CN102657647A - Ic-4在抗血管新生中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有式(I)结构的化合物IC-4或其盐，
在抗血管新生中的应用。另外，本发明还公开了具有式(I)结构的化合物IC-4或其盐在制备抗血管新生剂中的应用。本发明对IC-4或其盐在抗血管新生中的应用的研究，是建立在对IC-4或其盐在抑制生长因子诱导的内皮细胞生长、抑制小管生成、抑制内皮细胞迁移和抑制内皮细胞转移的研究基础上，结合对斑马鱼胚胎血管生成抑制作用的整体实验而得以构建的科学、合理的研究体系。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物及其盐的用途，尤其涉及IC-4及其盐在抗血管新生中的应用。
背景技术
血管新生指在原毛细血管和/或微静脉基础上通过血管内皮细胞增殖、迁移、粘附和血管管腔形成等方式，形成具有功能的新血管的过程；该过程包含了血管内皮细胞与周围细胞外基质间的相互作用，主要受血管新生促进因子和血管新生抑制因子的调控。研究发现，多种生长因子如血管内皮细胞生长因子、血管生成素2和碱性成纤维细胞生长因子，及表皮生长因子等都可以通过不同的途径调节血管新生。生理状态下，血管新生仅在胚胎发育、创伤修复、女性月经时短暂开放，其余时段则处于关闭状态，从而使血管的生长与退化维持在动态的平衡状态。失去调控的血管新生广泛参与多种病理过程，如风湿性关节炎、视网膜病变、牛皮癣和动脉粥样硬化的发生发展。因此，对血管新生及相关血管新生抑制剂的研究具有重大的药理和临床实践意义。
中国专利(专利号CN101899011A，公开日2010年12月01日)、中国专利(专利号CN200410054686.9，公开日2004年07月27日)和中国专利(专利号CN01118399.3，公开日2001年05月29日)都公开了氨基二硫代甲酸酯类化合物，并且公开了该类化合物在制备抗肿瘤药物中的作用。但是现有技术中并未公开关于氨基二硫代甲酸酯类化合物是否具有抗血管新生作用的任何研究资料，因此无从知道是否存在具有抗血管新生作用氨基二硫代甲酸酯类化合物，更无从知道氨基二硫代甲酸酯类化合物中的哪些具体化合物具有抗血管新生作用。
发明内容
本发明所要解决的问题在于揭示了IC-4及其盐在抗血管新生中的应用；同时，本发明所要解决的问题还在于揭示了IC-4及其盐在制备抗血管新生剂中的应用。
为了解决以上技术问题，一方面，本发明揭示了一种具有式(I)结构的化合物IC-4或其盐，
在抗血管新生中的应用。
具体而言，化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，表现为在抑制生长因子诱导的内皮细胞生长中的应用，所述生长因子包括血清、内皮细胞生长因子及表皮生长因子。
另外，化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，也表现为在抑制小管生成中的应用。
同时，化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，也表现为在抑制内皮细胞迁移和抑制内皮细胞转移中应用。
优选地，本发明揭示了化合物IC-4或其盐，在抑制斑马鱼胚胎血管的生成中的应用。
另一方面，本发明揭示了一种具有式(I)结构的化合物IC-4或其盐，
在制备抗血管新生剂中的应用。
优选地，化合物IC-4或其盐在制备抗血管新生剂中的应用，是在制备由生长因子诱导的内皮细胞生长抑制剂中的应用，所述生长因子包括血清、内皮细胞生长因子及表皮生长因子。
优选地，化合物IC-4或其盐在制备抗血管新生剂中的应用，是在制备小管生成抑制剂中的应用。
优选地，化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，是在制备内皮细胞迁移抑制剂和内皮细胞转移抑制剂中应用。
优选地，本发明揭示了化合物IC-4或其盐，在制备斑马鱼胚胎血管生成抑制剂中的应用。
再则，本发明还公开了一种抗血管新生剂，抗血管新生剂中含有式(I)结构的化合物或其盐。
从新血管的形成机制和血管新生的调控机制来看，血管内皮细胞生长、小管生成、内皮细胞迁移和内皮细胞转移均对血管新生具有积极的作用，其中血管内皮细胞生长受到包括血清、内皮细胞生长因子及表皮生长因子等多种生长因子的诱导调控作用，因此，本发明对IC-4或其盐在抗血管新生中的应用的研究，是建立在对IC-4或其盐在抑制生长因子诱导的内皮细胞生长、抑制小管生成、抑制内皮细胞迁移和抑制内皮细胞转移的研究基础上，结合对斑马鱼胚胎血管生成抑制作用的整体实验而得以构建的科学、合理的研究体系。
