CN110463654A - 一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，所述方法包括以下步骤：(1)斑马鱼的饲养；(2)斑马鱼血管新生障碍模型的建立；(3)评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响。本发明建立了一种既有在体实验的生物复杂性和高可信性，又有体外实验的高通量特性的筛选方法，造模成功率高、造模重复性强，用于中药促血管新生活性物质的筛选很有指导意义。

Description

一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法
技术领域
本发明涉及基础医学领域，具体涉及一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法。
背景技术
血管新生是在原有的毛细血管或者微静脉基础上，通过内皮细胞的增殖、分化和迁移，以芽生或非芽生的形式生成新生的血管，是血管“从少到多”的生物学过程，参与了很多的生理或病理过程。血管新生一方面促进缺血细胞释放一系列促进血管生成因子，诱导动脉生成，新生的动脉在已经阻塞或狭窄的冠状动脉周围，建立新的侧支循环，实现自我搭桥；另一方面促进毛细血管密度增加，改善灌注，从而增加缺血区域的血流，减少组织的损伤和坏死。血管新生为缺血性心脑血管疾病提供了新的治疗策略。
目前有多种方法用于检测药物的促血管新生活性，体外实验包括内皮细胞增殖实验[1]，transwell/划痕迁移实验[2，3]、管腔形成实验[4]，鸡胚绒毛尿囊膜实验[5]，小鼠主动脉环血管新生实验[6]和视网膜血管新生实验[7]；在体实验包括下肢缺血模型[8]，急性心肌缺血模型(acute myocardial ischemia,AMI)[9]和脑缺血模型(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)[10]等。但在体实验通量低，成本较高；而体外实验不能完全反映机体血管新生过程中的生物复杂性。
中国专利申请号CN20171024488.7，发明名称:藁本内酯在制备促进血管新生的药物中的用途，试验例1血管新生促进试验2.1.1斑马鱼血管新生障碍模型造模实验用VRI使用DMSO配制成10mg/ml的储备液，避光保存于4℃冰箱，临用时使用新鲜饲养水将其稀释至所需浓度。将受精后的斑马鱼卵放入24孔板中，加入适量新鲜饲养水；在鱼卵受精后24h，模型筛选组换液为含有300nM剂量VRI的新鲜饲养水1ml以抑制血管生成；3h后，换液为含藁本内酯的饲养水继续孵化21h。
但中国专利申请号CN20171024488.7存在以下缺陷：①是针对藁本内酯在制备促进血管新生的药物中的用途，并未明确公开辛伐他汀用于斑马鱼血管新生障碍模型的方法，因此辛伐他汀能否作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物需要进一步研究；②并未明确孵育温度，因此造模成功率需进一步提高，实验结果重复性需要进一步增强；③未明确雄性斑马鱼:野生型雌性斑马鱼的配比，斑马鱼受精成功率较低；④未明确造模前斑马鱼的饲养方法，因此造模成功率需进一步增强；⑤未摸索出斑马鱼血管新生抑制率。
中国专利申请号CN201110327420.7用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型及其建立方法和应用,一种斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于包括以下顺序步骤：(1)取受精后24～28小时大的转基因或野生型的斑马鱼胚胎拆蛋壳后；(2)加入浓度为100～600nM/L的血管生长因子受体抑制剂，造模3-4小时；(3)清洗掉血管生长因子受体抑制剂，得到斑马鱼血管损伤模型。试验结果表明，该发明所建立的模式生物斑马鱼血管损伤模型，其造模率极高，可以模拟体内血管新生不足的环境进行快速筛选具有促血管新生类的药物，效果易于观察明显，在实验过程中用药量低，实验结果准确可重复性强。该模型可以成批量筛选潜在的药物，工作效率高。
但中国专利申请号CN201110327420.7存在以下缺陷：①并未明确公开辛伐他汀用于斑马鱼血管新生障碍模型的方法，因此辛伐他汀能否作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物需要进一步研究；②并未明确孵育温度，因此造模成功率、重复性需要进一步增强；③未明确雄性斑马鱼:野生型雌性斑马鱼的配比，斑马鱼受精成功率较低；④未明确造模前斑马鱼的饲养方法，因此造模成功率需进一步增强；⑤未摸索出斑马鱼血管新生抑制率
基于上述问题，因此建立一种既有在体实验的生物复杂性和高可信性，又有体外实验的高通量特性的筛选方法，提高造模成功率、增强造模重复性，用于中药促血管新生活性物质的筛选是很有意义的，对此本研发团队基于TG(fli1α:EGFP)斑马鱼建立一种高通量在体筛选方法，为药学以及基础医学提供新的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法。
