CN110501508B - Pvy-cp作为筛选防治马铃薯y病毒的药物的靶标及其应用 - Google Patents

Pvy-cp作为筛选防治马铃薯y病毒的药物的靶标及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因的功能与应用领域领域，涉及一种PVY‑CP作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标及其应用。本发明提供一种筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标，所述靶标是马铃薯Y病毒外壳蛋白即PVY‑CP。本发明还提供一种马铃薯Y病毒外壳蛋白即PVY‑CP作为药物靶标在筛选防治马铃薯Y病毒的药物中的应用。本发明进一步提供一种以马铃薯Y病毒外壳蛋白即PVY‑CP为靶标的防治马铃薯Y病毒的药物。本发明针对PVY‑CP在病毒传播过程中的作用机制，首次将PVY‑CP作为潜在抗病毒药剂的作用靶标，对药物活性小分子进行体外筛选，进行药剂小分子在烟草活体植株内的活性检测，结合蛋白免疫印迹法证明了PVY‑CP可以作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标。

Description

PVY-CP作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标及其应用
技术领域
本发明涉及一种PVY-CP作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标及其应用，属于基因的功能与应用领域。
背景技术
近年来，植物病毒病害在农业生产过程中给农产品质量和数量带来了巨大损失，其中以马铃薯Y病毒(Potato virus Y，即PVY)引起的病毒病害尤为严重。PVY侵染植株的方式为系统侵染。植株感染了PVY之后在田间可呈现出不同的发病症状，这与PVY病毒株系、作物品种以及当地的气候条件等因素息息相关。一般来说，植株在发病初期的时候，会出现叶片明脉的现象，随后叶脉的脉间颜色会逐渐变浅，最后形成系统斑驳，出现花叶症状。而有的植株在发病的时候，叶脉会出现暗褐色或者黑色的坏死组织，坏死的部分通常会延伸到中部的叶脉或者茎秆部分，导致叶片皱缩并向内卷曲，出现出脉坏死症状。当植株感病情况严重时，坏死部分的病原菌还会进入茎的维管束组织，这时候植株的茎秆产生褐色坏死组织，出现茎秆坏死症状。
根据PVY侵染植株之后在寄主上表现出来的症状的不同，可以大致将PVY分为三个株系：普通株系、脉坏死株系以及点条纹株系。同样的株系在不同的寄主体内它们也会表现出不同的症状。当马铃薯被不同株系的PVY侵染后，普通株系会引起皱缩，脉坏死株系会引起一定程度的斑驳，而点条纹株系则会引起过敏反应。当烟草被侵染后，普通株系会出现系统斑驳症状，脉坏死株系会出现程度较为严重的系统脉坏死症状，而点条纹株系则会引起不同程度的系统斑驳症状。
虽然目前对马铃薯Y病毒病害的基础研究有所进展，市面上也有少数几种药剂能有效地治理该种病害，但其具体的作用机理尚不清楚，导致研发针对该病原体的特效药剂难度极大。如何有效地筛选抗PVY药物是防治马铃薯病毒病害的关键问题，因此建立一个以PVY关键蛋白为潜在靶标的药物的筛选模型，寻找高活性的抗PVY药物，对防治马铃薯病毒病害具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种PVY-CP作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标及其应用。
本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标，所述靶标是马铃薯Y病毒外壳蛋白即PVY-CP。