结合上述技术方案和原理说明，在本发明的具体实施方式中通过XTT试验，证明IC-4能够抑制生长因子诱导的的内皮细胞生长；通过划痕实验，证明IC-4对内皮细胞迁移具有明显的抑制作用；通过Transwell小室迁移实验，表明IC-4 对内皮细胞转移具有明显的抑制作用；通过内皮细胞管状形成实验，确定IC-4对小管生成具有强烈的抑制作用；另外，通过斑马鱼血管发育体内试验，证明IC-4对斑马鱼胚胎血管的生成具有明显的抑制效果。当然，作为本领域内的常用手段，采用含IC-4的盐类或者IC-4药用盐替代IC-4也具有抗血管新生的作用，并能够适用于制备抗血管新生剂。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，并配合附图，详细说明如下。
附图说明
图1A-1D是本发明实施例1中IC-4抑制内皮细胞的活性和生长实验的结果图；
图2A-2B是本发明实施例2中IC-4抑制内皮细胞迁移实验的结果图；
图3A-3D是本发明实施例3中Transwell小室迁移实验的结果图；
图4A-4D是本发明实施例4中IC-4抑制内皮细胞小管形成实验的结果图；
图5A-5B是本发明实施例5中IC-4抑制斑马鱼胚胎血管生成实验的结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步的描述。
实施例1
IC-4抑制内皮细胞的活性和生长实验
1、实验方法：
XTT法：取2-5代人脐静脉内皮细胞，按1×104/孔细胞接种于96孔板上。培养过夜使细胞贴壁后，分别给予不同浓度IC-4和各种生长诱导物(包括10％胎牛血清FBS，20ng/ml内皮细胞生长因子EVGF和20ng/ml表皮生长因子EGF)， 并设置0.1％DMSO对照组和单独生长诱导物刺激组，每组设6个平行孔。细胞经培养24h或48h后，采用Roche Cell Proliferation Kit II与细胞共培养4h以形成水溶性的甲臜产物。用Perkin Elmer Multilabel Counter以490nm为检测波长和690nm为参比波长检测OD值。实验共进行3次，计算平均值，以0.1％DMSO组作为对照计算细胞活力的百分数。
2、实验结果：
如图1A-1D所示，IC-4处理内皮细胞24h及48h均能剂量依赖性的抑制内皮细胞活力。同时，因为血管新生往往受到多种生长因子的调控，因此我们检测了IC-4对于在常见生长因子，包括血清(Serum)，内皮细胞生长因子(VEGF)，和表皮生长因子(EGF)诱导下内皮细胞增殖的影响。结果显示，这些生长因子均能够促进内皮细胞增殖，IC-4可以显着抑制胎牛血清，内皮细胞生长因子，表皮生长因子诱导的细胞增殖。
实施例2
IC-4抑制内皮细胞迁移实验
1、实验方法：
划痕实验：取2-5代人脐静脉内皮细胞，按2×105/孔细胞接种于24孔板上，待细胞100％融合后，对照组每孔加入500μl正常培养基，给药组每孔加入500μl含不同浓度IC-4的培养基培养24h。此实验中采用药物浓度下IC-4均未显示细胞毒性。用规格为100μl的Tip头于各孔中央划一直线。用PBS清洗一次后，每孔加入500μl培养基继续培养10h。在划痕后0h，6h和10h于显微镜下观察并拍照。实验进行3次，每个浓度任意取3个视野对细胞迁移距离计算其平均值。结果以对照组迁移距离为对照，计算各个浓度给药组迁移距离百分数。并以Student’s t-test进行统计，P＜0.05为显着性差异。
2、实验结果：
内皮细胞迁移是血管新生中的一个关键环节，采用划痕实验检测IC-4对内皮细胞迁移的作用。如图2A-2B所示，A图为显微镜拍照图片；B图为统计结果。划痕后，对照组细胞培养10h后几乎愈合。IC-4能够剂量依赖的抑制内皮细胞 的迁移剂量。与划痕后6h对照组相比有显着性差异(*P＜0.01)，与划痕后10h对照组相比有显着性差异(#P＜0.001)。
实施例3
IC-4抑制内皮细胞转移实验
1、实验方法：
Transwell小室迁移实验：本实验采用8μm孔径的Corning 24孔Transwell小室进行实验。取2-5代人脐静脉内皮细胞，按5×104/孔细胞接种于Tranwell小室聚碳酸脂膜上层，Transwell小室上层以100μl 0.1％DMSO无血清培养基作为对照组，其他各孔以100μl含不同浓度药物的无血清培养基培养。Transwell小室下层为含1％血清和20ng/ml内皮细胞生长因子的培养基。待细胞迁移6h后，以PBS清洗，用棉签轻轻去除上层细胞，下层细胞用1％多聚甲醛固定15min，之后用Hoechst 33342染料染色并荧光显微镜观察并拍照。实验进行3次，每个浓度任取3个视野对迁移至下层的细胞计数并计算其平均值。结果以对照组迁移至下层的细胞数目为对照，计算各个浓度给药组迁移细胞的百分数。并以Student’s t-test进行统计，P＜0.05为显着性差异。
