CN113773379B - 一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0～8.0、温度为2～8℃的条件下反应以制得聚乙二醇化类胶原蛋白；与现有其他制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法相比，使用本发明的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳，将使用本发明的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白制成水凝胶形成角膜后，在强度上可较使用现有方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白提高10倍以上，并且，使用本发明的方法制备聚乙二醇化类胶原蛋白的反应时间更短，仅需反应5～8h即可获得能制成水凝胶形成角膜的聚乙二醇化类胶原蛋白。

Description

一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
角膜(Cornea)是眼睛最前面的凸形高度透明物质，呈横椭圆形，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力。加上晶体的屈光力，光线便可准确地聚焦在视网膜上构成影像。角膜有十分敏感的神经末梢，如有外物接触眼角膜，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛。为了保持透明，角膜并没有血管，透过泪液及房水获取养份及氧气。
角膜十分脆弱，眼部外伤、炎症、过敏反应、物理损伤、化学灼伤、剧烈运动、用眼过度等均会导致角膜病变。角膜一旦病变，会导致明显的眼部症状，比如眼睛的疼痛、畏光、流泪、视力下降等，严重的还会导致失明。
角膜移植就是用正常的角膜替换患者现有的病变角膜，使患眼复明或控制角膜病变，达到增进视力或治疗某些角膜疾患的治疗方法。一些引起患者严重视力受损甚至是失明的角膜疾病，通过进行角膜移植的方法，完全可以治疗，帮助这些不幸的患者远离痛苦。因为角膜本身不含血管，处于“免疫赦免”地位，使角膜移植的成功率位于其他同种异体器官移植之首。
然而，角膜资源有限，远不能满足患者需求。为解决这一问题，有研究者提出了人工角膜移植术。人工角膜移植术是用透明的医用高分子材料制成的特殊光学装置，通过手术将它植入角膜组织中，以取代部分角膜瘢痕组织，而重新恢复视力的一种手术方法。由于角膜组织对人工合成材料的排异反应等问题尚未解决，远期效果不佳，常造成移植处的房水渗漏及移植片的脱落，故目前尚不可能广泛应用。现阶段人工角膜仅适用于患各种严重角膜疾患后的双目失明，特别是严重的化学烧伤引起的全部角膜白斑和多次角膜移植术失败，无法再做其他手术者。
在人工角膜的基础上，又有研究者提出了仿生角膜。例如，文献“Short peptideanalogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants”中，Jangamreddy,Jaganmohan R.等人提出了一种聚乙二醇化类胶原蛋白，将此聚乙二醇化类胶原蛋白经化学交联，即可获得仿生角膜。此仿生角膜生物相容性极好，可有效解决角膜组织对人工合成材料的排异反应强烈等问题。
但是，此仿生角膜的强度很低，仅有0.022MPa，若将此仿生角膜用于角膜移植，尚存在移植难度大、容易引起角膜圆锥等问题。
发明内容
为解决现有仿生角膜强度低的问题，本发明提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
反应步骤：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0～8.0、温度为2～8℃的条件下进行反应，得到反应产物；所述反应产物中含有上述聚乙二醇化类胶原蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为1～16:1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8～12:1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的反应溶剂为水或稀盐酸溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述稀盐酸溶液的浓度为1～10mmol/L；所述稀盐酸溶液的pH用稀碱溶液调节至6.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，所述稀碱溶液为pH 9.0～11.0的氢氧化钠溶液或氨水。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为1～15mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为8～10mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，反应步骤后，所述方法还包含纯化步骤；所述纯化步骤为：通过过滤截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤为透析或超滤。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的时间为1～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的时间为5～8h。
在本发明的一种实施方式中，所述类胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1中，X为4Hyp(4-羟脯氨酸)，即：
SEQ ID NO.1的氨基酸序列为：
H-Pro-Lys-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Asp-Hyp-Gly-Asp-Hyp-Gly-Asp-Hyp-Gly-Asp-Hy p-Gly-OH
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物包含PEG-40k、PEG-20k、PEG-10k或PEG-5k中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物的活化基团数为8-arm、4-arm、2-arm或1-arm中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物的活化基团数为4-arm或8-arm。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物的活化基团为-MAL、-NHS、-SG、-SPA、-SS或-EDC中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物的活化基团为-MAL。
