CN115463258B - 一种仿生角膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种仿生角膜及其制备方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜的原料为聚乙二醇化类胶原蛋白，聚乙二醇化类胶原蛋白包含类胶原蛋白以及修饰在类胶原蛋白上的PEG‑40k和PEG‑20k；PEG‑40k和PEG‑20k修饰可显著提高类胶原蛋白的交联性能，使得本发明角膜的强度可较使用类胶原蛋白制成的角膜的强度提高将近20倍，较使用现有其他聚乙二醇化类胶原蛋白制成角膜的强度提高将近12倍，因此，本发明的角膜在角膜移植领域极具应用前景。PEG‑40k和PEG‑20k的摩尔比为2～3:1；此摩尔比下的PEG修饰提高类胶原蛋白交联性能的效果更佳，能进一步提高本发明角膜的强度。
Description
本申请是申请号为2021110598401、申请日为2021年09月13日、发明名称为“一种仿生角膜及其制备方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种仿生角膜及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
角膜（Cornea）是眼睛最前面的凸形高度透明物质，呈横椭圆形，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力。加上晶体的屈光力，光线便可准确地聚焦在视网膜上构成影像。角膜有十分敏感的神经末梢，如有外物接触眼角膜，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛。为了保持透明，角膜并没有血管，透过泪液及房水获取养份及氧气。
角膜十分脆弱，眼部外伤、炎症、过敏反应、物理损伤、化学灼伤、剧烈运动、用眼过度等均会导致角膜病变。角膜一旦病变，会导致明显的眼部症状，比如眼睛的疼痛、畏光、流泪、视力下降等，严重的还会导致失明。
角膜移植就是用正常的角膜替换患者现有的病变角膜，使患眼复明或控制角膜病变，达到增进视力或治疗某些角膜疾患的治疗方法。一些引起患者严重视力受损甚至是失明的角膜疾病，通过进行角膜移植的方法，完全可以治疗，帮助这些不幸的患者远离痛苦。因为角膜本身不含血管，处于“免疫赦免”地位，使角膜移植的成功率位于其他同种异体器官移植之首。
然而，角膜资源有限，远不能满足患者需求。为解决这一问题，有研究者提出了人工角膜移植术。人工角膜移植术是用透明的医用高分子材料制成的特殊光学装置，通过手术将它植入角膜组织中，以取代部分角膜瘢痕组织，而重新恢复视力的一种手术方法。由于角膜组织对人工合成材料的排异反应等问题尚未解决，远期效果不佳，常造成移植处的房水渗漏及移植片的脱落，故目前尚不可能广泛应用。现阶段人工角膜仅适用于患各种严重角膜疾患后的双目失明，特别是严重的化学烧伤引起的全部角膜白斑和多次角膜移植术失败，无法再做其他手术者。
在人工角膜的基础上，又有研究者提出了仿生角膜。例如，文献“Short peptideanalogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants”中，Jangamreddy, Jaganmohan R.等人提出了一种聚乙二醇化类胶原蛋白，将此聚乙二醇化类胶原蛋白经化学交联，即可获得仿生角膜。此仿生角膜生物相容性极好，可有效解决角膜组织对人工合成材料的排异反应强烈等问题。
但是，此仿生角膜的强度很低，仅有0.022MPa，若将此仿生角膜用于角膜移植，尚存在移植难度大、容易引起角膜圆锥等问题。
发明内容
为解决现有仿生角膜强度低的问题，本发明提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜的原料为聚乙二醇化类胶原蛋白；所述聚乙二醇化类胶原蛋白包含类胶原蛋白以及修饰在类胶原蛋白上的聚乙二醇衍生物；所述聚乙二醇衍生物包含PEG-40k和PEG-20k。
在本发明的一种实施方式中，所述仿生角膜是通过将聚乙二醇化类胶原蛋白交联后固化制得的。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物由PEG-40k和PEG-20k组成。
在本发明的一种实施方式中，所述类胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1中，X为4Hyp（4-羟脯氨酸），即：
SEQ ID NO.1的氨基酸序列为：
H-Pro-Lys-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Asp-Hyp-Gly-Asp-Hyp-Gly-Asp-Hyp-Gly-Asp-Hyp-Gly-OH
在本发明的一种实施方式中，所述PEG-40k和PEG-20k的摩尔比为0.5~6:1。
在本发明的一种实施方式中，所述PEG-40k和PEG-20k的摩尔比为2~3:1。
在本发明的一种实施方式中，所述PEG-40k的活化基团数为8-arm、4-arm、2-arm或1-arm中的一种或一种以上；所述PEG-20k的活化基团数为8-arm、4-arm、2-arm或1-arm中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述PEG-40k的活化基团数为4-arm或8-arm；所述PEG-20k的活化基团数4-arm或8-arm。
在本发明的一种实施方式中，所述PEG-40k的活化基团为-MAL、-NHS、-SG、-SPA、-SS或-EDC中的一种或一种以上；所述PEG-20k的活化基团为-MAL、-NHS、-SG、-SPA、-SS或-EDC中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述PEG-40k的活化基团为-MAL；所述PEG-20k的活化基团为-MAL。
在本发明的一种实施方式中，所述类胶原蛋白的其中一端连接有linker；所述聚乙二醇衍生物通过活化基团修饰在linker上。
在本发明的一种实施方式中，所述linker连接在类胶原蛋白的N端。
在本发明的一种实施方式中，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示。
SEQ ID NO.2的氨基酸序列为：
H-Gly-Cys-OH
SEQ ID NO.3的氨基酸序列为：
H-Gly-Phe-OH