2、实验结果：
图3A-3D所示，A为对照组，B为0.25μM给药组，C为0.5μM给药组，D为1μM给药组。Transwell小室迁移法通过检测由小室上层迁移至下层的细胞数检测药物对内皮细胞三维迁移的作用。对迁移细胞进行染色拍照，结果显示，与对照组相比，IC-4给药组迁移至小室下层的细胞数明显减少，表明IC-4具有抑制内皮细胞迁移的能力。
实施例4
IC-4抑制内皮细胞的小管生成实验
1、实验方法：
内皮细胞管状形成实验：将Matrigel预先至于4℃过夜，将Matrigel与PBS按1∶1混合均匀，在24孔板中每孔加入250μl铺匀，置于37℃孵育20min使其聚合。取2-5代人脐静脉内皮细胞，按1×105/孔细胞接种于此24孔板。以 0.1％DMSO为对照组，给药组每孔为500μl含不同浓度IC-4的培养基培养6-8h使其形成管状。采用显微镜观察小管形成情况，每孔任意取3个视野计数小管形成结点数计算平均值。结果以对照组形成小管结点数为对照，计算各个浓度给药组形成小管结点数的百分数。并以Student’s t-test进行统计，P＜0.05为显着性差异。
2、实验结果：
血管新生是在生理或者病理情况下，在原有血管基础上形成新的血管的过程，该过程主要分为血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成三个步骤。小管形成实验对IC-4对血管新生的另一重要环节的影响进行评价。如图4A-4D所示，图中A为对照组，B为0.5μM给药组，C为1μM给药组，D为统计结果。对照组细胞在Matrigel上成网状相连，形成小管结构，IC-4给药组形成的小管完整性和数目减少。对各组网状形成的节点数进行统计，给药组节点数与对照组相比有显着性减少(*P＜0.05，**P＜0.01)。
实施例5
4IC-4抑制斑马鱼胚胎血管生成实验
1、实验方法：
斑马鱼血管发育体内试验：取受精后48h(post-fertilization)的Tg(fli1：EGFP)转基因斑马鱼胚胎，随机分组，每组10个放入24孔板。以0.1％DMSO为对照组，给药组每孔为500μl含4μM IC-4的MilliQ水培养30h。以0.02％三卡因麻醉将胚胎置于载玻片上，以荧光显微镜观察药物对斑马鱼胚胎节间血管(inter-segmental vessels，ISV)形成的影响。
2、实验结果：
Tg(fli1：EGFP)转基因斑马鱼的内皮细胞能够表达绿色荧光蛋白，配合荧光显微镜可用于评价药物对血管新生的影响。在斑马鱼胚胎早期发育过程，血管形成模式主要出现在头部和躯干部位节间。本实验观察了药物对于胚胎节间血管(inter-segmental vessels，ISV)形成的影响。如图5A-5B所示，A为对照组，B为4μM给药组。与对照组相比，给药组斑马鱼ISV的完整性降低。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有式(I)结构的化合物IC-4或其盐，
在抗血管新生中的应用。
2.根据权利要求1所述的化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，其特征在于：表现为在抑制生长因子诱导的内皮细胞生长中的应用，所述生长因子包括血清、内皮细胞生长因子及表皮生长因子。
3.根据权利要求1所述的化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，其特征在于：表现为在抑制小管生成中的应用。
4.根据权利要求1所述的化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，其特征在于：表现为在抑制内皮细胞迁移和抑制内皮细胞转移中应用。
5.根据权利要求1所述的化合物IC-4或其盐，在抑制斑马鱼胚胎血管的生成中的应用。
6.一种具有式(I)结构的化合物IC-4或其盐，
在制备抗血管新生剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的化合物IC-4或其盐在制备抗血管新生剂中的应用，其特征在于：是在制备由生长因子诱导的内皮细胞生长抑制剂中的应用，所述生长因子包括血清、内皮细胞生长因子及表皮生长因子。
8.根据权利要求6所述的化合物IC-4或其盐在制备抗血管新生剂中的应用，其特征在于：是在制备小管生成抑制剂中的应用。
9.根据权利要求6所述的化合物IC-4或其盐在抗血管新生中的应用，其特征在于：是在制备内皮细胞迁移抑制剂和内皮细胞转移抑制剂中应用。
10.一种抗血管新生剂，其特征在于：抗血管新生剂中含有式(I)结构的化合物或其盐。
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