在本发明的一种实施方式中，所述类胶原蛋白的其中一端连接有linker；所述聚乙二醇衍生物通过活化基团修饰在linker上。
在本发明的一种实施方式中，所述linker连接在类胶原蛋白的N端。
在本发明的一种实施方式中，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为巯基、氨基、羧基或咪唑基中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为巯基。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白的母核构象为HG或TP中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白中聚乙二醇衍生物的母核构象为TP。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白中类胶原蛋白的氨基酸构型为D型或L型中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白的分子量为15000～75000Da。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白的分子量为30000～75000Da。
本发明还提供了一种聚乙二醇化类胶原蛋白，所述聚乙二醇化类胶原蛋白是使用上述方法制备得到的。
本发明还提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法包括如下步骤：
冻干步骤：将使用上述方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白进行冻干，得到冻干制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干步骤为：将聚乙二醇化类胶原蛋白和冻干保护剂混合后进行冻干，得到冻干制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂为甘露醇、蔗糖或丙氨酸中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干包括如下阶段：
阶段一：于温度为-45℃、真空度(vacuum)为500m Torr的条件下冻干6h；
阶段二：于温度为-30℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干17h；
阶段三：于温度为25℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干7h。
本发明还提供了一种聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂，所述冻干制剂是是使用上述方法制备得到的。
本发明还提供了上述方法制备得到的聚乙二醇化类胶原蛋白或上述方法制备得到的冻干制剂在制备仿生或再生生物材料中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述仿生或再生生物材料为角膜。
本发明还提供了一种制备仿生角膜的方法，所述方法包括如下步骤：
交联步骤：将使用上述方法制备得到的冻干制剂溶于缓冲液中，得到溶解液；将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1；将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2；
固化步骤：将混合液2浇注在角膜模具中进行静置，得到角膜粗品。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤后，所述方法还包括浸泡步骤；所述浸泡步骤为：将角膜粗品连带模具一起添加至缓冲液中进行第一次浸泡，第一次浸泡结束后，打开模具，进行第二次浸泡，第二次浸泡结束后，脱模，得到角膜成品。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液的pH为5.5～8.0。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液的pH为6.5～7.5。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液的浓度为0.5～0.7mol/L。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MESBuffer或PBS Buffer。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为5～40g/mL。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为12～18g/mL。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为15g/mL。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述溶解液和MPC母液的混合质量比为2:1～4:1。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述混合液1和DMTMM母液的混合质量比为5:1～7:1。
在本发明的一种实施方式中，所述交联步骤在25～60℃下完成。
在本发明的一种实施方式中，所述交联步骤在45～55℃下完成。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤中，所述静置的温度为4～35℃。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤中，所述静置的温度为4～25℃。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤中，所述静置的时间为8～20h。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液的pH为5.5～8.0。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液的pH为6.5～7.5。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液的浓度为0.05～1mol/L。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MESBuffer或PBS Buffer。