CN110501449B - 一种坎地沙坦酯基因毒性杂质的检测方法 - Google Patents

一种坎地沙坦酯基因毒性杂质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种坎地沙坦酯基因毒性杂质1‑氯乙基环己基碳酸酯的分析方法，属于原料药分析技术领域。本发明利用坎地沙坦酯中自身存在的杂质1‑氯乙基环己基碳酸酯与坎地沙坦酯本身进行衍生反应的柱前衍生化方法，测定杂质1‑氯乙基环己基碳酸酯含量，实现了对坎地沙坦酯中基因毒性杂质1‑氯乙基环己基碳酸酯的控制。本发明提供了一种坎地沙坦酯中该基因毒性杂质的检测方法，为坎地沙坦酯制剂的质量控制提供了保障。

Description

一种坎地沙坦酯基因毒性杂质的检测方法
技术领域
本发明涉及一种坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的分析方法，属于原料药质量控制技术领域。
背景技术
基因毒性杂质与药品质量、安全性密切相关，基因毒性杂质的存在可能会对人体产生毒副作用，甚至引起基因突变或者癌症等。因此，必须通过适当的检测分析方法控制药物中基因毒性杂质的种类和含量，确保药品质量。
坎地沙坦酯是一种选择性血管紧张素II受体（ATI）拮抗剂，适用于原发性高血压，化学名为（±）-l-[(环己氧基）羰基氧基]乙基 2-乙氧基-1 -[ [2’-(1H-四氮唑基-5-基）联苯-4-基] 甲基]-1H-苯并咪唑-7-羧酸酯，化学结构式如下：
Figure 292370DEST_PATH_IMAGE001
。
目前，常用的坎地沙坦酯合成工艺为：
Figure 396461DEST_PATH_IMAGE002
Figure 176198DEST_PATH_IMAGE003
Figure 509091DEST_PATH_IMAGE004
Figure 8949DEST_PATH_IMAGE005
.。
1-氯乙基环己基碳酸酯是合成坎地沙坦酯的原料，因含有基因毒性结构，根据药品注册法规，需要在坎地沙坦酯原料药中对1-氯乙基环己基碳酸酯进行检测。因1-氯乙基环己基碳酸酯紫外吸收极弱，且遇水会降解，而坎地沙坦酯在高温条件下也会降解，同时作为基因毒性杂质，要求其限度极低，根据该药制剂的用法用量，上述基因毒性杂质的限度为47ppm。
文献《Method development and validation by GC-MS for quantification of1-chloroethyl cyclohexyl carbonate as a genotoxic impurity in candesartancilexetil drug substance》（Nalavade Atul Kakasaheb, Ramakrishna K,Srinivasarao V.Method Development and Validation by GC-MS for Quantificationfor 1-Chloroethyl Cyclohexyl Caronate as a Genotoxic Impurity in CandesartanCilexetil Drug Substance. International Journal of Pharmacy andPhermaceutical Sciences.2014,vol6,Issue11:370-372）中采用GC-MS检测杂质1-氯乙基环己基碳酸酯，文献采用丙酮做溶剂，存在以下缺陷：一是在丙酮中坎地沙坦酯不溶解；二是坎地沙坦酯在170℃以上高温条件下会降解，降解物质进入质谱检测器，重复进样会干扰杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测，并污染检测器，导致检测结果不准确。且使用气相-质谱检测器，价格昂贵，限制了方法的推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较高精密度的坎地沙坦酯中基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法。
通过高效液相柱前衍生法对样品前处理、流动相、色谱条件等反复筛选，探索出了合适的分析条件。
本发明利用坎地沙坦酯中自身存在的杂质1-氯乙基环己基碳酸酯与坎地沙坦酯本身进行衍生反应的柱前衍生化方法，测定杂质1-氯乙基环己基碳酸酯含量，实现了对坎地沙坦酯中基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的控制，保证了坎地沙坦酯原料药的质量。
本发明的技术方案是：
一种坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，包括以下步骤：
步骤1. 采用衍生化法制备样品溶液：
在碱性条件下，以碘化钾做催化剂，坎地沙坦酯原料药与自身存在的1-氯乙基环己基碳酸酯反应，水浴加热至40-80℃并搅拌，生成衍生物1与衍生物2。反应方程式如下：
Figure 831411DEST_PATH_IMAGE006
。
后处理过程：将反应瓶中的反应液用滤纸过滤，保留滤液作为供试品溶液。
所述搅拌为磁旋子搅拌加热3-8h，更优选的，所述水浴加热温度为60℃，磁旋子搅拌加热3h。反应溶剂选自N,N-二甲基乙酰胺。
因衍生条件下，1M的杂质1-氯乙基环己基碳酸酯与坎地沙坦酯反应，会生成1M的衍生物1或者1M的衍生物2，杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的分子量为206.67，衍生物1、衍生物2的分子量均为780.35，根据杂质1-氯乙基环己基碳酸酯与衍生物1/衍生物2的分子量，折合换算系数为：0.265:1，故杂质1-氯乙基环己基碳酸酯检出量为衍生物1与衍生物2检出量之和乘以0.265。
