具体实施方式
本发明公开了通过将一种或更多种功能性肽基序添加到先前公开的36-氨基酸肽中而制备的经修饰的胶原样肽。将具有蛋白水解切割位点、抗炎作用和/或细胞粘附基序的肽基序添加到本发明的氨基酸序列中。此外,已将甘氨酸和半胱氨酸残基添加到肽中,其允许聚乙二醇(PEG)的共价结合以形成稳健的水凝胶。
用DMTMM交联的胶原蛋白或胶原样肽用于制备治疗角膜、缺陷和疾病的水凝胶、角膜植入物以及填料胶。
本发明考虑了在开发高效角膜植入物方面的多维度方法,所述角膜植入物包含用DMTMM交联的胶原或胶原样肽。发现用DMTMM交联的胶原或胶原样肽开发的水凝胶比先前使用的EDC/NHS交联体系更有效且细胞毒性更低。
DMTMM相对于常用交联剂的功效
DMTMM首次被用作开发基于胶原和胶原样肽的水凝胶、植入物和填料胶的交联剂。本发明人已经确定,与现有的交联剂如EDC/NHS和N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)相比,DMTMM是优异的交联剂。
本发明的方法已经开发出高效且坚固的水凝胶,其特征在于以下特性:
a.振荡流变学研究证明了优异的机械性能;
b.改善植入物的可缝合性;
c.用不同交联剂进行的人角膜上皮细胞培养研究证明,细胞毒性更小且没有长期细胞毒性作用;
d.如FTIR光谱研究所证明的,长时间内水凝胶完整性增加;
e.卓越的抗疤痕特性;
f.增加诱导细胞外囊泡的产生。
此外,本发明中开发的水凝胶还具有化妆用途,例如校正屈光不正的能力,用作矫正先前激光眼科手术(PRK、LASIK、LASEK)的填充物,或对于矫正视力用作嵌上体、嵌入体和环以代替激光眼科手术。填料胶也可用作抗衰老工具来填充皱纹。
本发明还涉及制造水凝胶、角膜植入物和填料胶的方法,所述水凝胶、角膜植入物和填料胶包含用DMTMM交联的胶原或胶原样肽。
此外,本发明还涉及使用本发明开发的水凝胶和基于胶原的内路贴片治疗角膜缺陷的方法。本发明还揭示了一种包含基于胶原的内路贴片和填料胶的试剂盒。
在更详细地描述本公开的胶原样肽、缀合物、水凝胶、植入物、填料胶和方法之前,应理解,本发明不限于特定实施方式并且可以变化。还应理解,本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的,而不是限制性的,因为所述方法和组合物的范围仅受所附权利要求的限制。
本发明的方面涉及使用36-氨基酸的肽序列作为基础设计的经修饰的胶原样肽。将功能性基序添加到该基础肽序列中以改善基于这些胶原样肽的水凝胶的功能性和治疗功效。加入甘氨酸和半胱氨酸以允许共价结合至8臂聚乙二醇马来酰亚胺(PEG)并形成稳健的水凝胶。添加到基础CLP的功能基序包括MMP切割基序、抗炎基序和细胞粘附基序。
为了赋予对基质金属蛋白酶(MMP)的抗性,加入MMP切割基序以阻止细胞外基质蛋白的降解。
本发明开发的胶原样肽含有MMP切割基序。基质金属蛋白酶(MMPs),也称为Matrixins,是大约24种人类含锌内肽酶的家族,其能够降解ECM和许多其他蛋白质的组分。MMP在多种病理状态下过表达,例如关节炎疾病、癌症和炎症。
包含MMP切割基序的组合物用于在炎症部位切割MMP。加入细胞粘附基序如RGDSPG(来自纤连蛋白)和IKVAV(来自层粘连蛋白)以增强角膜上皮细胞增殖和分化以及神经突向外生长。
本发明的另一方面涉及胶原样肽的重组生产。胶原样肽的重组生产提供了无可挑剔的高产率,因此导致以较低的费用控制所需的较高纯度。
在本发明中,将编码经修饰的胶原样肽的核酸克隆到表达载体中用于重组表达。在优选的实施方式中,载体是pCOLDI表达载体。
使用限制性位点和合适的正向和反向引物将核酸克隆到上述表达载体中。在优选的实施方式中,限制性位点是NdeI和XbaI。
对于脯氨酸残基向羟脯氨酸的翻译后修饰,编码脯氨酰4-羟化酶的表达载体与编码胶原样肽的载体一起转化。在优选的实施方式中,用于编码脯氨酰4-羟化酶的载体是pET载体。
使用用于表达重组胶原样肽的合适宿主细胞。在优选的实施方式中,使用的宿主细胞是大肠杆菌BL-21(DE3)菌株。在优选的实施方式中,宿主细胞用于产生无内毒素的重组蛋白。
对于CLP的重组表达,选择抗抗生素的预培养细菌。在优选的实施方式中,抗生素是氨苄青霉素。
存在于宿主中的启动子是诱导型启动子。在优选的实施方式中,启动子是IPTG。
通过离心收获重组宿主细胞并进行裂解以回收重组蛋白。在优选的实施方式中,通过超声处理进行裂解。
使用合适的纯化系统进一步纯化胶原样多肽。在一个优选的实施方式中,特异性结合附着于CLP的N-末端的组氨酸标签的Ni-NTI柱用于纯化。
重组表达的蛋白质不会在人体细胞中引发内毒素反应,并用于制备水凝胶和植入物。
可选择地,使用肽合成仪合成肽。
本发明的其他方面涉及使用DMTMM制备交联为网络的胶原或CLP-PEG水凝胶。此外,制备使用水凝胶的植入物和填料胶。为了制备水凝胶,胶原或重组产生的胶原样肽与聚乙二醇缀合,聚乙二醇分子量为10-40kDa、具有4-8个臂并且具有六聚甘油或季戊四醇核心。在优选的实施方式中,使用MW为40KDa和具有六聚甘油核心的8-臂-PEG-马来酰亚胺。将得到的CLP-PEG缀合物进行三阶段过滤。在一个优选的实施方式中,三阶段过滤方法包括使用P3烧结玻璃漏斗,0.45μm无菌过滤器,然后通过截留分子量为12-14KDa的再生纤维素透析膜相对水透析进行纯化。最后将纯化的溶液冻干。
为了制备水凝胶,使用合适的交联剂使CLP-PEG水溶液交联。在优选的实施方式中,制备15%(w/w)CLP-PEG水溶液,并加入2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)作为缓冲液。优选实施方式中的交联剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride,DMTMM)。
在另一个实施方式中,将纤维蛋白原与CLP-PEG混合,然后加入DMTMM以制备水凝胶。将凝血酶预先施加到角膜缺陷上,当它与水凝胶的纤维蛋白原接触时,反应转化成纤维蛋白,纤维蛋白是一种优质的填料胶。
为了制备植入物,将水凝胶模制成角膜状植入物并在惰性或非氧化气氛下于加湿室中固化过夜。在优选的实施方式中,所述惰性或非氧化气氛是氮气氛。
为了制备CLP-PEG填料胶,将CLP-PEG缀合物溶解在去离子水中。所得溶液在37℃下表现为液体并且是可注射的。任选地,可以将纤维蛋白原添加到该溶液中。在将15%(w/w)CLP-PEG的溶液从37℃冷却至25℃的同时添加DMTMM是制备填料胶的优选方式。
本发明的另一方面涉及具有抗炎生物聚合物、小药物和预先装载干细胞的经修饰的植入物。水凝胶的缓慢胶凝动力学允许均匀掺入第二网络抗炎和防污生物聚合物。在优选的实施方式中,抗炎和防污生物聚合物是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱网络(MPC)。CLP-MPC植入物适合用作具有严重病理状况例如化学灼伤、严重感染、自身免疫病症等的角膜植入物。较慢的胶凝动力学还允许各种小分子药物如万古霉素的共价结合。
本发明的另一方面涉及制备用预先装载干细胞的基于胶原或CLP的植入物,用于将干细胞递送至其自身内源性干细胞耗尽的患者。在一个优选的实施方式中,在植入物上生长DeltaNp63阳性角膜缘上皮细胞,并且发现植入物支持干细胞的增殖。
本发明的其他方面涉及所开发的植入物的表征,其包括机械表征、热表征和细胞毒性表征。
对于机械表征,对这些水凝胶和植入物进行振荡流变学研究。结果表明,与先前公开的植入物相比,植入物具有高得多的储能模量和更低的损耗角正切(tangent loss)。
对于热表征,进行差示扫描量热分析,其显示用各种当量的DMTMM制备的水凝胶的玻璃化转变温度与人角膜的玻璃化转变温度相匹配。
通过比较使用不同交联剂制备的植入物对其上人角膜上皮细胞的生长来进行进一步的细胞毒性表征。为了比较,将HCEC接种到组织培养板上并且比较DMTMM和EDC/NHS交联系统对永生化人角膜上皮细胞的影响。
在另一方面,测试了DMTMM对HCEC的长期毒性。将HCEC与DMTMM一起温育并培养长达7天。进行染色以检查细胞的活力。
在另一个方面,在新西兰白色雄性兔子移植植入物之前和之后的不同时间测量角膜的厚度。
在本发明的其他方面,展现了植入物的可缝合性、抗瘢痕性质、细胞外囊泡产生的诱导和植入物在长时间内的稳定性。
在本发明的另一个方面,已经表明,在切除的猪眼上测试的植入物的可缝合性被发现能够承受多次间断缝合而几乎没有断裂。
在本发明的另一方面,使用FTIR光谱法研究样品的长期完整性。对样品进行650-4000cm-1的波扫描,并且在样品之间没有发现显著的光谱差异,表明在14个月的储存期间植入物的完整性。
在另一方面,测试了植入物的抗瘢痕形成特性。植入物上的原代真皮成纤维细胞的体外培养显示CLP植入物可能用作预先形成或原位固化的再生支架或模板,以具有抗瘢痕形成作用。
在另一方面,测试了植入物诱导细胞外囊泡产生的能力。研究小型猪新角膜以表征外来体,并且在植入CLP-PEG和RHCIII-MPC的切片上进行的免疫组织化学显示外来体的CD9标记和核内体标记物Rab-7的差异染色。结果显示角膜中的CLP-PEG植入物促进细胞外囊泡的再生。
在另一方面,展示了治疗角膜和缺陷和疾病的方法。在角膜上进行穿孔并制作标准化的角膜缺损。然后通过使用A)采用氰基丙烯酸酯胶的传统外部修补;B)仅基于胶原水凝胶的内路贴片;C)胶原水凝胶内路贴片以及CLP-PEG填充剂。
此外,评估破裂压力以显示使用CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶进行修补是密封角膜缺陷的最佳方法。
实施例
实施例1:胶原样肽
使用36-氨基酸肽(Pro-Lys-Gly)4(Pro-Hyp-Gly)4(Asp-Hyp-Gly)4作为基础设计胶原样肽。向该多肽序列中加入甘氨酸和半胱氨酸以允许共价结合至8臂聚乙二醇马来酰亚胺(PEG)并形成稳健的水凝胶。向其中加入另外的肽基序,使多肽成为多功能的。
将包含10个编码38-氨基酸CLP的核酸序列的重复序列的毕赤酵母模板载体(pPink-aMF-COL模拟物-His-P4H-HC)用作模板载体。模板载体的核酸序列由SEQ ID NO:l表示。
使用包含SEQ ID NO:2所示的核酸序列的正向引物和包含SEQ ID NO:3的核酸序列的反向引物,分离编码38-氨基酸序列的核酸的一个重复。该重复序列的核酸序列由SEQID NO:4表示。
使用NdeI和XbaI限制性位点将与添加的功能性基序融合的该重复序列克隆到pCOLDI载体(Takara Bio Inc)中。使用的正向引物和反向引物分别由SEQ ID NO:2和SEQID NO:3表示。
在本发明中,使用38-氨基酸多肽作为基础合成了几种多肽。38-氨基酸的多肽由SEQ ID NO:5表示。
基质金属蛋白酶(MMP)切割基序在功能上与包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽融合。MMP基序由SEQ ID NO:6表示,编码CLP-MMP多肽的核酸由SEQ ID NO:7所示。
抗炎基序(RYTVELA)在功能上与包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽融合。抗炎基序由SEQ ID NO:8表示,编码CLP-MMP多肽的核酸由SEQ ID NO:9表示。