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次浸泡的温度为4～35℃、时间为5～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次浸泡的温度为4～35℃、时间为3～10h。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液的成分包含MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)、PEGDA(聚(乙二醇)二丙烯酸酯)、TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)以及溶剂。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液中，MPC的浓度为15～40g/mL；以体积百分比计，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为0.6～15％，TEMED的浓度为0.05～2％。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为8～12％。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为10％。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液的溶剂为缓冲液；所述缓冲液的pH为6.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，MPC母液中，所述缓冲液的pH为6.5～7.5。
在本发明的一种实施方式中，MPC母液中，所述缓冲液的浓度为0.5～0.7mol/L。
在本发明的一种实施方式中，MPC母液中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MES Buffer或PBS Buffer。
在本发明的一种实施方式中，所述DMTMM母液的成分包含DMTMM(4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐)、APS(过硫酸铵)以及溶剂。
在本发明的一种实施方式中，所述DMTMM母液中，DMTMM的浓度为5～20g/mL，APS的浓度为0.5～5g/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述DMTMM母液的溶剂为缓冲液；所述缓冲液的pH为6.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，DMTMM母液中，所述缓冲液的pH为6.5～7.5。
在本发明的一种实施方式中，DMTMM母液中，所述缓冲液的浓度为0.5～0.7mol/L。
在本发明的一种实施方式中，DMTMM母液中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MESBuffer或PBS Buffer。
本发明还提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜是是使用上述方法制备得到的。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0～8.0、温度为2～8℃的条件下进行反应以制得聚乙二醇化类胶原蛋白；与现有其他制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法相比，使用本发明的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳，将使用本发明的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白制成水凝胶形成角膜后，在强度上可较使用现有方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白提高10倍以上(用文献“Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants”中的聚乙二醇化类胶原蛋白制得的角膜强度仅有0.022MPa)。
并且，与现有其他制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法相比，使用本发明的方法制备聚乙二醇化类胶原蛋白的反应时间更短，仅需反应5～8h即可获得能制成水凝胶形成角膜的聚乙二醇化类胶原蛋白(文献“Short peptide analogs as alternatives tocollagen in pro-regenerative corneal implants”中，制备能制成水凝胶形成角膜的聚乙二醇化类胶原蛋白需要反应4周)。
进一步地，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8～12:1；此投料摩尔数比下制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳。
进一步地，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为8～10mg/mL；此投料浓度下制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳。
综上，本发明的方法及使用本发明的方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白在仿生角膜等仿生或再生生物材料的制备中具有极高的应用前景。
2、本发明提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法为将使用上述方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白和冻干保护剂混合后进行冻干以制得聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂；冻干保护剂可对使用上述方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白进行保护，使得使用上述方法制得的聚乙二醇化类胶原蛋白的结构在冻干过程不会被破坏，进而使得使用本发明的方法制得的冻干制剂制成水凝胶形成角膜后，强度进一步提高。
综上，本发明的方法及使用本发明的方法制得的冻干制剂在仿生角膜等仿生或再生生物材料的制备中具有极高的应用前景。