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为巯基、氨基、羧基或咪唑基中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，当linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示时，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为巯基；当linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示时，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为氨基。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白的母核构象为HG或TP中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白中聚乙二醇衍生物的母核构象为TP。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白中类胶原蛋白的氨基酸构型为D型或L型中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白的分子量为15000~75000Da。
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇化类胶原蛋白的分子量为30000~75000Da。
本发明还提供了一种制备上述仿生角膜的方法，所述方法包括如下步骤：
反应步骤：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为4.0~10.0、温度为2~40℃的条件下反应1~48h，得到反应产物；
冻干步骤：将反应产物进行冻干，得到冻干制剂；
交联步骤：将冻干制剂溶于缓冲液中，得到溶解液；将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1；将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2；
固化步骤：将混合液2浇注在角膜模具中进行静置，得到角膜粗品。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤为：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0~8.0、温度为2~8℃的条件下反应5~8h。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为1~16:1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8~12:1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的反应溶剂为水或稀盐酸溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述稀盐酸溶液的浓度为1~10mmol/L；所述稀盐酸溶液的pH用稀碱溶液调节至6.0~8.0。
在本发明的一种实施方式中，所述稀碱溶液为pH 9.0~11.0的氢氧化钠溶液或氨水。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为1~15mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为8~10mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干步骤为：将反应产物和冻干保护剂混合后进行冻干，得到冻干制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂为甘露醇、蔗糖或丙氨酸中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干包括如下阶段：
阶段一：于温度为-45℃、真空度（vacuum）为500 m Torr的条件下冻干6h；
阶段二：于温度为-30℃、真空度（vacuum）为100 m Torr的条件下冻干17h；
阶段三：于温度为25℃、真空度（vacuum）为100 m Torr的条件下冻干7h。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液的pH为5.5~8.0。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液的pH为6.5~7.5。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液的浓度为0.5~0.7mol/L。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MESBuffer或PBS Buffer。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为5~40g/mL。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为12~18g/mL。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为15g/mL。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述溶解液和MPC母液的混合质量比为2:1~4:1。
在本发明的一种实施方式中，交联步骤中，所述混合液1和DMTMM母液的混合质量比为5:1~7:1。
在本发明的一种实施方式中，所述交联步骤在25~60℃下完成。
在本发明的一种实施方式中，所述交联步骤在45~55℃下完成。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤中，所述静置的温度为4~35℃。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤中，所述静置的温度为4~25℃。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤中，所述静置的时间为8~20h。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液的成分包含MPC（2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）、PEGDA（聚(乙二醇)二丙烯酸酯）、TEMED（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺）以及溶剂。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液中，MPC的浓度为15~40g/mL；以体积百分比计，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为0.6~15%，TEMED的浓度为0.05~2%。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为8~12%。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为10%。