本发明所述的一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法包括以下步骤：
(1)斑马鱼的饲养；
(2)斑马鱼血管新生障碍模型的建立；
(3)评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响。
本发明所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法中的斑马鱼的饲养条件为：斑马鱼在25～30℃循环水环境下生长；光暗比为11h～15h:8～12h，PH值6.5～7.5，硬度6～8，胚胎通过自然交配获得，每次交配前一天2～3对，均令两只斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对，平均每对获得100～150个胚胎，胚胎于26～29℃浓度的霍尔弗雷特溶液中培育。
优选的，本发明所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法中的斑马鱼的饲养条件为：斑马鱼在28℃循环水环境下生长；光暗比为14h:10h，PH值6.5～7.5，硬度6～8，胚胎通过自然交配获得，每次交配前一天2～3对，均令两只斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对，平均每对会获得100～150个胚胎，胚胎于28℃浓度的霍尔弗雷特溶液中培育。
本发明所述斑马鱼血管新生障碍模型的建立方法为：
(1)从循环水饲养系统中取出健康性成熟的雄性转基因纯合子斑马鱼与雌性野生型斑马鱼放入同一产卵用的鱼缸内，雌雄鱼用挡板隔开；
(2)过夜后于第二天上午9:00～10:00拆除挡板，使雄雌斑马鱼交配；
(3)受精1小时后(1hpf)，收集受精卵，并将其转至6孔板中，12枚/孔；20hpf于解剖显微镜下去除绒毛膜；24hpf分组加药，正常对照组加入正常斑马鱼培养水，培养48小时，血管新生障碍组加入辛伐他汀工作液，培养48小时；
(4)72phf于正置荧光显微镜下观察斑马鱼躯干节间血管和背主动脉生长情况，拍照，对斑马鱼新生血管荧光图片进行量化分析。
本发明所述的雄性转基因纯合子斑马鱼：雌性野生型斑马鱼＝1:2。
本发明权利要求4步骤(3)所述正常对照组加入正常斑马鱼培养水具体为：3mL含0.1％DMSO的培养水。
本发明所述权利要求4步骤(3)所述血管新生障碍组加入辛伐他汀工作液具体终浓度分别为0.15μM和0.30μM。
本发明所述权利要求4步骤(3)所述培养条件为：盖好6孔板盖板，在28.5±1.5℃培养箱汇中孵育。
本发明所述评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响具体方法为：观察0.15μM和0.30μM的辛伐他汀对24～72hpf斑马鱼血管新生的影响，与NC相比，0.15μm和0.30μm辛伐他汀均能显著抑制斑马鱼的血管新生，P<0.01。经观察，0.15μM辛伐他汀的斑马鱼血管新生抑制率达到43.40±11.98％，在此选用0.15μM辛伐他汀作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物。
本发明所述的斑马鱼为Tg(Fli1α:EGFP)斑马鱼(野生型斑马鱼除外)
有益效果：
1、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)中国专利申请号CN20171024488.7存在以下缺陷：①是针对藁本内酯在制备促进血管新生的药物中的用途，并未明确公开辛伐他汀用于斑马鱼血管新生障碍模型的方法，因此辛伐他汀能否作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物需要进一步研究；②并未明确孵育温度，因此造模成功率较低，实验结果重复性需要进一步增强；③未明确.雄性斑马鱼:野生型雌性斑马鱼的配比，斑马鱼受精成功率较低；④未明确造模前斑马鱼的饲养方法，因此造模成功率需进一步增强。⑤未明确斑马鱼血管新生抑制率。
(2)中国专利申请号CN201110327420.7存在以下缺陷：①并未明确公开辛伐他汀用于斑马鱼血管新生障碍模型的方法，因此辛伐他汀能否作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物需要进一步研究；②并未明确孵育温度，因此造模成功率、重复性需要进一步增强；③未明确雄性斑马鱼:野生型雌性斑马鱼的配比，斑马鱼受精成功率较低；④未明确造模前斑马鱼的饲养方法，因此造模成功率需进一步增强；⑤未摸索出斑马鱼血管新生抑制率。
