudomonas）菌株，例如恶臭假单胞菌（Pseudomonas putitda）。在一些实施方案中，宿主细胞是粘液球菌属（Myxococcus）菌株，例如黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）。
方法
本发明的蛋白质、核酸、载体和宿主细胞可以用于生产化合物（例如聚酮）。将异源结构域引入蛋白质允许改变通过蛋白质产生的聚酮的化学结构。
异源结构域的引入
可以通过引入来自其它聚酮合酶的结构域序列来改变β-酮加工结构域的活性。可以测试多重异源序列改变特定结构域活性，而不急剧减少所表达的聚酮量的能力。可以使聚酮合酶的新变体经受严格的质量控制（目标区域的Sanger测序、基于PCR的“平铺”以确认簇完整性、以及Illumina测序以测序整个BAC）。然后可以将BAC与两种优化的链霉菌生产菌株缀合，并且可以用纯化的FKBP12蛋白使固相提取的（SPE）样品经受自上而下的质谱法，以鉴定产生的化合物。
从嵌合聚酮合酶生成化合物的工作流的代表性实例包括使用基于同源性的克隆，将来自一种聚酮合酶的结构域（例如酮还原酶结构域）的短肽序列移植到另一种聚酮合酶上。例如，一种酮还原酶的催化Tyr可以替换为Phe，并且活性位点αFG环也可以缺失，以使该结构域失活。然后可以将所得到的克隆缀合到链霉菌属表达宿主内且发酵。然后可以使用未分级的SPE样品的比较LC-TOF分析来鉴定化合物。自上而下的质谱法分析还可以通过共注射纯化的天然FKBP12和来自修饰的聚酮合酶的化合物与来自未修饰的聚酮合酶的化合物来执行。该分析可以显示两种化合物之间的质量差异，其与结构域活性中的变化一致，例如，对于失活的酮还原酶结构域差异为2。
可以使用KR、DH或ER单一变体的组合生成具有多重结构变化的化合物。
改造的聚酮合酶文库的生产
可以通过在单个蛋白质主链上组合多重结构域水平变体来执行组合结构域水平改造，因此允许用于药物开发的多种PKS/NRPS分子的文库规模构建。
可替代地，多重并行改造（例如，通过定点诱变）可以用于产生用于药物开发的改造PKS/NRPS分子的文库。例如，编码亲本聚酮合酶的多核苷酸的定点诱变可以用于并行生成编码多种改造的聚酮合酶的多种多核苷酸。在一些实施方案中，多种改造的聚酮合酶各自包括相对于亲本聚酮合酶的至少一种密码子修饰（例如，指定亲本聚酮合酶的至少一个结构域的保守基序中的残基的密码子）。
通过单分子长读测序表征改造的PKS文库
在本发明的一些实施方案中，单分子长读测序技术（例如，纳米孔测序或SMRT测序）可以用于表征通过本文所述的任何方法产生的改造的聚酮合酶或非核糖体肽合酶的文库。特别地，单分子长读测序（例如，纳米孔测序或SMRT测序）可以用于表征（例如，解卷积）改造的聚酮合酶或非核糖体肽合酶的组合或多重文库（例如，通过并行改造生成的多重文库）。单分子长读测序允许鉴定掺入组合文库内的一个或多个模块。这进一步允许预测所得到的多种改造的聚酮合酶或非核糖体肽合酶的化学。预测的酶促化学因此可以与由改造的聚酮合酶或非核糖体肽合酶产生的化合物相关联。可以通过本领域技术人员已知的化学分析方法（例如，质谱法或高效液相层析）鉴定所得到的化合物。此外，预测的酶促化学可以与所得到的化合物的功能（例如，与靶蛋白结合或诱导表型，例如基于细胞的表型）相关联。相应地，遗传编码分子的长读测序可以允许基因型-表型连锁。
单分子长读测序技术可以被认为包括任何测序技术，其允许测序单分子生物聚合物（例如多核苷酸如DNA或RNA），并且允许大于2千碱基（例如，大于5千碱基、大于10千碱基、大于20千碱基、大于50千碱基或大于100千碱基）的读取长度。单分子长读测序技术可以允许并行地测序DNA或RNA的多重单分子。单分子长读测序技术可以包括依赖待测序的每个DNA或RNA分子的个别区室化的测序技术。
纳米孔测序是示例性单分子长读测序技术，其可以用于表征通过本文描述的任何方法制备的改造的聚酮合酶或非核糖体肽合酶的文库。纳米孔测序允许单分子生物聚合物（例如多核苷酸如DNA或RNA）的长读测序。纳米孔测序依赖设置在电阻聚合物膜中的蛋白质纳米孔。通过跨越该膜设定电压使离子电流穿过纳米孔。如果分析物（例如生物聚合物如DNA或RNA）穿过孔或在其小孔附近穿过，则该事件产生特征性的电流中断。跨越纳米孔表面的电流密度的幅度取决于占据纳米孔的DNA或RNA（例如，特定碱基）的组成。因此，电流的测量使得能够鉴定所讨论的分子的序列。