所述碱性条件用碳酸钾控制，为分析纯试剂。
取坎地沙坦酯供试品2-10g，优选的，取坎地沙坦酯供试品2g ，加入的碳酸钾的量为0.4g-1.0g，碘化钾的量为0.04g-0.20g， 加入3-8ml N,N-二甲基乙酰胺，加热反应。
本发明检测方法衍生过程中溶剂与坎地沙坦酯的比例、衍生温度及衍生时间对检测结果中基因毒性杂质的回收率有很大影响。通过研究发现，衍生过程中溶剂与坎地沙坦酯的比例为（2-2.5）ml：1g时回收率最好，衍生温度为60℃，反应3小时时反应最完全。
所述后处理过程为：反应液用滤纸过滤，用乙腈冲洗反应瓶并过滤，滤液置于100ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀。
再精密量取5ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
步骤2. 对照品溶液的制备：
分别取坎地沙坦酯衍生物1和坎地沙坦酯衍生物2的对照品，加乙腈溶解后制成分别含坎地沙坦酯衍生物1和坎地沙坦酯衍生物2的溶液，作为对照品溶液。
坎地沙坦酯衍生物1和坎地沙坦酯衍生物2对照品由申请人根据药品注册法规自行制备。
具体的，包括以下步骤：
分别精密称定衍生物1和衍生物2对照品各约18mg，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；再精密量取1ml对照品贮备液，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
步骤3. 检测：
采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，依据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中坎地沙坦酯衍生物1和衍生物2的含量。
色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为十八烷基硅烷键和硅胶柱，检测波长为208-212nm，流速：0.6-1.0ml/min。流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱。
所述高效液相色谱法的色谱条件为：检测波长为210nm，流速：0.8ml。梯度洗脱，分析时间50min。
所述梯度洗脱的具体程序为（见表1）：
第0-27min，A相：B相体积比为45:55-10:90；
第27-40min，A相：B相体积比为10:90；
第40-41min，A相：B相体积比为10:90-45:55；
第41-50min，A相：B相体积比为45:55。
表1 洗脱梯度表
Figure 98445DEST_PATH_IMAGE007
。
所述高效液相色谱法还包括有以下条件：柱温：25-40℃，优选为30℃；进样量5-50μl，优选为10μl。
所述确定供试品溶液中衍生物1、衍生物2的成分含量的方法为外标法。所述外标法是指：按各品种项下的规定，精密称取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积，按下式计算衍生物1和衍生物2的含量。
含量(Cx)＝Ax*CR/AR
式中：Ax为供试品的峰面积；
AR为对照品的峰面积；
Cx为供试品的浓度；
CR为对照品的浓度；
可得到相应衍生物1和衍生物2成分的含量。
有益效果：
为使杂质1-氯乙基环己基碳酸酯尽可能与坎地沙坦酯完全反应，对样品处理中反应容器、供试品浓度、反应时间、反应温度等进行了筛选，使杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的回收率达到90%以上，最终确立的方法达到了发明目的。
本发明检测方法可实现对坎地沙坦酯中该基因毒性杂质的有效控制，减少了患者的用药副反应的发生，一定程度保证了患者用药安全。
本发明提供了一种坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的测定方法，采用柱前衍生化的高效液相方法进行检测。本发明方法的效果和优点是：
1.本发明可有效检出杂质1-氯乙基环己基碳酸酯，方法专属性强，方法准确可行，回收率为91.4%，RSD为5.8%，仪器精密度RSD为3.2%。
2.本发明检测方法的检测灵敏度高，其检测限为0.0017μg/ml，相当于限度浓度的0.36%；定量限为0.0048μg/ml，相当于限度浓度的1.02%，远低于基因毒性杂质衍生物的限度。灵敏度也高于参考文献[1]中GC-MS法。
3.本发明检测方法检测成本低廉、经济适用、易于推广。
4.本发明方法经过方法学验证，结果均符合要求，证明本发明可用于坎地沙坦酯中基因毒性杂质的检测。
附图说明
图1为空白溶液色谱图。
图2为最佳色谱条件下对照品溶液色谱图。
图3为最佳色谱条件下供试品溶液色谱图。
图4为最佳色谱条件下CA181102W批坎地沙坦酯供试品添加杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的色谱图。
具体实施方式 下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
试剂:
乙睛：色谱级，生产商为Merck公司；
衍生物1对照品：批号：KDST-C10-1-2592-15-3-C，纯度97.6％，自制；