第二方面，本发明提供一种马铃薯Y病毒外壳蛋白即PVY-CP作为药物靶标在筛选防治马铃薯Y病毒的药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种以马铃薯Y病毒外壳蛋白即PVY-CP为靶标的防治马铃薯Y病毒的药物。
优选地，所述药物是病毒唑。
PVY-CP在病毒粒子的装配以及病毒侵染全过程中起着重要作用。假如高活性小分子与目标蛋白之间存在强烈相互作用，就会直接导致蛋白质无法发挥其相应的生理活性，从而破坏病毒RNA复制和和病毒粒子的组装过程，结果必将大大减少病毒对植物的危害。
本发明的有益效果是：本发明针对PVY-CP在病毒传播过程中的作用机制，首次将PVY-CP作为潜在抗病毒药剂的作用靶标，对药物活性小分子进行体外筛选，将筛选出的药剂小分子与PVY-CP进行分子对接后寻找药剂与PVY-CP的活性结合位点，同时使用农杆菌介导法将目标蛋白转入本氏烟中，进行药剂小分子在烟草活体植株内的活性检测，结合蛋白免疫印迹法证明了PVY-CP可以作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标。
附图说明
图1为MST分析PVY-CP与抗病毒剂之间的相互作用，(A)RTC滴定PVY-CP；(B)AOBO滴定PVY-CP；
图2为MST分析PVY-CP与抗病毒剂之间的相互作用，(A)COS滴定PVY-CP；(B)BTH滴定PVY-CP；
图3为ITC分析PVY-CP与抗病毒剂之间的相互作用，(A)空白背景；(B)RTC滴定PVY-CP；
图4为PVY-CP与WMV-CP氨基酸序列对比；
图5为分子对接；
图6为农杆菌介导的PVY-CP表达情况。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对发明进行进一步介绍：
一、实验材料
(一)质粒与表达菌株
PVY购于中国科学院武汉病毒研究所；
BL21(DE3)RIL株系购于Takara公司；
本氏烟，普通烟K326可在贵州大学农学院人工气候温室培养得到。
(二)供试蛋白和抗植物病毒小分子
PVY-CP蛋白表达和纯化；苯并噻二唑和盐酸吗啉胍由广西田园提供；氨基寡糖素购于广西北海国发海洋生物农药有限公司；病毒唑购于杭州民生药业有限公司。
(三)主要缓冲溶液的配制方法
LB固体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，8g琼脂粉，二次水1000mL，充分震荡，使其混合均匀，调节PH至7.4，再于121℃条件下灭菌20min，放至常温冷却备用；
LB液体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，二次水1000mL，充分震荡，使其混合均匀，调节PH至7.4，再于121℃条件下灭菌20min，放至常温冷却备用；
1M Tris-HCl溶液：称取121.14g的Tris固体，加入800mL二次水，待溶解完全后使用盐酸调节PH为8.0，最后使用二次水定容至1000mL即可；
75％的乙醇溶液：量取750mL无水乙醇溶液，加入250mL二次水，搅拌均匀即可；
0.1M CaCl2溶液：称取11.1gCaCl2固体，加入1000mL二次水，搅拌溶解即可；
0.02mM CaCl2溶液：称取2.22gCaCl2固体，加入1000mL二次水，搅拌溶解即可；
0.2M PB溶液：称取NaH2PO4·2H2O固体10.06g，Na2HPO4·12H2O固体48.54g，加入800mL二次水，充分震荡，使其混合均匀，调节PH为7.4，定容至1000mL；
0.01M PB溶液：量取0.2M的NaH2PO4溶液39mL与0.2M的Na2HPO4溶液61mL混合，加入二次水稀释20倍，充分震荡，使其混合均匀后调节PH至7.4，定容至2000mL；
