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一种抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了式A所示化合物在制备抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的药物中的用途，其中，R1、R2各自独立地选自C1‑3烷基、C2‑3烯基、C2‑3炔基。实验证明，式A所示化合物，特别是厚朴酚及和厚朴酚，能够显著抑制艰难梭菌的活性，并能够显著抑制艰难梭菌芽孢的萌发，在制备预防和/或治疗艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发、或艰难梭菌感染性疾病并发症的药物中具有非常好的应用前景。

Description

一种抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的药物
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的药物。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile)是梭菌属的一种专性厌氧菌，对氧十分敏感，很难分离培养，故得名，一般寄生在人的肠道内。通常艰难梭菌感染是由于过度服用某些抗生素，打破了肠内菌群的平衡，使得艰难梭菌的菌群生长速度加快，引发炎症。艰难梭菌会产生外毒素A和B，并在不同时期产生不同的作用。毒素A为肠毒素，在初期首先与黏膜细胞绑定，造成初级的破坏，可使肠壁出现炎症，细胞侵润，肠壁通透性增加，出血及坏死。毒素B为细胞毒素，损害细胞骨架，致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞导致腹泻。
艰难梭菌感染性疾病是由艰难梭菌菌体和/或艰难梭菌芽孢的感染引起的一种疾病。伪膜性肠炎是一种常见的艰难梭菌感染性疾病，临床表现为腹泻、腹痛、伴有全身中毒症状。症状突然开始，并伴随血压低，通常还伴有发烧，白细胞增多，之后可导致死亡，是很严重的一类疾病。此外，艰难梭菌菌体和/或艰难梭菌芽孢的感染还可能引起艰难梭菌感染性疾病并发症，常见的并发症包括肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等。近年来，艰难梭菌已成为引起医院内感染性疾病的重要病原菌，日益被人们所重视。
对于艰难梭菌感染症的治疗目前主要的手段是采用抑菌剂。甲硝唑和万古霉素是最常用的两种，但是，经过甲硝唑和万古霉素治疗后的艰难梭菌感染性疾病患者有较高的几率出现复发，考虑到细菌在进化压力下的耐药性迟早会成为治疗的重大挑战，并且临床已经观察到耐甲硝唑和耐万古霉素的难治菌株出现，因此开发具有高活性抑制艰难梭菌新的抑菌剂是刻不容缓的。
另外，艰难梭菌属于芽孢杆菌，尽管有些抑菌剂可以很好地抑制艰难梭菌生长，但其在被抑制生长之前产出芽孢进入潜伏状态。艰难梭菌的芽孢具有强大的顽固性，对光热以及抑菌剂都能耐受，并且通过接触传染给其他人，一旦在合适条件下芽孢萌发后导致病症。这是艰难梭菌感染症高复发高传染的原因之一。因此，开发抑制芽孢萌发的新的抑制剂也是治疗艰难梭菌感染症的临床未满足需求。
厚朴酚以及和厚朴酚是木兰科植物或中药厚朴中含有的一种活性成分，在传统医药中使用的历史已经很长，味辛、性温，具有行气化湿、温中止痛、降逆平喘的功效。和厚朴酚已经较多的包括心血管等治疗领域的报道，例如Liou等人报道了其在缺血性再灌注损伤模型中对抗脑梗死的活性(Planta Medica，2003，69：130-134)。CN201710100322.7公开了和厚朴酚衍生物的制备方法及其医药用途，但尚未见该类衍生物在治疗艰难梭菌感染性疾病中的报道。
发明内容
本发明的目的是为解决艰难梭菌引起的感染性疾病这一临床难题，提供一种抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的新药物。
本发明提供了式A所示化合物在制备抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的药物中的用途，