衍生物2对照品：批号：KDST-C10-3-2592-15-2-C，纯度98.7％，自制；
坎地沙坦酯供试品：原料药，批号：CA181102W，99.8%，自制；
纯水：纯水机自制；
仪器:
Thermo U3000高效液相色谱仪:生产商为美国Thermo公司；
MS105DU型电子分析天平:生产商为METTLER TOLEDO公司；
HJ-6A型磁力搅拌器:生产商为江苏金坛市双捷实验仪器厂；
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱:生产商为Waters公司。
实施例测定方法：采用外标法，先配制一定浓度的混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，衍生物2、衍生物1依次出峰。再将获得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，得到衍生物1和衍生物2的含量，将衍生物1和衍生物2的含量之和乘以换算系数0.265即得供试品溶液中杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的含量。
实施例1 反应容器及坎地沙坦酯用量的优化。
实验部分：
1.1样品前处理：
（1）100ml茄形瓶做反应容器：
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约5g，碳酸钾约1g及碘化钾约0.1g，置同一100ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（49.30μg/ml）5ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺5ml，摇匀，放入磁转子，置60℃水浴中搅拌加热6h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置25ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
（2）25ml茄形瓶做反应容器：
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g及碘化钾约0.05g，置同一25ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（47.55μg/ml）2ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺2ml，摇匀，放入磁转子，置60℃水浴中搅拌加热6h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
1.2对照品配制：
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.色谱条件
仪器：高效液相色谱仪（紫外检测器）；流动相A：水（用磷酸调节pH至2.6）；流动相B：乙腈；进样量：10μl；波长：210nm；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；色谱柱：Waters Symmetryshiled RP18（4.6mm×150mm，3.5µm）；洗脱梯度见表2。
表2
Figure 235028DEST_PATH_IMAGE008
。
3. 结果与讨论
表3
Figure 903907DEST_PATH_IMAGE009
。
结论：由表3可知，反应容器为100ml茄形瓶，坎地沙坦酯用量为5g时，杂质1-氯乙基环己基碳酸酯回收率要优于反应容器为25ml茄形瓶、坎地沙坦酯用量为2g时杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的回收率。但考虑到坎地沙坦酯5g时用量较大，且用量为2g时的回收率大于95%，能满足回收率要求，故采用25ml茄形瓶做反应容器，坎地沙坦酯用量为2g。
实施例2 衍生温度的考察
1.实验部分
1.1样品前处理
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g及碘化钾约0.05g，置同一25ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（51.33μg/ml）2ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺2ml，摇匀，放入磁转子。照上述配制方法分别配制3份供试品溶液，分别置40℃、50℃、60℃水浴中搅拌加热5h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
1.2对照品配制
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.色谱条件
仪器：高效液相色谱仪（紫外检测器）；流动相A：水（用磷酸调节pH至2.6）；流动相B：乙腈；进样量：10μl；波长：210nm；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；色谱柱：Waters Symmetryshiled RP18（4.6mm×150mm，3.5µm）；洗脱梯度见表4。
表4
Figure 897270DEST_PATH_IMAGE010
。
3.结果与结论
表5
Figure 838550DEST_PATH_IMAGE011
。
结论：由表5数据可知，反应温度为60℃时，杂质1-氯乙基环己基碳酸酯回收率最好，故选择60℃为衍生温度。