3、本发明提供了一种制备仿生角膜的方法，所述方法为先将使用上述方法制备得到的冻干制剂溶于MES Buffer中，得到溶解液，然后将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1，再将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2，最后将混合液2浇注在角膜模具中进行静置，得到角膜粗品；与现有其他制备仿生角膜的方法相比，使用本发明的方法制得的角膜强度高，可较使用现有其他制备仿生角膜的方法制得的角膜提高10倍以上(文献“Shortpeptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative cornealimplants”制得的角膜强度仅有0.022MPa)。
进一步地，所述方法将冻干制剂于pH为6.5～7.5、温度为45～55℃的条件下进行交联；此交联条件下制得的仿生角膜强度更高。
进一步地，所述方法将聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度控制在12～18g/mL；此聚乙二醇化类胶原蛋白浓度下制得的仿生角膜强度更高。
进一步地，所述方法将MPC母液中PEGDA的浓度控制在8～12％；此PEGDA浓度下制得的仿生角膜强度更高。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。下述实施例中类胶原蛋白的合成以及类胶原蛋白与linker之间的连接均由上海昂博生物技术有限公司(AmbioPharm.InC.)完成。下述实施例中的聚乙二醇衍生物均购自厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司。
实施例1-1：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
反应步骤：将类胶原蛋白(类胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且类胶原蛋白的N端连接有氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的linker)和聚乙二醇衍生物(8-arm-PEG-40k-MAL)溶于浓度为5mmol/L的稀盐酸溶液(稀盐酸溶液的pH用pH 11.0的氢氧化钠溶液调节至6.5)，使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为2.4mmol/L和0.3mmol/L，得到反应体系；将反应体系于pH为6.5、温度为5℃的条件下反应12h，得到反应产物；
纯化步骤：将反应产物用孔径为30000Da的超滤膜，于5℃下进行超滤，截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白1。
实施例2-1：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法包括如下步骤：
将实施例1制得的聚乙二醇化类胶原蛋白1和甘露醇按照质量比1:5的比例混合，得到冻干体系；将冻干体系进行冻干，得到冻干制剂1；
其中，冻干包括如下阶段：
阶段一：于温度为-45℃、真空度(vacuum)为500m Torr的条件下冻干6h；
阶段二：于温度为-30℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干17h；
阶段三：于温度为25℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干7h。
实施例1-2：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法在实施例1-1的方法的基础上，将反应温度(5℃)分别替换为：2℃、8℃、25℃、37℃，制得聚乙二醇化类胶原蛋白2～5。
实施例2-2：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法在实施例2-1的方法的基础上，将聚乙二醇化类胶原蛋白1分别替换为实施例1-2制得的聚乙二醇化类胶原蛋白2～5，制得冻干制剂2～5。
实施例1-3：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法在实施例1-1的方法的基础上，将反应pH(6.5)分别替换为：pH 2.5、pH 4.5、pH 5.5、pH 6.0、pH 7.0、pH8.0、pH 8.5、pH 10.5，制得聚乙二醇化类胶原蛋白6～13。
实施例2-3：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法在实施例2-1的方法的基础上，将聚乙二醇化类胶原蛋白1分别替换为实施例1-3制得的聚乙二醇化类胶原蛋白6～13，制得冻干制剂6～13。
实施例1-4：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法在实施例1-1的方法的基础上，将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物在稀盐酸溶液中的摩尔浓度分别替换为：
使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为3.0mmol/L和0.375mmol/L；
使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为1.8mmol/L和0.225mmol/L；
使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为1.2mmol/L和0.15mmol/L，
制得聚乙二醇化类胶原蛋白14～16。
实施例2-4：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法在实施例2-1的方法的基础上，将聚乙二醇化类胶原蛋白1分别替换为实施例1-4制得的聚乙二醇化类胶原蛋白14～16，制得冻干制剂14～16。
实施例1-5：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法，所述方法在实施例1-1的方法的基础上，将反应时间(12h)分别替换为：4h、8h、16h、24h，制得聚乙二醇化类胶原蛋白17～20。
实施例2-5：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法在实施例2-1的方法的基础上，将聚乙二醇化类胶原蛋白1分别替换为实施例1-5制得的聚乙二醇化类胶原蛋白17～20，制得冻干制剂17～20。
实施例2-6：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法