在本发明的一种实施方式中，所述MPC母液的溶剂为缓冲液；所述缓冲液的pH为6.0~8.0。
在本发明的一种实施方式中，MPC母液中，所述缓冲液的pH为6.5~7.5。
在本发明的一种实施方式中，MPC母液中，所述缓冲液的浓度为0.5~0.7mol/L。
在本发明的一种实施方式中，MPC母液中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MES Buffer或PBS Buffer。
在本发明的一种实施方式中，所述DMTMM母液的成分包含DMTMM（4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐）、APS（过硫酸铵）以及溶剂。
在本发明的一种实施方式中，所述DMTMM母液中，DMTMM的浓度为5~20g/mL，APS的浓度为0.5~5g/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述DMTMM母液的溶剂为缓冲液；所述缓冲液的pH为6.0~8.0。
在本发明的一种实施方式中，DMTMM母液中，所述缓冲液的pH为6.5~7.5。
在本发明的一种实施方式中，DMTMM母液中，所述缓冲液的浓度为0.5~0.7mol/L。
在本发明的一种实施方式中，DMTMM母液中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MESBuffer或PBS Buffer。
在本发明的一种实施方式中，固化步骤后，所述方法还包括浸泡步骤；所述浸泡步骤为：将角膜粗品连带模具一起添加至缓冲液中进行第一次浸泡，第一次浸泡结束后，打开模具，进行第二次浸泡，第二次浸泡结束后，脱模，得到角膜成品。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液的pH为5.5~8.0。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液的pH为6.5~7.5。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液的浓度为0.05~1mol/L。
在本发明的一种实施方式中，浸泡步骤中，所述缓冲液为MOPS Buffer、MESBuffer或PBS Buffer。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次浸泡的温度为4~35℃、时间为5~24h。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次浸泡的温度为4~35℃、时间为3~10h。
在本发明的一种实施方式中，反应步骤后、冻干步骤前，所述方法还包含纯化步骤；所述纯化步骤为：通过过滤截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤为透析或超滤。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜的原料为聚乙二醇化类胶原蛋白，所述聚乙二醇化类胶原蛋白包含类胶原蛋白以及修饰在类胶原蛋白上的PEG-40k和PEG-20k；PEG-40k和PEG-20k的修饰可显著提高类胶原蛋白的交联性能，使得本发明角膜的强度可较使用类胶原蛋白制成的角膜的强度提高将近20倍，较使用现有其他聚乙二醇化类胶原蛋白制成角膜的强度提高将近12倍（用文献“Short peptide analogs as alternativesto collagen in pro-regenerative corneal implants”中的聚乙二醇化类胶原蛋白制得的角膜强度仅有0.022MPa），因此，本发明的角膜在角膜移植领域极具应用前景。
进一步地，所述PEG-40k和PEG-20k的摩尔比为2~3:1；此摩尔比下的PEG修饰提高类胶原蛋白交联性能的效果更佳，能进一步提高本发明角膜的强度。
进一步地，所述PEG-40k为8-arm-PEG-40k-MAL，所述PEG-20k为4-arm-PEG-20k-MAL；此配方下的PEG修饰提高类胶原蛋白交联性能的效果更佳，能进一步提高本发明角膜的强度。
2、本发明提供了上述仿生角膜的制备方法，所述方法包括反应、冻干、交联和固化这四个步骤，所述反应步骤将类胶原蛋白和PEG衍生物于pH为6.0~8.0、温度为2~8℃的条件下进行反应以制得聚乙二醇化类胶原蛋白；此反应步骤下制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳，能进一步提高制得的角膜的强度，并且，与现有其他聚乙二醇化类胶原蛋白的制备方法相比，此反应步骤的反应时间更短，仅需反应5~8h即可获得能制成水凝胶形成角膜的聚乙二醇化类胶原蛋白（文献“Short peptide analogs as alternatives tocollagen in pro-regenerative corneal implants”中，制备能制成水凝胶形成角膜的聚乙二醇化类胶原蛋白需要反应4周），有助于角膜的大规模工业化生产。
进一步地，所述反应步骤中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8~12:1；此投料摩尔数比下制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳，能进一步提高制得的角膜的强度。
进一步地，所述反应步骤中，类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为8~10mg/mL；此投料浓度下制得的聚乙二醇化类胶原蛋白交联性能更佳，能进一步提高制得的角膜的强度。
进一步地，所述交联步骤将冻干制剂于pH为6.5~7.5、温度为45~55℃的条件下进行交联以制得仿生角膜；此交联条件下制得的仿生角膜强度更高。
进一步地，所述交联步骤将聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度控制在12~18g/mL；此聚乙二醇化类胶原蛋白浓度下制得的仿生角膜强度更高。