实施例3 衍生时间的考察
1.实验部分
1.1样品前处理
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g及碘化钾约0.05g，置同一25ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（50.15μg/ml）2ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺2ml，摇匀，放入磁转子，照上述配制方法分别配制3份供试品溶液，置60℃水浴中分别搅拌加热1h、2h、3h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
1.2对照品配制
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.色谱条件
仪器：高效液相色谱仪（紫外检测器）；流动相A：水（用磷酸调节pH至2.6）；流动相B：乙腈；进样量：10μl；波长：210nm；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；色谱柱：Waters Symmetryshiled RP18（4.6mm×150mm，3.5µm）；洗脱梯度见表6。
表6
Figure 575562DEST_PATH_IMAGE012
。
3.结果与结论
表7
Figure 98947DEST_PATH_IMAGE013
。
结论：由表7数据可知，反应时间为3h时，杂质1-氯乙基环己基碳酸酯回收率最好，并结合实施例2衍生温度考察试验中反应时间5h时的回收率结果95.44%，认为杂质1-氯乙基环己基碳酸酯在60℃加热搅拌3h已反应完全，不需要再延长反应时间，因此确定3h为最终衍生时间。
实施例4 流动相的选择及流动相pH值的优化
1.实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g、碘化钾约0.05g和N,N-二甲基甲酰胺4ml，置同一25ml茄形反应瓶中，摇匀，放入磁转子，置60℃水浴中搅拌加热3h后，将反应液过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
1.2对照品配制
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.色谱条件
色谱条件1 仪器：高效液相色谱仪（紫外检测器）；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈；进样量：10μl；波长：210nm；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；色谱柱：Waters Symmetryshiled RP18（4.6mm×150mm，3.5µm）；洗脱梯度见表8。
表8
Figure 466475DEST_PATH_IMAGE014
。
色谱条件2 流动相A：水（用磷酸调节pH至3.0）；其余条件均不变。
3.结果与结论
当流动相A为水与用磷酸调节pH至3.0的水相比较，供试品溶液中主成分及杂质出峰时间缩短，而杂质对照品混合溶液出峰时间不受流动相pH影响。流动A相为水时，供试品溶液在杂质对照品出峰位置基线平整、无干扰；流动相A为水（用磷酸调节pH至3.0）时，供试品溶液在杂质对照品出峰位置基线波动较大，影响检测结果及杂质回收率测定。综合比较，确定以水作流动相A。
实施例5 流动相洗脱梯度的考察
1.实验部分
1.1样品前处理
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g及碘化钾约0.05g，置同一25ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（50.15μg/ml）2ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺2ml，摇匀，放入磁转子，置60℃水浴中搅拌加热3h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
1.2对照品配制
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.色谱条件
仪器：高效液相色谱仪（紫外检测器）；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈；进样量：10μl；波长：210nm；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；色谱柱：Waters Symmetry shiled RP18（4.6mm×150mm，3.5µm）；
按下表洗脱梯度分别运行对照品溶液及供试品（加样）溶液。
洗脱梯度1见表9。
表9
Figure 708100DEST_PATH_IMAGE015
。
洗脱梯度2见表10。
表10
Figure 983224DEST_PATH_IMAGE016
。
结果及结论：采用洗脱梯度1，衍生物1色谱峰呈裂峰。采用洗脱梯度2，衍生物2色谱峰形尖锐。
实施例6
1..实验部分
1.1样品前处理