2×聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液：分别称取SDS固体0.4g，溴酚蓝固体0.1mg，分别量取0.5M Tris-HCl 2.5mL(PH 6.8)，甘油2mL，β-巯基乙醇0.2mL，最后加入二次水5.2mL，充分震荡，使其混合均匀，放置室温备用；
5×电泳缓冲液：分别称取Tris固体15.1g，甘氨酸94g，SDS5.0 g，加入二次水约800mL，充分震荡，使其混合均匀，最后定容至1000mL，室温保存备用；
结合缓冲溶液(buffer A)：50mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，10％甘油，PH 8.0；
洗脱缓冲溶液(buffer B)：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，300mM Imidazole，10％甘油，PH 8.0；
裂解缓冲溶液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1％β-巯基乙醇，10％甘油，PH 8.0；
脱盐缓冲溶液：2mM DTT，10mM PB，150mM NaCl，PH 7.5。
PBST溶液：量取0.01M的PB溶液1000mL，加入3gNaCl,3mL吐温-20，充分搅拌溶解即可；
5％的脱脂奶粉溶液(用PBST配置)：称取2.5g脱脂奶粉，加入50mLPBST溶液，充分搅拌均匀，使其溶解即可。
二、PVY-CP的载体构建
(一)烟草总RNA的提取
1.将普通烟K326植株保持在24℃的人工温室中，设置条件为16小时的光照和8小时的黑暗循环，成熟的烟草植物接种PVY，三周后，挑选叶子用于RNA的提取实验；
2.称取感病的烟草绿叶大约100mg，加入液氮，研磨成粉状，将研磨好的粉末转移到灭酶的1.5mL离心管中，再加入1mL的RNAiso Plus，悬浮均匀；
3.将悬浮液置于离心机中离心5min，设置条件为4℃，12000rpm；
4.将上清液转移至1.5mL RNAase离心管中；
5.向转移出的上清液中加入体积浓度为20％的氯仿，充分悬浮使其混合均匀，于室常温下静置5min，直至出现液体分层现象；
6.将混合液置于离心机中离心15min，条件为4℃，12000rpm；
7.将上清液转移至1.5mLRNAase离心管中；
8.向转移出的上清液加入等体积的异丙醇，充分悬浮使其混合均匀，于-20℃下静置20min；
9.将混合液置于离心机中离心10min，条件为4℃，12000rpm；
10.丢弃上清液，向沉淀中加入75％的乙醇溶液1mL，充分悬浮使其混合均匀；
11.将混合液置于离心机中离心5min，条件为4℃，12000rpm；
12.丢弃上清液，于常温下放置5min,使残余的乙醇溶液充分挥发；
13.向剩余沉淀中加入30μl经过灭酶处理的二次水。
(二)cDNA的合成
将总RNA稀释至10μg/μL的浓度，并通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，根据TaKaRa公司的cDNA Synthesis System试剂盒合成cDNA第一链。
取感病烟草RNA约1g，分别加入5×Prime ScriptTM Buffer、Prime ScriptTMEnzyme Mix、Oligo dNTPrimer和Random 6mers，最终加RNase free H2O至20μL(反应体系参照TakaRa试剂盒说明书)。设置仪器条件为37℃，15min后进行反转录反应；再设置85℃，5s为反转录酶的失活反应的条件。
(三)PCR扩增
根据NCBI中提交的序列设计扩增PVY-CP所需引物，并送到上海生工生物进行合成，如下表所示：
PVC-CP-F：CGggatccATGCATGCCCGGTGGTAGCAGC；
PVC-CP-R：CCGctcgagCTCGAGCATATTTTTCACACCCAGC；
上述引物分别如SEQ ID NO.1、2所示
