CN110461317A - 皮肤屏障增强剂、药物组合物、药用化妆品及美容方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够增强皮肤屏障功能的皮肤屏障增强剂。该皮肤屏障增强剂含有单糖及糖醇中的至少一种，且pH为4.0以上7.0以下。

Description

皮肤屏障增强剂、药物组合物、药用化妆品及美容方法

技术领域

本发明涉及皮肤屏障增强剂、药物组合物、药用化妆品及美容方法。

本申请基于2017年3月31日在日本申请的日本特愿2017-071379号主张优先权，在此引用其内容。

背景技术

表皮具有防止体内水份蒸发并保持皮肤水份量的保湿功能与防止螨、灰尘、花粉及微生物等侵入的皮肤屏障功能。

在各种皮肤疾病、异位性皮肤炎、干癣及接触性皮肤炎等可见的炎症症状中，显著可见水份自皮肤消失。保湿功能下降及皮肤屏障功能下降与水份消失有关。

报告了随着皮肤屏障功能下降，经由皮肤的过敏原及细菌等所导致的致敏作用增加而引起过敏反应及皮肤炎症等。例如，对高龄者而言，由于皮肤屏障功能下降及皮肤屏障功能无法充分恢复，皮肤炎及褥疮等症状容易恶化。因此，期待开发出可促进皮肤屏障功能增强的皮肤屏障增强剂等药剂。

鉴于以上状况，专利文献1公开了葡萄糖促进HMGB1的产生，诱导HMGB1向细胞外释放，提高正常细胞的增殖及迁移，促进组织修复。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2013-147480号公报

发明内容

发明要解决的问题

然而，需要能够进一步增强皮肤屏障功能的皮肤屏障增强剂。

因此，本发明的目的在于提供可进一步增强皮肤屏障功能的皮肤屏障增强剂。

解决问题的手段

丝聚蛋白(Filaggrin)是存在于形成表皮颗粒层的细胞内的蛋白质，是保持皮肤水份量、对保湿功能有益的蛋白质。紧密连接蛋白-1(Claudin-1)则是构成将表皮细胞彼此连接的紧密连接(tight junction)的膜蛋白质。Claudin-1是防止过敏原、微生物等侵入细胞内的蛋白质，并且对防止体表水份蒸发的功能有益。

本申请发明人等针对促进皮肤组织修复的皮肤屏障增强剂进行精心研究，结果发现，含有在酸性区域具有pH的单糖及糖醇中的至少一种的液体具有促进与皮肤屏障相关的蛋白质Filaggrin及Claudin-1产生的作用。本申请发明人考虑如果这些与皮肤屏障相关的蛋白质的产生被促进，则能够增强皮肤屏障功能，从而完成了本发明。

即，本发明具有以下[1]-[6]的方式。

[1]一种皮肤屏障增强剂，含有单糖及糖醇中的至少一种，并且pH在4.0以上7.0以下。

[2]如[1]所述的皮肤屏障增强剂，含有葡萄糖作为所述单糖。

[3]如[1]所述的皮肤屏障增强剂，含有甘露糖醇作为所述糖醇。

[4]如[1]至[3]中任一项所述的皮肤屏障增强剂，其中所述pH在5.0以上7.0以下。

[5]一种药物组合物，含有如[1]至[4]中任一项所述的皮肤屏障增强剂，且pH在4.0以上7.0以下。

[6]一种药用化妆品，含有如[1]至[4]中任一项所述的皮肤屏障增强剂，且pH在4.0以上7.0以下。

[7]如[6]所述的药用化妆品，其为液体状、凝胶状或片状。

[8]一种美容方法，包括将[6]或[7]所述的药用化妆品涂覆于皮肤或粘膜的步骤。

发明效果

根据本发明，能够提供一种可进一步增强皮肤屏障功能的皮肤屏障增强剂。

附图说明

图1是显示实施例1-6、比较例1-4的Filaggrin蛋白质表达量的评价结果的图表。

图2是显示实施例2、4、6、比较例2、4的Filaggrin的mRNA表达量的评价结果的图表。

图3是显示实施例2、4、6、比较例2、4的Claudin-1的mRNA表达量的评价结果的图表。

图4是显示实施例7、比较例7的Filaggrin蛋白质表达量的评价结果的图表。

图5是显示实施例1-6、比较例1-4的细胞伤害率的评价结果的图表。

图6是显示以异位性皮肤炎小鼠模型进行评价的小鼠耳廓部的外观的照片。

图7是显示以异位性皮肤炎小鼠模型进行评价的小鼠耳廓部的切片组织染色结果的照片。

图8是显示参考试验1的Filaggrin及Claudin-1的mRNA表达量的评价结果的图表。

图9是显示参考试验2的Filaggrin蛋白质表达量的评价结果的图表。

图10是显示参考试验3的Claudin-1蛋白质表达量的评价结果的图表。

具体实施方式

(皮肤屏障增强剂)