单分子实时（SMRT）测序（PacBio）是示例性单分子长读测序技术，其可以用于表征通过本文所述的任何方法制备的改造的聚酮合酶或非核糖体肽合酶的文库。SMRT是并行化的单分子DNA测序方法。SMRT利用零模式波导（ZMW）。将单个DNA聚合酶附着在ZMW的底部，用DNA的单分子作为模板。ZMW是产生的照明观察体积足够小，仅能观察到通过DNA聚合酶掺入的DNA的单个核苷酸的结构。四种DNA碱基各自与四种不同荧光染料之一附着。当通过DNA聚合酶掺入核苷酸时，荧光标签被切除并且扩散出ZMW的观察区域，其中其荧光不再可观察。检测器检测核苷酸掺入的荧光信号，并且根据染料的相应荧光进行碱基调用。
实施例
实施例1. 酮还原酶结构域的失活
使用基于同源性的克隆，将来自S303-KR6的短肽序列移植到X1-KR6上。催化Tyr替换为Phe（以红色显示），并且还缺失活性位点αFG环（以蓝色显示）（图5A）。将所得到的克隆缀合到链霉菌属表达宿主内且发酵。化合物1和C16-酮-化合物1的未分级SPE样品的比较LC-TOF分析指示新化合物具有608.35的所需M+H质量（图5B）。然后我们通过共注射纯化的天然FKBP12和化合物1或C16-酮-化合物1来执行自上而下的质谱法分析。该分析再次显示2的质量差异，与在C16处羟基至酮的转换一致（图5C）。将C16-酮-化合物1在大规模下再发酵，纯化至同质性，并且通过NMR光谱确认结构。
实施例2. 脱水酶和烯酰还原酶结构域的失活
使用来自实施例1的方案，产生化合物1的PKS中的DH和ER结构域被成功地失活，如图6A中所示。
实施例3. 多重结构域的同时灭活
使用来自实施例1的方案，使两个结构域同时失活，如图6B中所示。
此外，比较了E-06（KR6*） - 通过使模块6的KR结构域失活生成的C16-酮-化合物1化合物、以及E36（DH4*） - 通过使模块4的DH结构域失活生成的羟基-化合物1类似物的表达概况。当将验证的KR和DH修饰组合在单一构建体上时，所得到的组合化合物E-74(KR6*-DH4*)以良好的产率产生625.36的预期的化合物质量，如通过自上而下的测定检测的（图6c）。
实施例4. 恒定区的改造
雷帕霉素/FK506“恒定区”是结合FKBP12的大环内酯环的保守部分。产生化合物1的PKS中的DH8通过使LPFXW基序突变而失活，以生成在恒定区的吡喃环中具有羟基的化合物2（图7A）。通过自上而下的测定观察到611.38的预期质量（图7B），其证实化合物2保留了FKBP12结合亲和力。通过结晶溶解FKBP12：化合物2：CEP250复合物（图7C）的结构。该结构确认（1）FKBP12：CEP250界面可以容纳吡喃环上羟基的添加，（2）新安装的-OH基团的立体化学，并且如预期的，（3）还保留了CEP250结合。与化合物2相比，如通过TR-FRET测量的，FKBP12依赖性与化合物2结合的CEP250增加（图7D）。
上文数据确定了结构域水平改造，以生成保留生物学功能（即靶蛋白结合）的PKS天然产物的化学新型衍生物的实用性。
实施例5. 组合结构域改造
开发了基于胰蛋白酶肽的FKBP12亲和富集和LC-MS/MS测序的优化的靶-ID测定，其允许鉴定粗提取物中化合物的蛋白质靶（图8A）。靶-ID分析确认化合物1结合CEP250和CBY1Ain 293T裂解产物两者，而化合物3，化合物1的组合化合物衍生物，选择性结合CBY1而不结合CEP250。基于质谱法的靶-ID结果用TR-FRET数据进行验证。TR-FRET测定确认CBY1与化合物1结合（图8B）。数据还确认化合物3对于CBY1是特异性的，并且不能再接合CEP250。此外，化合物2（图7A）对于CEP250而不是CBY1是特异性的。通过NMR确认化合物3的结构，其指示经由上述结构域水平的改造方法成功地使KR6、DH4和ER5结构域失活。化合物2在恒定区中也缺乏第三羰基，提示CypB（化合物1生物合成中的最终定制步骤）不能利用化合物2作为生产底物。
上述数据证实，结构域水平改造导致具有“重编程”或改变的靶结合的化合物，并且因此可以利用结构域改造来生成具有新潜在生物学功能的分子。