进一步地，所述交联步骤将MPC母液中PEGDA的浓度控制在8~12%；此PEGDA浓度下制得的仿生角膜强度更高。
进一步地，所述冻干步骤在冻干保护剂的保护下对聚乙二醇化类胶原蛋白进行冻干；冻干保护剂可对聚乙二醇化类胶原蛋白进行保护，使得聚乙二醇化类胶原蛋白的结构在冻干过程不会被破坏，进而使得冻干制剂的交联性能更佳，进一步提高了制得的角膜的强度。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。下述实施例中类胶原蛋白的合成以及类胶原蛋白与linker之间的连接均由上海昂博生物技术有限公司（AmbioPharm.InC.）完成。下述实施例中的PEG衍生物均购自厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司。
实施例1：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜是通过将聚乙二醇化类胶原蛋白交联后固化制得的，所述聚乙二醇化类胶原蛋白由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的类胶原蛋白，连接在类胶原蛋白N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的linker，以及，修饰在linker巯基上的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL组成；其中，8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL的摩尔比为2:1，聚乙二醇化类胶原蛋白中聚乙二醇衍生物的母核构象为TP，且聚乙二醇化类胶原蛋白的分子量为30000~75000Da。将此仿生角膜命名为仿生角膜1。
上述仿生角膜1的制备方法包括如下步骤：
反应步骤：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物溶于浓度为5mmol/L的稀盐酸溶液（稀盐酸溶液的pH用pH 11.0的氢氧化钠溶液调节至6.5），使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为2.4mmol/L和0.3mmol/L，得到反应体系；将反应体系于pH为6.5、温度为5℃的条件下反应12h，得到反应产物；
纯化步骤：将反应产物用孔径为30000Da的超滤膜，于5℃下进行超滤，截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白；
冻干步骤：将聚乙二醇化类胶原蛋白和甘露醇按照质量比1:5的比例混合，得到冻干体系；将冻干体系进行冻干，得到冻干制剂；
交联步骤：将冻干制剂溶于浓度为0.5mol/L、pH 5.5的MES Buffer中，使得MESBuffer中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为12.5g/mL，得到溶解液；按照质量比5:1将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1；按照质量比7:1将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2；整个交联过程均在45℃下完成；
固化步骤：将混合液2浇注在角膜模具中，于25℃下放置12h，得到角膜粗品；
浸泡步骤：将角膜粗品（连带模具）添加至浓度为0.1mol/L、pH 5.5的PBS Buffer中，于4℃下浸泡24h后，打开模具，于4℃下继续浸泡4h，脱模，得到仿生角膜1；
其中，MPC母液的配方为：30g/mL MPC、10% PEGDA（v/v）、1% TEMED（v/v），溶剂为0.5mol/L、pH 5.5的MOPS Buffer；
DMTMM母液的配方为：10g/mL DMTMM、15g/mL APS，溶剂为0.5mol/L、pH 5.5的MOPSBuffer；
冻干包括如下阶段：
阶段一：于温度为-45℃、真空度（vacuum）为500 m Torr的条件下冻干6h；
阶段二：于温度为-30℃、真空度（vacuum）为100 m Torr的条件下冻干17h；
阶段三：于温度为25℃、真空度（vacuum）为100 m Torr的条件下冻干7h。
实施例2：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将使用的PEG配方（摩尔比为2:1的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL）分别替换为：
摩尔比为1:0的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL；
摩尔比为0:1的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL；
摩尔比为6:1的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL；
摩尔比为4:1的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL；
摩尔比为2:1的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-40k-MAL；
摩尔比为4:2:1的8-arm-PEG-40k-MAL、4-arm-PEG-20k-MAL和4-arm-PEG-40k-MAL；
摩尔比为2:2:1的8-arm-PEG-40k-MAL、4-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL；
摩尔比为2:2:1的8-arm-PEG-40k-MAL、4-arm-PEG-40k-MAL和8-arm-PEG-20k-MAL。
将上述仿生角膜蛋白依次命名为仿生角膜2~9。
上述仿生角膜2~9的制备方法同仿生角膜1。
实施例3：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜是通过将聚乙二醇化类胶原蛋白交联后固化制得的，所述聚乙二醇化类胶原蛋白由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的类胶原蛋白，连接在类胶原蛋白N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的linker，以及，修饰在linker氨基上的8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL组成；其中，8-arm-PEG-40k-MAL和4-arm-PEG-20k-MAL的摩尔比为2:1，聚乙二醇化类胶原蛋白中聚乙二醇衍生物的母核构象为TP，且聚乙二醇化类胶原蛋白的分子量为30000~75000Da。将此仿生角膜命名为仿生角膜10。