本发明的皮肤屏障增强剂含有单糖及糖醇中的至少一种，且pH在4.0以上7.0以下。皮肤屏障增强剂的形态只要是可测定pH的形态则没有特别限制。作为具体例可例示液体状、凝胶状、片状、溶胶、乳霜及乳液等，但并不限于这些。

本发明的皮肤屏障增强剂含有单糖及糖醇中的至少一种。通过含有单糖及糖醇中的至少一种，能够促进细胞的Filaggrin及Claudin-1的产生，能够增强皮肤屏障功能。皮肤屏障增强剂谋求增强或恢复保持皮肤水份量、进行保湿的功能、防止微生物等侵入细胞内的功能等皮肤原本具有的皮肤屏障功能。

皮肤屏障增强剂中的单糖及糖醇中的至少一种的含量优选为1-5000mM，更优选为6-3000mM，进一步优选为6-1000mM，特别优选为6-165mM。单糖及糖醇中的至少一种的含量若在所述下限值以上，则Filaggrin及Claudin-1的产生因皮肤屏障增强剂而受到促进，容易增强或恢复皮肤屏障功能。单糖及糖醇中的至少一种的含量若在所述上限值以下，单糖及糖醇中的至少一种会均匀分散在皮肤屏障增强剂中，可充分促进Filaggrin及Claudin-1的产生，而容易充分地增强或恢复皮肤屏障功能。

<单糖>

单糖可例示葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、古洛糖、木糖、来苏糖、赤藓糖、苏糖、半乳糖及山梨糖等单糖，但并不限于这些。在这些之中，皮肤屏障增强剂优选含有葡萄糖作为单糖。

<糖醇>

糖醇可例示甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇及乳糖醇等，但并不限于这些。在这些之中，皮肤屏障增强剂优选含有甘露糖醇作为糖醇。

<皮肤屏障增强剂的pH>

本发明的皮肤屏障增强剂的pH为4.0以上7.0以下，优选5.0以上7.0以下。pH若在所述下限值以上，则皮肤屏障增强剂导致的皮肤组织及细胞损害降低，且Filaggrin的mRNA及Claudin-1的mRNA的转录及表达被促进，容易增强或恢复皮肤屏障功能。pH若在所述上限值以下，则可充分促进Filaggrin及Claudin-1的产生，充分增强或恢复皮肤屏障功能。

另外，在本说明书中，pH是利用pH计测器(堀场制作所制“F-53”)在25℃下测得的值。

皮肤屏障增强剂的pH可通过缓冲液来调节。

缓冲液只要使皮肤屏障增强剂的pH维持在4.0以上7.0以下，则没有特别限制。缓冲液可例示磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液、马来酸缓冲液、苹果酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、偏磷酸缓冲液、山梨酸缓冲液、碳酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液(Tris盐酸缓冲液)、MES缓冲液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)、TES缓冲液(N-Tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液)、醋酸缓冲液、MOPS缓冲液(3-吗啉丙磺酸缓冲液)、HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液)等缓冲液；甘氨酸-盐酸缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、甘氨酰甘氨酸-NaOH缓冲液及甘氨酰甘氨酸-KOH缓冲液等氨基酸系缓冲液；Tris-硼酸缓冲液、硼酸-NaOH缓冲液、硼酸缓冲液等硼酸系缓冲液；以及咪唑缓冲液等，但不限于这些。在这些之中，优选磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、苹果酸缓冲液、琥珀酸缓冲液及偏磷酸缓冲液。缓冲液的pH调整可使用盐酸及醋酸等酸性物质或氢氧化钠、氨等碱性物质来适当调整。