本发明克服了中国专利申请号CN20171024488.7、CN201110327420.7存在的缺陷，具有以下有益效果：①明确了辛伐他汀用于斑马鱼血管新生障碍模型的方法，用于中药促血管新生活性物质的筛选是很有意义；②明确了孵育温度为28.5±1.5℃，造模成功率较高，实验结果重复性强；③明确Tg(Fli1α:EGFP)雄性斑马鱼:野生型雌性斑马鱼的配比＝1:2，斑马鱼受精成功率较高；④明确造模前斑马鱼的饲养方法，因此造模成功率较高；⑤通过试验证实斑马鱼血管新生抑制率达到43.40±11.98％。
2、本发明建立了一种既有在体实验的生物复杂性和高可信性，又有体外实验的高通量特性的筛选方法。
3、成本低。
附图说明
图1：0.15μM和0.30μM辛伐他汀对Tg(Fli1α:EGFP)斑马鱼血管新生的影响(A：72hpf斑马鱼胚胎作为正常对照组(NC)；B：0.15μM辛伐他汀诱导的血管新生抑制模型；C:0.30μM辛伐他汀诱导的血管新生抑制模型；D:斑马鱼躯干新生血管面积百分比图；n＝12，**P<0.01vs.NC组。)
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1
建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法:
(1)斑马鱼的饲养；
(2)斑马鱼血管新生障碍模型的建立；
(3)评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响。
实施例2
建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法:
仪器与试剂：尼康SMZ18体视显微镜(Nikon Metrology,Inc.USA)，
辛伐他汀：货号S6196；纯度≥97％(HPLC),(Sigma-Aldrich,Inc.USA)。
方法：
(1)斑马鱼在25℃循环水环境下生长；光暗比为11h:8h，PH值6.5～7.5，硬度6～8，胚胎通过自然交配获得，每次交配前一天2～3对，均令两只斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对，平均每对获得100～150个胚胎，胚胎于26℃浓度的霍尔弗雷特溶液中培育。
(2)从循环水饲养系统中取出健康性成熟的雄性TG(Fli1α:EGFP)转基因纯合子斑马鱼：雌性野生型斑马鱼(1:2)放入同一产卵用的鱼缸内，雌雄鱼用挡板隔开；
(3)过夜后于第二天上午9:00～10:00拆除挡板，使雄雌斑马鱼交配；
(4)受精1小时后(1hpf)，收集受精卵，并将其转至6孔板中，12枚/孔，盖好6孔板盖板，在28.5±1.5℃培养箱汇中孵育；20hpf于解剖显微镜下去除绒毛膜；24hpf分组加药，正常对照组加入正常斑马鱼培养水(每3mL含0.1％DMSO培养水)，培养48小时；血管新生障碍组加入0.15μM和0.3μM辛伐他汀工作液，培养48小时；
(5)72phf于正置荧光显微镜下观察斑马鱼躯干节间血管和背主动脉生长情况，拍照，对斑马鱼新生血管荧光图片进行量化分析。
(6)观察0.15μM和0.30μM的辛伐他汀对24～72hpf斑马鱼血管新生的影响，与NC相比，0.15μm和0.30μm辛伐他汀均能显著抑制斑马鱼的血管新生，P<0.01。
(7)经观察，0.15μM辛伐他汀的斑马鱼血管新生抑制率达到43.40±11.98％，因此选用0.15μM辛伐他汀作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物。
实施例3
建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法:
仪器与试剂：尼康SMZ18体视显微镜(Nikon Metrology,Inc.USA)，
辛伐他汀：货号S6196；纯度≥97％(HPLC),(Sigma-Aldrich,Inc.USA)。
方法：
(1)斑马鱼在30℃循环水环境下生长；光暗比为15h:12h，PH值6.5～7.5，硬度6～8，胚胎通过自然交配获得，每次交配前一天2～3对，均令两只斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对，平均每对获得100～150个胚胎，胚胎于29℃浓度的霍尔弗雷特溶液中培育。
(2)从循环水饲养系统中取出健康性成熟的雄性TG(Fli1α:EGFP)转基因纯合子斑马鱼：雌性野生型斑马鱼(1:2)放入同一产卵用的鱼缸内，雌雄鱼用挡板隔开；
(3)过夜后于第二天上午9:00～10:00拆除挡板，使雄雌斑马鱼交配；
(4)受精1小时后(1hpf)，收集受精卵，并将其转至6孔板中，12枚/孔，盖好6孔板盖板，在28.5±1.5℃培养箱汇中孵育；20hpf于解剖显微镜下去除绒毛膜；24hpf分组加药，正常对照组加入正常斑马鱼培养水(每3mL含0.1％DMSO培养水)，培养48小时；血管新生障碍组加入0.15μM和0.3μM辛伐他汀工作液，培养48小时；
(5)72phf于正置荧光显微镜下观察斑马鱼躯干节间血管和背主动脉生长情况，拍照，对斑马鱼新生血管荧光图片进行量化分析。
(6)观察0.15μM和0.30μM的辛伐他汀对24～72hpf斑马鱼血管新生的影响，与NC相比，0.15μm和0.30μm辛伐他汀均能显著抑制斑马鱼的血管新生，P<0.01。