上述仿生角膜10的制备方法同仿生角膜1。
实施例4：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将反应步骤中的反应温度（5℃）分别替换为：2℃、8℃、25℃、37℃。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜11~14。
实施例5：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将反应步骤中的反应pH（6.5）分别替换为：pH 2.5、pH 4.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH8.0、pH 8.5、pH 10.5。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜15~22。
实施例6：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将反应步骤中类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物在稀盐酸溶液中的摩尔浓度分别替换为：
使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为3.0mmol/L和0.375mmol/L；
使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为1.8mmol/L和0.225mmol/L；
使得稀盐酸溶液中，类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的摩尔浓度分别为1.2mmol/L和0.15mmol/L。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜23~25。
实施例7：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将反应步骤中的反应时间（12h）分别替换为：4h、8h、16h、24h。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜26~29。
实施例8：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将冻干步骤中的冻干保护剂（甘露醇）分别替换为：蔗糖、丙氨酸。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜30~31。
实施例9：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将交联步骤中的交联温度（45℃）分别替换为：20℃、25℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜32~38。
实施例10：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将交联步骤中Buffer的pH（5.5）分别替换为：5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜39~46。
实施例11：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将交联步骤中聚乙二醇化类胶原蛋在MES Buffer中的浓度（15g/mL）分别替换为：1g/mL、5g/mL、10g/mL、20g/mL、25g/mL、30g/mL、35g/mL、40g/mL、45g/mL。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜47~55。
实施例12：一种仿生角膜及其制备
本实施例提供了一种仿生角膜，所述仿生角膜在实施例1的仿生角膜1的基础上，将交联步骤中PEGDA在MPC母液中的浓度（10%，v/v）分别替换为：0.5%、0.6%、1%、5%、8%、12%、15%（v/v）。
将上述仿生角膜依次命名为仿生角膜56~62。
实验例1：PEG配方及制备工艺对仿生角膜强度的影响实验
本实验例提供了PEG配方及制备工艺对仿生角膜强度的影响实验，实验过程如下：
参照仿生角膜1的制备方法将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的类胶原蛋白直接制备成仿生角膜，以此仿生角膜作为空白对照，使用万能拉力机检测角膜1~62的强度，检测结果见表1。
由表1可知，PEG修饰配方组合及制备工艺均会对仿生角膜的强度造成影响；其中，PEG修饰配方组合会显著影响角膜的强度和弹性；反应温度和pH与类胶原蛋白和PEG衍生物之间的缀合率有直接关联，能通过影响聚合物网络结构的形成，成为修饰产物是否能制成水凝胶形成角膜的关键因素之一；冻干辅料组成为聚乙二醇化胶原蛋白提供骨架支撑和保护，从而影响聚合物的空间构象和生物活性，导致成膜后的硬度存在差异；聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度太低会导致角膜强度变差，浓度太高导致角膜固化时间极短，无法完成后面的浇注步骤；由于聚乙二醇化类胶原蛋白的等电点为偏中性，当交联pH远离等电点时，参与反应的基团无法彼此靠近，会导致角膜强度变低或聚乙二醇化类胶原蛋白不发生凝胶的现象；聚乙二醇化类胶原蛋白制成的水凝胶为温敏型水凝胶，温度低时，其溶解度不好，会导致角膜固形物浓度偏低强度变小，温度高时，会导致其交联速度极快，进而导致无法浇注到模具中，提前成胶；MPC母液中PEGDA的浓度过低会导致角膜强度变差，浓度过高会导致聚乙二醇化类胶原蛋白过度交联，使聚乙二醇化类胶原蛋白制成的水凝胶脆性增加、韧性降低，进而使角膜强度变差。表1中，角膜1~13、16~21、23~31、33~37、39~44、49~53、56~62的强度都较佳，且生物相容性也很好，在角膜移植领域极具应用前景。
表1 角膜1~62的强度
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (19)