其中，R1、R2各自独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基、C2-3炔基。
C1-3烷基表示所有含1-3个碳原子的烷基；C2-3烯基表示所有含2-3个碳原子的烯基；C2-3炔基表示所有含2-3个碳原子的炔基。
进一步地，所述式A所示化合物的结构如式B所示：
进一步地，所述式A所示化合物的结构如式I或式II所示：
进一步地，所述药物能够预防和/或治疗艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发、或艰难梭菌感染性疾病并发症。
进一步地，所述艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发、或艰难梭菌感染性疾病并发症是由艰难梭菌菌体和/或艰难梭菌芽孢的感染引起的。
进一步地，所述艰难梭菌感染性疾病并发症是由艰难梭菌菌体和/或艰难梭菌芽孢的感染引起的消化道感染综合征。
进一步地，所述消化道感染综合征选自伪膜性肠炎、憩室炎、抗生素相关性腹泻。
实验证明，式A所述化合物，特别是厚朴酚及和厚朴酚，能够显著抑制艰难梭菌的活性，并能够显著抑制艰难梭菌芽孢的萌发，在制备预防和/或治疗艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发、或艰难梭菌感染性疾病并发症的药物中具有非常好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
其中，厚朴酚、和厚朴酚购买于广州晶晶生物科技有限公司，HPLC纯度>98％。
实施例1厚朴酚及和厚朴酚对艰难梭菌活性的抑制
实验选取ATCC BBA1870、ATCC 700057、ATCC 630共3种艰难梭菌菌株，以添加补充剂的布式琼脂培养基测试。-80℃甘油冻存的菌株接到固体琼脂培养基上。放置37℃培养箱厌氧培养24～48h。厚朴酚、和厚朴酚的测试范围为128μg/ml-0.0625μg/ml，共11个两倍稀释浓度梯度。厚朴酚、和厚朴酚分别配置成一百倍浓度的高浓度工作液，当天使用，溶剂为100％DMSO。对于每个稀释浓度琼脂板的准备，20μl高浓度工作液与2ml的熔化的、添加补充剂的布氏琼脂(45-55℃)混合并加入到六孔板里，待凝固。1％的DMSO作为生长控制。实验当天，挑取适量单菌落悬浮于生理盐水，使用浊度仪将菌液浊度调节至OD600＝0.2，含约1×108cfu/ml。将此2ul菌液直接点在化合物固体稀释琼脂板中。因此六孔板每个孔含约105cfu艰难梭菌。此为测试板。将准备好的所有测试板置于35±2℃厌氧培养48h。培养48h后，通过肉眼观察，完全或显著抑制菌体生长的最低药物浓度为MIC。实验结果记录如下表1所示：
表1厚朴酚及和厚朴酚抑制艰难梭菌活性MIC值(μg/ml)
结果表明，厚朴酚在8-32μg/ml的浓度下能有效抑制艰难梭菌的生长，和厚朴酚在8-16μg/ml的浓度下能有效抑制艰难梭菌的生长。
实施例2厚朴酚及和厚朴酚对不同厌氧菌活性的抑制
实验选取ATCC 10031、ATCC 12022、ATCC 13048、ATCC 25611、ATCC 25922等5种厌氧菌菌株，以添加补充剂的BHI琼脂培养基测试。-80℃甘油冻存的菌株接到固体琼脂培养基上。放置37℃培养箱厌氧培养24～48h。厚朴酚、和厚朴酚的测试范围为128μg/ml-0.0625μg/ml，共11个两倍稀释浓度梯度。厚朴酚、和厚朴酚分别配置成一百倍浓度的高浓度工作液，当天使用，溶剂为100％DMSO。对于每个稀释浓度琼脂板的准备，20μl高浓度工作液与2ml的熔化的、添加补充剂的布氏琼脂(45-55℃)混合并加入到六孔板里，待凝固。1％的DMSO作为生长控制。实验当天，挑取适量单菌落悬浮于生理盐水，使用浊度仪将菌液浊度调节至OD600＝0.2，含约1×108cfu/ml。将此2ul菌液直接点在化合物固体稀释琼脂板中。因此六孔板每个孔含约105cfu艰难梭菌。此为测试板。将准备好的所有测试板置于35±2℃厌氧培养48h。培养48h后，通过肉眼观察，完全或显著抑制菌体生长的最低药物浓度为MIC。实验结果记录如下表2所示：
表2厚朴酚及和厚朴酚抑制不同厌氧菌活性MIC值(μg/ml)