此外,设计了编码与MMP切割基序以及抗炎基序融合的CLP的核酸。融合多肽由SEQID NO:10表示,编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO:11表示。如SEQ ID NO:10所示的CLP用于涉及植入物评估的所有实验,除非在具体实施例中另有说明。
此外,修饰胶原样肽以将细胞粘附肽基序RGDSPG(来自纤连蛋白)和IKVAV(来自层粘连蛋白)掺入肽序列中。
融合多肽CLP-RGDSPG由SEQ ID NO:12表示,编码该融合多肽的核酸由SEQ ID NO:13表示。
融合多肽CLP-IKVAV由SEQ ID NO:14表示,编码该融合多肽的核酸由SEQ ID NO:15表示。
实施例2:重组胶原样肽的重组生产
将实施例1的核酸克隆到pCOLDI表达载体(Takara Bio Inc)中。表达载体pCOLDI的载体图谱如图1所示。该过程中使用的限制性位点是NdeI和XbaI。此外,使用的正向引物和反向引物分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3表示。
对于翻译后修饰脯氨酸残基为羟脯氨酸,使用包含编码脯氨酰4-羟化酶的核酸的pET载体。
将表达载体(pCOLDI和pET)均转化到大肠杆菌BL-21(DE3)菌株中。大肠杆菌BL-21(DE3)电感受态菌株以商标名
出售。
BL21(DE3)细菌细胞用于生产无内毒素的重组蛋白。
对于CLP的重组表达,将4-20μL抗氨苄青霉素溶液的预培养细菌接种到含有100μg/mL氨苄青霉素和0.5%葡萄糖的40mL LB Miller培养基中,并于37℃下在振动板(150rpm)上生长16小时。16小时后,将细菌培养物给予含有100μg/mL氨苄青霉素的1L LBMiller,并在37℃和150rpm振荡下生长直至OD600为0.6-0.8。
加入IPTG以达到1.5mM IPTG CLP蛋白培养物的终浓度。然后将细菌于室温下在振动板(150rpm)上生长16小时。
离心20分钟(5000×g,室温)收获重组宿主细胞。弃去上清液,将沉淀物储存在-20℃。此后,将细菌沉淀重悬于10mL变性结合缓冲液(20mM磷酸氢二钠、0.5M NaCl、40mM咪唑、8M尿素(U5378,Sigma),pH8.0)/1gm沉淀中,并通过超声处理裂解。
将溶液在4℃下超声处理60×10秒,期间间隔10秒并且在最初的30脉冲和最后30脉冲之间间歇45分钟。然后将样品在4℃下以5000×g离心2×20分钟,并将上清液转移到新管中,然后将其储存在4℃。
实施例3:重组胶原样肽的纯化
使用Ni-NTI柱纯化胶原样多肽,所述柱特异性结合附着于CLP的N-末端的组氨酸标签。
用10-15CV变性结合缓冲液平衡Ni-NTA柱,并施加蛋白质样品的上清液。用3×2mL变性结合缓冲液洗涤柱子,用5CV变性洗脱缓冲液(20mM磷酸氢二钠、0.5M氯化钠、0.5M咪唑、8M尿素,pH8.0)洗脱蛋白质。收集样品并使用SDS PAGE分析。使用标准规程对重组CLP进行SDS-PAGE。SDS-PAGE的结果如图2所示。SDS PAGE结果的E1-E5示出了由SEQ ID NO:10表示的CLP的洗脱液。使用300mM咪唑使His标签多肽显现。
对于透析,收集所有含有蛋白质的洗脱液并在一个50ml管中混合。根据制造商的使用移液管的规程使用
透析盒G2(#87730,Thermo Scientific)。纯化蛋白质的天然结合缓冲液用作透析缓冲液,并在4℃下进行透析过夜。
为了进一步减少所透析的CLP蛋白质溶液的盐含量,使用具有8.3mL SEPHADEXTMG-25介质(52-1308-00BB,GE Healthcare)的PD-10脱盐柱和所提供的重力规程(gravityprotocol)于室温下进行凝胶过滤。用6mL 1X磷酸盐缓冲盐水(PBS,P5368,Sigma)进行洗脱,并将洗脱液保持在4℃的冰上。
将CLP样品在-80℃于falcon管中完全冷冻。然后用封口膜代替盖子并用使液体蒸发的注射器穿孔。将管置于真空下直至所有液体蒸发。
实施例4:CLP-PEG缀合物的制备
将前面实施例中获得的重组胶原样肽用于制备CLP-PEG缀合物。8臂-PEG-马来酰亚胺(MW:40KDa,六聚甘油核心)购自Creative PEG Works(Chapel Hill,NC,USA)。
用N2喷射(sparge)20mL水20分钟。向喷射的水中加入8-臂PEG-马来酰亚胺(770mg,18.7μmol)直至完全溶解。将CLP(625mg,149.5μmol,相对于PEG为8摩尔当量)作为固体粉末加入到搅拌的溶液中。
将反应混合物在25℃搅拌20分钟直至PEG完全溶解。通过逐滴加入2MNaOH将反应混合物的pH调节至4.5,并进一步分三部分加入30mL喷射水以适当搅拌。将反应烧瓶用铝箔覆盖,并在25℃下搅拌5天。在第5天结束时,加入另外的50mL水并将反应混合物的pH重新调节至4.5。
然后将溶液吸取到50mL注射器中并通过0.45μM注射过滤器过滤。然后将过滤的溶液转移到截留分子量(MWCO)为12-14kDa,优选截留分子量为14kDa的透析管中。然后将含有滤液的透析管转移到含有pH 4.5水的2L烧杯中(通过逐滴加入浓HCl调节pH并使用pH电极测量)。用大磁力搅拌棒搅拌烧杯并用铝箔覆盖。透析水每天更换两次,持续7天。然后将透析袋的内容物转移至50mL Falcon管中,作为25mL等分试样。然后将溶液在-80℃冰箱中冷冻过夜。然后将Falcon管冷冻干燥,并且获得如棉状固体的CLP-PEG缀合物。(温度=-48℃,真空=90×10-3巴)。此过程在使用的系统上花费了5天。
为了制备10%(w/w)CLP-PEG溶液,将300mg CLP-PEG加入无菌注射器的枪管中。加入2700μL水至10mL无菌注射器的柱塞,使其终浓度为10%(w/w)。
用封口膜密封注射器,使CLP-PEG在室温下重建2-3周。对于重建过程,用刮刀定期搅拌混合物并在培养箱中加热至37℃。一旦溶液完全重悬浮,将其加热至高于其熔化温度,高于37℃并以3000rpm离心10分钟。重复该过程直至从注射器中除去所有气泡。
使用DMSO-d6作为溶剂,通过1H-NMR谱(Jeol 400MHz NMR谱仪,Joel Nordic AB,Sollentuna,Sweden)表征CLP-PEG缀合物。光谱分析的结果如图3所示。
使用2.5δppm的溶剂峰作为内标。通过在7δppm处乙烯基质子峰的完全消失证实CLP与PEG-马来酰亚胺的成功缀合。
实施例5:CLP-PEG水凝胶和植入物的制备
制备15%(w/w)CLP-PEG(每个CLP-PEG分子中32个赖氨酸)水溶液。加入26μl0.625M的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液作为缓冲液。
用于制备水凝胶的交联剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)。
为了制备水凝胶,交联剂采用的浓度为CLP-PEG中每个赖氨酸残基1当量。交联剂以在0.625M MES溶液中10%的形式加入。
将得到的含有CLP-PEG和交联剂的混合物充分混合并模塑成角膜状植入物,并在氮气氛下于加湿室中固化过夜。该水凝胶中的最终CLP-PEG浓度为9.8%(w/w)。
还使用用DMTMM交联的胶原制备水凝胶和植入物。
实施例6:CLP-PEG填料胶的制备
使用DMTMM化学,基于CLP-PEG开发了热辅助化学交联制剂。
为了制备CLP-PEG填料胶,将CLP-PEG缀合物以15%(w/w)浓度溶解于去离子水(pH7)中。所得溶液在37℃下表现为液体并且是可注射的。但是,由于CLP的模板组装,该溶液在冷却至25℃时凝固成凝胶。CLP-PEG的溶胶-凝胶转变是可逆的。
通过加入DMTMM的10mM PBS溶液至终浓度为4%(w/v)同时将15%(w/w)CLP-PEG的溶液从37℃冷却至25℃使该溶胶-凝胶转变不可逆。获得的水凝胶用作填料胶。
DMTMM在CLP中分别引发侧链羧酸与来自天冬氨酸和赖氨酸的胺之间的酰胺键形成。该凝胶通常在2分钟内凝固。
图4描述了使用DMTMM交联化学的热辅助不可逆溶胶(左)-凝胶(右)转变。
由于角膜表面温度约为34℃,因此可以在37℃下与DMTMM混合后将该材料注射到角膜表面上,由于角膜表面温度较低,材料在体内发生不可逆角膜凝胶化。如果需要,进一步冷却角膜以促进该过程。
实施例7:基于胶原的内路贴片的制备
为了制备基于胶原的内路贴片,将10%(w/w)猪I型胶原(分子量300KDa,每个胶原蛋白分子114个赖氨酸,Nordic Biolabs AB,Stockholm,Sweden)水溶液加入到200μl的0.625M MES溶液中并加载到注射器混合系统上。此外,加入12μl、2M的NaOH以达到pH为5.5。
将所得溶液进一步充分混合,偶尔在冰上冷却。以在0.625M的MES溶液中浓度为10%的方式加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(相对于胶原中赖氨酸数为0.4当量)并充分混合。然后以在0.625M的MES溶液中浓度为5%的方式加入EDC(相对于胶原中赖氨酸的数量为0.7当量)。在加入EDC后,将反应混合物非常快速地混合并模塑成100μm厚的薄片,并在氮气氛下于加湿室中固化过夜。内路贴片中的最终胶原浓度为5.5%(w/w)。
可以将该基于胶原的内路贴片和实施例5中提供的CLP-PEG填料胶包装到用于临床应用的试剂盒中。
实施例8:具有纤维蛋白原的CLP-PEG水凝胶的制备
为了增强CLP-PEG水凝胶和填料胶的性质,添加纤维蛋白原。使用如实施例3中制备的300mg 10%CLP-PEG。将30mg纤维蛋白原(可凝结蛋白-TISSEELTM试剂盒)和2700μL水加入到注射器枪管中,使最终浓度为10%(w/w)CLP-PEG和1%(w/w)纤维蛋白原。
用封口膜密封注射器,使CLP-PEG和纤维蛋白原在室温下重构2-3周。为了帮助重构过程,用刮刀定期搅拌混合物,且可以在培养箱中加热至37℃。一旦溶液完全重新悬浮,将其加热至高于其熔化温度,即37℃,并以3000rpm离心10分钟。重复该过程直至从注射器中除去所有气泡。
实施例9:CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶的制备
注射器内含有10%w/w CLP-PEG和1%(w/w)纤维蛋白原的溶液在高于37℃的温度下表现为液体(可注射),但由于CLP的模板组装,当冷却至25℃时凝固成凝胶。然而,这种溶胶-凝胶转变是可逆的。为了使这种溶胶-凝胶转变不可逆,我们加入交联剂4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)的10mM PBS溶液至混合物中使DMTMM的最终浓度为2%w/w,同时将CLP-PEG和纤维蛋白原的溶液从37℃以上冷却至25℃。
为了制备CLP-PEG-纤维蛋白,将CLP-PEG/纤维蛋白原混合物在50℃下加热5分钟。将适量的CLP-PEG/纤维蛋白原混合物转移至2mL玻璃注射器中。
用10mM PBS填充T型件系统(T-piece system)。将含有CLP-PEG/纤维蛋白原混合物的注射器连接到T型件系统。将T型件系统在50℃培养箱中加热5分钟。将溶液混合75次。在10mM PBS中制备10%(w/w)DMTMM溶液。通过T型件系统上的添加端口将DMTMM溶液添加到Hamilton微注射器中。将溶液再次混合75次以获得含有CLP-PEG-纤维蛋白原胶的水凝胶。