(7)0.15μM辛伐他汀的斑马鱼血管新生抑制率达到43.40±11.98％，因此选用0.15μM辛伐他汀作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物。
实施例4
建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法:
仪器与试剂：尼康SMZ18体视显微镜(Nikon Metrology,Inc.USA)，
辛伐他汀：货号S6196；纯度≥97％(HPLC),(Sigma-Aldrich,Inc.USA)。
方法：
(1)斑马鱼在28℃循环水环境下生长；光暗比为14h:10h，PH值6.5～7.5，硬度6～8，胚胎通过自然交配获得，每次交配前一天2～3对，均令两只斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对，平均每对获得100～150个胚胎，胚胎于28℃浓度的霍尔弗雷特溶液中培育。
(2)从循环水饲养系统中取出健康性成熟的雄性TG(Fli1α:EGFP)转基因纯合子斑马鱼：雌性野生型斑马鱼(1:2)放入同一产卵用的鱼缸内，雌雄鱼用挡板隔开；
(3)过夜后于第二天上午9:00～10:00拆除挡板，使雄雌斑马鱼交配；
(4)受精1小时后(1hpf)，收集受精卵，并将其转至6孔板中，12枚/孔，盖好6孔板盖板，在28.5±1.5℃培养箱汇中孵育；20hpf于解剖显微镜下去除绒毛膜；24hpf分组加药，正常对照组加入正常斑马鱼培养水(每3mL含0.1％DMSO培养水)，培养48小时；血管新生障碍组加入0.15μM和0.3μM辛伐他汀工作液，培养48小时；
(5)72phf于正置荧光显微镜下观察斑马鱼躯干节间血管和背主动脉生长情况，拍照，对斑马鱼新生血管荧光图片进行量化分析。
(6)观察0.15μM和0.30μM的辛伐他汀对24～72hpf斑马鱼血管新生的影响，与NC相比，0.15μm和0.30μm辛伐他汀均能显著抑制斑马鱼的血管新生，P<0.01。
(7)0.15μM辛伐他汀的斑马鱼血管新生抑制率达到43.40±11.98％，0.30μM辛伐他汀的斑马鱼血管新生抑制率达到24.23±14.58，选用0.15μM辛伐他汀作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物。
试验例1
1.TG(fli1α:EGFP)斑马鱼的饲养
斑马鱼在28℃循环水环境下生长；光暗比为14h:10h，PH值6.5-7.5，硬度6-8。胚胎通过自然交配获得。每次交配前一天2-3对，均令两只TG(fli1α:EGFP)斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对。平均每对会获得100-150个胚胎。胚胎于28℃浓度的Holtfreter溶液中培育。
2.TG(Fli1α:EGFP)斑马鱼血管新生障碍模型的建立
目前有多种方法用于检测药物的促血管新生活性，体外实验包括内皮细胞增殖实验[1]，transwell/划痕迁移实验[2，3]、管腔形成实验[4]，鸡胚绒毛尿囊膜实验[5]，小鼠主动脉环血管新生实验[6]和视网膜血管新生实验[7]；在体实验包括下肢缺血模型[8]，急性心肌缺血模型(acute myocardial ischemia,AMI)[9]和脑缺血模型(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)[10]等。但在体实验通量低，成本较高；而体外实验不能完全反映机体血管新生过程中的生物复杂性。
因此建立一种既有在体实验的生物复杂性和高可信性，又有体外实验的高通量特性的筛选方法，用于中药促血管新生活性物质的筛选是很有意义的。对此我们基于TG(fli1α:EGFP)斑马鱼建立一种高通量在体筛选方法，为药学以及基础医学提供新的方法。
从循环水饲养系统中取出健康性成熟的雄性TG(Fli1α:EGFP)转基因纯合子斑马鱼与雌性野生型斑马鱼放入同一产卵用的鱼缸内，雌雄鱼用挡板隔开。过夜后于第二天上午9:00-10:00拆除挡板，使雄雌斑马鱼交配。受精1小时后(1hpf)，收集受精卵，并将其转至6孔板中，12枚/well；20hpf于解剖显微镜下去除绒毛膜；24hpf分组加药；
正常对照组(normal control,NC)加入正常斑马鱼培养水，培养48小时血管新生障碍组(anti-angiogenesis control,AC)加入辛伐他汀(Simvastatin,Sim)工作液(Sim能够通过VEGF通路抑制斑马鱼血管新生[i])，其终浓度分别为0.15μM和0.3μM，培养48小时，72phf于正置荧光显微镜下观察斑马鱼躯干节间血管(intersegmental vessels,ISVs)和背主动脉(dorsal aorta,DA)生长情况，拍照，血管荧光图片用Image J图像分析软件进行量化分析。
血管新生抑制率(％)＝血管面积AC/血管面积NC×100％