1.一种制备仿生角膜的方法，其特征在于，所述仿生角膜的原料为聚乙二醇化类胶原蛋白；所述聚乙二醇化类胶原蛋白包含类胶原蛋白以及修饰在类胶原蛋白上的聚乙二醇衍生物；所述聚乙二醇衍生物包含PEG-40k和PEG-20k；所述类胶原蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；所述PEG-40k和PEG-20k的摩尔比为2~3:1；所述PEG-40k为8-arm-PEG-40k-MAL，所述PEG-20k为4-arm-PEG-20k-MAL；所述聚乙二醇化类胶原蛋白中聚乙二醇衍生物的母核构象为TP，且所述聚乙二醇化类胶原蛋白的分子量为30000~75000Da；
所述方法包括如下步骤：
反应步骤：将类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物于pH为6.0~8.0、温度为2~8℃的条件下反应5~8h，得到反应产物；
冻干步骤：将反应产物进行冻干，得到冻干制剂；
交联步骤：将冻干制剂溶于缓冲液中，得到溶解液；将溶解液和MPC母液混合，得到混合液1；将混合液1和DMTMM母液混合，得到混合液2；
固化步骤：将混合液2浇注在角膜模具中进行静置，得到角膜粗品；
反应步骤中，所述类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的投料摩尔数比为8~12:1，所述类胶原蛋白在反应溶剂中的投料浓度为8~10mg/mL，所述类胶原蛋白和聚乙二醇衍生物的反应溶剂为水或稀盐酸溶液，所述稀盐酸溶液的浓度为1~10mmol/L，所述稀盐酸溶液的pH用稀碱溶液调节至6.0~8.0；
交联步骤中，所述缓冲液的pH为6.5~7.5，所述交联步骤在45~55℃下完成，所述缓冲液中，聚乙二醇化类胶原蛋白的浓度为12~18g/mL，所述溶解液和MPC母液的混合质量比为2:1~4:1，所述混合液1和DMTMM母液的混合质量比为5:1~7:1；
固化步骤中，所述静置的温度为4~35℃、时间为8~20h；
所述MPC母液的成分包含MPC、PEGDA、TEMED以及溶剂，所述MPC母液中，MPC的浓度为15~40g/mL，以体积百分比计，所述MPC母液中，PEGDA的浓度为8~12%，TEMED的浓度为0.05~2%，所述MPC母液的溶剂为缓冲液，所述缓冲液的pH为6.0~8.0；
所述DMTMM母液的成分包含DMTMM、APS以及溶剂，所述DMTMM母液中，DMTMM的浓度为5~20g/mL，APS的浓度为0.5~5g/mL，所述DMTMM母液的溶剂为缓冲液；所述缓冲液的pH为6.0~8.0。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻干步骤为：将反应产物和冻干保护剂混合后进行冻干，得到冻干制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂为甘露醇、蔗糖或丙氨酸中的一种或一种以上。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冻干包括如下阶段：
阶段一：于温度为-45℃、真空度为500 m Torr的条件下冻干6h；
阶段二：于温度为-30℃、真空度为100 m Torr的条件下冻干17h；
阶段三：于温度为25℃、真空度为100 m Torr的条件下冻干7h。
5.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，交联步骤中，所述缓冲液的浓度为0.5~0.7mol/L，且所述缓冲液为MOPS Buffer、MES Buffer或PBS Buffer。
6.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，MPC母液中，所述缓冲液的pH为6.5~7.5，且所述所述缓冲液的浓度为0.5~0.7mol/L。
7.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，DMTMM母液中，所述缓冲液的浓度为0.5~0.7mol/L，且所述所述缓冲液为MOPS Buffer、MES Buffer或PBS Buffer。
8.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，固化步骤后，所述方法还包括浸泡步骤；所述浸泡步骤为：将角膜粗品连带模具一起添加至缓冲液中进行第一次浸泡，第一次浸泡结束后，打开模具，进行第二次浸泡，第二次浸泡结束后，脱模，得到角膜成品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，浸泡步骤中，所述缓冲液的pH为5.5~8.0。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，浸泡步骤中，所述缓冲液的浓度为0.05~1mol/L，且所述所述缓冲液为MOPS Buffer、MES Buffer或PBS Buffer。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一次浸泡的温度为4~35℃、时间为5~24h。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二次浸泡的温度为4~35℃、时间为3~10h。
13.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，反应步骤后、冻干步骤前，所述方法还包含纯化步骤；所述纯化步骤为：通过过滤截留反应产物中分子量大于等于30000Da的物质，得到聚乙二醇化类胶原蛋白。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过滤为透析或超滤。
15.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述类胶原蛋白的其中一端连接有linker；所述聚乙二醇衍生物通过活化基团修饰在linker上。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述linker连接在类胶原蛋白的N端。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为巯基、氨基、羧基或咪唑基中的一种或一种以上。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，当linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示时，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为巯基；当linker的氨基酸序列如SEQID NO.3所示时，所述聚乙二醇衍生物在linker上的修饰位点为氨基。
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