将水凝胶浇铸到500μM角膜模具中以制备植入物。然后使用夹具拧紧模具。然后将模具/夹具于室温下置于湿度室中24小时。然后将模具从夹具中取出并使其在水中浸泡18小时。然后将植入物脱模并转移到含有10mM PBS的无菌小瓶中。
实施例10:CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶的应用
CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶的应用与凝血酶组合进行。
通过向凝血酶小瓶(TISSEELTM试剂盒)中加入4mL 10mM PBS,以250U/mL重构凝血酶。在使用前将溶液在室温下混合20分钟。可以将溶液等分到几个Eppendorf管中并冷冻以备将来使用。
将凝血酶应用于创面床(wound bed)/基质内袋(intrastromal pocket)。然后将填料胶涂敷到伤口上。当与CLP-PEG-纤维蛋白原填料胶结合时,凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。
实施例11:掺入第二抗炎生物聚合物网络和附着小药物分子
使用实施例5中获得的水凝胶,并且缓慢胶凝动力学允许均匀掺入抗炎和防污的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)的生物聚合物第二网络。图16中描述了稳定整合的CLP-PEG-MPC植入物。
CLP-MPC植入物适合用作具有严重病理状况(例如化学灼伤,严重感染,自身免疫病症等)的角膜植入物。第二层的掺入还允许各种小分子药物如万古霉素的共价结合。此外,在植入物的制造过程中已经结合了各种持续的药物释放系统。
实施例12:具有预装干细胞的基于CLP的植入物
测试了用DMTMM交联的基于CLP的植入物的不利影响。基于DMTMM的植入物的细胞增殖数据在图7中给出。数据表明DMTMM对干细胞无细胞毒性。
测试了CLP-PEG植入物的体内干细胞递送能力。DeltaNp63角膜缘上皮细胞在CLP-PEG植入物上生长,基于RHC-MPC的植入物用作对照。
图5显示与在RHC上生长的细胞相比,DeltaNp63阳性角膜缘角膜上皮细胞的生长。CLP-PEG和对照RHC-MPC上的原代角膜缘干细胞。两者都支持这些干细胞的增殖,其特征在于DeltaNp63的存在。
CLP-PEG植入物具有用于结合干细胞以递送至其内源性干细胞耗尽的患者的潜力。
实施例13:CLP-PEG角膜植入物和基于胶原的内路贴片的机械表征
进行研究以表征和比较本发明的CLP-PEG植入物。
使用各种浓度的交联剂,其产生具有不同程度弹性的水凝胶。制备以下具有N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)和DMTMM作为交联剂的水凝胶:
表1:使用的各种浓度的交联剂
N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(CMC)交联水凝胶在频率扫描实验中仅到20Hz是稳定,而用不同浓度的DMTMM交联的水凝胶可耐受高达90Hz振荡频率。
DMTMM交联胶原植入物的振荡流变学研究结果如图6所示。结果表明,用DMTMM交联的胶原基水凝胶的机械强度有了前所未有的改善。DMTMM的较慢凝胶动力学允许聚合物链在整个水凝胶中非常精细和均匀地缠结,这解释了这些材料的非常高的回弹性。
在另一项研究中,还评估了仅CLP植入物的机械性能。通过将水凝胶植入兔角膜中来评估CLP-PEG水凝胶与宿主角膜的物理整合。使用振荡流变学研究将术后6个月后再生的新角膜的剪切特性与初始植入物和健康兔角膜的剪切特性进行比较。如频率扫描测量所发现的:与正常健康兔角膜相比,CLP-PEG植入物具有高得多的储能模量和低得多的损耗角正切。结果表明,植入物更硬且更不柔顺。
天然兔角膜具有相对高的损耗角正切。在被植入的角膜和未手术的健康角膜的情况下,发现损耗角正切在0.15-0.25的范围内,而植入物的损耗角正切在0.01-0.02之内。
由于初始植入物和再生或健康角膜的机械特性存在巨大差异,并且对于任何给定的兔子,手术和未手术的角膜之间没有显著差异,因此,结论是植入物稳定地整合到宿主组织中。
图9中示出了手术和未手术的兔角膜以及CLP-水凝胶植入物的振荡流变学。结果给出了在0.27%剪切应变幅度下作为振荡频率的函数的储能模量,损耗模量和损耗角正切。
此外,研究了使用DMTMM交联策略的两种类型的CLP-植入物,其包括具有略高固体含量的仅CLP-植入物(G1.1-CLP)和CLP-MPC植入物(G2.0.x-CLP-MPC)。
DMTMM交联策略使得仅CLP植入物中的固体含量进一步增加。这些具有较高固体含量的植入物具有优异的机械性能,以便于手术操作,但是由于表面侵蚀,预计也会在体内缓慢降解。
如振荡流变学中观察到的,发现G1.1-CLP的储能模量是G1.0-CLP近1.5倍高,表明机械性能优异。还测试了CLP-MPC制剂(G2.0.x-CLP-MPC)的机械性能,并与仅CLP制剂进行了比较。在频率扫描测量中发现所有样品稳定至约15Hz。
发现,对于除CLP-MPC之外的所有样品,频率的线性粘弹性区域为0-15Hz。
发现,除了样品(S4)的所有样品的储能模量均在14000-15000Pa范围内,样品(S4)的储能模量在21000-22000Pa范围内。然而,所有样品的粘性模量均为在相似的范围内。
发现G2.0.2-CLP-MPC和G1.1-CLP的机械性能非常相似,细胞培养数据显示这些制剂与细胞相容。
振荡流变学研究的结果如图10所示。
实施例14:差示扫描量热分析
水凝胶的差示扫描量热(DSC)分析显示玻璃化转变温度范围为43℃至63℃,这取决于如表2所示的用于交联的DMTMM的当量。
表2用各种当量的DMTMM交联的13%猪胶原水凝胶的DSC分析
DMTMM当量 |
起始温度(℃) |
T<sub>g</sub>(℃) |
0.4 |
43.3±0.35 |
43.4±0.35 |
0.6 |
44.9±0.38 |
45.1±0.18 |
0.8 |
39.7±0.67 |
47.9±0.57 |
1.0 |
54.5±0.35 |
54.6±0.41 |
1.5 |
62.8 |
62.9 |
水凝胶与人角膜的玻璃化转变温度65.1℃相匹配。
此外,实施例9描述了CLP-PEG植入物和手术或未手术角膜的量热分析。手术或未手术角膜的玻璃化转变温度在62-65℃的范围内,而发现初始植入物的转变温度为131.0±1.1℃。
表3 CLP-PEG水凝胶植入物和手术或未手术角膜的热性质
样品 |
转变温度(℃) |
CLP-PEG水凝胶 |
131.0±1.1 |
动物样本1(手术的角膜) |
63.1±0.5 |
动物样本1(未手术的角膜) |
63.5±0.2 |
动物样本2(手术的角膜) |
62.2±0.9 |
动物样本2(未手术的角膜) |
64.3±0.5 |
实施例15:使用HCEC的体外细胞毒性评价和与不同交联剂的比较
为了研究交联剂DMTMM对人角膜上皮细胞的影响,用两种配方(DMTMM 1当量(eqv)和DMTMM 1.5当量)进行体外细胞培养研究。如图7所示,这两种制剂在细胞生长方面没有显著差异,并且与组织培养塑料(TCP)上的细胞生长相当。
在另一个实验中,比较DMTMM交联剂与EDC/NHS交联体系对永生化人角膜上皮细胞的作用。
使用0.22μm过滤器对所有使用的溶液进行无菌过滤。将HCEC以10000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板上。它们补充有包含0.05mg/ml牛垂体提取物、5ng/ml表皮生长因子和1mg/ml青霉素/链霉素的角质形成细胞无血清培养基(KSFM;Gibco,Invitrogen,Stockholm,Sweden),并在37℃和5%CO2下于加湿培养箱中生长至汇合。在测试之前使细胞生长至汇合。
将KSFM中1%DMTMM(w/v)与浓度为0.5%(w/v)EDC和0.16%(w/v)NHS的共反应物(之前用于交联CLP-PEG的交联剂)进行比较。测试了5和15分钟的暴露时间。结果如图18B和图19所示。将HCEC暴露于1%DMTMM或0.5%EDC和0.16%NHS 5分钟,未导致活力的任何显著差异。然而,暴露15分钟后,观察到暴露于EDC-NHS的培养物中比暴露于DMTMM中具有更多的死细胞。在与EDC-NHS系统刚刚温育后的活的(绿色)和死的(红色)细胞显示了即使在非常低的浓度下(EDC+NHS-0.5%+0.16%)如所预期具有非常高的毒性,但当细胞与相当高浓度的DMTMM(1%DMTMM)一起温育15分钟时观察到很少至几乎没有细胞毒性。
实施例16:DMTMM的长期细胞毒性测定
测试了DMTMM对HCEC的长期毒性。将HCEC与4%DMTMM一起温育2和5分钟,并在培养物中保持长达7天。在不同时间点对活(绿色)和死亡(红色)细胞染色显示DMTMM没有引起毒性。更确切地说,细胞似乎完全从任何压力中恢复,并且在稍后的时间点如在组织培养塑料(TCP)上一样正常生长。从这些实验可以得出结论,DMTMM交联体系在所需浓度范围内对细胞没有长期毒性,应该能够使我们甚至包裹细胞并最终带来制造载有患者自身干细胞和基质细胞的角膜植入物。这在化学蛋白质交联领域是史无前例,其中尽管在细胞环境中存在非常相同的官能团,但交联系统不会对细胞产生任何急性或长期毒性。
图20示出了实验结果,其中已经测试了4%DMTMM对HCEC的影响。
在另一个测试细胞毒性的实验中,然后在抽吸培养基后,将KSFM中浓度为1%和4%(w/v)的DMTMM交联剂加入细胞中。将细胞暴露于交联剂2和5分钟,然后用KSFM三次冲洗洗掉含交联剂的培养基。
使用含有钙黄绿素-AM和乙非啶同型二聚体-1(活/死活力/细胞毒性试剂盒,Invitrogen,Oregon,USA)的0.01M PBS在1至7天的不同时间点进行活死染色,以评估HCEC的存活力。使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM800Carl Zeiss,Gottingen,Germany),对每个盘的三个不同视野区拍摄活细胞(绿色荧光)和坏死细胞(红色荧光)的照片。对照培养物由仅暴露于培养基的细胞组成。
为了确定细胞是否长期受到不利影响,在DMTMM暴露后第7天将HCEC分开并接种到1型胶原蛋白包被板(BioCoat,Corning,USA)上,并在21天时检查细胞在气举(airlifting)时的分层能力。
如图19B所示的结果表明,在暴露至交联剂2分钟后,将DMTMM浓度增加至4%不会导致细胞死亡的任何显著变化。这是交联15%(w/w)水性CLP-PEG以形成水凝胶所需的时间量。在暴露5分钟后,这是所需暴露时间的两倍以上,观察到更多的死细胞,但大多数细胞仍然存活。因此,DMTMM对人角膜上皮细胞没有长期细胞毒性作用。
实施例17:离体穿孔和密封
从穆尔菲尔兹生物库(Moorfields Biobank)伦理委员会获得了标准化角膜穿孔中替代密封方法的破裂压力离体研究的伦理批准。人体角膜巩膜扣状体安装在人工前房(Barron Artificial AC;Katena,New Jersy,USA)且制作了标准化的角膜缺陷。使用400μm一次性散光角膜切开术刀片作为量规,在400μm处标记2mm皮肤活检穿孔器(Acu-Punch;Acuderm,Florida,USA)。2mm穿孔器用于集中于400μm的预标记深度的角膜的部分环钻测试。用小儿新月形刀片进行帽(cap)的层状剥离(Lamellar dissection),留下约400μm的残余基质深度。在具有1mm皮肤活检穿孔器的中央基质床中产生随后的中央全厚度缺陷,以模拟临床实践中常见的全厚度角膜穿孔。