本实施例提供了一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的冻干制剂的方法，所述方法在实施例2-1的方法的基础上，将冻干保护剂(甘露醇)分别替换为：蔗糖、丙氨酸，制得冻干制剂21～22。
实验例1：制备工艺对聚乙二醇化类胶原蛋白及其冻干制剂交联性能的影响实验
本实验例提供了制备工艺对聚乙二醇化类胶原蛋白及其冻干制剂交联性能的影响实验，实验过程如下：
参照冻干制剂1的制备方法将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的类胶原蛋白直接制备成冻干制剂，以此冻干制剂作为空白对照，将实施例2-1～2-6制得的冻干制剂1～22分别制成角膜，得到角膜1～22。使用万能拉力机检测角膜1～22的强度，检测结果见表1；
其中，角膜的制备工艺如下：
交联步骤：将冻干制剂溶于浓度为0.5mol/L、pH 5.5的MES Buffer中，使得MESBuffer中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为12.5g/mL，得到溶解液；按照质量比5:1将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1；按照质量比7:1将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2；整个交联过程均在45℃下完成；
固化步骤：将混合液2浇注在角膜模具中，于25℃下放置12h，得到角膜粗品；
浸泡步骤：将角膜粗品(连带模具)添加至浓度为0.1mol/L、pH 6.5的PBS Buffer中，于4℃下浸泡24h后，打开模具，于4℃下继续浸泡4h，脱模，得到角膜成品；
其中，MPC母液的配方为：30g/mL MPC、10％PEGDA(v/v)、1％TEMED(v/v)，溶剂为0.5mol/L、pH 5.5的MOPS Buffer；
DMTMM母液的配方为：10g/mL DMTMM、15g/mL APS，溶剂为0.5mol/L、pH 5.5的MOPSBuffer。
由表1可知，制备工艺会对聚乙二醇化类胶原蛋白及其冻干制剂的交联性能造成影响，进而对制成水凝胶形成角膜造成影响，并且，冻干辅料组成为聚乙二醇化胶原蛋白提供骨架支撑和保护，从而影响聚合物的空间构象和生物活性，导致成膜后的硬度存在差异。使用实施例2-1～2-6制得的冻干制剂1～22制成的角膜1～22强度都较佳，同时提高了产品的生物相容性，在仿生角膜等仿生或再生生物材料的制备中具有极高的应用前景。
表1角膜1～22的强度
组别 强度(MPa) 组别 强度(MPa)
角膜1 0.083 角膜13 /(不成膜)
角膜2 0.080 角膜14 0.076
角膜3 0.075 角膜15 0.067
角膜4 0.025 角膜16 0.052
角膜5 /(不成膜) 角膜17 0.016
角膜6 /(不成膜) 角膜18 0.037
角膜7 0.019 角膜19 0.084
角膜8 0.036 角膜20 0.082
角膜9 0.074 角膜21 0.061
角膜10 0.072 角膜22 0.047
角膜11 0.062 角膜(空白对照) 0.014
角膜12 0.035
实施例3-1：一种制备仿生角膜的方法
本实施例提供了一种制备仿生角膜方法，所述方法包括如下步骤：
交联步骤：将实施例2-1制得的冻干制剂溶于浓度为0.5mol/L、pH 6.5的MESBuffer中，使得MES Buffer中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为15g/mL，得到溶解液；按照质量比4:1将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1；按照质量比7:1将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2；整个交联过程均在45℃下完成；
固化步骤：将混合液2浇注在角膜模具中，于25℃下放置12h，得到角膜粗品；
浸泡步骤：将角膜粗品(连带模具)添加至浓度为0.1mol/L、pH 6.5的PBS Buffer中，于4℃下浸泡24h后，打开模具，于4℃下继续浸泡4h，脱模，得到仿生角膜23；
其中，MPC母液的配方为：30％MPC(w/v，g/mL)、10％PEGDA(v/v)、1％TEMED(v/v)，溶剂为0.5mol/L、pH 6.5的MES Buffer；
DMTMM母液的配方为：10％DMTMM(w/v，g/mL)、15％APS(w/v，g/mL)，溶剂为0.5mol/L、pH 6.5的MES Buffer。
实施例3-2：一种制备仿生角膜的方法
本实施例提供了一种制备仿生角膜方法，所述方法在实施例3-1的方法的基础上，将交联温度(45℃)分别替换为：20℃、25℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃，制得仿生角膜24～30。
实施例3-3：一种制备仿生角膜的方法
本实施例提供了一种制备仿生角膜方法，所述方法在实施例3-1的方法的基础上，将Buffer的pH(6.5)分别替换为：5、5.5、6、7、7.5、8、8.5、9，制得仿生角膜31～38。
实施例3-4：一种制备仿生角膜的方法
本实施例提供了一种制备仿生角膜方法，所述方法在实施例3-1的方法的基础上，将MES Buffer中聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度(15g/mL)分别替换为：1g/mL、5g/mL、10g/mL、20g/mL、25g/mL、30g/mL、35g/mL、40g/mL、45g/mL，制得仿生角膜39～47。
实施例3-5：一种制备仿生角膜的方法
本实施例提供了一种制备仿生角膜方法，所述方法在实施例3-1的方法的基础上，将MPC母液中PEGDA的浓度(10％，v/v)分别替换为：0.5％、0.6％、1％、5％、8％、12％、15％(v/v)，制得仿生角膜48～54。
实验例2：制备工艺对角膜强度性能的影响实验
本实验例提供了制备工艺对角膜强度性能的影响实验，实验过程如下：
使用万能拉力机检测角膜23～54的强度，检测结果见表2。
由表2可知，制备工艺会对角膜的强度性能造成影响，其中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度太低会导致角膜强度变差，浓度太高导致角膜固化时间极短，无法完成后面的浇注步骤；由于聚乙二醇化类胶原蛋白的等电点为偏中性，当交联pH远离等电点时，参与反应的基团无法彼此靠近，会导致角膜强度变低或聚乙二醇化类胶原蛋白不发生凝胶的现象；聚乙二醇化类胶原蛋白制成的水凝胶为温敏型水凝胶，温度低时，其溶解度不好，会导致角膜固形物浓度偏低强度变小，温度高时，会导致其交联速度极快，进而导致无法浇注到模具中，提前成胶；MPC母液中PEGDA的浓度过低会导致角膜强度变差，浓度过高会导致聚乙二醇化类胶原蛋白过度交联，使聚乙二醇化类胶原蛋白制成的水凝胶脆性增加、韧性降低，进而使角膜强度变差。表1中，角膜23、25～29、32～36、40～45以及50～54的强度都较佳，且生物相容性也很好，在角膜移植领域极具应用前景。