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g及碘化钾约0.05g，置同一25ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（49.32μg/ml）2ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺2ml，摇匀，放入磁转子，置60℃水浴中搅拌加热3h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
12色谱条件
高效液相色谱法色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters SymmetryRP18，4.6mm×150mm，3.5µm或效能相当的色谱柱）；以水为流动相A，乙腈为流动相B，按表11进行梯度洗脱；检测波长为208nm；流速为每分钟0.8ml；柱温为30℃。精密量取对照品溶液和供试品溶液各10µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
表11
Figure 315110DEST_PATH_IMAGE017
。
2.结果与讨论
表12
Figure 650277DEST_PATH_IMAGE018
。
从表12中可以看出，在该色谱系统中坎地沙坦酯杂质1-氯乙基环己基碳酸酯衍生物1与衍生物2能有效检出，峰响应好，灵敏度高。该方法能够有效、灵敏的检测坎地沙坦酯中的杂质1-氯乙基环己基碳酸酯。
实施例7
1.实验部分
1.1样品前处理
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g及碘化钾约0.05g，置同一25ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（49.32μg/ml）2ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺2ml，摇匀，放入磁转子，置60℃水浴中搅拌加热3h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
1.2色谱条件
高效液相色谱法色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters SymmetryRP18，4.6mm×150mm，3.5µm或效能相当的色谱柱）；以水为流动相A，乙腈为流动相B，按表13进行梯度洗脱；检测波长为212nm；流速为每分钟0.8ml；柱温为30℃。精密量取对照品溶液和供试品溶液各10µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
表13
Figure 379198DEST_PATH_IMAGE019
。
1.3测定
采用外标法，先配制一定浓度的混合对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，衍生物1、衍生物2依次出峰。再将获得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间定性，色谱峰面积定量，得到衍生物1和衍生物2的含量，将衍生物1和衍生物2的含量之和乘以换算系数0.265即得供试品溶液中杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的含量。
2.结果与讨论
表14
Figure 395696DEST_PATH_IMAGE020
。
从表14中可以看出，在该色谱系统中坎地沙坦酯衍生物1与衍生物2能有效检出，峰响应好，灵敏度高。该方法能够有效、灵敏的检测坎地沙坦酯中的杂质1-氯乙基环己基碳酸酯。
实施例8
1.实验部分
1.1样品前处理
供试品（加样）溶液：称取坎地沙坦酯约2g，碳酸钾约0.5g及碘化钾约0.05g，置同一25ml茄形反应瓶中；精密量取杂质1-氯乙基环己基碳酸酯贮备液（49.32μg/ml）2ml加入瓶中，再加入N,N-二甲基甲酰胺2ml，摇匀，放入磁转子，置60℃水浴中搅拌加热3h后，将反应液用滤纸过滤至100ml量瓶中，再用乙腈冲洗反应瓶，并将冲洗液过滤置同一量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml置10ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀，即得。
对照品溶液的制备：取衍生物1对照品和衍生物2对照品各约18mg，精密称定，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
1.2色谱条件
高效液相色谱法色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters SymmetryRP18，4.6mm×150mm，3.5µm或效能相当的色谱柱）；以水为流动相A，乙腈为流动相B，按表15进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为每分钟0.8ml；柱温为30℃。精密量取对照品溶液和供试品溶液各10µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
表15
Figure 893673DEST_PATH_IMAGE021
。
2.结果与讨论
表16
Figure 665320DEST_PATH_IMAGE022
。
从表16中可以看出，在该色谱系统中坎地沙坦酯杂质1-氯乙基环己基碳酸酯衍生物1与衍生物2能有效检出，峰响应好，灵敏度高。该方法能够有效、灵敏的检测坎地沙坦酯中的杂质1-氯乙基环己基碳酸酯。
方法学考察：
专属性考察：空白溶液不干扰衍生物1和衍生物2的检测。