为了测试CLP-PEG/纤维蛋白原胶和纤维蛋白胶的破裂压力,在猪角巩膜纽扣上制作标准化的角膜缺损。4mm穿孔器用于集中于深度约为200μm的中央角膜的部分环钻测试。用小儿新月形刀片进行帽的层状剥离,留下残留的基质深度,然后用3mm穿孔器环钻至约200μm的深度。在具有1mm皮肤活检穿孔器的中央基质床中产生随后的中央全厚度缺陷,以模拟临床实践中常见的全厚度角膜穿孔。
在如上所述制备标准化角膜穿孔后,测试了用于密封角膜缺损的实验条件。尝试了五种密封方法。
第一种密封方法是使用氰基丙烯酸酯胶和3mm透明塑料贴片的当前标准处理外路修补(ab externo patching)。简而言之,通过穿刺术插入气泡以帮助形成干燥的眼表面,并且在标准穿孔周围的角膜上皮清创术之后使用箭头手术海绵(arrow-tip surgicalsponges)来干燥任何残余液体。使用皮肤活检穿孔器从透明的聚乙烯手术单(UnomedicalSterile Surgical Drapes,Oklahoma City,USA)冲压3mm塑料贴片。在用氰基丙烯酸酯胶涂覆之后,将单个贴片从外部直接施加到测试缺陷上。使用相同的方法,使用纤维蛋白胶密封角膜缺陷。
第二种密封方法是单独使用100μm厚的化学交联的胶原-水凝胶内路贴片。评估在DSAEK手术中可以切割成所需形状、插入并用气泡定位的胶原水凝胶片。22在此,用外科角膜刀制作一个3.2mm的3步角膜缘切口,用镊子通过该切口插入3mm直径圆盘的测试水凝胶。将圆盘置于缺损下并使用气泡漂浮到位,如在内皮角膜移植术中那样。贴片以30号针头为中心。一旦达到令人满意的位置,就增加输注并测量破裂压力。
第三个条件是胶原-水凝胶内路贴片与CLP-PEG填料胶相结合。如在第二密封方法中给出的那样插入基于水凝胶的内路贴片。将一滴纤维蛋白胶放入缺陷中以涂覆缺损的基部和壁。随后,施用CLP-PEG填料胶以完全填充缺陷,并且用纤维素眼科海绵(Weck-Cel;Beaver-Visitec,Massachusetts,USA)使前表面平滑以类似于角膜前表面。干燥后,增加输注并测量破裂压力。
第四个条件是使用CLP-PEG-纤维蛋白原胶与凝血酶组合。缺陷用250U/mL凝血酶包被。注入CLP-PEG/纤维蛋白原胶以完全填充缺陷。在使胶干燥后,增加输注并测量破裂压力。
图13显示了具有宏观穿孔的人角膜的示例和图解方案,示出了在简化的标准化离体人角膜模型中重现这种缺陷。标准化缺陷包括直径为1mm的中心全厚度缺陷,周围的部分厚度缺陷直径为2mm,深度为400μm。测试的三种修补模式如下:A)从外部施加到标准化缺陷的氰基丙烯酸酯胶贴。将胶贴施加到从手术单上切下的3mm塑料圆盘的内表面上并施加到角膜上。B)将100μm直径3mm的交联胶原贴片从内部施加到标准化缺陷上作为内路贴片。C)将100μm的3mm胶原内路贴片与CLP-PEG水凝胶的外部施用组合以密封标准化缺陷并替换丢失的角膜组织。
实施例18:爆破压力评估
为了评估在前面的例子中制造的密封件的爆破压力,通过动脉内血压监测器(Infinity 540;Draeger,Lubeck,Germany)将人工前房连接到氯化钠注射液,其使用血压袖带调节输注压力。在施加测试贴片后,增加输注压力直到密封件泄露,导致流体流出。然后记录破裂压力(mmHg)作为输注压力的连续痕量对比时间的峰值。使用单因素方差分析和随后的Tukey事后检验来比较三种条件下的破裂压力的差异。表4总结了三种不同修补方式记录的破裂压力。
表4各种测试材料的破裂压力(mmHg)
尽管氰基丙烯酸酯胶具有最高的破裂压力(p<0.0001),但是其中有用其他材料时没有见到的30%的失败率(没有实现密封)。
*100μm胶原水凝胶内路贴片;
§100μm水凝胶内路贴片加外部施用的CLP-PEG胶;
#没有达到密封的实例。这些结果不包括在平均值或标准偏差的计算中.;
SD=标准偏差。
使用氰基丙烯酸酯胶的常规外路修补获得最高的破裂压力,平均(标准偏差)破裂压力为325.9±30.4mmHg,然后使用纤维蛋白胶进行外路修补。然而,所获得的表面是粗糙的,并且在13个实验穿孔的3个中,在使用氰基丙烯酸酯胶时发生泄漏,因为密封未能形成。
使用100μm厚的胶原水凝胶的内路修补在10个样品的10个中产生有效密封。然而,虽然实现了足够的密封,但平均爆破压力仅为46.3±3.7mmHg,并且观察到贴片的凸起。
使用CLP-PEG填料胶结合100μm内路贴片,凸起不太明显,因为CLP-PEG填料胶增强了水凝胶贴片,有助于防止其穿过角膜缺陷。用该技术观察到更高的平均破裂压力(86.6±5.4mmHg)。
尽管使用氰基丙烯酸酯胶获得了最佳结果,但它缺乏基于CLP的水凝胶的有效性。在基于CLP-PEG的水凝胶中,与其他基于CLP-PEG的水凝胶相比,CLP-PEG-纤维蛋白原胶的水凝胶给出了最好的结果。
图14描述了A)穿孔人角膜的实例。B)实验设置显示在人造前房装置内的体外穿孔角膜模型。C)填充含有CLP-PEG的纤维蛋白胶的穿孔角膜模型。其他体外角膜模型用D)采用氰基丙烯酸酯胶的常规外路修补(对照),E)胶原水凝胶仅作为内路贴片,F)胶原水凝胶和CLP-PEG填充物的内部贴片。
实施例19:角膜植入物的可缝合性
通过放置12根间断的缝合线在离体的猪眼上测试水凝胶的可缝合性,并且发现植入物经受多次间断缝合而几乎没有断裂。对离体的猪眼进行体外缝合试验的结果如图8所示。
实施例20:水凝胶的FTIR光谱学以评估样品的长期完整性
测试了开发的CLP植入物的储存条件。将新制备或长期储存的CLP-PEG水凝胶进行FTIR光谱学分析以检查光谱的任何变化。为此目的,用液氮将水凝胶冷冻并冻干。使用通用ATR在Perkin Elmer IR(红外光谱)分光光度计上对冻干的干燥水凝胶进行FTIR光谱分析。对样品进行650-4000cm-1的波扫描。结果总结在图15中。发现样品之间的光谱没有显著差异,表明在10天到14天的储存期间植入物的完整性。
实施例21:角膜厚度测量
通过深层前板层角膜移植术(DALK)将先前实施例中制备的水凝胶移植到新西兰白色雄性兔中以确定它们对角膜再生的能力。植入物强度足以耐受环钻、植入手术和缝合。术后4只兔中有3只没有观察到不良炎症反应。在手术后1个月,如荧光素染色所证明的那样,所有植入物和周围的兔角膜都是透明的,具有完全的上皮覆盖。所有动物中,愈合过程伴随着轻度角膜新血管形成。然而,在所有动物,新血管逐渐消退并且在植入后3个月不再存在。然而,所有植入物都保持透明并覆盖有上皮细胞。
在表5中示出了在手术之前和之后的不同时间点,所有动物的双眼的角膜厚度变化。在所有动物中,眼压保持在正常范围内。
表5在手术之前和手术之后不同时间点所有动物的两只眼睛的中央角膜厚度(μm,M±SD)
实施例22:猪的体内安全性评价
符合良好实验室原则(GLP),NV/MC/CHEM(98)17,1997,并获得Stockholms Norra
的当地道德许可,包含9.7%的DMTMM交联的CLP(w/w)的CLP-PEG植入物移植到四只接受受控碱烧伤的
小型猪的角膜中。在动物中测试含有8.5%CLP的掺入MPC的CLP-PEG植入物。
在完全麻醉下切除猪自身中央角膜组织500μm厚、6.5mm的扣状体后,通过前板层角膜移植术将直径6.75mm和500μm厚的植入物植入每只猪的一个角膜中。使用覆盖的缝合线将植入物固定到位。在手术后施用抗菌和抗炎眼用溶液(
具有3mg/mL地塞米松和1mg/mL妥拉霉素的悬浮液,Alcon,瑞典)5周,此时移除缝合线。监测角膜的任何不良反应12个月。
图16显示了术后12个月的所有8只手术动物。眼睛中可见一些血管和浑浊。总体而言,浑浊和血管稍微更突出,甚至在CLP-PEG组内,而含MPC组中的浑浊在植入物内的外围。对胶原含量的分析表明,CLP-PEG植入物的胶原1和V的总含量高于健康的未手术角膜,而CLP-PEG-MPC植入物的胶原总体显著减少。然而,CLP-MPC显示出相似的高分子量,即成熟的胶原原纤维作为健康的未手术对照。
实施例23:水凝胶的抗瘢痕形成性质
为了分析水凝胶的抗瘢痕形成性质,测试仅CLP和含有来自纤连蛋白的SEQ IDNO:8所示的RGDSPG基序的CLP。
测试了具有和不具有RGDSPG的CLP-PEG水凝胶上的皮肤真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞。对照细胞在组织培养塑料(TCP)上生长。成纤维细胞由TCP和CLP-RGDSPG-PEG支持。这些被抗平滑肌肌动蛋白(SMA)的抗体阳性染色,表明这些细胞是活化的成纤维细胞。图21描述了实验结果。
在另一个实验中,研究了在组织培养塑料(TCP)、猪I型胶原水凝胶(PC)、CLP-PEG和CLP-RGDSPG-PEG水凝胶上培养的真皮成纤维细胞的比较性质。
通过在没有任何处理的情况下铺设在TCP上来活化成纤维细胞。在接种到基质上(“预处理”)之前或在接种到基质上之后(“后处理”),使用TGF-β(10ng/mL)处理一些成纤维细胞。类似地,猪I型胶原水凝胶(PC)、CLP-PEG和CLP-RGDSPG-PEG水凝胶也被处理和活化,如通过抗SMA抗体的阳性染色所示。
图22显示了原代真皮成纤维细胞在组织培养塑料(TCP)和猪胶原(PC)、CLP-PEG(CLP)和CLP-RGDSPG-PEG(CLP-RGD)的水凝胶上的体外培养。在接种到基质上(“预处理”)之前或在接种到基质上之后(“后处理”),将细胞保持未处理或用TGF-β(10ng/ml)处理。红色染色表明是平滑肌肌动蛋白阳性的细胞。DAPI核的复染物显示为蓝色。结果显示CLP类似物能够潜在的用作预制或原位固化的再生支架或模板,以具有抗瘢痕形成效果。
实施例24:细胞外囊泡产生的诱导
研究小型猪新角膜以表征外来体,并且在植入CLP-PEG和RHCIII-MPC的切片上进行的免疫组织化学显示外来体的CD9标记和内体标记物Rab-7的差异染色。
植入RHCIII-MPC和CLP-PEG植入物的小型猪的TEM图像显示出特征性的基底表面形态,具有许多内陷和外泌体如基底表面下的囊泡。
与健康的未手术对照相比,植入CLP-PEG的角膜显示CD9染色增加但RHCIII-MPC没有。
植入CLP-PEG和RHCII-MPC的角膜均显示Rab7的染色增加。通过培养在CMP-PEG和RHCIII-MPC植入物上的人角膜上皮细胞,在体外研究中进行进一步检查。在CMP-PEG和RHCIII-MPC植入物中均观察到连接细胞的染色CD9的囊泡网络。
另一方面,与组织培养塑料相比,Rab7染色的囊泡仅保留在细胞内并且在两种植入物的细胞培养物中增加。
因此,可以得出结论,角膜中的无细胞CLP-PEG植入物促进再生。与RHCIII-MPC植入物相比,这些植入物中的外泌体释放增加。检查他们所载物质显示了所包括的这些与修复和再生相关的胶原和其他大分子。当接种角膜上皮细胞时,CLP-PEG植入物能够在细胞培养物中体外刺激外泌体(exosome)产生。因此,CLP-PEG刺激外泌体的产生,进而促进再生。
图23描述了实验结果。
图23(a)显示了在手术后12个月植入CLP-PEG的小型猪的角膜TEM。再生的新角膜上皮-基质界面区域显示出产生电子致密的细胞外囊泡。这些通过整体面SEM截面的3D重建可视化。图23(b)显示细胞外囊泡为黄色。图23(c)是对照RHC-III MPC和CLP-PEG的CD9阳性细胞外囊泡的3D重建。免疫组织化学标记的切片为在图23(d)中标记的切片。图23(e)显示了针对Rab7染色的EV。图23(f)显示了在不同底物上培养的角膜上皮细胞中的差异EV模式。