实施例6. 起因于酮还原酶失活的扩环
产生化合物1的PKS的模块3-6中的每个KR结构域被系统地失活。测试了六种序列使KR结构域失活的能力（图9A）。出乎意料的是，观察到化合物4（化合物中的+44质量），所述化合物进行纯化并且通过NMR测定结构。该结构指示，不是通过使KR5失活来安装酮，而是将化合物4的环大小扩展2个碳，对应于经由PKS链延伸的另外一轮丙二酰基掺入（图9B）。产生得到化合物4的化合物1的PKS中的结构域水平化合物变体是在保守的催化YAAAN基序附近的KR5中的单个Ala至Glu取代。该突变可以阻止酮还原酶活性位点的接近，并且在这样做时，可以改变在下一个聚酮延长循环中的模块内结构域-结构域切换和模块间转移之间的动力学平衡。该模型预测模块迭代作为KR5突变的结果是有利的，这导致另外的丙二酰基掺入事件和扩大的环大小。
其它实施方案
应当理解，虽然本发明已结合其详细描述进行描述，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和改变在下述权利要求的范围内。
本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过例行实验确定根据本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价物。本发明的范围并非旨在限制于上文描述，而是如所附权利要求中所述。
在权利要求中，冠词如“一个”、“一种”和“该/所述”可以意指一个/种或多于一个/种，除非上下文指出相反或在其它方面显而易见。如果一个、多于一个或所有组成员在给定产物或过程中存在、采用或以其它方式相关，则认为在组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足的，除非上下文指出相反或在其它方面显而易见。本发明包括其中该组的恰好一个成员在给定产物或过程中存在、采用或以其它方式相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或所有组成员在给定产物或过程中存在、采用或以其它方式相关的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在是开放的并且允许但不要求包括另外的元件或步骤。当术语“包含”在本文中使用时，因此也涵盖且公开了术语“由……组成”。
当给出范围时，包括端点。此外，应理解，除非上下文和本领域普通技术人员的理解指出相反或在其它方面显而易见，否则表示为范围的值可以采取在本发明的不同实施方案中的所述范围内的任何特定值或子范围，至范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
另外，应理解，落入现有技术内的本发明的任何特定实施例可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。由于此类实施例被认为是本领域普通技术人员已知的，因此即使在本文中未明确阐述排除，也可排除它们。出于任何原因，本发明的组合物的任何特定实施例（例如，由其编码的任何多核苷酸或蛋白；任何生产方法；任何使用方法）可以从任何一个或多个权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在相关。

Claims (66)

1.一种改造的聚酮合酶，其包含一个或多个修饰的结构域，所述一个或多个修饰的结构域相对于包含未修饰的结构域的参考聚酮合酶具有改变的酶促活性，其中所述改造的聚酮合酶能够在适合于允许通过所述改造的聚酮合酶表达化合物的条件下表达时产生聚酮。
2.权利要求1的改造的聚酮合酶，其中所述聚酮合酶包含具有改变的酶促活性的两个或更多个修饰的结构域。
3.权利要求1或2的改造的聚酮合酶，其中至少一个修饰的结构域具有降低的酶促活性。
4.权利要求3的改造的聚酮合酶，其中至少一个修饰的结构域是功能性失活的。
5.权利要求1至4中任一项的改造的聚酮合酶，其中所述修饰的结构域是β-酮加工结构域。
6.权利要求5的改造的聚酮合酶，其中所述β-酮加工结构域是酮还原酶、脱水酶或烯酰还原酶。
7.权利要求6的改造的聚酮合酶，其中所述β-酮加工结构域包含与SEQ ID NO：1-9中任何一个的保守区域具有至少90%序列同一性的部分。