表2角膜23～54的强度
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 熹微（苏州）生物医药科技有限公司
<120> 一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 1
Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Lys Gly Pro Xaa Gly Pro
1 5 10 15
Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Asp Xaa Gly Asp Xaa Gly Asp Xaa
20 25 30
Gly Asp Xaa Gly
35
<210> 2
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Gly Cys
1
<210> 3
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Phe
1

Claims (17)

1.一种制备仿生角膜的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
反应步骤：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0～8.0、温度为2～8℃的条件下反应12～24h，得到反应产物；所述反应产物中含有聚乙二醇化类胶原蛋白；
冻干步骤：将反应产物进行冻干，得到冻干制剂；
交联步骤：将冻干制剂溶于缓冲液中，得到溶解液；将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1；将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2；交联步骤中，所述缓冲液的pH为6.0～8.0；交联步骤中，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为10～35g/mL；所述交联步骤在40～60℃下完成；
固化步骤：将混合液2浇注在角膜模具中进行静置，得到角膜粗品；
所述MPC母液的成分包含MPC、PEGDA、TEMED以及溶剂；以体积百分比计，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为1～15％，TEMED的浓度为0.05～2％；所述MPC母液中，MPC的浓度为15～40g/mL；
所述DMTMM母液的成分包含DMTMM、APS以及溶剂；所述DMTMM母液中，DMTMM的浓度为5～20g/mL，APS的浓度为0.5～5g/mL；
所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8～12:1；
交联步骤中，所述溶解液和MPC母液的混合质量比为2:1～4:1，所述混合液1和DMTMM母液的混合质量比为5:1～7:1；
所述类胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述聚乙二醇衍生物的活化基团数为4-arm或8-arm；所述聚乙二醇衍生物的活化基团为-MAL。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的反应溶剂为水或稀盐酸溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述稀盐酸溶液的浓度为1～10mmol/L；所述稀盐酸溶液的pH用稀碱溶液调节至6.0～8.0。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稀碱溶液为pH 9.0～11.0的氢氧化钠溶液或氨水。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应步骤后，所述方法还包含纯化步骤；所述纯化步骤为：通过过滤截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述过滤为透析或超滤。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻干步骤为：将聚乙二醇化类胶原蛋白和冻干保护剂混合后进行冻干，得到冻干制剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂为甘露醇、蔗糖或丙氨酸中的一种或一种以上。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述冻干包括如下阶段：
阶段一：于温度为-45℃、真空度(vacuum)为500m Torr的条件下冻干6h；
阶段二：于温度为-30℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干17h；
阶段三：于温度为25℃、真空度(vacuum)为100m Torr的条件下冻干7h。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固化步骤后，所述方法还包括浸泡步骤；所述浸泡步骤为：将角膜粗品连带模具一起添加至缓冲液中进行第一次浸泡，第一次浸泡结束后，打开模具，进行第二次浸泡，第二次浸泡结束后，脱模，得到角膜成品。
11.如权利要求1或10所述的方法，其特征在于，固化步骤中，所述静置的温度为4～35℃。
12.如权利要求1或10所述的方法，其特征在于，浸泡步骤中，所述缓冲液的pH为5.5～8.0。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一次浸泡的温度为4～35℃、时间为5～24h。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二次浸泡的温度为4～35℃、时间为3～10h。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MPC母液的溶剂为缓冲液；所述缓冲液的pH为6～8。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DMTMM母液的溶剂为缓冲液；所述缓冲液的pH为6.0～8.0。
17.一种仿生角膜，其特征在于，所述仿生角膜是是使用权利要求1～16任一项所述的方法制备得到的。
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