化合物 ATCC 10031 ATCC 12022 ATCC 13048 ATCC 25611 ATCC 25922
厚朴酚 32 >128 >128 32 >128
和厚朴酚 128 >128 >128 32 >128
结果表明，厚朴酚及和厚朴酚对于部分厌氧菌具有抑制活性，对于部分厌氧菌不具有抑制活性，且其抑制活性的强弱没有明显的规律。
结合实施例1的结果说明，厚朴酚及和厚朴酚的抑菌作用是具有选择性的，其能够针对艰难梭菌起到明显的抑制效果。所以，厚朴酚及和厚朴酚对于艰难梭菌的抑制活性是非显而易见的。
实施例3厚朴酚及和厚朴酚抑制艰难梭菌芽孢萌发实验
依据文献The Journal of Infectious Diseases 2013；207:1498-504公开的方法培养纯化得到ATCC BBA1870、ATCC 43255、ATCC 630菌株的芽孢。将纯化的艰难梭菌孢子沉淀并用去离子水洗涤三次，通过9400g离心除去储存孢子的缓冲液。将孢子在68℃下热活化30分钟，然后再洗涤三次以除去任何自动萌发的孢子。用含有5mg/mL碳酸氢钠的100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)将孢子液浊度调整至OD580＝1.0。分别将厚朴酚、和厚朴酚与6mM牛磺胆酸盐和12mM甘氨酸混合后分别加入96孔板。在添加孢子后，每分钟测量一次OD580(计为OD580(t)，持续2小时，并与零点的OD580比较(计为OD580(t0)，计算相对OD580[相对OD580＝OD580(t)/OD580(t0)]。使用软件GraphpadPrism5.0计算化合物IC 50值：
结果记录如下表3：
表3厚朴酚及和厚朴酚抑制孢子萌发IC50(μM)
化合物 ATCC BBA1870 ATCC 43255 ATCC 630
厚朴酚 28.48 35.10 18.70
和厚朴酚 50.71 67.50 47.15
结果表明，厚朴酚及和厚朴酚对于不同艰难梭菌的菌株产生的芽孢均有显著抑制其萌发的效果。
综上，本发明提供了式A所示化合物在制备抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的药物中的用途，实验证明，式A所述化合物，特别是厚朴酚及和厚朴酚，能够显著抑制艰难梭菌的活性，并能够显著抑制艰难梭菌芽孢的萌发，在制备预防和/或治疗艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发、或艰难梭菌感染性疾病并发症的药物中具有非常好的应用前景。

Claims (7)

1.式A所示化合物在制备抑制艰难梭菌菌体和/或抑制艰难梭菌芽孢萌发的药物中的用途，
其中，R1、R2各自独立地选自C1-3烷基、C2-3烯基、C2-3炔基。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述式A所示化合物的结构如式B所示：
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述式A所示化合物的结构如式I或式II所示：
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于：所述药物能够预防和/或治疗艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发、或艰难梭菌感染性疾病并发症。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述艰难梭菌感染性疾病、艰难梭菌感染性疾病的复发、或艰难梭菌感染性疾病并发症是由艰难梭菌菌体和/或艰难梭菌芽孢的感染引起的。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述艰难梭菌感染性疾病并发症是由艰难梭菌菌体和/或艰难梭菌芽孢的感染引起的消化道感染综合征。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述消化道感染综合征选自伪膜性肠炎、憩室炎、抗生素相关性腹泻。
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