实施例25:细胞特异性和生长的增强
使用由结合RGDSPG和IKVAV肽基序的CLP-PEG制备的植入物。RGDSPG和IKVAV肽基序如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示。
形态学以及各种细胞类型的比例取决于细胞粘附肽序列的存在以及CLP-PEG水凝胶的固体含量百分比。如结果所示,6%(w/w)CLP-PEG水凝胶表面上的小脑外植体分化成顶部具有神经元-星形胶质细胞环的小神经胶质细胞的汇合层,类似于视网膜和视神经的神经胶质管。在12%(w/w)CLP-PEG水凝胶上,从小脑外植体生长的细胞不能紧密粘附于水凝胶表面,而是在铺板后形成小球状体。
随后的星形胶质细胞和神经元的生长保留了球状结构。与单独的CLP相比,在12%(w/w)水凝胶中掺入RGDSPG和IKVAV序列增加了细胞粘附并刺激了较长神经突的生长,导致每个神经元覆盖的区域更大,特别是在含有CLP-RGDSPG的水凝胶中。
CLP-RGDSPG-PEG产生均匀分布的具有高神经突密度的神经元-神经胶质细胞培养物和变形虫形状的小神经胶质细胞,其物理缠结在神经元-星形胶质细胞垫内。然而,在CLP-IKVAV-PEG上,分化的神经元-星形胶质细胞网络被组织成离散的神经元束,小胶质细胞具有圆形或棒状形态。
与单独的CLP相比,与用细胞粘附肽标记的CLP上的神经细胞的差异生长相似,原代皮肤成纤维细胞在单独CLP凝胶上显示出受阻的生长,同时在RGDS存在下显示出增强的细胞附着和增殖。这些结果显示细胞粘附肽的关键作用,以优化模拟原始胶原蛋白的植入物的细胞结合、增殖和分化能力。使用用DMTMM交联的CLP-PEG作为固体植入物或作为掺入这些其他生物活性基序的填充剂将允许角膜(或皮肤)伤口的再生而无需移植。
图24显示在种植于6%和12%CLP-PEG以及已掺入RGDS和IKVAV肽的CLP-PEG上之后在体外第6天从大鼠小脑获得的原代神经元和神经胶质。神经元(黄色)用抗微管相关蛋白2免疫标记,星形胶质细胞(红色)用抗胶质纤维酸性蛋白免疫标记。小胶质细胞用同工凝集素GS-IB4染成绿色。用Hoechst33342将所有细胞核染成蓝色。还显示了由RGDS的存在激活的成纤维细胞,但单独的CLP即使明显支持神经和神经胶质,也不会支持这些瘢痕再生细胞。
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<223> 包含10个胶原样肽的重复序列的pPINKa-HC 载体 (pPink-aMF-COL 模拟物-His-P4H-HC)
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tggtccacca ggtcctcctg gtgacccagg tgaccctggt gacccaggtg acccaggtgc 1620
tgcaggtgca aaaggtgaca gaggtgaaac cggtcctgct cctaagggtc caaaaggtcc 1680
taaaggtcca aagggtccac ctggtccacc tggtccacca ggtccacctg gtgaccctgg 1740
tgacccaggt gaccctggtg acccaggtgg tccaagaggt gacgctggtc ctaaaggtcc 1800
aaagggtcca aagggtccta aaggtcctcc aggtcctcca ggtcctcctg gtcctccagg 1860
tgaccctggt gacccaggtg acccaggtga cccaggtcca aaaggtccaa aaggtccaaa 1920
aggtcctaag ggtccaccag gtccaccagg tccacctggt cctccaggtg acccaggtga 1980
cccaggtgac ccaggtgacc caggtccagc tggtaaatct ggtgacagag gtgaaacagg 2040
tccagctcca aaaggtccta agggtccaaa gggtccaaag ggtccaccag gtcctccagg 2100
tccaccaggt cctcctggtg acccaggtga cccaggtgac cctggtgacc ctggtggtgc 2160
tagaggtgac gcaggtccaa agggtcctaa gggtccaaaa ggtccaaaag gtccacctgg 2220
tccaccaggt cctccaggtc caccaggtga cccaggtgac ccaggtgacc caggtgaccc 2280
aggtcatcat catcatcatc attgaggtac cggccggcca tttaaataca ggcccctttt 2340
cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct cctcccacat 2400
ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt 2460
tttaatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 2520
gtacaaacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 2580
acgctcgaag gctttaattt gcaagctgga tccatgagtc acaatctgct tccacagacg 2640
agtacaagga caggcaaaag gaattggaag aagttgctaa cccaataatg agcaagttct 2700
atggagctgc tggtggagct cctggtggag ctcctggtgg cttccctgga ggtttccctg 2760
gcggagctgg cgcagctggc ggtgccccag gtggtgctgc cccaggcgga gacagcggac 2820
caaccgtgga agaagtcgat taagcaattc aacggataaa ttctggttaa tatatataac 2880
gtgaatagga aattaaggaa attttggatc taataatgtg ctgtatgccg acatcgggca 2940
tcgtagattg tatagtatcg ctgacactat aataagccag ccaaaacccc taaaccagtt 3000
gccctccact aattagtgta ctacccaatc ttgcctcttc gggtgtcttt tataaggaca 3060
gattcacaag ctcttgttgc ccaatacaca catacacaca gagataatag cagtcccgcg 3120
ggaaacgatg agatttccta gtatttttac agcagttctt tttgcagcct cctccgcatt 3180
ggcacatcct ggtttcttca cctccatcgg tcagatgaca gatttgattc ataccgaaaa 3240
ggaccttgtt acttctttga aggattacat caaggctgaa gaggacaagt tggaacaaat 3300
caagaaatgg gcagagaaac ttgatagatt gacctccact gctacaaagg acccagaagg 3360
ttttgttgga caccctgtca acgctttcaa acttatgaag agattgaaca cagagtggag 3420
tgaattggag aatcttgttt tgaaggatat gtcagacggt tttattagta accttaccat 3480
ccaaagacca gtcttgtcaa atgatgaaga ccaggttgga gctgccaaag ctttgcttag 3540
acttcaagat acttacaact tggataccga cactattagt aagggtaatt tgcctggagt 3600
caaacataag tcttttctta cagcagaaga ttgtttcgag ttgggtaaag ttgcatacac 3660
tgaagctgac tactatcaca cagaattgtg gatggagcaa gcccttagac agttggatga 3720
aggagagatt tctaccatcg ataaagtttc cgtccttgac tacttgtcat atgccgttta 3780
ccaacaggga gatttggaca aggcattgct tttgactaag aaacttttgg aacttgatcc 3840
agagcatcaa agagctaacg gtaatttgaa gtacttcgaa tacattatgg ctaaagagaa 3900
ggatgttaac aaatctgcct ccgatgacca atccgaccag aagactacac caaagaaaaa 3960
gggagttgct gtcgattatc ttcctgaaag acaaaaatac gagatgttgt gtagaggtga 4020
aggaattaag atgacaccaa gaagacagaa aaagttgttt tgcagatatc atgatggtaa 4080
cagaaaccca aaattcatct tggcccctgc aaagcaagaa gatgagtggg acaaacctag 4140
aattatcaga ttccacgata ttatctccga cgctgaaatt gagatcgtca aagatcttgc 4200
taagccaaga ttgagaagag ccactatttc aaatcctatc actggtgact tggaaacagt 4260
tcattacaga atctcaaaga gtgcttggtt gtccggatac gagaacccag ttgtctcaag 4320
aattaatatg agaatccagg atcttactgg tttggacgtt tctactgccg aagagttgca 4380
agtcgcaaac tatggagttg gtggacagta cgaaccacac tttgatttcg caagaaagga 4440
tgaacctgac gctttcaaag agcttggtac aggaaataga attgctacct ggttgtttta 4500
catgtctgac gtctccgctg gtggagccac cgttttccca gaagtcggtg cctcagtttg 4560
gcctaaaaag ggtactgctg ttttctggta taatttgttc gcaagtggag agggagatta 4620
ctctactaga cacgcagctt gccctgtttt ggtcggtaac aaatgggttt ctaataagtg 4680
gcttcacgag agaggacagg agttcagaag accttgcaca ctttccgagt tggagtaggt 4740
cgaccttgct agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgcctga gagatgcagg 4800