以合成的cDNA为模板和2对PVY-CP鉴定特异性引物进行PCR扩增，并分别加入10×PCR Bufffer、MgCl2(25mmol/L)、dNTP(10mmol/L)和Taq酶(5U/μL)，最终加去离子水至25μL。扩增条件为：94℃3min，20个循环，94℃50s，65℃50s，72℃50s，每个循环的退火温度降低1℃。然后在94℃下进行25个循环50s，55℃进行50s，72℃进行50s，最终孵育时间为10min。反应结束后，取5μL PCR扩增产物进行0.8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
DNA分子量为标准判断目的基因的片段是否扩增。将PCR产物进行回收、纯化，将纯化后的PCR产物送至大连宝生物公司进行测序，并采用NCBI在线BLSAT比对软件进行序列分析。
(四)T4 ase酶连接PVY-CP基因和pET28a质粒
将双酶切的PVY-CP基因和pET28a质粒用T4 ase酶进行酶连接反应，同时进行无目的基因空白对照组。
表1 PVY-CP基因和pET28a质粒酶连体系
Figure BDA0002187234060000061
(五)双酶切PVY-CP基因和pET28a质粒
pET28a质粒和回收的PVY-CP目的基因进行BamH I、Xho I两种酶的双酶切反应。这两种限制性内切酶均采购于宝生物公司。根据下表分别加入各种反应物后，在37℃条件下进行酶切反应，约2-3h，反应完后于60℃灭活15min。
表2双酶切PVY-CP基因和pET28a质粒
Figure BDA0002187234060000062
三、PVY-CP的表达纯化
(一)感受态细胞的制备
1.从新活化的平板中挑取单克隆菌落，接种到含有100mL LB培养基的干净离心管中，于37℃，200rpm条件的摇床上培养4h左右，直到OD 600为0.45；
2.将样品放置于冰上约10min；
3.将菌液置于离心机中离心15min，条件为4℃，4000rpm；
4.丢弃上清液，加入30mL预冷的0.1M CaCl2溶液，充分重悬细胞；
5.将混合液置于离心机中离心4min，条件为4℃，5000rpm；
6.丢弃上清液，再次加入4℃提前预冷的0.02M CaCl2-0.08M MgCl2溶液2mL，再次重悬细胞；
7.将重悬的细胞悬浊液进行分装，并使用液氮速速冷冻，放置于-80℃冰箱条件下保存备用。
(二)pET28a-His-PVY-CP重组质粒的转化
1.在超净工作台无菌条件下，取100μL的感受态细胞BL 21(DE 3)RIL加入2μL的pET28a质粒；
2.将样品放置于冰上约30min；
3.将水浴锅设置为42℃，待温度到42℃后将样品热激80s；
4.将样品放置于冰上约2min；
5.向装有样品的离心管中加入900μL含有卡那抗生素的LB液体培养基；
6.将菌液置于摇床中培养45min，仪器设置为150rpm；
7.将菌液置于离心机中离心5min，仪器设置为4000rpm，离心结束后丢弃900μL上液清，充分重悬菌体，用移液器吸取100μL菌液涂于LB固体平板上；
8.将培养皿放入37℃培养箱中过夜培养。
(三)PVY-CP的表达
1.在长出单克隆菌落的平板上挑取单克隆体，向灭菌的50mL离心管中加入10mLLB液体培养基和30ng/mL卡那抗生素，于37℃，200rpm的摇床上培养过夜；
2.当测菌液的OD 600到达0.65时，加入1M IPTG，之后放置于16℃，200rpm的摇床上培养约14h；
3.将菌液置于离心机中离心25min，仪器设置为5000rpm，丢弃上清液，收集菌体；
4.放置于冰上约10min，向离心管中加入裂解缓冲溶液约40mL，置于冰上重悬10min；
5.使用超声细胞破碎仪进行细胞破碎，超声条件设置为：40％power，超声4s停6s，连续超声35min；