另外，也可以不将上述缓冲液添加至皮肤屏障增强剂，而通过将磷酸、醋酸、氨基酸等酸性物质添加至皮肤屏障增强剂中将皮肤屏障增强剂的pH调整为4.0以上7.0以下。

以缓冲液调节皮肤屏障增强剂的pH的情况下，皮肤屏障增强剂中的缓冲液浓度优选为6-165mM。若缓冲液浓度在所述下限值以上，则变得容易调整皮肤屏障增强剂的pH。若缓冲液浓度在所述上限值以下，则可通过皮肤屏障增强剂来充分促进Filaggrin及Claudin-1的产生，容易充分地增强或恢复皮肤屏障功能。

<可选成分>

皮肤屏障增强剂可在不抑制本发明效果的范围内根据需要含有单糖及糖醇中的至少一种以外的可选成分。

可选成分可例示赋形剂、增粘剂、担体、香料、色素等。这些可选成分可单独使用1种，也可组合2种以上使用。关于可选成分，后述的“(药物组合物)”的项目中作具体说明。

本发明是单糖及糖醇中的至少一种在皮肤屏障增强剂中的使用，该使用包括在pH为4.0以上7.0以下投与单糖及糖醇中的至少一种。

即，本发明是单糖及糖醇中的至少一种与作为可选成分的pH调整剂的组合用于制造皮肤屏障增强剂的使用，该使用包括在pH为4.0以上7.0以下投与单糖及糖醇中的至少一种。

(药物组合物)

本发明的药物组合物含有本发明的皮肤屏障增强剂，且pH为4.0以上7.0以下。

药物组合物中的单糖及糖醇中的至少一种的含量可考虑药物组合物(皮肤屏障增强剂)的用途、用法等来决定。例如，若为使用药物组合物的经皮吸收剂，则优选100-5000mM，更优选1000-3000mM。若为使用药物组合物的注射剂，则优选1-1000mM，更优选6-165mM。单糖及糖醇中的至少一种的含量若在所述下限值以上，则Filaggrin及Claudin-1的产生因药物组合物而被促进，皮肤屏障功能容易增强或恢复。单糖及糖醇中的至少一种的含量若在所述上限值以下，则单糖及糖醇中的至少一种会均匀分散于药物组合物中，可充分促进Filaggrin及Claudin-1的产生，容易使皮肤屏障功能充分增强或恢复。

药物组合物的pH为4.0以上7.0以下，优选为5.0以上7.0以下。pH若在所述下限值以上，可使编码Filaggrin的mRNA及编码Claudin-1的mRNA的表达受到促进，而使皮肤屏障功能容易增强或恢复。pH若在所述上限值以下，难以因投与药物组合物而引起皮肤组织受损，可充分促进Filaggrin及Claudin-1的产生，容易使得皮肤屏障功能充分增强或恢复。

药物组合物的用途可例示异位性皮肤炎、支气管喘息、类风湿性关节炎及胶原病等自体免疫疾病的治疗药；肾病综合症、溃疡性大肠炎、肝炎、胰炎、甲状腺炎、感冒、口内炎、牙龈炎及牙周炎等脏器炎症等疾病的抗炎症药；烧烫伤、受伤、褥疮、痤疮、汗疹及冻疮等创伤的创伤治疗药等；色素性干皮症及鱼鳞癣等遗传性疾病的治疗药等。在这些之中，若将本发明的药物组合物应用在抗炎症药及创伤治疗药上，本发明的效果是显著的。

药物组合物的剂形只要是可测定pH的形态，则无特别限定。剂形的具体例可例示液剂、乳剂、悬浊剂及糖浆剂等经口制剂；软膏、洗剂、乳霜、贴剂及气溶胶剂等经皮吸收剂；注射剂、点眼剂及栓剂等非经口剂。在这些之中，本发明的效果特别在软膏等经皮吸收剂上表现显著。另外，注射剂从安定性的观点来看，可在液剂填充至药水瓶等后以冷冻干燥处理来除去水份。在水份已除去的情况下，可在使用之前，使冷冻干燥物分散于生理盐水等中而调制成液剂。