8.权利要求6的改造的聚酮合酶，其中所述β-酮加工结构域是酮还原酶，其中所述酮还原酶（a）在对应于保守的YAAAN催化基序中的酪氨酸的位置处包含除酪氨酸外的氨基酸，并且不包含SEQ ID NO：1中保守的αFG螺旋；（b）在对应于SEQ ID NO：2中S9-pksA ORF（S9中的变化）的丙氨酸6632的位置处包含谷氨酸残基；或（c）不包含对应于SEQ ID NO：3的WT S12-pksB ORF的氨基酸3386至3516的氨基酸。
9.权利要求6的改造的聚酮合酶，其中所述β-酮加工结构域是脱水酶，其中所述脱水酶包含（a）在对应于SEQ ID NO：4的保守HXXXGXXXXP基序中的S679-pksB ORF的pksB中位置4288处的甘氨酸的位置处的天冬氨酸；（b）在对应于SEQ ID NO：5的S12-pksB ORF中的位置3066至3070的位置处的保守LPFXW基序中的取代；（c）在SEQ ID NO：6的S679-pksA ORF的Pro 6844和Trp 6874之间的缺失；或（d）在对应于SEQ ID NO：7的A、B、C和D的位置处的取代或缺失。
10.权利要求6的改造的聚酮合酶，其中所述β-酮加工结构域是烯酰还原酶，其中所述烯酰还原酶在对应于SEQ ID NO：8中S12-pksB ORF的位置1546的位置处不包含赖氨酸和/或在对应于SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中S12-pksB的位置1568的位置处不包括天冬氨酸。
11.一种聚酮合酶，其包括：
（a）包含第一聚酮合酶的结构域的保守区域的第一结构域；和
（b）包含第二聚酮合酶的结构域的保守区域的第二结构域。
12.权利要求11的聚酮合酶，其中所述第一结构域和所述第二结构域中的至少一个是β-酮加工结构域。
13.权利要求11或12的聚酮合酶，其中所述第一结构域和所述第二结构域均为β-酮加工结构域。
14.权利要求12或13的聚酮合酶，其中所述β-酮加工结构域是酮还原酶、脱水酶或烯酰还原酶。
15.权利要求11至14中任一项的聚酮合酶，其中所述第一结构域和所述第二结构域中的至少一个是功能性失活的结构域。
16.权利要求15的聚酮合酶，其中所述第一结构域和所述第二结构域均为功能性失活的结构域。
17.权利要求11至16中任一项的聚酮合酶，其中所述聚酮合酶包含（c）第三聚酮合酶的结构域的保守区域或第二聚酮合酶的第二结构域的保守区域。
18.权利要求17的聚酮合酶，其中所述第三结构域是功能性失活的结构域。
19.权利要求11-18中任一项的聚酮合酶，其中所述聚酮合酶包含（d）第四聚酮合酶的结构域的保守区域、第三聚酮合酶的第二结构域的保守区域或第二聚酮合酶的第三结构域的保守区域。
20.权利要求19的聚酮合酶，其中所述第四结构域是功能性失活的。
21.权利要求15至20中任一项的聚酮合酶，其中所述功能性失活的结构域包含SEQ IDNO：1-9中任何一个的保守区域的氨基酸序列。
22.一种嵌合聚酮合酶，其中与具有SEQ ID NO：10或11的序列的聚酮合酶相比，所述聚酮合酶的至少一个结构域已得到修饰，其中所述修饰导致改变的酶促活性。
23.一种嵌合聚酮合酶，其中至少一个酮还原酶结构域（a）在对应于保守的YAAAN催化基序中的酪氨酸的位置处包含除酪氨酸外的氨基酸，并且不包含SEQ ID NO：1中保守的αFG螺旋；（b）在对应于SEQ ID NO：2中S9-pksA ORF的丙氨酸6632的位置处包含谷氨酸残基；或（c）不包含对应于SEQ ID NO：3的WT S12-pksB ORF的氨基酸3386至3516的氨基酸。
24.一种嵌合聚酮合酶，其中至少一个脱水酶结构域（a）在对应于SEQ ID NO：4的保守HXXXGXXXXP基序中S679-pksB ORF的pksB中的位置4288处的甘氨酸的位置处的天冬氨酸；（b）包含在对应于SEQ ID NO：5中的S12-pksB ORF中的位置3066至3070的位置处的保守LPFXW基序中的取代；（c）包含在对应于SEQ ID NO：6的S679-pksA ORF的Pro 6844和Trp6874之间位置的缺失；或（d）包含在对应于SEQ ID NO：7的A、B、C和D的位置处的取代或缺失。