6.将超声好的悬浮液装入灭菌的离心管中，于4℃，12,000rpm条件下的离心机中离心30min，保留上清，另将20μL上清液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳检测。
(四)PVY-CP的纯化
1.将提前配制的溶液(结合缓冲液和洗脱缓冲液)用0.22μm水系微孔滤膜进行抽滤除固体杂质，并超声除气泡；
2.用20％的乙醇溶液清洗蠕动泵约10mL，再用二次水清洗泵约10mL，清洗完后用BufferA冲洗Ni柱约20mL，将离心得到的上清液过Ni柱约2h；
3.用蛋白亲和层析系统对Ni柱进行梯度洗脱；
4.洗脱完后，依次使用20％的乙醇溶液和二次水清洗纯化系统，约50mL；
5.将出峰位置处的蛋白流出液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，筛选目标蛋白存在的流出液；
6.用10KDa超滤管将目的蛋白进行浓缩；
7.使用脱盐柱对浓缩后的目的蛋白进行脱盐操作：
8.将得到的蛋白再次进行12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，并将目的蛋白用液氮速冻，放置于-80℃冰箱保存。
四、PVY-CP的验证
(一)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证PVY-CP
采用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化得到的蛋白样品进行凝胶验证，电泳凝胶的配方如表3。
电泳步骤如下：
1.向20mL的2×SDS上样缓冲液中加入20mL的蛋白样品，充分混合均匀；
2.将混合液置于100℃条件下水浴10min；
3.向凝胶的样品槽中加入15μL变性后的样品，将电泳条件设置为：浓缩胶90V，20min；分离胶120V，约80min；
4.电泳完成后取出凝胶，用考马斯亮蓝染料对凝胶进行染色处理，染色完成后考马斯亮蓝脱色液进行脱色处理，待脱色完成后，观察蛋白条带。
表3 12％SDS-PAGE电泳胶的配制
Figure BDA0002187234060000091
(二)通过高分辨质谱仪鉴定PVY-CP目的蛋白
1.将SDS-PAGE凝胶块裁剪成1mm 3左右的胶块，装入干净的10mL离心管中；
2.用50％的乙腈溶液以及100mM的NH 4 HCO 3(pH 8.0)溶液缓慢冲洗胶块约10min，重复清洗3次，丢弃清洗溶液；
3.用Speed Vac将胶块表面的液体吸干；
4.将蛋白胶块侵泡在10mM的DTT溶液以及50mM的NH4HCO3(PH 8.0)混合液中，缓慢地逐渐升温至56℃，之后再吸干胶块表面的液体；
5.将蛋白胶块浸泡在55mM的咪唑溶液以及50mM的NH4HCO3(PH 8.0)混合液中，在黑暗处于室温下侵泡大约30min，之后再吸干胶块表面的液体；
6.将胶块用100mL的10mM NH4HCO3溶液缓慢清洗约10min，清洗完后吸干胶块表面溶液；
7.用100mL的乙腈溶液缓慢冲洗洗约10min，清洗完后吸干胶块表面溶液；
8.用Speed Vac将胶块表面液体充分抽干，大约5min；
9.向装有胶块的离心管中加入5mL稀释后的Promega trypsin酶溶液，使酶溶液完全浸没胶块；
10.加入大量的10mM NH 4 HCO 3溶液约20mL，使其足以覆盖泡胀的胶块；
11.于37℃的条件下侵泡过夜；
12.加入等体积的60％ACN和5％甲酸水混合溶液，超声振荡约10min；
13.于20000g的条件下离心大约40min，留存上清液；
14.向剩余胶块加入约80mL的60％ACN/5％甲酸水溶液，超声振荡约10min；
15.于20000g的条件下离心大约40min，与上一次留存的上清液混合；
16.将收集保存的上清液抽干后，将残留滤渣溶于30μL 0.1％的甲酸水溶液中，上质谱仪器，进行检测。
五、PVY-CP与抗病毒药剂的相互作用研究