药物组合物的用法可根据诸如疾病种类等来适当决定。例如，疾病为异位性皮肤炎、切伤、擦伤等皮肤创伤等时，可例示将经皮吸收剂的药物组合物直接涂覆于患部的方法等。

疾病位于口腔内或胃肠的情况下，可例示将药物组合物作为经口制剂来进行经口投与的方法、将药物组合物作为注射剂注入患部组织的方法等。也可以在上部内视镜下以药物组合物洗净患部并涂覆药物组合物至患部，由此促进粘膜再生。由此，可形成健全的粘膜而使自然治愈渐增，防止粘膜侵袭。进一步地，通过将药物组合物涂覆于胃粘膜，能够促进胃粘膜再生，增强或恢复上皮组织的屏障功能。

疾病为花粉症等鼻、眼粘膜部的疾病时，可例示将药物组合物涂覆于患部的方法。若将药物组合物涂覆于鼻、眼粘膜部，则鼻、眼粘膜部被修复且在粘膜层上形成坚固的屏障。因此，即使过敏原大量附着于鼻、眼粘膜部，也可抑制过敏反应，能够消除发生鼻塞或分泌大量鼻涕或眼泪等现象。

疾病为感冒等因病毒、细菌感染所致的上呼吸道粘膜炎症(感冒)时，可例示将药物组合物点入鼻腔或吸入的方法。由此，可抑制上呼吸道粘膜的炎症，修复上呼吸道粘膜并使其再生，能够抑制感染发展，并促进自然免疫应答的活性化。

另外，药物组合物的投与量可根据患者或受试者的年龄、体重、疾病种类、程度、投与方法等适当决定。

药物组合物可在不妨碍本发明效果的范围内根据需要含有本发明的皮肤屏障增强剂以外的可选成分(以下也记载为“药物可选成分”)。

药物可选成分可例示药理学上允许的盐、赋形剂、增粘剂、担体、香料、色素等。这些药物可选成分可单独使用1种，也可组合2种以上使用。

药理学上允许的盐可例示惯用的无毒性的盐，即酸加成盐及与各种碱的盐。具体例可例示盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐等无机酸盐；醋酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐等有机酸盐；甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐、丙氨酸盐、亮氨酸盐、谷氨酸盐等氨基酸盐；碱金属盐(例如钠盐、钾盐等)及碱土金属盐(例如镁盐、钙盐等)等无机碱盐；三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐等有机胺盐等。这些盐可单独使用1种，也可组合2种以上使用。因为如果含有这样的盐，容易结晶化。

赋形剂可根据药物组合物的剂形适当选择。具体例可例示蒸馏水、离子交换水、纯水等水、甲醇、乙醇等碳原子数1-6的低级醇、甘油等液体赋形剂；乳糖、淀粉、糊精、白糖等固体赋形剂等。这些赋形剂可单独使用1种，也可组合2种以上使用。

增粘剂可根据药物组合物的剂形适当选择。具体例可例示明胶、黄原胶及卡拉胶等。这些增粘剂可单独使用1种，也可组合2种以上使用。

本发明是单糖及糖醇中的至少一种在用于治疗皮肤疾病的药物组合物中的使用，包括在pH为4.0以上7.0以下投与单糖及糖醇中的至少一种。

即，本发明是单糖及糖醇中的至少一种与可选成分的pH调整剂的组合在用于制造治疗皮肤疾病的药物组合物中的使用，包括在pH为4.0以上7.0以下投与单糖及糖醇中的至少一种。

本发明的药物组合物可在皮肤屏障功能的增强方法中使用。皮肤屏障功能的增强方法包括将有效成分量以上的单糖及糖醇中的至少一种以pH为4.0以上7.0以下进行投与。

(药用化妆品)

本发明的药用化妆品含有本发明的皮肤屏障增强剂，pH为4.0以上7.0以下。本发明的药用化妆品是例如洗剂、乳霜、乳液、粉底等，其目的是预防皮肤疾病及皮肤保湿。另外，药用化妆品被分类为日本国药事法所规定的医药部外品。

药用化妆品中的皮肤屏障增强剂含量可考虑药用化妆品用途及投与形态等来决定。例如，药用化妆品中的单糖及糖醇中的至少一种的浓度优选设成1-1000mM，更优选设成6-165mM的量。单糖及糖醇中的至少一种的浓度若在所述范围内，可促进Filaggrin及Claudin-1的产生，充分增强或恢复皮肤屏障功能，更进一步促进皮肤组织的修复。