25.一种嵌合聚酮合酶，其中至少一个烯酰还原酶结构域不包含在对应于SEQ ID NO：8中的S12-pksB ORF的位置1546的位置处的赖氨酸和/或在对应于SEQ ID NO：8或9中的S12-pksB的位置1568的位置处的天冬氨酸。
26.一种嵌合聚酮合酶，其包含与以下的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的结构域：(a) SEQ ID NO: 7、8或9；(b) SEQ ID NO: 10、11或12；(c) SEQ ID NO: 13、14或15；(d) SEQ ID NO: 16、17或18；(e) SEQ ID NO: 19、20、21或22；(f) SEQ ID NO: 23、24、25或26；(g) SEQ ID NO: 27、28、29或30；或(h) SEQ ID NO: 31或32。
27.一种核酸，其编码权利要求1至26中任一项的聚酮合酶。
28.权利要求27的核酸，其中所述核酸进一步编码LAL，其中编码所述LAL的序列与编码所述聚酮合酶的序列可操作地连接。
29.权利要求28的核酸，其中所述LAL是异源LAL。
30.权利要求28或29的核酸，其中LAL包含与SEQ ID NO：38具有至少80%同一性的部分。
31.权利要求30的核酸，其中所述LAL包含具有SEQ ID NO：38序列的部分。
32.权利要求31的核酸，其中所述LAL具有SEQ ID NO：38的序列。
33.权利要求28至32中任一项的核酸，其中编码所述LAL的核酸在开放读码框中缺乏TTA抑制密码子。
34.权利要求27至33中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含LAL结合位点，其中编码所述LAL结合位点的序列与编码所述聚酮合酶的序列可操作地连接。
35.权利要求34的核酸，其中所述LAL结合位点包含与SEQ ID NO：39的序列具有至少80%序列同一性的部分。
36.权利要求35的核酸，其中所述LAL结合位点包含具有SEQ ID NO：39序列的部分。
37.权利要求36的核酸，其中所述LAL结合位点具有SEQ ID NO：39的序列。
38.权利要求34的核酸，其中所述LAL结合位点具有序列GGGGGT（SEQ ID NO：40）。
39.权利要求34至38中任一项的核酸，其中所述LAL与所述LAL结合位点的结合促进所述聚酮合酶的表达。
40.权利要求27至39中任一项的核酸，其中所述核酸进一步编码非核糖体肽合酶。
41.权利要求27至40中任一项的核酸，其中所述核酸进一步编码第一P450酶。
42.权利要求41的核酸，其中所述核酸进一步编码第二P450酶。
43.一种表达载体，其包含权利要求27至42中任一项的核酸。
44.权利要求43的表达载体，其中所述表达载体是人工染色体。
45.权利要求44的表达载体，其中所述人工染色体是细菌人工染色体。
46.一种宿主细胞，其包含权利要求43至45中任一项的表达载体。
47.一种宿主细胞，其包含权利要求1至26中任一项的聚酮合酶，其中所述聚酮对于所述宿主细胞是异源的。
48.权利要求46或47的宿主细胞，其中所述宿主细胞天然缺乏LAL。
49.权利要求46至48中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞天然缺乏LAL结合位点。
50.权利要求46至49中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含能够结合LAL结合位点且调节聚酮合酶表达的LAL。
51.权利要求50的宿主细胞，其中所述LAL是异源的。
52.权利要求50或51的宿主细胞，其中所述LAL包含与SEQ ID NO：38的序列具有至少80%同一性的部分。
53.权利要求46至52中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌。
54.权利要求53的宿主细胞，其中所述细菌是放线菌。
55.权利要求54所述的宿主细胞，其中所述放线菌是生二素链霉菌、吸水链霉菌或马来亚链霉菌。