(一)ITC研究PVY-CP蛋白与抗病毒小分子的相互作用
样品制备：若抗病毒小分子为水溶性化合物，则可以直接用PBS缓冲液溶解，若抗病毒小分子为难溶性化合物，则应该先用DMSO溶解，再用PBS缓冲液稀释至所需浓度。注意，溶剂药剂时要始终保证DMSO最终的体积浓度不高于药液总体积的5％；而且蛋白的缓冲液与溶解小分子的缓冲液必须为同一种溶液。ITC的仪器条件应该初步设置为：参照功率5μcal/s，25℃，搅拌器转速750rpm/min总注射次数20次。
(二)MST研究PVY-CP蛋白与抗病毒小分子的相互作用
本实验将采用Monolith NT.115微量热泳动仪对病毒唑(RTC)、盐酸吗啉胍(AOBO)、氨基寡糖(COS)和苯并噻二唑(BTH)等抗病毒小分子与PVY-CP的相互作用进行研究。
在实验开始前，应该将药物进行浓度梯度的稀释，配制为16个不同浓度的药液(500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015μM)，配制好的药物与荧光染料标记的PVY-CP进行黑暗下的孵育，约30min。
MST的仪器参数应该设置为：LED power 40％，Laser power 30％，Red激发
六、高活性药剂的体内活体验证
(一)农杆菌感受态的制备
农杆菌感受态细胞的制备
1.取-80℃保存的pYBA1132菌液于利福平和卡那霉素的LB固体平板上划线，置于28℃培养箱中培养过夜；
2.待长出单菌落后，挑取单菌落接种于灭菌离心管中，加入5mL LB液体培养基，于200rpm 28℃条件下的摇床中培养12～14h；
3.吸取2mL菌液于灭菌离心管中，并加入100mL LB液体培养基，于28℃220rpm条件下的摇床中培养约5h，直至OD 600为0.5；
4.将菌液完全转移到无菌的50mL离心管中，置于冰上大约15-30min；
5.于3,000rpm，4℃条件下的离心机中，离心约5min，丢弃上清；
6.向保留的沉淀中加入提前预冷过的CaCl2溶液10mL，缓慢轻柔地悬浮细胞体；
7.将悬浮液于冰上放置约20min；
8.于4℃，5000rpm条件下的离心机中，离心约5min，丢弃上清；
9.向50mL悬浮液中加入2mL提前预冷的的CaCl2溶液，缓慢轻柔地悬浮细胞体；
10.将农杆菌悬浮液分装于无菌灭酶离心管中，每管约100μL，保存于-80℃条件下备用。
(二)农杆菌转化
电击法转化农杆菌
1.在洁净操作台内，放置冰盒，取1ul质粒加入到100μl感受态细胞中，轻柔地混匀；
2.将样品混合均匀后转入干净灭菌的电击杯中，电击转化；
3.在电击杯中加入无抗生素的LB液体培养基约300μl，轻柔地混匀；
4.将混匀后的菌液转移进灭菌的1.5mL的离心管中；
5.于28℃，180rpm条件下的摇床中培养约4h；
6.取培养后的菌体悬浊液大约100μl涂布于含有利福平和卡那霉素的LB固体平板上；
7.将培养皿倒置后放入28℃的培养箱中培养3d。
(三)农杆菌注射
1.挑取转化后的pYBA1132-PVY-CP(wt)农杆菌单菌落于灭菌离心管中，加入5mLLB液体培养基以及50μg/mL的利福平和卡那霉素，于28℃，180rpm条件下的摇床中培养约2d；
2.以1％的比例加入10mM的MES溶液、40μL的乙酰丁香酮、50μg/mL的利福平和卡那霉素，以及10mL的LB液体培养基，于28℃，180rpm条件下的摇床中培养约16h；
3.将菌液置于20℃，4000rpm条件下的离心机中离心约10min，丢弃上清液；
4.向沉淀中加入10mM的MgCl2和MES溶液，悬浮菌体，调整OD 600至1,5。
5.使用同样的操作手段将含有P19的农杆菌悬浮液浓度OD 600调整至1.5；
6.将上述两种农杆菌悬浮液等体积混合之后，置于室温下黑暗处约3h；
7.用注射器吸取农杆菌悬浮液注射进烟草业片内，观察叶片生长情况。
(四)喷施药剂并进行WB分析