cttcattttt gatacttttt tatttgtaac ctatatagta taggattttt tttgtcattt 4860
tgtttcttct cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct cgcagctgat gaatatcttg 4920
tggtaggggt ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt cttggtattt cccactcctc 4980
ttcagagtac agaagattaa gtgagaagtt cgtttgtgca agcttaatga gtcacaatct 5040
gcttccacag acgagtacaa ggacaggcaa aaggaattgg aagaagttgc taacccaata 5100
atgagcaagt tctatggagc tgctggtgga gctcctggtg gagctcctgg tggcttccct 5160
ggaggtttcc ctggcggagc tggcgcagct ggcggtgccc caggtggtgc tgccccaggc 5220
ggagacagcg gaccaaccgt ggaagaagtc gattaagcaa ttcaacggat aaattctggt 5280
taatatatat aacgtgaata ggaaattaag gaaattttgg atctaataat gtgctgtatg 5340
ccgacatcgg gcatcgtaga ttgtatagta tcgctgacac tataataagc cagccaaaac 5400
ccctaaacca gttgccctcc actaattagt gtactaccca atcttgcctc ttcgggtgtc 5460
ttttataagg acagattcac aagctcttgt tgcccaatac acacatacac acagagataa 5520
tagcagtcct cgaggaaacg atgagattcc catccatttt taccgcagtc ttgttcgccg 5580
catccagtgc tttggctgac gcccctgagg aggaggacca tgtcttggtc ttgagaaagt 5640
ctaactttgc cgaggcactt gctgcccata agtacttgct tgttgaattt tacgctccat 5700
ggtgtggtca ctgcaaggct ttggcccctg aatacgccaa agctgctggt aaattgaaag 5760
cagagggatc tgaaattaga cttgccaagg tcgatgcaac cgaagagtcc gacttggccc 5820
aacagtacgg tgttagagga tatccaacta ttaagttttt cagaaacgga gataccgcat 5880
ctcctaaaga gtatactgct ggaagagaag ccgatgacat cgttaattgg ttgaagaaaa 5940
gaactggtcc agccgcaact acattgcctg atggagctgc cgcagaatcc cttgtcgagt 6000
cttccgaagt tgctgtcatt ggtttcttta aggatgttga gtcagacagt gctaaacaat 6060
ttttgcaggc tgccgaagcc attgatgaca tcccatttgg tatcacttct aattccgatg 6120
ttttctcaaa gtaccaattg gataaagacg gagttgtcct ttttaagaaa ttcgatgagg 6180
gtagaaacaa ttttgaggga gaagtcacaa aggaaaactt gcttgacttc atcaagcata 6240
accaattgcc acttgttatc gagtttaccg aacagactgc tcctaagatt ttcggtggag 6300
aaattaaaac tcacatcttg ttgtttttgc ctaagtcagt tagtgattac gacggtaaat 6360
tgtctaactt caagacagca gctgagtcct tcaagggaaa aatcttgttt attttcatcg 6420
attccgacca taccgataac caaagaatct tggaattttt cggtcttaag aaagaagagt 6480
gtccagccgt tagattgatt actcttgaag aggaaatgac aaagtataaa cctgagtcag 6540
aggaattgac agctgagaga attaccgaat tttgccatag attcttggaa ggtaaaatta 6600
agccacactt gatgagtcaa gagcttccag aagattggga caagcagcct gttaaagtct 6660
tggttggtaa aaactttgag gatgttgctt tcgacgaaaa gaaaaatgtc ttcgttgaat 6720
tttacgcacc atggtgtggt cattgcaagc aattggctcc tatttgggat aagcttggag 6780
agacttataa agaccacgaa aacattgtca tcgctaaaat ggattcaact gcaaatgagg 6840
ttgaagctgt caaggttcac tcatttccaa cattgaaatt tttccctgca agtgctgata 6900
gaacagttat tgactataac ggagagagaa ccttggatgg ttttaagaag ttccttgaaa 6960
gtggtggaca ggatggtgct ggagatgacg atgacttgga agaccttgag gaagccgaag 7020
agcctgatat ggaagaagac gatgaccaaa aagccgttca cgacgagttg tagaccggtc 7080
ttgctagatt ctaatcaaga ggatgtcaga atgccatttg cctgagagat gcaggcttca 7140
tttttgatac ttttttattt gtaacctata tagtatagga ttttttttgt cattttgttt 7200
cttctcgtac gagcttgctc ctgatcagcc tatctcgcag ctgatgaata tcttgtggta 7260
ggggtttggg aaaatcattc gagtttgatg tttttcttgg tatttcccac tcctcttcag 7320
agtacagaag attaagtgag aagttcgttt gtgcaagctt agcggccgcc ttccaaactc 7380
tcatggattc tcaggtaata ggtattctag gaggaggcca gctaggccga atgattgttg 7440
aggccgctag caggctcaat atcaagaccg tgattcttga tgatggtttt tcacctgcta 7500
agcacattaa tgctgcgcaa gaccacatcg acggatcatt caaagatgag gaggctatcg 7560
ccaagttagc tgccaaatgt gatgttctca ctgtagagat tgagcatgtc aacacagatg 7620
ctctaaagag agttcaagac agaactggaa tcaagatata tcctttacca gagacaatcg 7680
aactaatcaa ggataagtac ttgcaaaagg aacatttgat caagcacaac atttcggtga 7740
caaagtctca gggtatagaa tctaatgaaa aggcgctgct tttgtttgga gaagagaatg 7800
gatttccata tctgttgaag tcccggacta tggcttatga tggaagaggc aattttgtag 7860
tggagtctaa agaggacatc agtaaggcat tagagttctt gaaagatcgt ccattgtatg 7920
ccgagaagtt tgctcctttt gttaaagaat tagcggtaat ggttgtgaga tcactggaag 7980
gcgaagtatt ctcctaccca accgtagaaa ctgtgcacaa ggacaatatc tgtcatattg 8040
tgtatgctcc ggccagagtt aatgacacca tccaaaagaa agctcaaata ttagctgaaa 8100
acactgtgaa gactttccca ggcgctggaa tcttcggagt tgagatgttc ctattgtctg 8160
atggagaact tcttgtaaat gagattgctc caaggcccca caattctggt cactatacaa 8220
tcgatgcatg tgtaacatct cagttcgaag cacatgtaag agccataact ggtctgccaa 8280
tgccactaga tttcaccaaa ctatctactt ccaacaccaa cgctattatg ctcaatgttt 8340
tgggtgctga aaaatctcac ggggaattag agttttgtag aagagcctta gaaacacccg 8400
gtgcttctgt atatctgtac ggaaagacca cccgattggc tcgtaagatg ggtcatatca 8460
acataatagg atcttccatg ttggaagcag aacaaaagtt agagtacatt ctagaagaat 8520
caacccactt accatccagt actgtatcag ctgacactaa accgttggtt ggagttatca 8580
tgggttcaga ctctgatcta cctgtgattt cgaaaggttg cgatatttta aaacagtttg 8640
gtgttccatt cgaagttact attgtctctg ctcatagaac accacagaga atgaccagat 8700
atgcctttga agccgctagt agaggtatca aggctatcat tgcaggtgct ggtggtgctg 8760
ctcatcttcc aggaatggtt gctgccatga ctccgttgcc agtcattggt gttcctgtca 8820
agggctctac gttggatggt gtagactcgc tacactcgat tgtccaaatg cctagaggtg 8880
ttcctgtggc tacggttgct atcaacaacg ccaccaatgc cgctctgttg gccatcagga 8940