药用化妆品的pH为4.0以上7.0以下，优选为5.0以上7.0以下。pH若在所述下限值以上，Filaggrin的mRNA及Claudin-1的mRNA的表达受到促进，容易增强或恢复皮肤屏障功能。pH若在所述上限值以下，则不易因投与药物组合物而引起皮肤组织受损，可充分促进Filaggrin及Claudin-1的产生，容易充分增强或恢复皮肤屏障功能。

药用化妆品的形态只要是可测定pH的形态，则无特别限定。具体例可例示液体状、凝胶状及片状等的药用化妆品。

药用化妆品的使用方法可根据例如美容目的等来适当决定。药用化妆品目的为皮肤美容及保湿时，可例示将液体状、乳液状、凝胶状及片状的药用化妆品直接涂覆于皮肤的方法等。

以口腔内的美容为目的时，可例示将液体状及凝胶状等药用化妆品经口涂覆的方法、将液体状的药用化妆品作为注射剂来注入的方法等。

药用化妆品可在不妨碍本发明效果的范围内根据需要含有本发明的屏障增强剂以外的可选成分(以下也记载为“化妆品可选成分”)。

化妆品可选成分可例示流动石蜡、纯地蜡、地蜡、羊毛脂、凡士林、鲸蜡醇、角鲨烯、荷荷芭油、硬脂酸、棕榈酸、月桂醇、硬脂醇、鲸蜡醇、蜜蜡、甲基聚硅氧烷、二甲基环聚硅氧烷等油剂；丙醇、乙二醇、丙二醇、玻尿酸、胶原蛋白、聚乙二醇、羟基硬脂酸胆甾酯、甘油、山梨糖醇等保湿剂；各种界面活性剂；乳化剂；赋形剂；增粘剂；pH调整剂；抗氧化剂；色素；香料；紫外线吸收剂等。这些化妆品可选成分可单独使用1种，也可组合2种以上使用。

本发明是单糖及糖醇中的至少一种在皮肤保湿或美容的药用化妆品中的使用，该使用包括以pH为4.0以上7.0以下投与单糖及糖醇中的至少一种。

即，本发明是单糖及糖醇中的至少一种与可选成分的pH调整剂的组合在用于制造皮肤保湿或美容的药用化妆品中的使用，该使用包括以pH为4.0以上7.0以下投与单糖及糖醇中的至少一种。

(美容方法)

本发明的美容方法包括将上述本发明的药用化妆品涂覆于皮肤或粘膜的第1步骤。药用化妆品的涂覆量可根据患者或受试者的年龄、体重、皮肤状态、涂覆方法等适当决定。

本发明的美容方法优选包括在第1步骤后使皮肤或粘膜的pH回到大于7.0的碱性区域的第2步骤。进行第1步骤后至进行第2步骤为止的时间优选为15-30分钟左右。第1步骤与第2步骤间的间隔若为15-30分钟左右，则容易回到皮肤或粘膜原本pH的碱性区域。使pH回到碱性区域的方法可例示以流水等冲洗的方法、擦拭药用化妆品将其除去的方法以及将含有中和剂的乳霜等从药用化妆品上涂覆于皮肤或粘膜的方法等。这些方法可单独使用1种，也可组合2种以上使用。

本发明的美容方法优选重复进行上述第1步骤与第2步骤。

本发明的美容方法包括在pH为4.0以上7.0以下投与有效成分量以上的单糖及糖醇中的至少一种。投与单糖及糖醇中的至少一种时，也可在患者或受试者的皮肤或粘膜上涂覆单糖及糖醇中的至少一种。

(作用效果)

如以上说明的，由于本发明的皮肤屏障增强剂含有单糖及糖醇中的至少一种且pH为4.0以上7.0以下，因此能够促进细胞产生Filaggrin及Claudin-1，能够促进Filaggrin的mRNA及Claudin-1的mRNA的转录及表达。因此，能够借助皮肤屏障增强剂充分增强或恢复皮肤屏障功能。

以上详述了本发明的实施方式，但本发明不限于这些特定的实施方式。

实施例

以下示出实施例来详细说明本发明，但本发明不受以下记载所限。

(实施例1-7、比较例1-7)

在HuMedia-KG2培养基(KURABO公司制)中添加表1浓度的D-葡萄糖(产品编号：G5767，SIGMA公司制)或D-甘露糖醇(产品编号：M9647，SIGMA公司制)以及用于调整培养基pH的盐酸(HCl)(产品编号：080-0106，和光纯药公司制)，并调制出含有被调整为表1所示pH的皮肤屏障增强剂的培养基(以下也记为“试验用培养基”)。此外，pH是使用pH计测器(堀场制作所制“F-53”)在25℃下测得的值。