1.向表现出病症的新鲜叶片喷施候选药剂病毒唑，于3d后选取新鲜叶片，进行WB。
2.取少量叶片组织，加入液氮，充分研磨破碎；
3.加入0.5mL含有PMSF的蛋白提取液，充分震荡，使其混合均匀，后放置于冰上静置约10min；
4.将混合液置于离心机中离心15min，条件为4℃，15000g；
5.将上清液转移至干净的灭酶的离心管中，放置于冰上；
6.向沉淀中再次加入0.5mL含有PMSF的蛋白提取液，充分震荡，使其混合均匀，后放置于冰上静置约10min；
7.将混合液置于离心机中离心15min，条件为4℃，15000g；
8.将第二次离心得到的上清液转移至含有第一次得到的上清液的离心管
中，两次上清液的总和即为提取到的总蛋白；
9.取一定量的蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳凝胶鉴定；
10.电泳完成后拆除玻璃板，取出凝胶，将多余的胶(包括溴酚蓝条带和空白胶)水平切除；
11.用直尺测量出切除后的胶的长和宽，用裁纸刀裁剪出6张稍大一点的滤纸和一张PVDF膜；
12.将裁减好的PVDF膜用甲醇侵泡30s，取出后用二次水侵泡3-5min，最后放入转膜缓冲液中保存备用；
13.将胶块和裁剪好的滤纸全部放置在转膜缓冲液中侵泡大约5min，保存备用；
14.在胶夹板的黑色板面上依次平整无气泡的铺上海绵、三层滤纸、胶块、PVDF膜、三层滤纸，操作务必保证滤纸和膜边缘整齐平整；
15.将胶板夹放入转移电泳槽中，向电泳槽内加入转膜缓冲液直至淹没胶块；
16.将电泳槽放置于冷凝柜中，冷凝柜温度设置为4℃；
17.开始转膜操作，将电泳仪设置为75V、60mA、12h；
18.电泳结束后，取出PVDF膜，置于干净的试剂盒内，加入丽春红染色溶液，侵泡大约30s,取出后用灭菌后的二次水缓慢冲洗两遍；
19.将PVDF膜放置于50mL灭菌的离心管内，加入5％的脱脂奶粉溶液50mL，放置于4℃冷凝柜中大约12h；
20.将过夜的溶液丢弃，加入3％的脱脂奶粉溶液3mL和一抗3μL，放置于室温下，孵育2h；
21.使用PBST溶液缓慢冲洗PVDF膜，重复大约3次，每次大约5min；
22.将冲洗的溶液丢弃后，加入3％的脱脂奶粉溶液3mL和二抗3μL，放置于室温下，孵育2h；
23.使用PBST溶液缓慢冲洗PVDF膜，重复大约3次，每次大约5min；
24.将冲洗的溶液丢弃后，加入HRP的化学发光底物，静置约5min；
25.在暗室中用X-光片检测发光信号。
七、结果验证
(一)pET28a-PVY-CP重组载体的验证
用双酶切验证pET28a-PVY-CP重组载体，双酶切后产生了与PVY-CP大小相当的条带以及空质粒条带，可以看出说明pET28a-PVY-CP(wt)重组载体构建成功。
将双酶切后验证重组成功的重组质粒送到上海生工生物公司进行基因序列测定，将得到的测序结果与NCBI中已经提交的序列进行比对分析。比对结果表明，送检的PVY-CP序列与其他已提交的基因序列(GenBank登录号AAV63981.1)有98％的基因相似性。所有结果均可证明，构建的pET28a-PVY-CP(wt)重组质粒已经成功。
(二)PVY-CP蛋白的鉴定
取纯化时出峰位置的蛋白流出液和脱盐后的样品进行煮沸变性后，使用12％SDS-PAGE电泳，经过Ni-NAT亲和柱纯化得到明显条带，其大小符合目标蛋白的大小36KDa。脱盐后的蛋白流出液，其大小同样符合目标蛋白的大小36KDa，初步可以将纯化得到的目标蛋白确定为PVY-CP。并且通过对肽段进行比对分析，送于鉴定的肽段样品与已报道的PVY-CP覆盖率高达62.7％，结果表明纯化的蛋白为PVY-CP。
(三)抗病毒药剂与PVY-CP体外互作研究
1、MST研究抗病毒药剂与PVY-CP体外互作