ttttaggtac aattgaccac aaatggcaaa aggaaatgtc caagtatatg aatgcaatgg 9000
agaccgaagt gttggggaag gcatccaact tggaatctga agggtatgaa tcctatttga 9060
agaatcgtct ttgaatttag tattgttttt taatagatgt atatataata gtacacgtaa 9120
cttatctatt ccattcataa ttttatttta aaggttcggt agaaatttgt cctccaaaaa 9180
gttggttaga gcctggcagt tttgataggc attattatag attgggtaat atttaccctg 9240
cacctggagg aactttgcaa agagcctcat gtgcggcgcg ccaggccata atggccaaac 9300
ggtttctcaa ttactatata ctactaacca tttacctgta gcgtatttct tttccctctt 9360
cgcgaaagct caagggcatc ttcttgactc atgaaaaata tctggatttc ttctgacaga 9420
tcatcaccct tgagcccaac tctctagcct atgagtgtaa gtgatagtca tcttgcaaca 9480
gattattttg gaacgcaact aacaaagcag atacaccctt cagcagaatc ctttctggat 9540
attgtgaaga atgatcgcca aagtcacagt cctgagacag ttcctaatct ttaccccatt 9600
tacaagttca tccaatcaga cttcttaacg cctcatctgg cttatatcaa gcttaccaac 9660
agttcagaaa ctcccagtcc aagtttcttg cttgaaagtg cgaagaatgg tgacaccgtt 9720
gacaggtaca cctttatggg acattccccc agaaaaataa tcaagactgg gcctttagag 9780
ggtgctgaag ttgacccctt ggtgcttctg gaaaaagaac tgaagggcac cagacaagcg 9840
caacttcctg gtattcctcg tctaagtggt ggtgccatag gatacatctc gtacgattgt 9900
attaagtact ttgaaccaaa aactgaaaga aaactgaaag atgttttgca acttccggaa 9960
gcagctttga tgttgttcga cacgatcgtg gcttttgaca atgtttatca aagattccag 10020
gtaattggaa acgtttctct atccgttgat gactcggacg aagctattct tgagaaatat 10080
tataagacaa gagaagaagt ggaaaagatc agtaaagtgg tatttgacaa taaaactgtt 10140
ccctactatg aacagaaaga tattattcaa ggccaaacgt tcacctctaa tattggtcag 10200
gaagggtatg aaaaccatgt tcgcaagctg aaagaacata ttctgaaagg agacatcttc 10260
caagctgttc cctctcaaag ggtagccagg ccgacctcat tgcacccttt caacatctat 10320
cgtcatttga gaactgtcaa tccttctcca tacatgttct atattgacta tctagacttc 10380
caagttgttg gtgcttcacc tgaattacta gttaaatccg acaacaacaa caaaatcatc 10440
acacatccta ttgctggaac tcttcccaga ggtaaaacta tcgaagagga cgacaattat 10500
gctaagcaat tgaagtcgtc tttgaaagac agggccgagc acgtcatgct ggtagatttg 10560
gccagaaatg atattaaccg tgtgtgtgag cccaccagta ccacggttga tcgtttattg 10620
actgtggaga gattttctca tgtgatgcat cttgtgtcag aagtcagtgg aacattgaga 10680
ccaaacaaga ctcgcttcga tgctttcaga tccattttcc cagcaggaac cgtctccggt 10740
gctccgaagg taagagcaat gcaactcata ggagaattgg aaggagaaaa gagaggtgtt 10800
tatgcggggg ccgtaggaca ctggtcgtac gatggaaaat cgatggacac atgtattgcc 10860
ttaagaacaa tggtcgtcaa ggacggtgtc gcttaccttc aagccggagg tggaattgtc 10920
tacgattctg acccctatga cgagtacatc gaaaccatga acaaaatgag atccaacaat 10980
aacaccatct tggaggctga gaaaatctgg accgataggt tggccagaga cgagaatcaa 11040
agtgaatccg aagaaaacga tcaatgaacg gaggacgtaa gtaggaattt atggtttggc 11100
cataatggcc tagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 11160
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 11220
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 11280
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 11340
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 11400
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 11460
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 11520
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 11580
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 11640
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 11700
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 11760
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 11820
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 11880
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 11940
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 12000
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 12060
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 12120
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 12180
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 12240
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 12300
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 12360
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 12420
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 12480
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 12540
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 12600
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 12660
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 12720
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 12780
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 12840
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 12900
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 12960
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 13020
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 13080
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 13140
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 13200
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 13260
ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 13320
aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 13380
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 13440
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 13500