使用实施例1-7及比较例1-4、7的试验用培养基，进行以下所记载的Filaggrin蛋白质表达量分析、以及Filaggrin蛋白质的mRNA及Claudin-1蛋白质的mRNA的各表达量分析，并将结果示于图1-4。

<Filaggrin蛋白质表达量的分析1>

使用HuMedia-KG2培养基(pH7.6，KURABO公司制)，将正常人类皮肤角化细胞(源自单一供体的初代培养正常皮肤角化细胞，Takara Bio株式会社制)以1,000,000cells/well的细胞密度播种至6孔(6well)微板，并在37℃下培养24小时(前培养)。前培养之后，吸引除去培养液，将培养基置换为实施例1-6及比较例1-4的试验培养基，在37℃下培养30分钟(正式培养)。正式培养后，吸引除去培养上清，将培养基置换为pH为7.6的HuMedia-KG2培养基，在37℃下培养3小时(后培养)。后培养之后除去培养基，从培养的细胞抽提蛋白质。以SDS-PAGE使所抽提的蛋白质展开。之后，将抽提的蛋白质转录到硝基纤维素膜，再以使用源自小鼠的Filaggrin抗体的免疫印迹法来分析培养细胞内的Filaggrin蛋白质的表达量。此外，分析同一样本的β-actin的蛋白质表达量来作为内生性对照组。以光密度计测定所检测出的各蛋白质的band的浓度，分析出Filaggrin蛋白质及β-actin蛋白质的表达量。令所述同一样本的β-actin蛋白质表达量为1，以Filaggrin蛋白质表达量的相对值(相对表达量)来评价Filaggrin蛋白质表达量。将结果示于图1。

<Filaggrin的mRNA、Claudin-1的mRNA的表达量分析>

除了将试验培养基变更为实施例2、4、6及比较例2、4的试验培养基以外，利用与“<Filaggrin蛋白质表达量的分析1>”相同手法进行前培养、正式培养及后培养。后培养之后除去培养基，从培养的细胞抽提Total RNA。使用RT-PCR法，从所抽提的RNA放大Filaggrin及Claudin-1的mRNA，并分析各mRNA的表达量。令比较例2的各mRNA的表达量为1，以实施例2、4、6及比较例4的各mRNA表达量的相对值(相对表达量)来评价Filaggrin的mRNA及Claudin-1的mRNA的表达量。将结果示于图2、3。

<Filaggrin蛋白质表达量的分析2>

除了使用实施例7及比较例7的试验用培养基以外，利用与“<Filaggrin蛋白质表达量的分析1>”相同的手法进行实施例7及比较例7的Filaggrin蛋白质表达量的分析。另外，令比较例7的Filaggrin蛋白质表达量为1，以实施例7的Filaggrin蛋白质表达量相对于比较例7的Filaggrin蛋白质表达量的相对值(相对表达量)来评价实施例7的Filaggrin蛋白质的表达量。将结果示于图4。

[表1]

如表1及图1所示，应用本发明的实施例1-6中Filagglin蛋白质的表达量增加。尤其是在含有110mM的D-葡萄糖的实施例2、4、6中，Filagglin蛋白质的表达量显著增加。

如表1及图2、3所示，应用本发明的实施例2、4、6中，Filagglin及Claudin-1的各mRNA表达量增加。另外，即使是在含有110mM的D-葡萄糖且pH为3.0的比较例4中，也可见Filagglin及Claudin-1的各mRNA增加。

如表1及图4所示，应用本发明的实施例7的Filagglin蛋白质表达量与比较例7相比增加4.3倍。

从实施例1-6及比较例1-4的结果判定，通过使试验培养基的葡萄糖浓度为6mM或110mM且将pH调整至4.0以上7.0以下，能够促进培养细胞产生Filagglin蛋白质。

从实施例1-6及比较例2、4的结果判定，通过使试验培养基的葡萄糖浓度为110mM且将pH调整至3.0以上7.0以下，能够促进培养细胞内的Filagglin及Claudin-1的各mRNA的表达。