56.权利要求55的宿主细胞，其中所述放线菌是S1391、S1496或S2441。
57.权利要求46至56中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞已进行修饰以增强聚酮合酶的表达。
58.权利要求57的宿主细胞，其中所述宿主细胞已通过以下进行修饰，以增强产生化合物的蛋白质的表达：（i）缺失表达产生化合物的蛋白质的内源基因簇；（ii）插入表达产生化合物的蛋白质的异源基因簇；（iii）宿主细胞暴露于抗生素攻击；和/或（iv）引入异源启动子，与同源启动子相比，所述异源启动子导致化合物的表达中的至少2倍增加。
59.一种产生聚酮的方法，所述方法包括在合适的条件下培养权利要求46至58中任一项的宿主细胞。
60.一种产生聚酮的方法，所述方法包括在适合于聚酮合酶产生聚酮的条件下，培养改造为表达权利要求1至26中任一项的聚酮合酶的宿主细胞。
61.一种调节聚酮合酶的活性的方法，所述方法包括：
（a）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸序列；和
（b）修饰亲本核酸序列的至少一个密码子，其中所述密码子指定亲本聚酮合酶的至少一个结构域的保守基序中的残基；和
其中所述修饰导致所述至少一个结构域的酶促活性或调节活性的改变。
62.一种产生化合物的方法，所述方法包括：
（a）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸；
（b）修饰亲本核酸的至少一个密码子，以产生编码能够产生化合物的修饰的聚酮合酶的修饰的核酸，其中所述密码子指定聚酮合酶的至少一个结构域的保守结构域中的残基，并且其中所述修饰导致聚酮合酶的至少一个结构域的酶促活性的改变；
（c）将所述修饰的核酸引入宿主细胞；和
（d）在适合于允许通过修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下，培养所述宿主细胞；
从而产生化合物。
63.一种产生化合物的方法，所述方法包括：
（a）提供能够产生化合物的亲本聚酮合酶；
（b）确定亲本聚酮合酶的氨基酸序列；
（c）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸；
（d）修饰亲本核酸的至少一个密码子，以产生编码能够产生化合物的修饰的聚酮合酶的修饰的核酸序列，其中所述密码子指定聚酮合酶的至少一个结构域的保守结构域中的残基，并且其中所述修饰导致至少一个结构域的酶促活性的改变；
（e）将所述修饰的核酸引入宿主细胞；
（f）在适合于允许通过修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下，培养所述宿主细胞；和
（g）回收通过所述修饰的聚酮合酶产生的化合物；
从而产生化合物。
64.一种产生化合物的方法，所述方法包括：
（a）确定亲本聚酮合酶的结构；
（b）产生编码所述亲本聚酮合酶的亲本核酸；
（c）修饰核酸以产生编码修饰的聚酮合酶的修饰的核酸，其中所述修饰的聚酮合酶的至少一个结构域具有与亲本聚酮合酶相比改变的酶促活性；
（d）将所述修饰的核酸序列引入宿主细胞；和
（e）在适合于允许通过修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下，培养所述宿主细胞；
从而产生化合物。
65.一种产生化合物文库的方法，所述方法包括：
（a）提供编码亲本聚酮合酶的亲本核酸序列；
（b）修饰亲本核酸序列的至少一个密码子，以产生编码能够产生化合物的第一修饰的聚酮合酶的第一修饰的核酸；
（c）修饰亲本核酸的至少一个密码子，以产生编码能够产生化合物的第二修饰的聚酮合酶的第二修饰的核酸，其中所述第一修饰的核酸和第二修饰的核酸是不同的；
（d）将所述第一修饰的核酸和所述第二修饰的核酸序列引入一种或多种宿主细胞；和
（e）在适合于允许通过第一修饰的聚酮合酶和第二修饰的聚酮合酶表达化合物的条件下，培养所述一种或多种宿主细胞；
从而产生化合物文库。
66.一种化合物，其通过权利要求59至65中任一项的方法产生。
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