检测限考察：分别取衍生物1对照品和衍生物2对照品各适量，用乙腈溶解并稀释制成适当浓度，取溶液检测，根据两对照品的峰的信噪比对溶液进行稀释，当信噪比为3时为检测限，信噪比为10时为定量限。
线性考察：分别取衍生物1对照品和衍生物2对照品各适量，用乙腈溶解并稀释制成0.02μg/ml-2.7μg/ml的6个不同浓度的溶液，分别进样。
重复性考察：分别取衍生物1对照品和衍生物2对照品各适量，用乙腈溶解并稀释制成1.8μg/ml的溶液，作为对照品溶液，按实施例8的1.1方法制备6份供试品溶液，按1.2色谱条件进行检测。
稳定性考察：取重复性考察项下的对照品溶液和供试品溶液，分别0、2、4、8、12、18、24小时内进行检测，具体结果见表17。
表17
Figure 802909DEST_PATH_IMAGE024
准确度：分别取衍生物1对照品和衍生物2对照品各适量，用乙腈溶解并稀释制成1.8μg/ml的溶液，作为对照品溶液，取供试品，加杂质1-氯乙基环己基碳酸酯对照品贮备液，配制出含杂质80%，100%，120%的溶液，同法平行测定3次，按表18制备对照品、供试品及加标供试品溶液，按实施例8中1.2色谱条件进行检测。
表18
Figure 685415DEST_PATH_IMAGE025
检测结果见表19。
表19
Figure 975582DEST_PATH_IMAGE026
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1. 采用衍生化法制备样品溶液：
在碱性条件下，以碘化钾做催化剂，坎地沙坦酯原料药与自身存在的1-氯乙基环己基碳酸酯反应，水浴加热至40-80℃并搅拌，生成衍生物1与衍生物2，将反应瓶中的反应液用滤纸过滤，保留滤液作为供试品溶液，反应方程式如下：
Figure 752052DEST_PATH_IMAGE001
步骤2. 对照品溶液的制备：
分别称取坎地沙坦酯衍生物1和坎地沙坦酯衍生物2的对照品，加乙腈溶解后制成分别含坎地沙坦酯衍生物1和坎地沙坦酯衍生物2的溶液，作为对照品溶液；
步骤3. 检测：
采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，依据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中坎地沙坦酯衍生物1和衍生物2的含量，色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温：25-40℃，检测波长为208-212nm，流速：0.6-1.0ml/min，流动相A为水，流动相B为乙腈，进样量5-50μl，梯度洗脱，
所述梯度洗脱的具体程序为：
第0-27min，A相：B相体积比为45：55-10:90,；
第27-40min，A相：B相体积比为10:90；
第40-41min，A相：B相体积比为10:90-45:55；
第41-50min，A相：B相体积比为45:55。
2.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤1中，水浴加热温度控制在60℃。
3.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤1中，取坎地沙坦酯供试品2-10g，加入的碳酸钾的量为0.4g-1.0g，碘化钾的量为0.04g-0.20g， 加入3-8ml N,N-二甲基甲酰胺，加热反应。
4.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤1中，溶剂N,N-二甲基甲酰胺与坎地沙坦酯的体积质量比例为2-2.5ml:1g，衍生温度为60℃，反应时间为3小时，反应液用滤纸过滤，用乙腈冲洗反应瓶并过滤，滤液置于100ml量瓶中，用乙腈定容，摇匀；再精密量取5ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
5.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤2中，分别精密称定衍生物1和衍生物2对照品各约18mg，置同一100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；再精密量取1ml对照品贮备液，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
6.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤3中，高效液相色谱法柱温30℃；进样量为10μl。
7.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤3中，高效液相色谱法的色谱条件为：检测波长为210nm，流速：0.8ml/min，梯度洗脱。
8.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤3中，确定供试品溶液中衍生物1、衍生物2的成分含量的方法为外标法。
9.根据权利要求1所述坎地沙坦酯基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测方法，其特征在于，步骤1中，取坎地沙坦酯供试品2g，加入的碳酸钾的量为0.4g-1.0g，碘化钾的量为0.04g-0.20g， 加入3-8ml N,N-二甲基甲酰胺，加热反应。
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