表1在体TG(fli1α:EGFP)斑马鱼二级筛选步骤
注：1)雄性Tg(Fli1α:EGFP)斑马鱼纯合子:野生型雌性斑马鱼＝1:2；
2)斑马鱼卵收集至60mm培养皿中，用吸管吸出未受精的鱼卵；
3)根据形态学指标挑选正常的受精卵；
4)用吸管将鱼卵转至6孔板中；
5)盖好6孔板盖板，在28.5±1.5℃培养箱汇中孵育；
6)斑马鱼卵在解剖显微镜下进行去绒毛膜，形态学检查等。
3.辛伐他汀对Tg(Fli1α:EGFP)斑马鱼血管新生的影响，见表2。
结果：0.15μM和0.30μM的辛伐他汀(Simvastatin)对24-72hpf TG(Fli1α:EGFP)斑马鱼血管新生的影响。与NC相比，0.15μM和0.30μM辛伐他汀均能显著抑制斑马鱼的血管新生(P<0.01)，其中0.15μM Sim的斑马鱼血管新生抑制率达到50％左右。因此选用0.15μM辛伐他汀。见图1。
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虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)斑马鱼的饲养；
(2)斑马鱼血管新生障碍模型的建立；
(3)评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响。
2.根据权利要求1所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述斑马鱼的饲养条件为：斑马鱼在25～30℃循环水环境下生长；光暗比为11h～15h:8～12h，PH值6.5～7.5，硬度6～8，胚胎通过自然交配获得，每次交配前一天2～3对，均令两只斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对，平均每对获得100～150个胚胎，胚胎于26～29℃浓度的霍尔弗雷特溶液中培育。
3.根据权利要求2所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述斑马鱼的饲养条件为：斑马鱼在28℃循环水环境下生长；光暗比为14h:10h，PH值6.5～7.5，硬度6～8，胚胎通过自然交配获得，每次交配前一天2～3对，均令两只斑马鱼纯合子斑马鱼与一只野生型斑马鱼配对，平均每对会获得100～150个胚胎，胚胎于28℃浓度的霍尔弗雷特溶液中培育。
4.根据权利要求1所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述斑马鱼血管新生障碍模型的建立方法为：
(1)从循环水饲养系统中取出健康性成熟的雄性转基因纯合子斑马鱼与雌性野生型斑马鱼放入同一产卵用的鱼缸内，雌雄鱼用挡板隔开；
(2)过夜后于第二天上午9:00～10:00拆除挡板，使雄雌斑马鱼交配；
(3)受精1小时后(1hpf)，收集受精卵，并将其转至6孔板中，12枚/孔；20hpf于解剖显微镜下去除绒毛膜；24hpf分组加药，正常对照组加入正常斑马鱼培养水，培养48小时，血管新生障碍组加入辛伐他汀工作液，培养48小时；
(4)72phf于正置荧光显微镜下观察斑马鱼躯干节间血管和背主动脉
生长情况，拍照，对斑马鱼新生血管荧光图片进行量化分析。
5.根据权利要求4所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述权利要求4步骤(1)所述的雄性转基因纯合子斑马鱼：雌性野生型斑马鱼＝1:2。
6.根据权利要求4所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述权利要求4步骤(3)所述正常对照组加入正常斑马鱼培养水具体为：3mL含0.1％DMSO的培养水。
7.根据权利要求4所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述权利要求4步骤(3)所述血管新生障碍组加入辛伐他汀工作液具体终浓度分别为0.15μM和0.30μM。
8.根据权利要求4所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述权利要求4步骤(3)所述培养条件为：盖好6孔板盖板，在28.5±1.5℃培养箱汇中孵育。
9.根据权利要求1所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响具体方法为：观察0.15μM和0.30μM的辛伐他汀对24～72hpf斑马鱼血管新生的影响，与NC相比，0.15μm和0.30μm辛伐他汀均能显著抑制斑马鱼的血管新生，P<0.01。
10.根据权利要求9所述的建立斑马鱼血管新生障碍模型的方法，其特征在于所述评价辛伐他汀对斑马鱼血管新生的影响具体方法还包括以下内容：0.15μM辛伐他汀的斑马鱼血管新生抑制率达到43.40±11.98，选用0.15μM辛伐他汀作为抑制斑马鱼血管新生的造模药物。
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