从比较例3、4的结果判定，使葡萄糖浓度为110mM且将pH调整至3.0虽可促进Filagglin蛋白质的mRNA表达，但未检测出Filagglin蛋白质。

从实施例7及比较例7的结果判定，通过使试验培养基的甘露糖醇浓度为110mM且将pH调整至5.7，可促进培养细胞产生Filagglin蛋白质。

由上述结果判定，能够通过应用本发明来促进Filagglin及Claudin-1的表达，增强皮肤屏障功能。

<细胞损害试验>

与“<Filaggrin蛋白质表达量的分析1>”的项目相同地培养正常人类皮肤角化细胞。并以LDH法分析所培养的细胞的损害程度。将各例的试验培养基培养的细胞以TritonX100处理的细胞损害程度为100％，评价此时各例培养所得细胞的损害率。

图5为示出评价实施例1-6及比较例1-4的试验培养基培养的细胞的损害率的结果。

如表1及图5所示，应用本发明的实施例1-6的细胞损害率较pH为7.6的比较例1、2的细胞损害率更低。另一方面，pH为3.0的比较例3、4的细胞损害率较pH为7.6的比较例1、2的细胞损害率更高。

由以上结果得知，pH为3.0的比较例3、4中可观察到发生细胞损害。然而该细胞损害可通过在pH为5.0以上的酸性区域的试验培养基中应用本发明而显著降低，降低至较pH为7.6的比较例1、2的试验培养基培养所得细胞的细胞损害更低的水平。

即，判定能够通过在pH为5.0以上的试验培养基中应用本发明而使皮肤屏障功能恢复并降低细胞损害。

<异位性皮肤炎小鼠模型的评价>

制作出分别将葡萄糖浓度调整为20％且pH调整为6.0的磷酸缓冲生理盐水(PBS)的水溶液，将其作为应用了本发明的皮肤屏障增强剂。

从Day0起至Day14为止，以每周2次的频率，对驯化饲育后8周大的雌性NC/Nga小鼠的右耳廓部皮内投与螨抗原。与此并行地，从Day0起至Day28为止，1日1次地每日涂覆投与本发明的皮肤屏障增强剂。作为Mock组，从Day0起至Day28为止，1日1次地每天涂覆投与pH调整成7.6的PBS。

在Day28拍摄Mock组及涂覆了皮肤屏障增强剂的组的耳廓部照片，从异氟醚麻醉下放血、安乐死的小鼠采取左右耳廓部，进行中性福尔马林固定。石蜡包埋后制作组织切片。将该切片以苏木精-伊红(HE)溶液染色，并使用源自小鼠的Filaggrin及Claudin-1抗体进行免疫染色。阴性对照组中使用将8周大雌性NC/Nga小鼠在无处置下饲育至Day28的小鼠耳廓切片。

图6为示出以异位性皮肤炎小鼠模型进行评价的小鼠耳廓部外观的照片。以肉眼观察小鼠耳廓部，结果，在经螨抗原致敏的小鼠耳廓部涂覆pH为7.6的PBS的组(Mock组)中，在Day15观察到轻度溃疡形成与出血，Day28观察到高度出血与溃疡形成。另一方面，涂覆本发明的皮肤屏障增强剂的组中，虽在Day28观察到些微皮肤肿胀，但Day15、Day28均完全未观察到耳廓部的溃疡形成、出血。

图7是示出利用异位性皮肤炎小鼠进行评价的小鼠耳廓部切片组织的染色结果的照片。如图7的HE染色结果所示，Mock组观察到真皮中的炎症性细胞强烈浸润。但是，涂覆了本发明皮肤屏障增强剂的组中，炎症性细胞浸润减少，角质层与表皮形态也维持正常。如图7的免疫染色结果所示，Mock组失去Claudin-1蛋白质的表达连续性，并且其表达量下降。与此相对，涂覆了本发明的皮肤屏障增强剂的组中观察到强连续的Claudin-1蛋白质染色像。同样地，Mock组中观察到Filaggrin蛋白质表达的下降与丧失连续性。与此相对，涂覆了本发明的皮肤屏障增强剂的组中，Filaggrin蛋白质连续且幅度较宽地表达于颗粒层部分中。