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 13560
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 13620
aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 13680
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 13740
ccagtgaatt g 13751
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正向引物
<400> 2
gccgcatatg agatttccta gtattttcac c 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反向引物
<400> 3
gccgtctaga ggtacctcaa tgatgatgat g 31
<210> 4
<211> 1554
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 胶原样肽的一个重复的核酸序列
<400> 4
catcctggtt tcttcacctc catcggtcag atgacagatt tgattcatac cgaaaaggac 60
cttgttactt ctttgaagga ttacatcaag gctgaagagg acaagttgga acaaatcaag 120
aaatgggcag agaaacttga tagattgacc tccactgcta caaaggaccc agaaggtttt 180
gttggacacc ctgtcaacgc tttcaaactt atgaagagat tgaacacaga gtggagtgaa 240
ttggagaatc ttgttttgaa ggatatgtca gacggtttta ttagtaacct taccatccaa 300
agaccagtct tgtcaaatga tgaagaccag gttggagctg ccaaagcttt gcttagactt 360
caagatactt acaacttgga taccgacact attagtaagg gtaatttgcc tggagtcaaa 420
cataagtctt ttcttacagc agaagattgt ttcgagttgg gtaaagttgc atacactgaa 480
gctgactact atcacacaga attgtggatg gagcaagccc ttagacagtt ggatgaagga 540
gagatttcta ccatcgataa agtttccgtc cttgactact tgtcatatgc cgtttaccaa 600
cagggagatt tggacaaggc attgcttttg actaagaaac ttttggaact tgatccagag 660
catcaaagag ctaacggtaa tttgaagtac ttcgaataca ttatggctaa agagaaggat 720
gttaacaaat ctgcctccga tgaccaatcc gaccagaaga ctacaccaaa gaaaaaggga 780
gttgctgtcg attatcttcc tgaaagacaa aaatacgaga tgttgtgtag aggtgaagga 840
attaagatga caccaagaag acagaaaaag ttgttttgca gatatcatga tggtaacaga 900
aacccaaaat tcatcttggc ccctgcaaag caagaagatg agtgggacaa acctagaatt 960
atcagattcc acgatattat ctccgacgct gaaattgaga tcgtcaaaga tcttgctaag 1020
ccaagattga gaagagccac tatttcaaat cctatcactg gtgacttgga aacagttcat 1080
tacagaatct caaagagtgc ttggttgtcc ggatacgaga acccagttgt ctcaagaatt 1140
aatatgagaa tccaggatct tactggtttg gacgtttcta ctgccgaaga gttgcaagtc 1200
gcaaactatg gagttggtgg acagtacgaa ccacactttg atttcgcaag aaaggatgaa 1260
cctgacgctt tcaaagagct tggtacagga aatagaattg ctacctggtt gttttacatg 1320
tctgacgtct ccgctggtgg agccaccgtt ttcccagaag tcggtgcctc agtttggcct 1380
aaaaagggta ctgctgtttt ctggtataat ttgttcgcaa gtggagaggg agattactct 1440
actagacacg cagcttgccc tgttttggtc ggtaacaaat gggtttctaa taagtggctt 1500
cacgagagag gacaggagtt cagaagacct tgcacacttt ccgagttgga gtag 1554
<210> 5
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 胶原模拟肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(38)
<223> X是羟基脯氨酸
<400> 5
Cys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Xaa
1 5 10 15
Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly
20 25 30
Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly
35
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP基序
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码具有MMP基序的CLP的核酸
<400> 7
catatgtgtg gcccgaaagg tcccaagggt ccaaaagggc ccaagggtcc acccggaccg 60
ccgggacccc ctggaccccc cggtgatcca ggtgatcctg gagaccctgg tgaccccggt 120
ggaggcggtg ggcgtccgct tggattatgg gctgggggtg gaggacgcgg gggcggaggt 180
catcaccatc atcatcacta atctaga 207
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗炎肽基序
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码具有抗炎基序的CLP的核酸
<400> 9
catatgtgtg gtcctaaggg tcctaaaggt cctaaaggtc ctaaaggtcc tccaggtcca 60
cctggtcctc ctggtcctcc aggtgaccct ggtgaccctg gtgacccagg tgaccctggt 120
gggggggggg ggaggtatac ggtggagttg gcgtaatcta ga 162
<210> 10
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码包含MMP和抗炎基序的CLP的融合多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(61)
<223> X是羟基脯氨酸
<400> 10
Cys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Xaa
1 5 10 15
Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly
20 25 30
Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Trp
35 40 45
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Arg Tyr Thr Val Glu Leu Ala
50 55 60
<210> 11
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码包含MMP和抗炎基序的CLP融合蛋白的核酸
<400> 11
catatgtgcg gcccaaaagg acctaagggg cccaaaggcc ctaaaggccc accagggccc 60
ccaggtccgc caggacctcc aggggaccca ggcgatcctg gggatcccgg cgacccagga 120
ggagggggcg gacgtccgct tggcttatgg gcgggtgggg gtggacgccg ctacactgtt 180
gagcttgctg ggggaggagg ccatcaccac caccaccact aaagcaga 228
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGDSPG细胞粘附基序
<400> 12
Arg Gly Asp Ser Pro Gly
1 5
<210> 13
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码具有RGDSPG基序的CLP的核酸
<400> 13
tgtggtccca agggccctaa agggccgaaa ggacctaagg gtccccctgg gccgccggga 60
ccccctgggc caccgggtga cccaggcgat ccaggggatc caggcgatcc aggacgcggc 120
gattcgccgg ga 132
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IKVAV细胞粘附基序
<400> 14
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 15
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码具有IKVAV基序的CLP的核酸
<400> 15
tgtggaccta aaggtcccaa gggtccaaag gggcctaaag gcccccctgg tccgcccgga 60
ccgccaggac cacctggcga tcctggggac ccgggtgatc caggagaccc gggcattaaa 120
gtggcagtt 129