用MST技术研究病毒唑(RTC)、盐酸吗啉胍(AOBO)、氨基寡糖(COS)和苯并噻二唑(BTH)和PVY-CP之间的相互作用。通过MST研究发现抗病毒剂病毒唑对PVY-CP有强相互作用。RTC与PVY-CP之间的解离常数是Kd＝4.56μM。抗病毒剂盐酸吗啉胍对PVY-CP有弱相互作用，AOBO与PVY-CP之间的解离常数是Kd＝77.5μM(图1)。因此本实验的后续实验将使用抗病毒剂病毒唑作为药剂筛选的阳性对照。
通过MST研究发现抗病毒剂COS和BTH与PVY-CP的实验结果无法进行线性拟合，因此推断COS和BTH与PVY-CP无相互作用(图2)。
2、ITC研究抗病毒药剂与PVY-CP体外互作
通过MST研究发现病毒唑与PVY-CP在体外存在互作，因此将使用ITC研究验证药剂小分子与蛋白之间的互作关系。将PVY-CP分别与药液的溶剂和RTC药液进行ITC滴定分析，结果如图3所示。对得到的数据结果进行分析处理后，得到结合常数Ka＝2.47×103，该结果与MST结果相符合，综合两次的实验数据可以表明，RTC与PVY-CP在体外存在互作。
3、药物小分子与PVY-CP分子对接情况
使用同源模建的方法，进行PVY–CP结构的模拟构建。通过比对发现，PVY-CP与Watermelon mosaic virus(WMV)CP同源性为66.41％(图4)，因此根据WMV-CP构建了PVY-CP的三维结构。
将建立的模型与活性小分子进行分子对接，分子对接情况见图5。RTC的活性基团深入到精氨酸(R)153、精氨酸(R)179、天冬氨酸(D)197和赖氨酸(K)217等氨基酸残基形成的活性口袋中，初步推断该药物小分子与这四个氨基酸之间同时存在不同程度的结合力。
(四)高活性药剂的体内活体验证
采用农杆菌介导法并结合WB手段探究PVY-CP在本氏烟活体植株内的表达情况，实验结果如下图6。结果显示，随着抗病毒剂病毒唑的喷施浓度逐渐增加，PVY-CP的蛋白条带逐渐变暗，而对照组无明显变化。此实验结果表明了在活体植株内，病毒唑对PVY-CP的表达有一定的抑制作用。
核苷酸系列表：
<110>贵州大学
<120>PVY-CP作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标及其应用
<160>2
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CGggatccAT GCATGCCCGG TGGTAGCAGC 30
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CCGctcgagC TCGAGCATAT TTTTCACACC CAGC 34
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州大学
<120> PVY-CP作为筛选防治马铃薯Y病毒的药物的靶标及其应用
<160> 2
<210>1
<211>30
<212> DNA
<213>人工序列
<400>1
CGggatccAT GCATGCCCGG TGGTAGCAGC 30
<210>2
<211>34
<212> DNA
<213>人工序列
<400>2
CCGctcgagC TCGAGCATAT TTTTCACACC CAGC 34

Claims (1)

1.马铃薯Y病毒外壳蛋白即PVY-CP作为药物靶标在筛选防治马铃薯Y病毒的药物中的应用，其特征在于，所述药物的筛选方法为：PVY-CP 作为潜在抗病毒药剂的作用靶标，使用如SEQ ID NO.1、2所示的引物扩增PVY-CP ，对药物活性小分子进行体外互作筛选，筛选具有强相互作用的药物；将筛选出的药物小分子与PVY-CP 进行分子对接，得到目标蛋白；使用农杆菌介导法将目标蛋白转入本氏烟中，进行药物小分子在烟草活体植株内的活性检测，筛选对 PVY-CP 的表达有一定抑制作用的药物作为防治马铃薯Y病毒的药物，所述药物是病毒唑。
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