<参考试验1>

使用HuMedia-KG2培养基(pH7.6、KURABO公司制)，以1,000,000cells/well的细胞密度将正常人类皮肤角化细胞播种于6孔(6well)微板中，在37℃下培养24小时(前培养)。前培养之后，吸引除去培养液，将培养基置换为比较例2的试验培养基并在37℃下进行正式培养。从正式培养时间为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0小时的各培养液中除去培养基，从培养的细胞抽提Total RNA。使用RT-PCR法，从抽提自各培养液的RNA扩增Filaggrin及Claudin-1的mRNA，并对正式培养时间相异的各培养液分析各mRNA的表达量。使正式培养时间为0小时的各mRNA表达量为1，以各培养时间的细胞的各mRNA表达量相对值(相对表达量)来评价Filaggrin及Claudin-1的各mRNA表达量。

图8是示出参考试验1的各培养时间中比较例2的Filaggrin及Claudin-1的mRNA表达量的评价结果的图表。在比较例2中，Claudin-1的mRNA的诱导表达峰值在开始诱导表达后0.5小时观察到。Filaggrin的mRNA诱导表达峰值在开始诱导表达后2.0小时观察到。

<参考试验2>

除了培养基使用比较例5的试验培养基并且正式培养的时间为0、2.0、4.0、6.0、24.0小时以外，与“<Filaggrin蛋白质表达量的分析1>”项目同样地评价各培养时间的Filaggrin蛋白质表达量。

图9是示出参考试验2的Filaggrin蛋白质表达量的评价结果的图表。从开始诱导表达后2小时观察到Filaggrin蛋白质表达量增加。Filaggrin蛋白质表达量的增加在开始诱导表达后至24小时之间观察到。

<参考试验3>

除了培养基使用比较例6的试验培养基并使用源自小鼠的Claudin-1抗体以外，利用与“<参考例2>”项目相同的手法，评价各培养时间的Claudin-1蛋白质表达量。

图10为示出参考试验3的Claudin-1蛋白质表达量的评价结果的图表。从开始诱导表达后2小时观察到Claudin-1蛋白质表达量的增加。Claudin-1蛋白质表达量的增加在开始诱导表达后至24小时之间观察到。

以上各试验等的结果显示，通过含有6mM或110mM的葡萄糖或110mM的甘露糖醇且pH为4.0以上7.0以下的皮肤屏障增强剂，皮肤屏障相关蛋白质的基因表达受到诱导。即，显示了本发明的皮肤屏障增强剂可通过促进皮肤屏障相关蛋白质的基因表达来促进皮肤屏障相关蛋白质的Filaggrin及Claudin-1的产生，能够增强皮肤屏障功能。

如参考试验2、3的结果所示，即使是pH为7.6的比较例2、5、6中也因含有55-165mM的葡萄糖而观察到皮肤屏障相关蛋白质的表达量及生产量增加(图8-图10)。然而，本发明的皮肤屏障增强剂通过pH在4.0以上7.0以下能够进一步增强皮肤屏障相关蛋白质的表达(图1、图4)。因此，本发明的皮肤屏障增强剂与现有的皮肤屏障增强剂相比能够更有效地增强皮肤屏障功能。因此，若将本发明的皮肤屏障增强剂应用于药物等，能够期待可更有效地修复皮肤组织等的显著效果。

产业上的可利用性

本发明所得的皮肤屏障增强剂、药物组合物及药用化妆品能够进一步增强皮肤屏障功能，能够用于皮肤的保湿或美容以及增强皮肤屏障功能等。

Claims (8)

1.一种皮肤屏障增强剂，含有单糖及糖醇中的至少一种，且pH为4.0以上7.0以下。

2.如权利要求1所述的皮肤屏障增强剂，其特征在于，含有葡萄糖作为所述单糖。

3.如权利要求1所述的皮肤屏障增强剂，其特征在于，含有甘露糖醇作为所述糖醇。

4.如权利要求1-3中任一项所述的皮肤屏障增强剂，其特征在于，所述pH为5.0以上7.0以下。

5.一种药物组合物，含有如权利要求1-4中任一项所述的皮肤屏障增强剂，且pH为4.0以上7.0以下。

6.一种药用化妆品，含有如权利要求1-4中任一项所述的皮肤屏障增强剂，且pH为4.0以上7.0以下。

7.如权利要求6所述的药用化妆品，其特征在于，所述药用化妆品为液体状、凝胶状或片状。

8.一种美容方法，包括将权利要求6或7所述的药用化妆品涂覆于皮肤或粘膜的步骤。